CN101724162B - 仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法，包括如下步骤：(1)制备MPC∶LMA物质的量之比为3∶7～7∶3，MPC∶SMA物质的量之比为3∶7～7∶3的仿细胞膜结构聚合物；(2)制备聚合物胶束溶液；(3)将制备的聚合物胶束溶液在50～90℃搅拌热处理5～90分钟；(4)降温后过滤得到仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液。本发明通过简便的直接溶解法和溶剂挥发法制备聚合物胶束，并经50～90℃搅拌处理5～90分钟后，得到结构紧密、粒径分布较窄的纳米胶束溶液。

Description

仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法

技术领域

本发明涉及仿生聚合物胶束的制备方法，具体涉及用含磷酰胆碱亲水基团及烷基疏水链的随机共聚物制备仿细胞外层膜结构胶束的方法。

背景技术

聚合物纳米胶束作为药物载体，将药物包裹其中，不仅可以增溶水溶性差的药物，而且可以通过被动靶向作用将药物输送至目标部位，从而降低毒副作用，显著提高药物的生物利用度。聚合物纳米胶束可防止药物在酸性环境中水解，大大降低药物与胃蛋白酶的接触机会。例如，用聚合物纳米胶束对易被肠道酶解破坏的多肽和蛋白类药物进行包裹，经口服后可穿过小肠的集合淋巴结(Peryer’s结)到达肝脾等组织，也可以穿过肠系膜的细胞间通路进入循环积聚于肝脏，发挥药效，降低药物毒性及其他不良反应，提高药物的生物利用度。然而，在体循环中，大多数憎水及表面带电荷的微-纳米药物载体不能完全躲避单核吞噬细胞系统的清除，使药物的利用度降低。因此，设计并合成生物相容性的纳米胶束将是提高纳米药物性能的关键。

大量研究表明，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)聚合物具有良好的生物相容性。两亲性MPC嵌段聚合物在一定条件下可以形成仿细胞膜的纳米胶束，能对药物进行包裹，实现胶束载药的优点(计剑，徐建平，陈伟东等ZL 200510049262.8)。MPC聚合物胶束具有与细胞外层膜相似的化学组成及结构，在很大程度上会被生物体防御系统认为是自体，可以阻止蛋白吸附和细胞粘附，避免单核巨噬细胞系统的吞噬。因而，MPC聚合物纳米胶束可以保护胶束内核的药物不被水解和酶解，显著延长药物在体内的循环时间，提高药效、降低毒副作用，使包裹的药物在病灶部位有效释放。

目前，MPC聚合物作为胶束载药的研究仅限于MPC嵌段共聚物。大部分研究是用原子转移自由基聚合法(ATRP)合成的嵌段共聚物。Lewis等人在该方面做了很多工作：将MPC与pH敏感性的单体甲基丙烯酸二异丙基氨基乙酯(DPA)、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯(DEA)分别进行共聚制备嵌段共聚物，在不同pH下制备得到胶束，并研究了胶束的稳定性。分别以Orange OT和潘生丁作为模型药物进行了药物控释实验(Salvage J.P.etal.Journal of Controlled Release，2005，104(2)：259-270；Giacomelli C.et al.Biomacromolecules，2006，7(3)：817-828)；合成了MPC与DPA的共聚物后，将叶酸键合在MPC嵌段末端，分别以它莫西芬和紫杉醇为模型药物。研究表明FA-MPC-DPA聚合物胶束可以作为一种有用的药物载体，实现对药物的控制释放。同时，可以通过调节溶液的pH使DPA嵌段质子化，从而使胶束较快解离，使药物快速释放(Licciardi M.，et al.Polymer，2006，47(9)：2946-2955)。

徐建平等人采用含有MPC亲水基团及胆固醇憎水基团的两亲性二元共聚物设计药物传输体系，通过水包油乳化法对阿霉素进行了包裹。实验结果表明，由该嵌段共聚物制备得到的纳米胶束可以作为新型药物控释载体(Xu J.P.et al.Journal of Controlled Release，2006，107(3)：502-512；徐建平等.高等学校化学学报，2007，28(2)：394-396；计剑等ZL 200510049262.8)。东南大学的陈志明等人通过可逆加成-断裂链转移聚合方法制备得到poly(MPC-co-BMA)两亲嵌段共聚物，通过溶剂挥发法，将该两亲嵌段共聚物制备纳米聚合物胶束，并通过物理作用将药物包裹于胶束中，得到具有良好生物相容性的纳米聚合物载药体系。

然而，嵌段共聚物的合成及提纯过程非常复杂繁琐，而且ATRP法合成的聚合物中夹杂的铜催化剂很难完全除去，可能严重影响材料的生物相容性。与之相比，自由基聚合合成和纯化方法简单易行。因此，利用自由基聚合法合成的两亲性MPC随机共聚物制备纳米胶束，研究其在药物载体方面的应用，具有非常重要实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种两亲性MPC随机共聚物制备仿细胞膜结构纳米胶束的方法。

本发明的实现过程如下：

一种仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备MPC∶LMA物质的量之比为3∶7～7∶3，MPC∶SMA物质的量之比为3∶7～7∶3的仿细胞膜结构聚合物；

(2)对于MPC∶LMA物质的量之比为3∶7～7∶3，MPC∶SMA物质的量之比为6∶4～7∶3具有较好的水溶性的仿细胞膜结构聚合物直接使用水溶法制备聚合物胶束溶液；对于MPC∶SMA物质的量之比为3∶7～5∶5的水溶性较差的仿细胞膜结构聚合物用极性易挥发有机溶剂溶解，在搅拌下加入蒸馏水制备得到聚合物胶束溶液；所述极性易挥发有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、乙醇、氯仿或其混合溶剂；

(3)将制备的聚合物胶束溶液在50～90℃搅拌热处理5～90分钟；

(4)降温后过滤得到仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液，聚合物胶束颗粒直径为80～500nm。

向制备得到的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液中滴加阿霉素的氯仿溶液，形成水包油乳化液，敞口体系持续搅拌使氯仿挥发，并在50～90℃加热处理加速药物的分配平衡，最后用离心方法除去体系中的游离药物，得到载药仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液。

向制备得到的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液中滴加中性红的水溶液，并在50～90℃加热处理加速药物的分配平衡，最后用离心方法除去体系中的游离药物，得到载药仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液。

本发明的优点与积极效果：

1)本发明以MPC随机共聚物代替MPC嵌段共聚物制备仿细胞膜结构胶束，可使生产成本大幅降低。

2)本发明通过简便的直接溶解法和溶剂挥发法制备聚合物胶束，并经50～90℃搅拌处理5～90分钟后，得到结构紧密、粒径分布较窄的纳米胶束溶液，并采用水包油法制备载药聚合物胶束，制备过程简单，操作简便，易于推广应用。

3)MPC两亲聚合物胶束与细胞外层膜相似的化学组成及结构在很大程度上会被体内系统认为是自体，可以降低或阻止蛋白质吸附和细胞粘附，避免单核吞噬细胞系统的吞噬，从而显著延长药物在体内的循环时间，提高药效、降低毒副作用。

附图说明

图1为MPC单体的结构式；

图2聚合物合成反应式；

图3为本发明中MPC聚合物胶束扫描电镜图，a为C＝1.6×10^-2g/mlPML70溶液，b为C＝1.0×10^-2g/ml PMS30溶液；

图4为本发明中游离阿霉素及聚合物包裹的阿霉素的荧光光谱；

图5为本发明中载药聚合物胶束及等量空白药物的体外药物释放对比曲线；

图6为芘荧光探针法测试PML30的CMC。

具体实施方式

1)2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)单体(图1)参考文献报道的方法(Ishihara K.et al Polymer Journal，1990，22(5)：355-360.)合成，并通过¹H NMR及元素分析对其进行表征。憎水单体甲基丙烯酸月桂酯(LMA)和甲基丙烯酸十八酯(SMA)从Sigma公司购买，低温保存，未经处理直接使用。偶氮二异丁腈(AIBN)用乙醇重结晶后使用。通过溶液自由基聚合法合成MPC与含憎水烷基单体的随机共聚物。为了得到具有设计组成的两亲性随机共聚物，参考文献(Lewis A.L.et al Biomaterials，2000，21(18)：1847-1859)选用“饥饿法”(“monomer-starved”)分别进行MPC与LMA/SMA的聚合反应，从而得到聚合物poly(MPC-co-LMA)(简称PML)和poly(MPC-co-SMA)(简称PMS)(图2)。

2)根据聚合物在水中的溶解性不同选用不同的方法制备聚合物胶束。定性实验结果表明，PML系列聚合物及MPC含量较高的PMS聚合物，如PMS70(物质的量之比MPC∶SMA＝7∶3)，在常温下具有较好的水溶性，因此采用直接水溶法制备聚合物胶束，即聚合物溶于二次蒸馏水得到质量百分浓度为0.002～0.5％溶液。常温下水溶性较差的PMS聚合物，如聚合物PMS30(物质的量之比MPC∶SMA＝3∶7)和PMS50(物质的量之比MPC∶SMA＝5∶5)，采用溶剂挥发法制备聚合物胶束。过程为：准确称取一定量的聚合物，向其中逐滴加入四氢呋喃，使聚合物溶解，然后向其中加入定量的二次蒸馏水，使聚合物的质量百分浓度为0.001～0.5％；敞口搅拌使溶液中的四氢呋喃挥发。2小时后在50～90℃搅拌处理5～90分钟。温度降到室温后，将聚合物胶束水溶液在7980r/min离心10min，并用G-3规格的砂芯漏斗过滤上清液，除去杂质，即得到结构紧密、粒径分布较窄的聚合物纳米胶束溶液(图3)。

3)采用芘荧光探针技术测定两亲性MPC随机共聚物的临界胶束浓度(CMC)和胶束结构。实验过程为：用微量进样器向数个10ml的棕色容量瓶中分别加入10微升浓度为1.37×10^-4mol/l芘的丙酮溶液，通风厨中避光敞口放置10min使丙酮自然挥发。然后用逐步稀释法配置一系列浓度为1.0～1.0×l0^-6mg/ml的聚合物梯度溶液于这些容量瓶中。将这些溶液超声处理3min，避光条件下60r/min摇振过夜，使芘在水和聚合物胶束中分配平衡。荧光光谱的测试条件如下：激发波长：337nm，发射光谱扫描范围：350～600nm，激发狭缝宽度：5.0nm，发射狭缝宽度：2.5nm，激发电压：950V。

由于芘荧光光谱的I₁/I₃值由憎水的芘荧光探针周围分子的极性决定，I₁/I₃值越小表明探针周围分子的极性越弱。I₁/I₃值对聚合物浓度图中I₁/I₃值随聚合物浓度升高急剧降低(图6)，不仅说明有聚合物胶束形成；也表明胶束核有强憎水性，亲水壳层由亲水的磷酰胆碱基团构成。因而，形成的胶束具有仿细胞外层膜结构。

4)采用扫描电镜(SEM)测试聚合物胶束的尺寸和形貌。通过冷冻升华法制备测试样品，喷金处理后测试聚合物胶束的尺寸和形貌。

5)以阿霉素(ADR)为疏水性模型药物，采用水包油法制备载药聚合物胶束溶液。称取一定量的盐酸阿霉素原料药，用氯仿溶解，然后用三乙胺去盐酸化，得到阿霉素浓度为2～8％的氯仿溶液。在剧烈搅拌下向聚合物胶束水溶液中逐滴滴加ADR的氯仿溶液，从而形成水包油乳化液，然后敞口体系持续搅拌使氯仿挥发，并在50～90℃加热处理来加速药物的分配平衡，最后用离心方法除去体系中的游离药物。由于阿霉素在水中的溶解度很小，在水中溶解的阿霉素的质量可以忽略，因此聚合物胶束溶液体系中的阿霉素质量即为所加入的药物总量减去离心除去的阿霉素质量。由于该聚合物溶液的浓度远远大于聚合物的CMC，除去离心操作所除去的聚合物的质量，即可以认为其余的聚合物全部形成胶束，因此聚合物胶束的质量为聚合物总质量减去离心沉淀物的质量。

6)图4为本发明中游离阿霉素及聚合物包裹的阿霉素的荧光光谱，图5为本发明中载药聚合物胶束及等量空白药物的体外药物释放对比曲线。采用载药聚合物胶束溶液进行体外药物释放实验，将载药聚合物胶束溶液装入透析袋中，在设定pH的缓冲液中于37℃恒温振荡透析，定时取出一定量的透析外液，并用等量的新鲜缓冲液补充。在体外药物释放实验中，分子量较小的聚合物可能透出透析袋。然而，在聚合物溶液浓度小于CMC时，没有检测到聚合物对盐酸阿霉素的荧光发射光谱的影响。因此，可以通过绘制盐酸阿霉素在缓冲液中的工作曲线计算透析外液中ADR的含量。荧光光谱测试条件为：激发波长为472nm，激发狭缝宽度为5.0nm，发射狭缝宽度为5.0nm，激发电压为700V。

累积释放率用以下公式计算：

$\mathrm{Er}=(V_e\underset{i=1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i+V_o{C}_n)/m_{\mathrm{drug}}\×100\%$

其中，Er为ADR的累积释放率；V_e为透析液的置换体积；V_o为释放液的体积；C_i为第i次置换取样时释放液中ADR的浓度；m_drug为用于释放的载药胶束中的ADR的质量；n为置换液的次数。

实施例1：

准确称取PML70(MPC∶LMA，mol％∶mol％，7∶3)10mg，用二次蒸馏水定容至10ml。超声处理1min，摇振使聚合物完全溶解后，60r/min摇振6h。经50℃搅拌处理90分钟后，得到结构紧密、粒径分布较窄的纳米胶束溶液，扫描电镜测定胶束粒子直径为200～400纳米。

对比实例表明，未经50℃搅拌热处理的纳米胶束结构疏松，且粒径分布宽，粒子直径为50～800纳米。

实施例2：

称取PMS30(MPC∶SMA，mol％∶mol％，3∶7)10mg，向其中逐滴加入100微升THF，使聚合物溶解，搅拌下向其中逐滴加入二次蒸馏水定容至10ml，敞口搅拌使溶液中的THF挥发。2小时后于80℃搅拌处理10分钟，冷却到室温后7980r/min离心10min，除去沉淀物后得到浓度为0.53mg/ml的PMS30聚合物胶束水溶液。扫描电镜测定胶束粒子直径为100～200纳米。

对比实例表明，未经80℃搅拌热处理的纳米胶束结构疏松，且粒径分布宽，粒子直径为30～500纳米。

实施例3：

以聚合物PML30(MPC∶LMA＝3∶7)为例，叙述芘荧光探针法测试水溶性较好的MPC聚合物临界胶束浓度及胶束结构的过程。

(1)以无水丙酮为溶剂，配制芘浓度为1.37×10^-4mol/L的丙酮溶液，超声波处理10min；

(2)准确称取10mg PML30于10ml容量瓶中，用二次蒸馏水溶解定容，超声波处理3min，然后振荡器60r/min摇振12h。即得到浓度为1.0mg/ml的PML30聚合物胶束溶液；

(3)用微量进样器向数个10ml的棕色容量瓶中分别加入10微升浓度为1.37×10^-4mol/l芘的丙酮溶液，通风厨中避光敞口放置10min使丙酮自然挥发；

(4)用逐步稀释法配置浓度为1.0～1.0×10^-6mg/ml的聚合物PML30的梯度溶液：分别移取不同体积浓度为1.0mg/ml聚合物溶液于上述容量瓶中，用二次蒸馏水定容至刻度。将这些溶液超声处理3min，避光60r/min摇振过夜，使芘在水和聚合物胶束中分配平衡。

(5)测试荧光发射光谱。以芘的I₁/I₃对聚合物溶液的浓度作图，由图6可知PML30聚合物的CMC为2.14×10^-6g/ml。

(6)由芘的I₁/I₃对聚合物浓度图可知，形成胶束后I₁/I₃值显著降低，说明胶束核有强憎水性，亲水壳层由亲水的磷酰胆碱基团构成。因而，形成的胶束具有仿细胞外层膜结构。

实施例4：

以实施例1中的聚合物PML70纳米胶束为载体，通过水包油法将阿霉素负载于胶束后，分别以pH＝7.4的磷酸缓冲溶液和pH＝4的邻苯二甲酸缓冲液为透析介质，间隔一定时间取透析外液2ml测定药物浓度，并用2ml新鲜的缓冲液补充透析外液。在pH＝7.4的磷酸缓冲溶液透析10小时阿霉素的累积释放率为40％；在pH＝4的邻苯二甲酸缓冲液中透析10小时阿霉素的累积释放率为65％。

实施例5：

以实施例1中的聚合物PML70纳米胶束为载体，平行取三份聚合物质量为10mg的胶束水溶液，在剧烈搅拌下分别向三份溶液中滴加0.10，0.25及0.5ml 5％的阿霉素氯仿溶液。避光，敞口体系搅拌过夜，使溶液中氯仿挥发。在50～90℃加热处理后离心10min，除去体系中未被包裹的阿霉素，得到载药量为聚合物质量8％、14％和19％的载药胶束溶液。三种载药胶束体外药物释放10小时，累计释药率分别达到90％、62％和35％。

实施例6：

分别以聚合物PML30和PML70胶束为药物载体，采用水包油法制备载阿霉素药量相同的载药聚合物胶束溶液，以pH＝4的缓冲液为透析外液，置换体积为5ml，进行体外药物释放实验。累积释放率达到70％时，憎水基团含量较高的聚合物PML30胶束体系需要5小时，而憎水基团含量较底的聚合物PML70胶束体系只需要2小时。

实施例7：

聚合物PML70胶束对中性红的负载：以实施例1中的PML70聚合物纳米胶束为载体，在浓度为3.0mM的中性红水溶液中摇振负载10小时。与相同浓度的中性红水溶液相比，含有PML70聚合物纳米胶束时，中性红的荧光发射波长从609nm蓝移至588nm，荧光强度显著增强。这种明显变化说明聚合物胶束对水溶性中性红药物也有一定的负载作用。

Claims (3)

1.一种仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法，其特征包括如下步骤：

（1）制备MPC:LMA物质的量之比为3:7～7:3，MPC:SMA物质的量之比为3:7～7:3的仿细胞膜结构聚合物；

（2）对于MPC:LMA物质的量之比为3:7～7:3，MPC:SMA物质的量之比为6:4～7:3具有较好的水溶性的仿细胞膜结构聚合物直接使用水溶法制备聚合物胶束溶液；对于MPC:SMA物质的量之比为3:7～5:5的水溶性较差的仿细胞膜结构聚合物用极性易挥发有机溶剂溶解，在搅拌下加入蒸馏水制备得到聚合物胶束溶液；

（3）将制备的聚合物胶束溶液在50～90oC搅拌热处理5～90分钟；

（4）降温后过滤得到颗粒直径为80~500 nm的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液；

所述的MPC 为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，LMA为甲基丙烯酸月桂酯，SMA为甲基丙烯酸十八酯；

所述极性易挥发有机溶剂为四氢呋喃、甲醇、乙醇、氯仿或其混合溶剂。

2.根据权利要求1所述的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法，其特征在于：向制备得到的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液中滴加阿霉素的氯仿溶液，形成水包油乳化液，敞口体系持续搅拌使氯仿挥发，并在50～90℃加热处理加速药物的分配平衡，最后用离心方法除去体系中的游离药物，得到载药仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液。

3.根据权利要求1所述的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液的制备方法，其特征在于：向制备得到的仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液中滴加中性红的水溶液，并在50～90℃加热处理加速药物的分配平衡，最后用离心方法除去体系中的游离药物，得到载药仿细胞外层膜结构聚合物纳米胶束溶液。

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