JP6314474B2 - 細胞培養用組成物及び細胞培養方法 - Google Patents
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
例えば、非特許文献1は、ジメチルスルホキシドがマウス胚性癌細胞(P19細胞)の心筋への分化を促進することを開示している。また、非特許文献2は、ジメチルスルホキシドがHL60細胞の顆粒球への分化を促進することを開示している。
そこで、本発明の課題は、難水溶性物質が必須の細胞培養において、難水溶性物質が培地中で細胞培養に対して有効かつ適切に働き、よって、細胞毒性を与えることなく細胞培養に資することができる、難水溶性物質を含有する細胞培養用組成物及びそれを使用する細胞培養方法を提供することにある。
ここで、共重合体(A)は2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとn−ステアリルメタクリレートとの共重合体、共重合体(B)は2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとn−ラウリルメタクリレートとの共重合体である。
本発明の細胞培養用組成物は、難水溶性物質と、上記共重合体(A)、共重合体(B)、又は共重合体(A)及び(B)の混合物とを含有する。なお、以後、「細胞培養用組成物」と称した場合、特に断らない限り、当該本発明の細胞培養用組成物を指すものとする。
なお、上記それぞれの難溶性は次の基準により判定される。すなわち、対象物が固形の場合は粉末とした後、水中に入れ、20±5℃で5分ごとに強く30秒間振り混ぜて、30分以内に溶ける度合を検討し、対象物1g又は1mLを溶かすのに要する水量が30mL以上100mL未満のものを「やや溶けにくい」、100mL以上1,000mL未満のものを「溶けにくい」、1,000mL以上10,000mL未満のものを「極めて溶けにくい」、10,000mL以上のものを「ほとんど溶けない」とする。
MPC−SMA共重合体及びMPC−LMA共重合体は、各々、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単量体(以下、MPCと称する)とn−ステアリルメタクリレート単量体(以下、SMAと称する)、MPCとn−ラウリルメタクリレート単量体(以下、LMAと称する)、を溶液重合、乳化重合、懸濁重合等、公知の重合方法に従って重合することで得ることができる。
なお、これらの共重合体を精製する場合は、再沈殿法、透析法、限外濾過法など一般的な精製方法により行うことができる。
なお、本発明の両共重合体はいずれも、本発明の効果が発揮される範囲内において、MPC、SMA及びLMA以外の単量体由来部を含む共重合体であってもよい。
以後、MPC−SMA共重合体、MPC−LMA共重合体又は両共重合体の混合物を総称して、単に共重合体と称することもある。
なお、溶媒への溶解又は分散の順番は、難水溶性物質が先であっても、あるいは共重合体が先であってもよい。
本発明の細胞培養方法は、上記説明した細胞培養用組成物を培養する細胞の要求性に応じて細胞培養用の培地に添加し、得られた難水溶性物質が添加された培地を用いて、細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で培養する細胞培養方法である。本発明により、難水溶性物質が添加された細胞培養用培地を用い、細胞毒性を与えることなく、細胞を培養することができる。
これら容器に培養する細胞と、その細胞に適した培地、上記各種増殖因子等、及び細胞培養用組成物を加え、温度および湿度、炭酸ガス濃度が制御されたインキュベーター内にて培養する。例えば、培養条件は細胞の種類によるが、37℃、5%CO2雰囲気下での培養でよい。
アラマーブルーアッセイ法は、動物細胞を中心とした細胞代謝を測定するために開発されたバイオアッセイ法の一つである。アラマーブルーは、その還元に細胞への取込みを必要とする酸化還元色素であり、ミトコンドリア内で行われている呼吸代謝系の還元反応により、酸化型(無蛍光・青色)から還元型(蛍光・赤色)に変化する性質を持つ。細胞代謝が正常であると還元反応が進行する一方、細胞増殖に異常をきたすと酸化型のままである。すなわち、細胞代謝が正常であれば、細胞数に比例して還元型色素量が増大していく。本発明では、培地中の蛍光強度(励起波長530nm〜560nm、検出波長580〜600nm)を測定し、その蛍光強度から細胞毒性の有無を判断した。
具体的には、「有機溶媒と難水溶性物質との混合物」が添加された培地で細胞を培養した場合の蛍光強度を基準として、当該基準蛍光強度と、細胞培養用組成物で細胞培養した場合の蛍光強度を比較して判断する。ここで、アラマーブルーは細胞数が多いほど蛍光強度が高くなる。従って、上記基準蛍光強度より高い蛍光強度を示せば、細胞毒性抑制効果が高いと判断できる。
アラマーブルーアッセイ法に使用する試薬としては、市販の試薬(例えば、Invitrogen社製など)を用いることができる。
また、蛍光強度は、マイクロプレートリーダー(SpectraMax M3、Molecular Devices社製)を使用して測定した。
得られた共重合体5mgを、0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)1gへ溶解し、GPCにより重量平均分量を測定する。測定条件は以下の通りである。
装置:RI−8020(東ソー社製)、DP−8020(東ソー社製)、SD−8022(東ソー社製)、AS−8020(東ソー社製)、865−CO(JASCO社製)、カラム:Shodex(GSM−700又はOHpak SB-802.5 HQ)、移動相:0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.0)、標準物質:ポリエチレングリコール、検出:視差屈折率計RI−8020(東ソー社製)、重量平均分子量(Mw)の算出:分子量計プログラム(SC−8020用GPCプログラム)、流速1.0ml/分、カラム温度:40℃、試料溶液注入量:100μL、測定時間:30分間。
有機元素分析(2400II−CHNS/iアナライザー、パーキンエルマー社製)を使用して測定した。
合成例1
MPCとSMAを、仕込みモル比で、MPC/SMA=8/2とし、以下のようにしてMPC−SMA共重合体(共重合体1)を合成した。
MPCとSMAの総濃度が1.0mol/Lとなるように重合容器に秤量し、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル(AIBN)がモノマーに対して1mol%となるように加えた。なお、反応溶媒としてはエタノールを用いた。重合容器内を充分に窒素置換した後、24時間60℃に加温することにより重合反応を行なった。得られた反応混合物を氷冷した後、ジエチルエーテルに滴下することによりポリマーを沈殿させた。これを濾別し、ジエチルエーテルにて洗浄した後、減圧乾燥して白色粉末状の共重合体1を得た。
得られた共重合体1について、上記方法で重量平均分子量(ポリエチレングリコール換算)を測定した。
さらに、共重合体1中の各単量体由来部の組成比(モル比)を元素分析で分析した結果、ほぼ仕込み組成比通りであった。得られた共重合体1を5重量%となるように純水に溶解し、保存した。合成例1の共重合体の分析結果等を表1に示す。
単量体(モノマー)種、単量体のモル比を表1に示した以外は、合成例1と同様にして各共重合体を合成し、さらに各分析を行った。結果を表1に示す。
なお、いずれの共重合体も、合成例1の共重合体と同様、元素分析による共重合体中の各単量体由来部の組成比(モル比)は、ほぼ仕込み組成比通りであった。従って、表1のモル比は、対応する単量体のモル比でもある。
単量体として、MPC及びn−ブチルアクリレート(BMA)を使用し、単量体のモル比を表1に示した以外は、合成例1と同様にして比較合成例として共重合体7を合成し、さらに各分析を行った。結果を表1に示す。また、共重合体7も、元素分析による共重合体中の各単量体由来部の組成比(モル比)は、ほぼ仕込み組成比通りであった。
10体積%ウシ胎児血清(以下FBSとする)を含有したMEM培地(以下10%FBS−MEM培地)にてヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞TIG−3−20細胞(JCRB0506、以下TIG細胞とする)を37℃の5%CO2インキュベーター内で培養し、トリプシン処理と遠心分離(1000rpm、4℃、3分)にてTIG細胞を回収した。その後、血球計算盤を用いて細胞数を計算し、10%FBS−MEM培地に80,000cells/mLとなるように懸濁した。以下、この細胞懸濁液をTIG細胞懸濁液とする。なお、TIG細胞は集団倍化数(PDL)が45以下のものを使用した。
正常ヒト皮膚繊維芽細胞増殖用低血清液体培地(クラボウ社製、FibroLife(登録商標) S2 Comp kit)を用いて、正常ヒト皮膚繊維芽細胞(クラボウ社製、製品番号KF−4109)を37℃の5%CO2インキュベーター内で培養し、トリプシン処理と遠心分離(1000rpm、4℃、3分)にて正常ヒト皮膚繊維芽細胞を回収した。その後、血球計算盤を用いて細胞数を計算し、下記細胞毒性試験用繊維芽細胞用培地に80,000cells/mLとなるように懸濁した。以下、この細胞懸濁液を正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液とする。
正常ヒト皮膚繊維芽細胞用基礎培地(クラボウ社製FibroLife(登録商標) Basal Medium)にL−グルタミンを終濃度7.5mM、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を終濃度5ng/mL、インスリンを終濃度5μg/mL、アスコルビン酸を終濃度50μg/mL、FBSを終濃度2体積%となるように添加し、攪拌した。以下、これを繊維芽細胞用培地とする。
実施例1−1
以下のようにして、アラマーブルーアッセイ法による細胞毒性試験1を行い、実施例1−1の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
2mgのアンホテリシンBと、2.5重量%の共重合体1を含むダルベッコリン酸緩衝液(以下D−PBS)10gとを混合して37℃で20分間加熱した。アンホテリシンBは共重合体1を含むD−PBSに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物20μLを、上記80,000cells/mLのTIG細胞懸濁液2mLに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用96ウェルプレート(平底)に100μL/ウェルで分注し、37℃の5%CO2インキュベーターにて4日間培養した。培養4日目にアラマーブルーを10μL/ウェル加え、37℃の5%CO2インキュベーターにて3時間培養した後に蛍光強度(励起波長550nm、検出波長585nm)を測定した。結果を表2に示す。
上記したように、アラマーブルーは細胞数が多いほど蛍光強度が高くなる。従って、より高い蛍光強度を示した方が、培養された細胞数が多い、すなわち細胞毒性抑制効果が高いことを示す。
使用共重合体種及びD−PBS中の共重合体濃度を表2に示すものとした以外は実施例1−1と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験1を実施した。結果を表2に示す。
使用共重合体種及びD−PBS中の共重合体濃度を表2に示すものとした以外は実施例1−1と同様にして、アンホテリシンBと共重合体7を含む溶液組成物の調製を試みた。
しかし、共重合体7を含むD−PBSにはアンホテリシンBは溶解しなかったため、TIG細胞懸濁液に添加することができず、細胞毒性試験を実施できなかった。結果を表2に示す。
1mgのアンホテリシンBを10mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した溶液を細胞培養用組成物の代わりに使用した以外は、実施例1−1と同様にして細胞毒性試験1を実施した。結果を表2に示す。なお、比較例1−2における蛍光強度を、細胞毒性試験1での基準蛍光強度とする。
以下のようにして細胞毒性試験1を行い、実施例1−25の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
9.75mLの10体積%のウシ胎児血清を含むDMEM(以下、10%FBS−DMEMとする)に、2mgのアンホテリシンBを加え、十分に攪拌した。この溶液と0.25gの共重合体1とを混合して37℃で20分間加熱した。アンホテリシンBは共重合体1を含む10%FBS−DMEMに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物20μLを、上記80,000cells/mLのTIG細胞懸濁液2mLに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用96ウェルプレート(平底)に100μL/ウェルで分注し、37℃の5%CO2インキュベーターにて4日間培養した。培養4日目にアラマーブルーを10μL/ウェル加え、37℃の5%CO2インキュベーターにて3時間培養した後に蛍光強度(励起波長550nm、検出波長585nm)を測定した。結果を表3に示す。
共重合体1及び10%FBS−DMEMの使用量を表3に示すものとした以外は実施例1−25と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験1を実施した。結果を表3に示す。
従って、各実施例の細胞培養用組成物でTIG細胞を培養することにより、比較例1−2に比較して細胞毒性を顕著に抑制してTIG細胞を培養できることが判る。
実施例2−1
以下のようにして、アラマーブルーアッセイ法による細胞毒性試験2を行い、実施例2−1の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
15mgのハイドロコルチゾンと、2.5重量%の共重合体1を含むD−PBS10gとを混合し、37℃で20分間加熱した。ハイドロコルチゾンは共重合体1を含むD−PBSに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物4μLを、上記80,000cells/mLの正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液2mLに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用96ウェルプレート(平底)に100μL/ウェルで分注し、37℃の5%CO2インキュベーターにて4日間培養した。培養4日目にアラマーブルーを10μL/ウェル加え、37℃の5%CO2インキュベーターにて3時間培養した後に蛍光強度(励起波長550nm、検出波長585nm)を測定した。結果を表4に示す。
使用共重合体種及びD−PBS中の共重合体濃度を表4に示すものとした以外は実施例2−1と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験2を実施した。結果を表4に示す。
使用共重合体種及びD−PBS中の共重合体濃度を表2に示すものとした以外は実施例2−1と同様にして、ハイドロコルチゾンと共重合体7を含む溶液組成物の調製を試みた。
しかし、共重合体7を含むD−PBSにはハイドロコルチゾンは溶解しなかったため、正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液に添加することができず、細胞毒性試験を実施できなかった。結果を表4に示す。
7.5mgのハイドロコルチゾンを10mLのエタノール(キシダ化学株式会社製)に溶解した溶液を細胞培養用組成物の代わりに使用した以外は、実施例2−1と同様にして細胞毒性試験2を実施した。結果を表4に示す。なお、比較例2−2における蛍光強度を、細胞毒性試験2での基準蛍光強度とする。
以下のようにして細胞毒性試験2を行い、実施例2−25の細胞培養用組成物の細胞毒性抑制効果を評価した。
9.75mLの10%FBS−DMEMに、15mgのハイドロコルチゾンを加え、十分に攪拌した。この溶液と0.25gの共重合体1とを混合して37℃で20分間加熱した。ハイドロコルチゾンは共重合体1を含む10%FBS−DMEMに均一に溶解し、細胞培養用組成物が得られた。該細胞培養用組成物4μLを、上記80,000cells/mLの正常ヒト皮膚繊維芽細胞懸濁液2mLに添加し、攪拌した。この溶液を細胞培養用96ウェルプレート(平底)に100μL/ウェルで分注し、37℃の5%CO2インキュベーターにて4日間培養した。培養4日目にアラマーブルーを10μL/ウェル加え、37℃の5%CO2インキュベーターにて3時間培養した後に蛍光強度(励起波長550nm、検出波長585nm)を測定した。結果を表5に示す。
共重合体1及び10%FBS−DMEMの使用量を表5に示すものとした以外は実施例2−25と同様にして細胞培養用組成物を調製し、細胞毒性試験2を実施した。結果を表5に示す。
従って、各実施例の細胞培養用組成物で正常ヒト繊維芽細胞を培養することにより、比較例2−2に比較して細胞毒性を顕著に抑制して正常ヒト繊維芽細胞を培養できることが判る。
Claims (4)
- 共重合体(A)、共重合体(B)、又は共重合体(A)及び(B)の混合物と、難水溶性物質と、細胞培養用基礎培地と、を含有し、
前記共重合体(A)は、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとn−ステアリルメタクリレートとの共重合体であり、前記共重合体(B)は、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとn−ラウリルメタクリレートとの共重合体である、
有機溶媒を含有しない、細胞培養用組成物。 - 前記共重合体(A)及び(B)は、当該各共重合体中の2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来部の組成比がいずれも10〜90モル%である、
請求項1に記載の細胞培養用組成物。 - 前記共重合体(A)及び(B)は、その重量平均分子量がいずれも5,000〜1,000,000である、
請求項1又は2に記載の細胞培養用組成物。 - 共重合体(A)、共重合体(B)、又は共重合体(A)及び(B)の混合物と、難水溶性物質と、細胞培養用基礎培地と、を含有し、有機溶媒を含有しない細胞培養用組成物を調製する工程と、
該細胞培養用組成物を細胞培養用の培地に添加して細胞を培養する工程と、を有し、
前記共重合体(A)は、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとn−ステアリルメタクリレートとの共重合体であり、前記共重合体(B)は、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとn−ラウリルメタクリレートとの共重合体である、
細胞培養方法。
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