CN101531740A - 交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法。该方法先将壳聚糖用戊二醛进行交联，然后在交联壳聚糖表面接枝磷酰胆碱基团构建仿细胞膜结构，接枝磷酰胆碱基团反应在无水非质子性溶剂中进行，反应温度为40～80℃，二氯磷酰胆碱浓度为0.1～20mg/ml。实验结果表明，用仿细胞膜结构修饰后的表面，对蛋白质吸附和血小板黏附明显降低，血液相容性显著提高。这种仿细胞外层膜结构的改性材料，在血液净化，体内植入材料，组织工程，药物缓释及生物传感器等领域有广阔的应用前景。

Description

交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法

技术领域

本发明涉及交联壳聚糖表面仿细胞膜结构的构建和作为生物和医学材料的应用，具体涉及改性交联壳聚糖材料，属于表面科学和生物医用高分子材料技术领域。

背景技术

当生物医用材料用于体内时，材料与血液接触后会发生凝血，形成血栓；与组织接触一般会产生炎症。目前还没有一种能完全满足生物相容性要求的合成或天然医用生物材料。因而选择物理性能良好的现有材料进行生物相容性表面改性成为研究的重点。

壳聚糖作为自然界唯一大量存在的碱性多糖，是一种无毒、无污染的可再生资源，具有较好的生物相容性，且容易改性，在国际上受到广泛的关注。越来越多的研究表明：壳聚糖及其衍生物材料可以用于血液净化。壳聚糖分子上的氨基有助于对血液中多种毒素的吸附，可以用于血液灌流材料(王虹等.高等学校化学学报2002，23(1)，75～77；Chandy T.et al Journalof Microencapsulation 1993，10(4)，475～486.)。壳聚糖膜具有高的透析率，选择性和强度，可以用作血液透析材料(Qurashi M.T.et al Journal ofApplied Polymer Science 1992，46,255-261；263-269)。虽然壳聚糖及其衍生物作为血液净化材料具有许多优点，但是也存在着蛋白质吸附，血小板黏附，最终导致凝血，形成血栓等问题，所以进一步提高壳聚糖及其衍生物材料的抗凝血性，降低对蛋白质的吸附，血小板的黏附，提高血液相容性迫在眉睫(Zhu A.P.et al Applied Surface Science 2005，241，485～492；Johan Benesch et al Biomaterials 2002，23，2561～2568；Wang X.H.et alBiomaterials 2003，24，3213～3220.)。

磷酰胆碱(Phosphorycholine，PC)是生物细胞外层膜的主要成份，是细胞外层膜中的外层官能团，是组成细胞膜基本单元卵磷脂的亲水端基。从结构来看，磷酰胆碱带有两性离子端基，即同时带有正、负两种电荷，因而具有很强的结合水的能力。这种性质使富含磷酰胆碱基团的材料表面不易吸附及沉集蛋白质、脂质体等生物体成分，表现出良好的生物相容性。近年来的研究表明，用磷酰胆碱基团及其聚合物对生物材料表面进行仿细胞膜结构的修饰，可以提高材料的生物相容性，明显降低对蛋白质的吸附，血小板的黏附，显著提高血液相容性。总之，在交联壳聚糖表面上，利用磷酰胆碱基团构建仿细胞膜的方法改性交联壳聚糖，具有重要的学术意义和巨大的应用市场。

Qurashi M.T.等人为了提高壳聚糖的生物容性，采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和壳聚糖共混，研究了血液中尿素，尿酸等的透过率(Qurashi M.T.et al Journal of Applied Polymer Science 1992，46，255-261；263-269)。伴随着科研人员对壳聚糖的研究日益深入，用磷酰胆碱基团在壳聚糖表面构建仿细胞膜结构，可以降低对蛋白质的吸附，血小板的黏附，提高血液相容性成为了研究的重点。Sheng Meng等人用2-氯-2-氧代-1，3，2-二氧磷杂环戊烷(COP，沸点为98℃/120Pa)先接枝在壳聚糖上，然后在高压反应条件下，用三甲胺开环制备具有仿细胞膜结构的壳聚糖(Sheng M.et alCarbohydrate Polymers 2007，70，82-88)。加拿大的科研小组采用含有醛基磷酰胆碱，接枝改性获得了水溶性壳聚糖(Kujawa P.et alBiomacromolecules 2007，8(10)，3169-3176；Tiera M.J.et alBiomacromolecules 2006，7(11)，3151-3156)，研究了细胞在含有改性壳聚糖材料表面上增长情况。Zhu A.P.等人在苯甲酸壳聚糖接枝磷酰胆碱基团，壳聚糖上接枝甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱，并进一步研究了细胞，蛋白在其表面的黏附和吸附行为(Zhu A.P.et al Journal of Applied Polymer Science2003，88(2)，489-493；Zhu A.P.et al Polymer International 2003，52(1)，81-85；Zhu A.P.et al Journal of biomaterials science.Polymer edition 2002，13(5)，501-510)。孟晟等人用缩合反应得到了一种磷脂基团修饰的多糖或其衍生物(ZL 200410054022.2)。林思聪等人用含羟基的磷酰胆碱对表面含有异氰酸酯基团的生物材料进行了改性(ZL 02113066.3)。

如上所述，改性后的壳聚糖可以明显改善其生物相容性。要达到理想的生物相容性，材料表面的磷酰胆碱基团密度必须接近细胞膜外层磷酰胆碱基团的密度。但目前的改性壳聚糖表面的磷酰胆碱基团密度较低，当密度较高时与体液接触存在溶解现象，因而限制了其应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，以改善现有技术溶解性能。

本发明的实现过程：

一种在交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，先将壳聚糖用戊二醛进行交联，然后在交联壳聚糖表面接枝磷酰胆碱基团构建仿细胞膜结构。使用带有磷酰胆碱两性离子基团的二氯磷酰胆碱对交联壳聚糖及其衍生物材料表面进行仿细胞外层膜结构的接枝修饰。二氯磷酰胆碱分子中的活泼氯可与壳聚糖单元中的氨基及羟基反应得到高表面密度的磷酰胆碱基团，在材料表面形成仿细胞外层膜结构。

接枝反应在无水非质子性溶剂中进行，反应温度为40～80℃，二氯磷酰胆碱浓度为0.1～20mg/mL，所述的无水非质子性溶剂为四氢呋喃、氯仿、甲苯、二甲苯或其混合溶剂。

接枝反应在碱性催化剂三乙胺或吡啶类化合物的协同作用下进行。

交联壳聚糖是颗粒状、膜状或附着在固体材料表面的涂层。

戊二醛与壳聚糖在水溶液中进行交联壳聚糖制备反应，戊二醛与壳聚糖的质量比为0.2％-20％。

具体的讲，交联壳聚糖的制备方法如下：用醋酸溶解壳聚糖，得到0.1～0.8wt％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液过滤后静置脱泡，加入的5％的戊二醛进行交联，得到淡黄色交联壳聚糖溶液，将交联壳聚糖制成颗粒状、膜状或附着在固体材料表面的涂层，用氢氧化钠溶液浸泡交联壳聚糖，之后用二次蒸馏水充分水洗，直到洗涤水的电导率与蒸馏水相当为止，即得到戊二醛交联壳聚糖。

壳聚糖表面接枝磷酰胆碱方法如下：用无水三氯甲烷溶解二氯磷酰胆碱，将交联壳聚糖浸入二氯磷酰胆碱溶液中，加入三乙胺作为催化剂，40～80℃下反应3～12h。

本发明的优点与积极效果：本发明的制备过程简单，原料易得，表面接枝密度可调。交联处理不仅使含大量亲水基团的材料不溶于水，而且提高了仿细胞膜结构表面的稳定性。这种接枝密度高，结构稳定的仿细胞膜表面可显著抑制蛋白质吸附和血小板粘附，可阻止或大大延缓免疫系统激活及血栓形成。本发明在人造心血管涂层材料，血液净化装置，新型药物控释材料，组织工程及基因治疗等领域有明显的应用前景。

具体实施方式

二氯磷酰胆碱按文献报道方法制备(Durrani A.A，et al Biomaterials1986，7，121-125；杨珊等西北大学学报(自然科学版)2008，3)。采用氯化胆碱与三氯氧磷在无水条件下一步合成得到。

交联壳聚糖膜和二氯磷酰胆碱接枝交联壳聚糖膜的化学组成用傅立叶衰减全反射红外光谱及X射线光电子能谱(XPS)测量。改性前后表面的亲疏水性用DCAT21型表面张力仪测定水接触角来衡量。磷酰胆碱接枝交联壳聚糖膜的前进角从接枝前的72.6±1.5°降低到50.6±1.1°，后退角由15.1±1.5°降低到9.6±2.2°。这种动态接触角的显著降低说明磷酰胆碱基团被成功引入到交联壳聚糖膜表面。XPS测定结果显示，接枝后出现磷元素含量也说明磷酰胆碱基团被键合在壳聚糖表面。对氮元素不同价态分析推测，磷酰胆碱基团的表面为含量为28～56％。

交联壳聚糖膜的制备：用1％(v/v)的醋酸溶解壳聚糖，得到0.1～0.8wt％的壳聚糖溶液。将上述的壳聚糖溶液过滤后静置脱泡，加入5％的戊二醛进行交联。室温下搅拌过夜，得到淡黄色交联壳聚糖溶液。将清洗干净的载玻片竖直浸入交联壳聚糖溶液中，待交联壳聚糖溶液浸没载玻片之后，轻轻将载玻片提出。将铺有交联壳聚糖膜的载玻片在室温下晾干。用0.5wt％的氢氧化钠溶液浸泡交联壳聚糖膜片1.5h，之后用二次蒸馏水充分水洗，直到洗涤水的电导率与蒸馏水相当为止，最后30℃真空干燥。

二氯磷酰胆碱接枝交联壳聚糖膜：用无水三氯甲烷溶解二氯磷酰胆碱，将交联壳聚糖膜片小心、竖直浸入二氯磷酰胆碱溶液中，加入无水三乙胺作为催化剂，40～80℃下反应3～12h。反应结束后将样片取出，待表面上的溶剂挥发之后，用蒸馏水小心淋洗，30℃真空干燥得到二氯磷酰胆碱接枝改性交联壳聚糖膜。

蛋白质吸附实验参照文献(Biomacromolecules，2004，5(6)：2238～2246)方法进行。分别用缓冲液(pH＝7.4)溶解一定量的牛血清白蛋白(BSA)和纤维蛋白原(Fg)，得到一定浓度的蛋白溶液。将样品在PBS缓冲溶液中平衡1h，小心的将样品表面的缓冲液擦拭干净，之后将样品转移到吸附容器中，加入一定量的BSA和Fg蛋白溶液，37℃孵育2h。孵育结束后，采用微量BCA法计算出吸附液中蛋白的浓度。样品表面吸附的蛋白含量通过蛋白吸附液浓度的变化来确定。

血小板黏附实验参照Chen等人(Biomaterials，2007，28：1752～1760)方法进行。按体积比9:1在新鲜血液中，加入3.8wt％的柠檬酸三钠盐溶液作为抗凝剂，以1000r/min离心10min，溶液分层，上层淡黄色清液为富含血小板血浆(PRP)。血小板黏附实验在静态条件下进行。将样品放置在干净的培养皿中，用40μl的富含血小板血浆(PRP)滴在样品表面上，37℃孵育2h后，用PBS缓冲液(pH＝7.4)小心冲洗样品表面，将黏附不牢的血小板洗去之后用2.5wt％的戊二醛浸泡1h进行固定，之后用PBS缓冲溶液和蒸馏水冲洗。再将样品用考马斯亮蓝溶液浸泡0.5h进行染色，之后用蒸馏水进行漂洗，在室温下干燥后放置于IBE-2003型荧光倒置显微镜下观察并拍照。

实施例1：

将0.5g壳聚糖溶于100mL 1％醋酸水溶液中，室温条件下搅拌20小时，然后再用砂心漏斗过滤，静置消除气泡。取过滤后的溶液50mL，加入5％戊二醛50μL，室温条件下搅拌8小时，涂覆于干净的玻璃片上，室温条件下晾置24小时。将晾干的壳聚糖膜放置于0.1％的氢氧化钠的溶液浸泡0.5小时，然后再用蒸馏水浸泡40小时。最后30℃真空干燥8小时，即可得到交联壳聚糖膜。

实施例2：

将1g壳聚糖溶于100mL，2％醋酸水溶液中，室温条件下搅拌20小时，然后再用砂心漏斗过滤，静置消除气泡，待用。将100mL四氯化碳100mL石油醚10mL span-80加入到500mL三颈瓶中，转速设置700，室温条件下搅拌0.5小时，然后再将加入上述的壳聚糖溶液搅拌0.5小时，接着加入5％戊二醛2mL反应1.5小时，再用10％氢氧化钠调节pH＝8-9，然后40℃反应3小时，60℃反应4小时。最后50℃真空干燥6小时，即可得到交联壳聚糖颗粒。

实施例3：

取用实施例1制备的交联壳聚糖膜5片，浸泡于2mg/mL二氯磷酰胆碱无水氯仿溶液100mL中，三乙胺催化，65℃条件下反应4小时，再用蒸馏水冲洗，然后30℃真空干燥，即可得到改性的交联壳聚糖膜。

实施例4：

取用实施例1制备的交联壳聚糖膜5片，浸泡于100mL，0.2mg/mL的二氯磷酰胆碱无水氯仿溶液中，三乙胺催化，45℃条件下反应8小时，用蒸馏水冲洗，然后30℃真空干燥，即可得到改性的交联壳聚糖膜。

实施例5：

取用实施例2制备的交联壳聚糖颗粒0.5g，浸泡于120mL，12mg/mL的二氯磷酰胆碱在无水氯仿与二甲苯溶液中，吡啶催化，73℃条件下反应2小时，再用蒸馏水冲洗，然后30℃真空干燥，即可得到改性的交联壳聚糖颗粒。

Claims (8)

1、一种在交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：先将壳聚糖用戊二醛进行交联，然后在交联壳聚糖表面接枝磷酰胆碱基团构建仿细胞膜结构。

2、根据权利要求1所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：接枝磷酰胆碱基团反应在无水非质子性溶剂中进行，反应温度为40～80℃，二氯磷酰胆碱浓度为0.1～20mg/mL。

3、根据权利要求2所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：无水非质子性溶剂为四氢呋喃、氯仿、甲苯、二甲苯或其混合溶剂。

4、根据权利要求1所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：接枝磷酰胆碱基团反应在碱性催化剂三乙胺或吡啶类化合物的协同作用下进行。

5、根据权利要求1所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：交联壳聚糖是颗粒状、膜状或附着在固体材料表面的涂层。

6、根据权利要求1所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：戊二醛与壳聚糖在水溶液中进行交联壳聚糖制备反应，戊二醛与壳聚糖的质量比为0.2％-20％。

7、根据权利要求1或6所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：用醋酸溶解壳聚糖，得到0.1～0.8wt％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液过滤后静置脱泡，加入的5％的戊二醛进行交联，得到淡黄色交联壳聚糖溶液，将交联壳聚糖制成颗粒状、膜状或涂层，用氢氧化钠溶液浸泡交联壳聚糖，之后用二次蒸馏水充分水洗，直到洗涤水的电导率与蒸馏水相当为止，即得到戊二醛交联壳聚糖。

8、根据权利要求1至6任意之一所述的交联壳聚糖表面构建仿细胞外层膜结构的方法，其特征在于：接枝磷酰胆碱基团反应用无水三氯甲烷溶解二氯磷酰胆碱，将交联壳聚糖浸入二氯磷酰胆碱溶液中，加入三乙胺作为催化剂，40～80℃下反应3～12h。