CN102210890A - 用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料及其制备方法。该涂层包含载药的聚合物基底层和固定生物活性分子的聚合物外层，基底层材料由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体通过自由基共聚得到，接着聚合物溶液与药物溶液共混构建支架的基底层；外层聚合物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体、含疏水功能基团的可聚合单体、以及含可反应活性功能基团的可聚合单体通过自由基共聚合得到，然后通过表面固定的方法引入促进内皮细胞粘附的生物活性分子，使涂层具有内皮细胞选择性。这种用于心血管支架涂层的复合涂层材料可以保持支架表面的非特异性阻抗性能，同时实现体内原位内皮细胞捕获能力，且得到的涂层结构稳定，能适应人体的内环境，在心血管再狭窄、癌症等方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料及其制备方法，所属技术领域为材料、生物、物理、化学等学科的交叉学科领域。
背景技术
药物洗脱支架的广泛使用，为高效、微创地治疗心血管疾病提供了良好的手段。然而药物洗脱支架自身携带的药物在治疗由平滑肌细胞过度增生引起的再狭窄的同时，它们也会降低内皮细胞的迁移与增殖能力，使血管内皮层遭到破坏，增加了晚期血栓的风险。由药物非选择性抑制效应引起的内皮化延迟和晚期血栓依然是制约其应用的关键问题。为了解决这一关键问题，人们进行了一系列尝试。
血管内皮化程度与支架植入后血管再狭窄有着密切的联系，因此基于内皮化的研究已经成为心血管植入材料预防再狭窄的新策略。由于人体内细胞环境的多样性，如何构建具有内皮细胞选择性的功能界面，是实现支架表面血管内皮原位再生的关键科学问题。通过功能界面材料实现生物活性分子的固定，原位增强内皮细胞的选择性黏附和竞争性生长，实现血管内皮在植入部位的原位快速愈合，是解决心血管植入材料生物相容性的重要途径之一。将生物活性分子的内皮选择性与雷帕霉素药物的抗增生性能结合起来，可以构建一种新型的复合功能涂层。这种兼具药物洗脱支架和原位内皮化支架优势的新型功能涂层可以同时发挥药物洗脱支架的抗再狭窄作用以及内皮化支架的促进原位内皮化作用。与传统的药物洗脱支架相比，这种方法可以在体内迅速原位捕获循环血液中的内皮细胞，形成快速内皮化的过程；同时抑制平滑肌细胞的生长，避免了血栓、再狭窄等不良反应的产生。
发明内容
本发明的目的是克服现有药物洗脱支架技术的不足，提供一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料及其制备方法。
用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料包括载药的聚合物基底层和固定生物活性分子的聚合物外层；所述的载药聚合物基底层由二元聚合物与药物组成，其中二元聚合物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体通过自由基共聚得到；所述的固定生物活性分子的聚合物外层由三元共聚物与生物活性分子组成，其中三元共聚物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体、含疏水功能基团的可聚合单体、以及含可反应活性功能基团的可聚合单体通过自由基共聚合得到；
所述的基底层中所载药物包括西罗莫司、依维莫司、派尔莫司、佐他莫司、他克莫司、吡美莫司、紫杉醇，单体结构如下：
所述的外层中所结合的生物活性分子包括含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的RGD多肽，含精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸序列的REDV多肽，含环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的cRGD环肽，CD34抗体，CD133抗体。
所述的基底层二元聚合物中所含细胞膜仿生结构的生物相容性单体选自如下单体：
其中
所述的基底层二元聚合物中含疏水功能基团的可聚合单体如下：
所述的外层三元共聚物中所含细胞膜仿生结构的生物相容性单体选自如下单体：
其中
所述的外层三元共聚物中所含疏水功能基团的可聚合单体如下：
所述的外层三元共聚物中所含可反应活性功能基团的可聚合单体如下：
n＝1～10
用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的制备方法，包括基底层的制备方法和外层的制备方法，其中，
基底层的制备方法的步骤如下：
1)将质量比为1∶0.1～1∶10的细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体溶解在10～100mL溶剂中，获得溶液A，其中溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、异丙醇、乙醇或甲醇；
2)将细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体总质量的0.2％～2％的自由基引发剂偶氮二异丁腈，加入到溶液A中，得到溶液B；
3)用氮气或者氩气对溶液B除氧5～30分钟，加热到50～90度，反应6～48小时；
4)减压除溶剂，冰乙醚或冰甲醇沉析2～3次，得到心血管支架基底层聚合物；
5)将质量比1∶0.1～1∶10的心血管支架基底层聚合物与药物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.01～5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C；
6)将聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架依次用丙酮、甲醇、三蒸水超声预处理10～30分钟；或者用体积比为7∶3的浓硫酸和双氧水热预处理30～60分钟，三蒸水冲洗；
7)将溶液C涂覆在预处理过的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层D；
外层的制备方法的步骤如下：
8)将细胞膜仿生结构的生物相容性单体、疏水功能基团的可聚合单体和可反应活性功能基团的可聚合单体按照质量比1∶0.1∶0.1～1∶10∶10的比例溶解在10～200mL溶剂中，获得溶液A1，其中溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、异丙醇、乙醇或甲醇；
9)按照步骤8)中三种单体总质量的0.2％～2％称取自由基引发剂偶氮二异丁腈，加入到溶液A1中，得到溶液B1；
10)用氮气或者氩气对溶液B1除氧5～30分钟，加热到50～90度，反应6～48小时；
11)减压除溶剂，用冰乙醚或冰甲醇沉析2～3次，得到心血管支架外层聚合物；
12)将步骤11)中心血管支架外层聚合物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.01～5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C1；
13)将溶液C1涂覆在含有基底层D的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层E；
14)将已涂覆聚合物外层E的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面用氮气吹干后，浸入质量百分比浓度为0.01～0.5％生物活性分子的磷酸盐缓冲液，在4～25℃下反应24～72h，用赖氨酸的PBS溶液封端，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是：
1)合成的聚合物性能良好，有利于药物的负载和生物分子的固定
2)复合涂层中底层的药物控释可以高效快速抑制平滑肌细胞的生长，防止再狭窄和血栓发生；顶层的生物功能涂层不仅可有效调控药物的释放速率，而且可同时诱导内皮细胞的快速生长，实现支架表面内皮化功能；
3)复合涂层中药物和生物分子的协同作用可以有效防止再狭窄和血栓发生同时促进表面内皮化的形成，对现有药物洗脱支架的内皮化不足进行很好的改进；
4)制备的复合涂层适用范围广泛，该复合涂层既可以用于不锈钢支架表面的修饰，也可以用于人工血管和聚对苯二甲酸乙二醇酯表面的修饰。
附图说明
图1(a)是聚合物外层为MPC-SMA-MEONP(n＝10)的复合涂层结构示意图。
图1(b)是聚合物外层为PEGAA(n＝10)-BMA-MEONP(n＝10)的复合涂层结构示意图。
图2(a)是基底层MPC-BMA与聚合物外层MPC-BMA-MEONP(n＝6)的核磁结构谱图。
图2(b)是基底层PEGMA-BMA与聚合物外层PEGMA-BMA-MEONP(n＝1)的核磁结构谱图。
图3(a)是MPC-SMA基底层与MPC-SMA-MEONP(n＝6)聚合物外层的药物释放曲线
图3(b)是PEGMA-BMA基底层与PEGMA-BMA-MEONP(n＝1)聚合物外层的药物释放曲线
图4(a)是空白参照表面内皮细胞和平滑肌细胞增殖比率结果。
图4(b)是无药物三元共聚物参照涂层内皮细胞和平滑肌细胞增殖比率结果。
图4(c)是含MPC-SMA-MEONP(n＝6)三元共聚物载雷帕霉素涂层内皮细胞和平滑肌细胞共培养结果。
图4(d)是含PEGMA-BMA-MEONP(n＝1)三元共聚物载雷帕霉素涂层涂层内皮细胞和平滑肌细胞共培养结果。
具体实施方式
本发明公开了一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料及其制备方法。该涂层包含载药的聚合物基底层和固定生物活性分子的聚合物外层，基底层材料由细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体通过自由基共聚合得到，接着聚合物溶液与药物溶液共混构建支架的基底层；外层聚合物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体、含疏水功能基团的可聚合单体、以及含可反应活性功能基团的可聚合单体自由基共聚合得到，然后通过表面固定的方法引入促进内皮细胞粘附的生物活性分子，使涂层具有内皮细胞选择性。这种用于心血管支架涂层材料可以保持支架表面的非特异性阻抗性能，同时实现体内原位内皮细胞捕获能力，且得到的涂层结构稳定，能适应人体的内环境，在心血管再狭窄、癌症等方面具有良好的应用前景。
用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料包括载药的聚合物基底层和固定生物活性分子的聚合物外层；所述的载药聚合物基底层由二元聚合物与药物组成，其中二元聚合物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体通过自由基共聚得到；所述的固定生物活性分子的聚合物外层由三元共聚物与生物活性分子组成，其中三元共聚物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体、含疏水功能基团的可聚合单体、以及含可反应活性功能基团的可聚合单体通过自由基共聚合得到；
所述的基底层中所载药物包括西罗莫司、依维莫司、派尔莫司、佐他莫司、他克莫司、吡美莫司、紫杉醇，单体结构如下：
所述的外层中所结合的生物活性分子包括含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的RGD多肽，含精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸序列的REDV多肽，含环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的cRGD环肽，CD34抗体，CD133抗体。
所述的基底层二元聚合物中所含细胞膜仿生结构的生物相容性单体选自如下单体：
其中
所述的基底层二元聚合物中含疏水功能基团的可聚合单体如下：
其中
所述的外层三元共聚物中所含细胞膜仿生结构的生物相容性单体选自如下单体：
其中
所述的外层三元共聚物中所含疏水功能基团的可聚合单体如下：
所述的外层三元共聚物中所含可反应活性功能基团的可聚合单体如下：
n＝1～10
用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的制备方法，包括基底层的制备方法和外层的制备方法，其中，
基底层的制备方法的步骤如下：
1)将质量比为1∶0.1～1∶10的细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体溶解在10～100mL溶剂中，获得溶液A，其中溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、异丙醇、乙醇或甲醇；
2)将细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体总质量的0.2％～2％的自由基引发剂偶氮二异丁腈，加入到溶液A中，得到溶液B；
3)用氮气或者氩气对溶液B除氧5～30分钟，加热到50～90度，反应6～48小时；
4)减压除溶剂，冰乙醚或冰甲醇沉析2～3次，得到心血管支架基底层聚合物；
5)将质量比1∶0.1～1∶10的心血管支架基底层聚合物与药物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.01～5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C；
6)将聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架依次用丙酮、甲醇、三蒸水超声预处理10～30分钟；或者用体积比为7∶3的浓硫酸和双氧水热预处理30～60分钟，三蒸水冲洗；
7)将溶液C涂覆在预处理过的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层D；
外层的制备方法的步骤如下：
8)将细胞膜仿生结构的生物相容性单体、疏水功能基团的可聚合单体和可反应活性功能基团的可聚合单体按照质量比1∶0.1∶0.1～1∶10∶10的比例溶解在10～200mL溶剂中，获得溶液A1，其中溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、异丙醇、乙醇或甲醇；
9)按照步骤8)中三种单体总质量的0.2％～2％称取自由基引发剂偶氮二异丁腈，加入到溶液A1中，得到溶液B1；
10)用氮气或者氩气对溶液B1除氧5～30分钟，加热到50～90度，反应6～48小时；
11)减压除溶剂，用冰乙醚或冰甲醇沉析2～3次，得到心血管支架外层聚合物；
12)将步骤11)中心血管支架外层聚合物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.01～5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C1；
13)将溶液C1涂覆在含有基底层D的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层E；
14)将已涂覆聚合物外层E的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面用氮气吹干后，浸入质量百分比浓度为0.01～0.5％生物活性分子的磷酸盐缓冲液，在4～25℃下反应24～72h，用赖氨酸的PBS溶液封端，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
实施例1
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
1)将0.5g细胞膜仿生结构的生物相容性单体MPC、1.5g疏水功能基团的可聚合单体SMA用30ml乙醇溶解，得到溶液A；
2)将0.04g引发剂AIBN加入到溶液A中，得到溶液B；
3)用氩气对溶液B除氧30分钟，加热到60℃，反应24小时；
4)减压除溶剂，冰甲醇沉析2次，得到心血管支架基底层聚合物；
5)将质量比为1∶0.5的心血管支架基底层聚合物与雷帕霉素药物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C；
6)将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜片依次用丙酮、甲醇、三蒸水超声预处理10分钟，三蒸水清洗，氮气吹干保存；
7)将溶液C涂覆在预处理过的PET表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层D；
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
8)将0.6g细胞膜仿生结构的生物相容性单体MPC、1.8g疏水功能基团的可聚合单体SMA和0.8g可反应活性功能基团的可聚合单体MEONP(n＝10)溶解在30mL乙醇溶剂中，获得溶液A1；
9)按照步骤8)中三种单体总质量的0.2％称取自由基引发剂偶氮二异丁腈AIBN，加入到溶液A1中，得到溶液B1；
10)用氩气对溶液B1除氧25分钟，加热到70度，反应30小时；
11)减压除溶剂，用冰甲醇沉析3次，得到心血管支架外层聚合物；
12)将步骤11)中心血管支架外层聚合物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.05％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C1；
13)将溶液C1涂覆在含有基底层D的PET膜片表面，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层E；
14)将已涂覆聚合物外层E的PET膜用氮气吹干后，浸入质量百分比浓度为0.01％的REDV的磷酸盐缓冲液中，在4℃下反应24h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端，三蒸水清洗膜片，氮气吹干，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，如图1(a)所示。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得雷帕霉素药物的标准吸收曲线。然后将载药涂层以及参照℃涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的雷帕霉素的量；
复合涂层材料的药物释放曲线如图3(a)所示。
(4)细胞选择性评价
将聚合物膜片移入超净台，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化、离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，实验结果如图4(c)所示，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.28。
实施例2
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
1)将0.5g细胞膜仿生结构的生物相容性单体MPC、0.8ml疏水功能基团的可聚合单体BMA用15ml四氢呋喃溶解，得到溶液A；
2)将0.02g引发剂AIBN加入到溶液A中，得到溶液B；
3)用氮气对溶液B除氧30分钟，加热到65℃，反应30小时；
4)减压除溶剂，冰乙醚沉析2次，得到心血管支架基底层聚合物；核磁结果证实所获得的产物具有预期结构，如图2(a)所示；
5)将质量比为1∶0.8的心血管支架基底层聚合物与紫杉醇药物(Paclitaxel)溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.7％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C；
6)将聚四氟乙烯(PTFE)膜片用H2SO4/H2O2＝7∶3(V/V)浸泡，在80℃下，加热处理30min；用三蒸水充分冲洗，氮气吹干，保存备用。
7)将溶液C涂覆在预处理过的PTFE表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层D；
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
8)将0.7g细胞膜仿生结构的生物相容性单体MPC、0.9ml疏水功能基团的可聚合单体BMA和1.9g可反应活性功能基团的可聚合单体MEONP(n＝6)溶解在30mL乙醇溶剂中，获得溶液A1；
9)按照步骤8)中三种单体总质量的1.4％称取自由基引发剂偶氮二异丁腈AIBN，加入到溶液A1中，得到溶液B1；
10)用氩气对溶液B1除氧30分钟，加热到70度，反应48小时；
11)减压除溶剂，用冰乙醚沉析3次，得到心血管支架外层聚合物；核磁结果证实产物具有预期结构，如图2(a)所示；
12)将步骤11)中心血管支架外层聚合物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.1％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C1；
13)将溶液C1涂覆在含有基底层D的PTFE膜片表面，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层E；
14)将已涂覆聚合物外层E的PET膜用氮气吹干后，浸入质量百分比浓度为0.05％的RGD的磷酸盐缓冲液中，在4℃下反应48h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端，三蒸水清洗膜片，氮气吹干，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得紫杉醇药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的紫杉醇的量；
(4)细胞选择性评价
将PTFE膜片放入48孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化，离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为3.98。
实施例3
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
在50mL聚合管中，加入1g PEGMA(n＝6)、2ml BMA和0.04g引发剂AIBN，用40ml异丙醇溶解。液氮冷冻至固体，抽真空30min，然后鼓入氩气除氧；重复以上步骤三次，酒精喷灯封管，放入65℃油浴中搅拌反应30h。反应完毕后转移聚合溶液至100ml单口烧瓶中，减压旋转蒸发除去溶剂，然后用冰乙醚沉析抽滤，复用四氢呋喃溶解，重复旋转蒸发、沉析和抽滤步骤三次。最后得到白色固体P(EG)6B，放入真空烘箱干燥。核磁结果证实所获得的产物具有预期结构，如图2(b)所示。
将直径14mm大小的圆形不锈钢片用H2SO4/H2O2＝7∶3(V/V)浸泡，在80℃下，加热处理60min；用三蒸水充分冲洗、干燥，保存备用。在50ml烧杯中配制P(EG)6B聚合物浓度为1％的四氢呋喃溶液，按照质量比1∶0.4(聚合物∶药物)加入他克莫司(Tacrolimus)，溶解均匀。将溶液在不锈钢片表面浇铸成膜，待THF挥发后，真空干燥。
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
在50mL聚合管中，加入0.7g PEGMA、0.9ml BMA、1.9g MEONP(n＝1)和0.02g引发剂AIBN，用30ml乙醇溶解。采用与(1)相同方法制备得到淡黄色固体P(EG)6BN，真空烘箱干燥。核磁结果证实产物具有预期结构，如图2(b)。
在50ml烧杯中配制P(EG)6BN聚合物浓度为2％的四氢呋喃溶液，在已涂覆P(EG)6B涂层的不锈钢片表面浇铸成膜，待THF挥发后，真空干燥。将膜片浸泡在配制好的CD34溶液(PBS，0.1％)中，4℃条件下反应36h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端。三蒸水清洗膜片，氮气吹干，干燥保存备用，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得他克莫司药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的他克莫司的量；
复合涂层材料的药物释放曲线如图3(b)所示。
(4)细胞选择性评价
将圆形不锈钢片放入24孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化，离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，实验结果如图4(d)所示，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.22。
实施例4
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
在50mL聚合管中，加入2.5g PEGMA(n＝23)、1.0g SMA和0.05g引发剂AIBN，用40ml异丙醇/四氢呋喃混合溶剂溶解。液氮冷冻至固体，抽真空30min，然后鼓入氩气除氧；重复以上步骤三次，酒精喷灯封管，放入60℃油浴中搅拌反应48h。反应完毕后转移聚合溶液至100ml单口烧瓶中，减压旋转蒸发除去溶剂，然后用冰乙醚沉析抽滤，复用四氢呋喃溶解，重复旋转蒸发、沉析和抽滤步骤三次。最后得到白色固体P(EG)23S，放入真空烘箱干燥。核磁结果证实所获得的产物具有预期结构。
将不锈钢支架用H2SO4/H2O2＝7∶3(V/V)浸泡，在80℃下，加热处理40min；
用三蒸水充分冲洗，干燥，保存备用。在50ml烧杯中配制P(EG)238聚合物浓度为0.3％的四氢呋喃溶液，按照质量比1∶0.6(聚合物∶药物)加入依维莫司(Everolimus)，溶解均匀。将溶液在不锈钢支架表面浸涂成膜，待THF挥发后，重复以上操作6次，真空干燥。
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
在50mL聚合管中，加入2.2g PEGMA(n＝23)、0.7g SMA、1.2g MEONP(n＝6)和0.06g引发剂AIBN，用30ml乙醇溶解。采用与(1)相同方法制备得到淡黄色固体P(EG)23SN，真空烘箱干燥。核磁结果证实产物具有预期结构。
在50ml烧杯中配制P(EG)23SN聚合物浓度为1％的四氢呋喃溶液，在已涂覆P(EG)23S涂层的不锈钢支架表面成膜，待THF挥发后，真空干燥。将膜片浸泡在配制好的cRGD溶液(PBS，0.25％)中，4℃条件下反应36h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端。三蒸水清洗膜片，氮气吹干，干燥保存备用，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得依维莫司药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的依维莫司的量；
(4)细胞选择性评价
将不锈钢支架放入24孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化、离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.04。
实施例5
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
在30mL聚合管中，加入1gPEGAA(n＝10)、0.5ml BMA和0.01g引发剂AIBN，用20ml甲醇/乙醇混合溶剂溶解。液氮冷冻至固体，抽真空25min，然后鼓入氩气除氧；重复以上步骤三次，酒精喷灯封管，放入70℃油浴中搅拌反应40h。反应完毕后转移聚合溶液至100ml单口烧瓶中，减压旋转蒸发除去溶剂，然后用冰乙醚沉析抽滤，复用四氢呋喃溶解，重复旋转蒸发、沉析和抽滤步骤三次。最后得到白色固体P(EG)10B，放入真空烘箱干燥。核磁结果证实所获得的产物具有预期结构。
将PET膜片依次在丙酮、甲醇、三蒸水中超声10min，最后三蒸水清洗，氮气吹干保存。在50ml烧杯中配制P(EG)10B聚合物浓度为0.6％的四氢呋喃溶液，按照质量比1∶0.3(聚合物∶药物)加入派尔莫司(Biolimus)，溶解均匀。将溶液在PET膜片表面浇铸成膜，待THF挥发后，真空干燥。
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
在50mL聚合管中，加入1.5g PEGAA(n＝10)、0.9ml BMA、0.8g MEONP(n＝10)和0.045g引发剂AIBN，用40ml乙醇溶解。采用与(1)相同方法制备得到淡黄色固体P(EG)10BN，真空烘箱干燥。核磁结果证实产物具有预期结构。
在50ml烧杯中配制P(EG)10BN聚合物浓度为0.1％的四氢呋喃溶液，在已涂覆P(EG)10B涂层的PET膜片表面浇铸成膜，待THF挥发后，真空干燥。将膜片浸泡在配制好的RGD溶液(PBS，0.3％)中，7℃条件下反应36h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端。三蒸水清洗膜片，氮气吹干，干燥保存备用，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，结构如图1(b)所示。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得派尔莫司药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的派尔莫司的量；
(4)细胞选择性评价
将PET膜片放入48孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化、离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.77。
实施例6
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
在100mL聚合管中，加入2g SBMA、8g PLAMA和0.03g引发剂AIBN，用60ml甲苯溶解。液氮冷冻至固体，抽真空40min，然后鼓入氩气除氧；重复以上步骤三次，酒精喷灯封管，放入75℃油浴中搅拌反应36h。反应完毕后转移聚合溶液至100ml单口烧瓶中，减压旋转蒸发除去溶剂，然后用冰乙醚沉析抽滤，复用四氢呋喃溶解，重复旋转蒸发、沉析和抽滤步骤三次。最后得到白色固体，放入真空烘箱干燥。核磁结果证实所获得产物具有预期结构。
将不锈钢支架用H2SO4/H2O2＝7∶3(V/V)浸泡，在80℃下，加热处理45min；用三蒸水充分冲洗、干燥，保存备用。在50ml烧杯中配制聚合物浓度为0.3％的四氢呋喃溶液，按照质量比1∶0.9(聚合物∶药物)加入佐他莫司(Zotarlimus)，溶解均匀。将不锈钢支架垂直匀速浸入，使不锈钢支架表面均匀的涂覆共聚物，然后匀速提起，在空气中静置一段时间，待THF挥发后，重复以上操作6次，真空干燥成膜，放在真空干燥器中备用。
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
在100mL聚合管中，加入2g SBMA、8g PLAMA和0.8g MEONP(n＝6)和0.1g引发剂AIBN，用50ml乙醇溶解。采用与(1)相同方法制备得到淡黄色固体，真空烘箱干燥。核磁结果证实产物具有预期结构。
在50ml烧杯中配制上述聚合物浓度为0.7％的四氢呋喃溶液，在已涂覆涂层(1)的不锈钢支架表面成膜，待THF挥发后，真空干燥。将膜片浸泡在配制好的cRGD溶液(PBS，0.06％)中，4℃条件下反应30h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端。三蒸水清洗膜片，氮气吹干，干燥保存备用，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得佐他莫司药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的佐他莫司的量；
(4)细胞选择性评价
将不锈钢支架放入24孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化、离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.25。
实施例7
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
在50mL聚合管中，加入1g APC(n＝2)、2.5g SMA和0.038g引发剂AIBN，用25ml甲醇/四氢呋喃混合溶剂溶解。液氮冷冻至固体，抽真空20min，然后鼓入氩气除氧；重复以上步骤三次，酒精喷灯封管，放入65℃油浴中搅拌反应45h。反应完毕后转移聚合溶液至100ml单口烧瓶中，减压旋转蒸发除去溶剂，然后用冰甲醇沉析抽滤，复用四氢呋喃溶解，重复旋转蒸发、沉析和抽滤步骤三次。最后得到白色固体，放入真空烘箱干燥。核磁结果证实所获得产物具有预期结构。
将PET膜片分别在丙酮、甲醇、三蒸水中超声20min，最后三蒸水清洗，氮气吹干保存。在50ml烧杯中配制聚合物浓度为0.4％的四氢呋喃溶液，按照质量比1∶0.4(聚合物∶药物)加入吡美莫司(Pimecrolimus)，溶解均匀。将溶液在PET膜片表面浇铸成膜，待THF挥发后，真空干燥。
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
在50mL聚合管中，加入0.7g APC(n＝2)、2.2g SMA、1.1g MEONP(n＝6)和0.045g引发剂AIBN，用30ml四氢呋喃混合溶剂溶解。采用与(1)相同方法制备得到淡黄色固体，真空烘箱干燥。核磁结果证实产物具有预期结构。
在50ml烧杯中配制上述聚合物浓度为0.6％的四氢呋喃溶液，在已涂覆涂层(1)的PET膜片表面成膜，真空干燥。将膜片浸泡在配制好的CD133溶液中(PBS，0.2％)，4℃条件下反应24h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端。三蒸水清洗膜片，氮气吹干，干燥保存备用，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得吡美莫司药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的吡美莫司的量；
(4)细胞选择性评价
将PET膜片放入48孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化，离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.17。
实施例8
(1)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层
在100mL聚合管中，加入1.5g PEGMA(n＝10)、6.8g LMA和0.1g引发剂AIBN，用55ml异丙醇/四氢呋喃混合溶剂溶解。液氮冷冻至固体，抽真空35min，然后鼓入氩气除氧；重复以上步骤三次，酒精喷灯封管，放入80℃油浴中搅拌反应48h。反应完毕后转移聚合溶液至100ml单口烧瓶中，减压旋转蒸发除去溶剂，然后用冰甲醇沉析抽滤，复用四氢呋喃溶解，重复旋转蒸发、沉析和抽滤步骤三次。最后得到白色固体P(EG)10L，放入真空烘箱干燥。核磁结果证实所获得产物具有预期结构。
将PTFE膜片用H2SO4/H2O2＝7∶3(V/V)浸泡，在80℃下，加热处理30min；用三蒸水充分冲洗，干燥，保存备用。在50ml烧杯中配制P(EG)10L聚合物浓度为0.25％的四氢呋喃溶液，按照质量比1∶0.1(聚合物∶药物)加入西罗莫司(Sirolimus)，溶解均匀。将溶液在PTFE膜片表面浇铸成膜，待THF挥发后，真空干燥。
(2)制备内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层
在50mL聚合管中，加入1.6g PEGMA(n＝10)、6.4g LMA、2.5g MEONP(n＝6)和0.05g引发剂AIBN，用40ml异丙醇/四氢呋喃混合溶剂溶解。采用与(1)相同方法制备得到淡黄色固体P(EG)10LN，真空烘箱干燥。核磁结果证实产物具有预期结构。
在50ml烧杯中配制上述聚合物浓度为0.1％的四氢呋喃溶液，在已涂覆涂层P(EG)10LN的PTFE膜片表面成膜，真空干燥。将膜片浸泡在配制好的REDV溶液(PBS，0.3％)中，20℃下反应24h，然后用赖氨酸的PBS溶液封端。三蒸水清洗膜片，氮气吹干，干燥保存备用，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
(3)体外药物释放曲线测定
首先测得西罗莫司药物的标准吸收曲线。接着将载药涂层以及参照涂层分别置于不同的扁体称量瓶中；加入PBS缓冲溶液2mL，将称量瓶置于37℃恒温振荡水浴中，避光释放；在设定的时间点，吸取2mL释放液，加入新的2mL PBS缓冲液继续进行释放，取出的液体按照PBS∶乙腈＝40∶60(V/V)的比例加入乙腈，配制紫外吸收测试液；利用紫外光谱吸收测定所取缓释溶液的吸收值。同时测定PBS溶液的吸光度作为背景扣除，然后根据标准曲线计算出溶液中释放的西罗莫司的量；
(4)细胞选择性评价
将PTFE膜片放入48孔板中，紫外照射灭菌2h，然后将样品浸于75％乙醇溶液中灭菌2h，最后移入灭菌的PBS溶液中浸泡备用。
内皮细胞与平滑肌细胞消化、离心，分别使用FDA和CMTMR染色剂染色1h左右，重新分散、离心，PBS冲洗两次以除去培养基中的染色剂。分别配制细胞密度为4×104cells/mL的内皮细胞和平滑肌细胞悬液并将二者等量混合，以总密度2×104个/孔种植于内置样品膜片的48孔细胞培养板中，放置细胞培养箱培养1h左右，用荧光显微镜观察不同激发光下的内皮细胞(488nm激发)和平滑肌细胞(532nm激发)。
内皮细胞和平滑肌细胞实验结果表明，所制备的聚合物涂层能促进内皮细胞的增长并抑制平滑肌细胞的生长，内皮细胞与平滑肌细胞的增殖比率为4.19。
Claims (7)
1.一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，其特征在于包括载药的聚合物基底层和固定生物活性分子的聚合物外层；所述的载药聚合物基底层由二元聚合物与药物组成，其中二元聚合物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体通过自由基共聚得到；所述的固定生物活性分子的聚合物外层由三元共聚物与生物活性分子组成，其中三元共聚物由含细胞膜仿生结构的生物相容性单体、含疏水功能基团的可聚合单体、以及含可反应活性功能基团的可聚合单体通过自由基共聚合得到；
所述的基底层中所载药物包括西罗莫司、依维莫司、派尔莫司、佐他莫司、他克莫司、吡美莫司、紫杉醇，单体结构如下：
所述的外层中所结合的生物活性分子包括含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的RGD多肽，含精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸序列的REDV多肽，含环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的cRGD环肽，CD34抗体，CD133抗体。
2.根据权利要求1所述的一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，其特征在于所述的基底层二元聚合物中所含细胞膜仿生结构的生物相容性单体选自如下单体：
其中
3.根据权利要求1所述的一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，其特征在于所述的基底层二元聚合物中含疏水功能基团的可聚合单体如下：
4.根据权利要求1所述的一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，其特征在于所述的外层三元共聚物中所含细胞膜仿生结构的生物相容性单体选自如下单体：
其中
5.根据权利要求1所述的一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，其特征在于所述的外层三元共聚物中所含疏水功能基团的可聚合单体如下：
6.根据权利要求1所述的一种用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料，其特征在于所述的外层三元共聚物中所含可反应活性功能基团的可聚合单体如下：
n＝1～10
7.一种根据权利要求1所述的用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的制备方法，包括基底层的制备方法和外层的制备方法其特征在于：其中，
基底层的制备方法的步骤如下：
1)将质量比为1∶0.1～1∶10的细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体溶解在10～100mL溶剂中，获得溶液A，其中溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、异丙醇、乙醇或甲醇；
2)将细胞膜仿生结构的生物相容性单体和含疏水功能基团的可聚合单体总质量的0.2％～2％的自由基引发剂偶氮二异丁腈，加入到溶液A中，得到溶液B；
3)用氮气或者氩气对溶液B除氧5～30分钟，加热到50～90度，反应6～48小时；
4)减压除溶剂，冰乙醚或冰甲醇沉析2～3次，得到心血管支架基底层聚合物；
5)将质量比1∶0.1～1∶10的心血管支架基底层聚合物与药物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.01～5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C；
6)将聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架依次用丙酮、甲醇、三蒸水超声预处理10～30分钟；或者用体积比为7∶3的浓硫酸和双氧水热预处理30～60分钟，三蒸水冲洗；
7)将溶液C涂覆在预处理过的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的基底层D；
外层的制备方法的步骤如下：
8)将细胞膜仿生结构的生物相容性单体、疏水功能基团的可聚合单体和可反应活性功能基团的可聚合单体按照质量比1∶0.1∶0.1～1∶10∶10的比例溶解在10～200mL溶剂中，获得溶液A1，其中溶剂为甲苯、四氢呋喃、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷、异丙醇、乙醇或甲醇；
9)按照步骤8)中三种单体总质量的0.2％～2％称取自由基引发剂偶氮二异丁腈，加入到溶液A1中，得到溶液B1；
10)用氮气或者氩气对溶液B1除氧5～30分钟，加热到50～90度，反应6～48小时；
11)减压除溶剂，用冰乙醚或冰甲醇沉析2～3次，得到心血管支架外层聚合物；
12)将步骤11)中心血管支架外层聚合物溶于四氢呋喃溶剂中，配置成质量百分比浓度为0.01～5％的溶液，超声处理，得到溶解均匀的溶液C1；
13)将溶液C1涂覆在含有基底层D的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面；真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料的聚合物外层E；
14)将已涂覆聚合物外层E的聚四氟乙烯底膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯底膜、不锈钢基底膜或不锈钢心血管支架表面用氮气吹干后，浸入质量百分比浓度为0.01～0.5％生物活性分子的磷酸盐缓冲液，在4～25℃下反应24～72h，用赖氨酸的PBS溶液封端，真空干燥，得到用于心血管支架的内皮细胞选择性复合涂层材料。
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Application publication date: 20111012 |