CN109529118A - 一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于材料、生物、物理、化学等学科的交叉学科领域，公开了一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法及应用。通过表面引发原子转移自由基聚合方法，在基材表面上构建内皮细胞选择性多肽修饰的二元嵌段共聚物刷，其制备过程包括：基片的表面处理、氨基硅烷偶联剂的固定、引发剂的固定、二元嵌段共聚物刷在表面的接枝、末端活性多肽的功能化修饰。本发明方法的工艺简单，反应条件温和、易控，基材可选择性广泛，且得到的涂层结构稳定，能适应人体的内环境，在心血管再狭窄、癌症等方面具有良好的应用前景。

Description

一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法及应用
技术领域
本发明属于材料、生物、物理、化学等学科的交叉学科领域，本发明具体涉及一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法及应用。
背景技术
药物洗脱支架的广泛使用，为高效、微创地治疗心血管疾病提供了良好的手段。然而药物洗脱支架自身携带的药物在治疗由平滑肌细胞过度增生引起的再狭窄的同时，它们也会降低内皮细胞的迁移与增殖能力，使血管内皮层遭到破坏，增加了晚期血栓的风险。由药物非选择性抑制效应引起的内皮化延迟和晚期血栓依然是制约其应用的关键问题。为了解决这一关键问题，人们进行了一系列尝试。
血管内皮化程度与支架植入后血管再狭窄有着密切的联系，因此基于内皮化的研究已经成为心血管植入材料预防再狭窄的新策略。通过功能界面材料实现生物活性分子的固定，构建具有内皮选择性的聚合物刷，原位增强内皮细胞的选择性黏附和竞争性生长，实现血管内皮在植入部位的原位快速愈合，是解决心血管植入材料生物相容性的重要途径之一。
传统的物理吸附方法构建的聚合物涂层存在厚度不可控，粘附力低，制备过程繁琐等不足，且基材可选择性有限；因此，制备适用于各种基材的具有高密度、聚合物分子量大小可控、分子量分布窄、聚合工艺简单的原位内皮选择性聚合物刷，非常重要的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法及应用。本发明提供的方法工艺简单，使用聚合单体范围广泛，反应条件温和、易控，且得到的涂层结构稳定，能适应人体的内环境，在心血管再狭窄、癌症等方面具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法及应用，采用表面引发原子转移自由基聚合(SI-ATRP)，可通过“graft from”的方式在材料表面合成聚合物刷，并可通过内皮细胞选择性生物活性分子的固定，原位构建具有内皮细胞选择性的心血管支架涂层，实现ATRP的功能性聚合。
本发明提供一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法：通过表面引发原子转移自由基聚合反应在基材表面构建内皮选择性多肽修饰的二元嵌段共聚物刷，制备具体步骤如下：
1.基材表面处理：用piranha溶液(96％H2SO4:30％H2O2＝7:3，V/V)煮沸1小时左右，丙酮、乙醇、超纯水中分别超声10分钟，高纯氮气吹干，密封保存备用。
2.氨基硅烷偶联剂的固定：将经过步骤1处理的表面羟基化的基材置于含有5-15mmol氨基硅烷偶联剂的无水甲苯溶液中，在氮气保护下反应过夜，分别用甲苯、丙酮、超纯水超声洗涤，用氮气将基材表面吹干，真空干燥，得到氨基硅烷偶联剂修饰的基材。
3.引发剂的固定：将表面氨基化的基材放入含有5-15mmol引发剂α-卤代酰卤的三乙胺和二氯甲烷溶液中，避光室温反应12-24小时，依次用甲苯、丙酮、超纯水超声洗涤，用氮气将基材表面吹干，真空干燥，得到引发剂修饰的基材；
4.二元嵌段共聚物刷在表面的接枝：将固定引发剂的基材、单体1、催化剂溶在溶剂中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合12-24小时。取出基材，用丙酮、甲醇、超纯水冲洗三次，氮气吹干，得到单体1修饰的基材。将单体1修饰的基材、单体2、催化剂溶在溶剂中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合12-24小时。取出基材，用丙酮、甲醇、超纯水冲洗三次，氮气吹干，得到二元嵌段共聚物刷修饰的基材。
5.末端活性多肽的功能化修饰：将二元嵌段共聚物刷修饰的基材浸入20-200μg/mL的活性多肽PBS溶液中，室温反应12-24小时，随后放入赖氨酸溶液中6-12小时，以消除没有与多肽反应的环氧基团，蒸馏水清洗，氮气吹干，最终得到具有内皮细胞选择性的活性聚合物刷修饰的基材。
上述制备方法，步骤1中所述基材包括各种金属、硅片、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜、玻璃、石英片、聚偏氟乙烯膜、不锈钢膜和不锈钢心血管支架、碳纳米管、二氧化硅微球/纳米颗粒。
上述制备方法，步骤2中所述氨基硅烷偶联剂为3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、4-氨丁基三乙氧基硅烷。
上述制备方法，步骤3中所述引发剂是α-卤代酰卤，包括：α-氯代丙酰氯、α-氯代丁酰氯、α-氯代异丁酰氯、α-溴代丙酰溴、α-溴代丁酰溴、α-溴代异丁酰溴。α-溴代异丁酰溴。
上述制备方法，步骤4中所述单体1选自如下单体：
其中
上述制备方法，步骤4中所述催化剂为氯化铜、氯化亚铜、溴化铜、溴化亚铜、氯化铁、氯化亚铁、二联吡啶、抗坏血酸体系。
上述制备方法，步骤4中所述溶剂为水、甲醇、乙醇中任意一种或其组合。
上述制备方法，步骤4中所述单体2为甲基丙烯酸缩水甘油酯。
上述制备方法，步骤5中所述活性多肽为RGD，REDV，YIGSR，cRGD，CD34抗体，CD133抗体。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
1)通过表面原子转移自由基聚合反应构建的聚合物刷密度高、分子量大小可控、分子量分布窄、涂层结构稳定，
2)通过该技术构建的二元嵌段聚合物刷适用于各种基材表面；
3)固定活性生物分子的反应条件温和，制备工艺简单；
4)所固定生物分子范围广泛，包括各种多肽和抗体；
5)构建的聚合物刷具有良好的反应活性可以保持支架表面的非特异性阻抗性能，同时实现体内原位内皮细胞捕获能力；本发明提供的方法工艺简单，反应条件温和、易控，且得到的涂层结构稳定，能适应人体的内环境，在心血管再狭窄、癌症等方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为空白玻璃片(左)与聚合物刷修饰玻璃片(右)表面血小板粘附对比图。
图2为空白硅片(左)与聚合物刷修饰玻璃片(右)表面内皮细胞(上)与平滑肌细胞(下)粘附情况对比图。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
实施例1
通过表面引发原子转移自由基聚合方法，在玻璃基材表面上合成具有内皮细胞选择性的活性聚合物刷，具体制备方法步骤如下：
1.基材表面处理：用piranha溶液(96％H2SO4:30％H2O2＝7:3，V/V)煮沸1小时左右，丙酮、乙醇、超纯水中分别超声10分钟，高纯氮气吹干，密封保存备用。
2.氨基硅烷偶联剂的固定：将经过步骤1处理的表面羟基化的玻璃片置于含有5mmol 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的无水甲苯溶液中，在氮气保护下反应过夜，分别用甲苯、丙酮、超纯水超声洗涤，用氮气将玻璃片表面吹干，真空干燥，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰的玻璃片。
3.引发剂的固定：将表面氨基化的玻璃放入含有15mmolα－溴代异丁酰溴的三乙胺和二氯甲烷溶液中，避光室温反应12小时，依次用甲苯、丙酮、超纯水超声洗涤，用氮气将玻璃片表面吹干，真空干燥，得到α－溴代异丁酰溴修饰的玻璃片；
4.二元嵌段共聚物刷在表面的接枝：将固定引发剂的玻璃片、PEGMA、溴化亚铜、二联吡啶溶在甲醇和超纯水中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合12小时。取出玻璃片，用丙酮、甲醇、超纯水冲洗三次，氮气吹干，得到PEGMA修饰的基材。将PEGMA修饰的基材、甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化亚铜、二联吡啶溶在甲醇和超纯水中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合12小时。取出玻璃片，用丙酮、甲醇、超纯水冲洗三次，氮气吹干，得到二元嵌段共聚物刷修饰的玻璃片。
5.末端活性多肽的功能化修饰：将二元嵌段共聚物刷修饰的玻璃片浸入20μg/mL的活性多肽REDV的PBS溶液中，室温反应24小时，随后放入赖氨酸溶液中6小时，以消除没有与多肽反应的环氧基团，蒸馏水清洗，氮气吹干，最终得到具有内皮细胞选择性的活性聚合物刷修饰的基材。
6.将聚合物刷修饰的基材与富含血小板的血浆接触，发现与空白玻璃片相比，该聚合物刷可以保持支架表面的非特异性阻抗，具有良好的血液相容性。如图1所示。图1表明聚合物刷可以有效阻抗血小板粘附。
实施例2
通过表面引发原子转移自由基聚合方法，在硅片表面上合成具有内皮细胞选择性的活性聚合物刷，具体制备方法步骤如下：
1.基材表面处理：用piranha溶液(96％H2SO4:30％H2O2＝7:3，V/V)煮沸1小时左右，丙酮、乙醇、超纯水中分别超声10分钟，高纯氮气吹干，密封保存备用。
2.氨基硅烷偶联剂的固定：将经过步骤1处理的表面羟基化的硅片置于含有15mmol 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的无水甲苯溶液中，在氮气保护下反应过夜，分别用甲苯、丙酮、超纯水超声洗涤，用氮气将基材表面吹干，真空干燥，得到3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰的硅片。
3.引发剂的固定：将表面氨基化的硅片放入含有10mmolα-氯代丙酰氯的三乙胺和二氯甲烷溶液中，避光室温反应24小时，依次用甲苯、丙酮、超纯水超声洗涤，用氮气将硅片表面吹干，真空干燥，得到α-氯代丙酰氯修饰的硅片；
4.二元嵌段共聚物刷在表面的接枝：将固定引发剂的硅片、CBMA、氯化铜、抗坏血酸在溶剂中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合24小时。取出硅片，用丙酮、甲醇、超纯水冲洗三次，氮气吹干，得到单体1修饰的基材。将CBMA修饰的基材、甲基丙烯酸缩水甘油酯、氯化铜、抗坏血酸溶在溶剂中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合24小时。取出基材，用丙酮、甲醇、超纯水冲洗三次，氮气吹干，得到二元嵌段共聚物刷修饰的硅片。
5.末端活性多肽的功能化修饰：将二元嵌段共聚物刷修饰的基材浸入100μg/mL的活性多肽RGD的PBS溶液中，室温反应12小时，随后放入赖氨酸溶液中12小时，以消除没有与多肽反应的环氧基团，蒸馏水清洗，氮气吹干，最终得到具有内皮细胞选择性的活性聚合物刷修饰的基材。
6.将聚合物刷修饰的基材分别置于内皮细胞和平滑肌细胞环境中24小时，发现与对照组空白硅片相比，该聚合物刷可以降低平滑肌细胞非特异性阻抗，同时促进内皮细胞粘附。如图2所示。图2表明聚合物刷可以降低平滑肌细胞非特异性阻抗，同时促进内皮细胞粘附。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (9)

1.一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，通过表面引发原子转移自由基聚合反应在基材表面构建内皮选择性多肽修饰的二元嵌段共聚物刷，制备具体步骤如下：
(1)基材表面处理：用piranha溶液煮沸1小时左右，丙酮、乙醇、超纯水中分别超声10分钟，高纯氮气吹干，密封保存备用；
(2)氨基硅烷偶联剂的固定：将经过步骤(1)处理的表面羟基化的基材置于含有5-15mmol氨基硅烷偶联剂的无水甲苯溶液中，在氮气保护下反应过夜，超纯水超声洗涤，用氮气将基材表面吹干，真空干燥，得到氨基硅烷偶联剂修饰的基材；
(3)引发剂的固定：将表面氨基化的基材放入含有5-15mmol引发剂的三乙胺和二氯甲烷溶液中，避光室温反应12-24小时，超声洗涤，用氮气将基材表面吹干，真空干燥，得到引发剂修饰的基材；
(4)二元嵌段共聚物刷在表面的接枝：将固定引发剂的基材、单体1、催化剂溶在溶剂中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合12-24小时，取出基材，冲洗三次，氮气吹干，得到单体1修饰的基材，将单体1修饰的基材、甲基丙烯酸缩水甘油酯、催化剂溶在溶剂中配制成反应溶液，混合均匀后，加入到真空除氧的反应装置内，室温聚合12-24小时，取出基材，冲洗三次，氮气吹干，得到二元嵌段共聚物刷修饰的基材；
(5)末端活性多肽的功能化修饰：将二元嵌段共聚物刷修饰的基材浸入20-200μg/mL的活性多肽PBS溶液中，室温反应12-24小时，随后放入赖氨酸溶液中6-12小时，以消除没有与多肽反应的环氧基团，蒸馏水清洗，氮气吹干，最终得到具有内皮细胞选择性的活性聚合物刷修饰的基材。
2.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，步骤(1)中的piranha溶液为96％H2SO4:30％H2O2＝7:3，V/V。
3.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，步骤(1)中所述基材包括各种金属、硅片、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜、玻璃、石英片、聚偏氟乙烯膜、不锈钢膜和不锈钢心血管支架、碳纳米管、二氧化硅微球/纳米颗粒。
4.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，步骤(2)中所述氨基硅烷偶联剂为3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、4-氨丁基三乙氧基硅烷。
5.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，步骤(3)中所述引发剂是α-卤代酰卤，包括：α-氯代丙酰氯、α-氯代丁酰氯、α-氯代异丁酰氯、α-溴代丙酰溴、α-溴代丁酰溴、α-溴代异丁酰溴。α-溴代异丁酰溴。
6.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，
步骤4中所述单体1选自如下单体：
其中R＝(1)MPC n＝1-18
(2)SBMA(CH2CH2O)nCH3 n＝1-50 n＝1-50
(3)CBMA n＝1-18
(4)PEGMA n＝1-18。
7.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，步骤(4)中所述催化剂为氯化铜、氯化亚铜、溴化铜、溴化亚铜、氯化铁、氯化亚铁、二联吡啶、抗坏血酸体系；步骤(4)中所述溶剂为水、甲醇、乙醇中任意一种或组合。
8.如权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法，其特征是，步骤(5)中所述活性多肽为RGD，REDV，YIGSR，cRGD，CD34抗体，CD133抗体。
9.权利要求1所述的一种原位内皮化心血管支架涂层的构建方法在心血管疾病中的应用。
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