CN114177363A - 促进内皮化防粘连纤维膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及促进内皮化防粘连纤维膜及其制备方法。本发明提供的方法所制备的促进内皮化防粘连纤维膜能够防粘连的同时，兼顾促进内皮细胞黏附。发明提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，通过表面修饰进行改性，方法简单材料本体不受到影响。表面接枝将生物活性材料固定在材料表面，在不改变膜本体结构和性质的前提下，仅在膜表面引入特定基团，使膜表面具备一定的功能。表面接枝促进内皮化可以促进内皮细胞的黏附，降低纤维蛋白原的吸附和以及血小板的沉积，具有更好的血液相容性，此外，本发明内皮化材料通过共价键接枝到基体上，非常牢固，不易脱落丧失性能。

Description

促进内皮化防粘连纤维膜及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及促进内皮化防粘连纤维膜及其制备方法。
背景技术
静电纺丝技术已成功制得超过各种天然和合成聚合物纳米纤维。随着生物医用材料的迅速发展，使用静电纺丝技术制备生物医用材料已越来越普遍，包括组织工程、人造血管、组织修复、伤口包扎制品、药物载体等方面。静电纺丝得到的纤维具有多孔结构，精细程度好、孔隙率高、比表面积大。已经有研究表明静电纺丝制备的纤维膜能够作为防粘连膜，防粘连膜需要一定的柔软性、服帖性，对防粘连起到更好的物理屏障效果。
为了使利用电纺工艺制备的防粘连膜具有更好的防粘连功能以及可以达到促进内皮化的效果，通过在电纺原料中添加促进内皮化成分，使用共混的方法促进了内皮化，要达到相同的效果需要添加的含量较多，成本较高。亦或是对电纺原料进行双键改性，再接枝活性多肽，从而改变了材料本身，最终使电纺纤维膜的力学性能受到影响，最终影响防粘连膜的使用效果。因此需要一种简单的方法，在防粘连膜表面修饰，促进内皮化。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了促进内皮化防粘连纤维膜及其制备方法，目的是为了现有制备电纺防粘连膜，通过在电纺原料中添加促进内皮化成分，使用共混的方法促进了内皮化，要达到相同的效果需要添加的含量较多，成本较高，或者对电纺原料进行双键改性，再接枝活性多肽，从而改变了材料本身，最终使典范纤维膜的力学性能受到影响，最终影响防粘连膜的使用效果。因此需要一种简单的方法，在防粘连膜表面修饰，促进内皮化解决的技术问题。
本发明提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，具体技术方案如下：
促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，包括如下步骤：
S1，将电纺原料溶解与有机溶剂中，获得纺丝液；所述电纺原料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚己内酯-羟基乙酸共聚物和聚己内酯中的一种或多种；所述有机溶剂为丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、六氟异丙醇、二氯甲烷、二甲亚砜等有机溶剂中的一种或多种；
S2，将步骤S1中纺丝液进行静电纺丝处理，获得电纺纤维膜；
S3，将步骤S2中电纺纤维膜进行真空干燥和热压处理，获得防粘连纤维膜；
S4，将步骤S3中防粘连纤维膜进行接枝内皮化材料改性处理，获得促进内皮化防粘连纤维膜。
在某些实施方式中，步骤S1中，所述纺丝液中电纺原料的浓度为20％-50％。
在某些实施方式中，步骤S2中，所述静电纺丝的条件为电压10-40Kv，推进速率为10-50μL/min，接收距离为10-35cm；所述电纺纤维膜直径为0.5-3μm，厚度为50-300μm。
在某些实施方式中，步骤S3中，所述真空处理的条件为，所述真空干燥处理条件为。
在某些实施方式中，步骤S4中，所述内皮化材料为多肽或多肽衍生物。
进一步，所述多肽为RGD、YIGSR、REDV、CAG、SVVYGLR。
在某些实施方式中，步骤S4中，所述接枝内皮化材料改性处理包括如下处理：
S41，将防粘连纤维膜进行表面修饰使其具有活性基团，获得改性防粘连纤维膜，所述活性基团为氨基或羧基；
S42，将步骤S41中预改性防粘连纤维膜浸入内皮化溶液并静置24h，获得促进内皮化防粘连纤维膜。
本发明还提供了促进内皮化防粘连纤维膜，利用上述的方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的方法所制备的促进内皮化防粘连纤维膜能够防粘连的同时，兼顾促进内皮细胞黏附。发明提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，通过表面修饰进行改性，方法简单材料本体不受到影响。表面接枝将生物活性材料固定在材料表面，在不改变膜本体结构和性质的前提下，仅在膜表面引入特定基团，使膜表面具备一定的功能。表面接枝促进内皮化可以促进内皮细胞的黏附，降低纤维蛋白原的吸附和沉积以及血小板的活性，具有更好的血液相容性，此外，本发明内皮化材料通过共价键接枝到基体上，非常牢固，不易脱落丧失性能。
附图说明
图1是本发明提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法的流程图。
图2是本发明实施例1中对照组的内皮细胞形态；
图3是本发明实施例1的促进内皮化防粘连纤维膜上的内皮细胞形态。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1-3，对本发明进一步详细说明。
实施例1
本实施例提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，具体技术方案如下：
(1)静电纺丝处理
用静电纺丝法制备聚合物纤维膜，其组分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物，溶剂为六氟异丙醇，浓度为30％，40℃加热搅拌至溶解，冷却至室温后装入注射针管中，使用电纺设备在室温下进行纺丝，接收距离为25cm，推进速度为20μl/min，电压为25KV，接收装置为滚筒，得到电纺纤维膜，再进行真空干燥(真空度为-0.08MPa，保压时间为8h)及热压处理(温度为45℃，30min)除去残余溶剂后进行热压处理得到防粘连纤维膜。
(2)内皮化
首先对防粘连膜进行羧基修饰，将静电纺丝膜浸入KMnO4的H2SO4(1.2N)溶液中进行氧化处理，并依次用HCl和纯水冲洗后干燥，获得氧化纤维膜；
将氧化纤维膜再浸入0.2M EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)+0.1M NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液中活化半小时，反应体系为0.1M MES缓冲液(2-(N-吗啉)-乙磺酸)，然后在纯化水中冲洗，获得改性纤维膜，将改性纤维膜浸入RGD多肽溶液中24h，获得内皮化静电纺丝防粘连膜。
本实施例还提供了利用上述方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。并对其进行内皮细胞增殖和粘附实验，具体操作步骤如下：内皮细胞(HMEC-1，ATCC)细胞通过胰蛋白酶酶切从平板上分离，1000rpm离心5分钟。使用培养基由10％(v/v)胎牛血清、0.01mg/mL胰岛素和DMEM-H培养基组成。细胞在37℃、5％CO2的细胞培养基中培养5天，用于增殖和粘附。使用卡扣将本实施例的促进内皮化防粘连纤维膜固定，放置于24孔板中，每个孔中接种2*104个细胞，对照组为24孔板的底面，于37℃、5％CO2的细胞培养基中培养5天，通过免疫荧光分析细胞的形态。对于细胞骨架染色，细胞用4％多聚甲醛固定，用0.1％Triton X-100透化，用TRICT鬼笔环肽(Sigma-Aldrich，MO，USA)和DAPI(Sigma-Aldrich，MO，美国)染色。使用荧光显微镜观察肌动蛋白丝和细胞核。与对照组相比，细胞数量相当，形态正常，证明材料能够很好地促进内皮细胞生长。
实施例2
本实施例提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，具体技术方案如下：
(1)静电纺丝处理
用静电纺丝法制备聚合物纤维膜，其组分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物的混合物，质量比为90/10，溶剂为六氟异丙醇，浓度为50％，40℃加热搅拌至溶解，冷却至室温后装入注射针管中，使用电纺设备在室温下进行纺丝，接收距离为20cm，推进速度为20μl/min，电压为40KV，接收装置为滚筒，得到电纺纤维膜，再进行真空干燥(真空度为-0.1MPa，保压时间为5h)及热压处理(温度为30℃，60min)除去残余溶剂后进行热压处理得到防粘连纤维膜。
(2)内皮化：
首先对防粘连膜进行氨基修饰，将防粘连膜放入10％的1，6-己二胺无水乙醇溶液，低温放置24h，然后用水冲洗，干燥，获得改性防粘连纤维膜。
醛肽的合成：REDV四肽(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)7-氨基庚酸，苯丙氨酸使用自动合成器和固相法合成。精氨酸的侧链保护使用五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，天冬氨酸和谷氨酸的侧链保护使用叔丁基(OBut)。
在搅拌下用三氟乙酸(TFA)去除侧链保护1小时，在搅拌下用乙酸、水、甲醇和二氯甲烷(10:5:21:63)的溶液裂解树脂1小时得到醛肽，冻干保存。
将冻干肽以10-5M(原液)的起始浓度溶解在PBS中加入还原剂氰基硼氢化钠(2.19mg NaBH3CN对应1mg肽)。将膜放入肽溶液功能化24小时。随后样品在PBS中洗涤，干燥后得到内皮化防粘连膜。
本实施例还提供了利用上述方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。
实施例3
本实施例提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，具体技术方案如下：
(1)静电纺丝处理
用静电纺丝法制备聚合物纤维膜，其组分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯的混合物，质量比为50/50，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，浓度为40％，40℃加热搅拌至溶解，冷却至室温后装入注射针管中，使用电纺设备在室温下进行纺丝，接收距离为20cm，推进速度为30μl/min，电压为30KV，接收装置为滚筒，得到电纺纤维膜，再进行真空干燥(真空度为-0.08MPa，保压时间为20h)及热压处理(温度为50℃，10min)去残余溶剂后进行热压处理得到防粘连纤维膜。电纺纤维膜直径为3μm，厚度为300μm。
(2)内皮化：
表面氨基修饰：将防粘连纤维膜浸入溶解在无水己烷中的10％(v/v)硅烷(APTES)溶液中，在N2气氛下将氨基硅烷链共价结合到表面。反应结束后，无水己烷冲洗3次，真空干燥。
醛肽的合成：REDV四肽(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)7-氨基庚酸，H-Phe-H树脂使用自动合成器和固相法合成。精氨酸的侧链保护使用五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，天冬氨酸和谷氨酸的侧链保护使用叔丁基(OBut)。
在搅拌下用三氟乙酸(TFA)去除侧链保护1小时，在搅拌下用乙酸、水、甲醇和二氯甲烷(10:5:21:63)的溶液裂解树脂1小时得到醛肽，冻干保存。
将冻干肽以10-5M(原液)的起始浓度溶解在PBS中加入还原剂氰基硼氢化钠(2.19mg NaBH3CN对应1mg肽)。将膜放入肽溶液功能化24小时。随后样品在PBS中洗涤，干燥后得到内皮化防粘连膜。
本实施例还提供了利用上述方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。
实施例4
本实施例提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，具体技术方案如下：
(1)静电纺丝处理
用静电纺丝法制备聚合物纤维膜，其组分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物的混合物，质量比为90/10，溶剂为六氟异丙醇，浓度为20％，40℃加热搅拌至溶解，冷却至室温后装入注射针管中，使用电纺设备在室温下进行纺丝，接收距离为10cm，推进速度为50μl/min，电压为30KV，接收装置为滚筒，得到电纺纤维膜，再进行真空干燥(真空度为-0.1MPa，保压时间为5h)及热压处理(温度为30℃，60min)除去残余溶剂后进行热压处理得到防粘连纤维膜。电纺纤维膜直径为1μm，厚度为100μm。
(2)内皮化：
首先对防粘连膜进行氨基修饰，将防粘连膜放入10％的1，6-己二胺无水乙醇溶液，低温放置24h，然后用水冲洗，干燥，获得改性防粘连纤维膜。
醛肽的合成：REDV四肽(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)7-氨基庚酸，苯丙氨酸使用自动合成器和固相法合成。精氨酸的侧链保护使用五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，天冬氨酸和谷氨酸的侧链保护使用叔丁基(OBut)。
在搅拌下用三氟乙酸(TFA)去除侧链保护1小时，在搅拌下用乙酸、水、甲醇和二氯甲烷(10:5:21:63)的溶液裂解树脂1小时得到醛肽，冻干保存。
将冻干肽以10-5M(原液)的起始浓度溶解在PBS中加入还原剂氰基硼氢化钠(2.19mg NaBH3CN对应1mg肽)。将膜放入肽溶液功能化24小时。随后样品在PBS中洗涤，干燥后得到内皮化防粘连膜。
本实施例还提供了利用上述方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。
实施例5
本实施例提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，具体技术方案如下：
(1)静电纺丝处理
用静电纺丝法制备聚合物纤维膜，其组分为聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚己内酯的混合物，质量比为50/50，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，浓度为40％，40℃加热搅拌至溶解，冷却至室温后装入注射针管中，使用电纺设备在室温下进行纺丝，接收距离为35cm，推进速度为10μl/min，电压为10KV，接收装置为滚筒，得到电纺纤维膜，再进行真空干燥(真空度为-0.08MPa，保压时间为20h)及热压处理(温度为50℃，10min)去残余溶剂后进行热压处理得到防粘连纤维膜。电纺纤维膜直径为0.5μm，厚度为50μm。
(2)内皮化：
表面氨基修饰：将防粘连纤维膜浸入溶解在无水己烷中的10％(v/v)硅烷(APTES)溶液中，在N2气氛下将氨基硅烷链共价结合到表面。反应结束后，无水己烷冲洗3次，真空干燥。
醛肽的合成：REDV四肽(精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)7-氨基庚酸，H-Phe-H树脂使用自动合成器和固相法合成。精氨酸的侧链保护使用五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)，天冬氨酸和谷氨酸的侧链保护使用叔丁基(OBut)。
在搅拌下用三氟乙酸(TFA)去除侧链保护1小时，在搅拌下用乙酸、水、甲醇和二氯甲烷(10:5:21:63)的溶液裂解树脂1小时得到醛肽，冻干保存。
将冻干肽以10-5M(原液)的起始浓度溶解在PBS中加入还原剂氰基硼氢化钠(2.19mg NaBH3CN对应1mg肽)。将膜放入肽溶液功能化24小时。随后样品在PBS中洗涤，干燥后得到内皮化防粘连膜。
本实施例还提供了利用上述方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。
综上所述，本发明提供的方法所制备的促进内皮化防粘连纤维膜能够防粘连的同时，兼顾促进内皮细胞黏附。发明提供的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，通过表面修饰进行改性，方法简单材料本体不受到影响。表面接枝将生物活性材料固定在材料表面，在不改变膜本体结构和性质的前提下，仅在膜表面引入特定基团，使膜表面具备一定的功能。表面接枝促进内皮化可以促进内皮细胞的黏附，降低纤维蛋白原的吸附和沉积以及血小板的活性，具有更好的血液相容性，此外，本发明内皮化材料通过共价键接枝到基体上，非常牢固，不易脱落丧失性能。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将电纺原料溶解与有机溶剂中，获得纺丝液；所述电纺原料为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚己内酯-羟基乙酸共聚物和聚己内酯中的一种或多种；所述有机溶剂为丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、六氟异丙醇、二氯甲烷、二甲亚砜有机溶剂中的一种或多种；
S2，将步骤S1中纺丝液进行静电纺丝处理，获得电纺纤维膜；
S3，将步骤S2中电纺纤维膜进行真空干燥和热压处理，获得防粘连纤维膜；
S4，将步骤S3中防粘连纤维膜表面通过偶联剂或引入活性基团进行接枝内皮化材料改性处理，获得促进内皮化防粘连纤维膜。
2.根据权利要求1所述的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述纺丝液中电纺原料的浓度为20％-50％。
3.根据权利要求1所述的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述静电纺丝的条件为电压10-40Kv，推进速率为10-50μL/min，接收距离为10-35cm；所述电纺纤维膜直径为0.5-3μm，厚度为50-300μm。
4.根据权利要求1所述的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述真空处理的真空度为-0.08MPa以下，保压时间为5-20h，所述热压处理的温度为30-50℃，10-60min。
5.根据权利要求1所述的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述内皮化材料为多肽或多肽衍生物。
6.根据权利要求5所述的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，所述内皮化材料为RGD、YIGSR、REDV、CAG、SVVYGLR。
7.根据权利要求1所述的促进内皮化防粘连纤维膜的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述接枝内皮化材料改性处理包括如下处理：
S41，将防粘连纤维膜进行表面修饰使其具有活性基团，获得改性防粘连纤维膜，所述活性基团为氨基或羧基；
S42，将步骤S41中预改性防粘连纤维膜浸入内皮化溶液并静置24h，获得促进内皮化防粘连纤维膜。
8.促进内皮化防粘连纤维膜，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述的方法制备的促进内皮化防粘连纤维膜。
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