CN102965849A - 静电纺丝制备医用屏障膜的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种静电纺丝制备医用屏障膜的方法。该方法以脂肪族聚酯材料为原料,运用静电纺丝制备厚度为50μm~2.0mm的电纺膜,再经真空干燥、溶剂脱除、冷冻干燥及在温度为25~45℃和压强为0.01~5.0MPa条件下热压,最后经Co60辐射灭菌得到医用屏障膜。本发明具有纺丝效率高的优点,静电纺丝出液速率可达到5.0ml/h~25.0ml/h,屏障膜制备过程简单易操作,易于实现工业化,所制得的屏障膜具有良好的生物相容性和生物可降解性,并且具有优良的力学性能和屏蔽性能,是一种理想的生物医用屏障膜材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种静电纺丝制备医用屏障膜的方法,属于高分子生物医用膜材料领域。
背景技术
在临床医学领域,医用屏障膜最早开始应用于牙周组织的引导修复再生研究中,基本原理是通过在根面与龈瓣之间放置屏障膜,阻止生长较快的牙龈上皮细胞和结缔组织的根向侵入生长,选择性保护和促进牙周特异性细胞优先占据根面,形成新的牙周组织附着装置。
除了应用于口腔医学领域外,医用屏障膜目前已经广泛的应用于引导组织再生、术后防粘连、软组补片等领域。如皮肤、耳鼻、眼表等暴露在外的组织容易因疾病、外伤或手术等引起组织损伤,而采用医用屏障膜将暴露的创面覆盖可以在止血的同时降低伤口感染并起到促进受损组织修复的目的。现有的外科手术中,几乎所有的手术都存在术后组织间的粘连问题,即结缔组织纤维带与相邻的组织或器官集合在一起形成异常的结构,它可以引起严重的并发症如肠梗塞、不孕症、术后癫痫等,而采用医用屏障膜作为物理隔离物是一种有效的避免组织粘连的方法。
大量的实验及临床研究表明,理想的屏障膜应该具有良好的生物相容性和合适的生物降解性以及适当的力学性能。良好的生物相容性能够保证屏蔽膜植入后机体不产生或产生较小的炎症和排异反应;合适的生物降解性可保证屏蔽膜在创伤愈合、组织修复再生过程中发挥其作用,而在康复后又可以完全降解,避免了二次手术;适当的力学性能可以保证屏蔽膜在手术过程中及植入后保持较好的完整性,从而发挥其屏蔽作用。因此,性能优异的医用屏障膜材料具有极大的临床需求和应用价值。
目前临床上使用的屏障膜可分为不可吸收和生物可吸收两大类,作为医用屏障膜,他们都具有维持特定空间、阻隔细胞和引导特定组织再生的功能。但不可吸收的医用屏障膜如聚四氟乙烯膜由于本身不被组织吸收且无法与周围组织结合,必须在植入后二次手术取出,会对已形成的新附着产生破坏,并增加了患者的痛苦及术后感染的可能性。生物可吸收的屏障膜按照其来源可分为天然医用膜材料,如胶原、明胶、壳聚糖等和合成高分子医用膜材料,如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚己内酯、聚乙烯醇及其共聚物等。天然医用屏障膜具有生物相容性好,抗原性低等优点,但由于其降解速度过快,湿强度低及来源受限等方面的原因限制了它在临床上的广泛应用。合成高分子医用屏障膜虽然在生物相容性上相对不如天然医用膜,但其优异的力学性能和热稳定性以及降解速率的可控性,使其在临床上逐渐得到了更为广泛的应用。
常用的制备屏障膜的方法主要有流涎成膜法、溶剂浇铸/粒子沥滤法、热致相分离法等,这些方法制备的屏障膜内部形态不均匀且柔韧性和重复性较差,虽然其组成上具备了仿生性,但其微结构并不具备生物体内细胞外基质的特征。而静电纺丝制备的多层纤维网络结构可以很好地仿生天然细胞外基质的结构特点,从而使结构和组成均具备了较好的仿生性,因而成为近年来发展较快的一种制备屏障膜的技术。但目前见诸文献和专利报道的静电纺丝成膜技术的主要缺点在于其生产效率较低,出液速率一般为10μl/h~1.0ml/h,制备厚度在10μm~1mm的电纺薄膜通常需要几十个小时甚至几天;此外普通电纺膜力学强度较差,电纺膜纤维之间的空隙或间距较大,用作屏障膜时的屏蔽作用较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种静电纺丝制备医用屏障膜的方法,该法具有纺丝效率高的优点,所制备的医用屏蔽膜具有良好的生物相容性和生物可降解性并具有优良的力学性能和优异的屏蔽性。
本发明是通过以下的技术方案加以实现的。一种静电纺丝制备医用屏障膜的方法,所述的医用屏障膜是由直径为纳米至亚微米级纤维构成的厚度为50μm~2.0mm的薄膜,其特征在于包括以下过程:
(1) 将粘均分子量为5万~150万的聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚羟基烷酸酯(PHA)和聚丁二酸丁二醇酯(PBS) 其中的一种或一种以上的混合物,溶解于三氯甲烷、二氯甲烷、六氟异丙醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环和丙酮其中的一种溶剂或一种以上的混合溶剂中,搅拌8~24小时,得到质量分数为1%~50%的电纺液;
(2) 以电纺液进行静电纺丝成膜,静电纺丝条件为:初纺电压为10~15KV,续纺电压按每消耗1毫升电纺液用量相应增加0.5~2.0KV进行调节,接收距离为5~50cm,出液速率为5~25ml/h,接收器为直径10cm~300cm的表面附有锡纸的旋转金属圆盘,圆盘转速为10~1000rpm,纺制完毕得到由直径为纳米至亚微米级纤维构成的厚度为100μm~3.0mm的无纺布形式的电纺膜;
(3) 将步骤(2)所制备的无纺布形式的电纺膜在温度15~45℃条件下恒温真空干燥24~72小时,得到干燥的电纺膜;
(4) 将步骤(3)所得的干燥电纺膜在体积分数为1%~75%的乙醇溶液中浸泡5~60分钟,然后用去离子水浸泡至水溶液中不含残留溶剂为止,冷冻干燥得到冻干电纺膜;
(5) 将步骤(4)所得的冻干电纺膜置于内表面带有花纹的两块平板之间,在温度为25~45℃和压强为0.01~5.0MPa条件下热压得到厚度为50μm~2.0mm的热压电纺膜;
(6) 将步骤(5)所得的热压电纺膜按照不同使用要求进行裁制封装,再经Co60辐射灭菌后得到医用屏障膜。
本发明与现有技术相比,其优点在于:(1)本发明解决了静电纺丝制备电纺膜生产效率低下的关键技术问题,静电纺丝出液速率可达到5.0ml/h~25.0ml/h,能快速高效的制备出纤维直径在纳米至亚微米级且表面光滑,大小均一的电纺纤维(如图1),所得到的电纺膜表面光洁平整且厚度均一。(2)本发明所制备的屏障膜在干态和湿态下均具有较高的力学强度,并且具有较好的柔韧性,完全可以满足手术操作过程及植入后对其力学性能方面的要求。(3)本发明采用了热压过程,提高了屏蔽膜中纤维之间的堆积密度,所制备的医用屏障膜在动物体内实验中显示出很好地屏蔽纤维组织长入的作用(如图2),并且没有明显的炎症反应,屏蔽膜制备方法简单,过程易操作,易于实现工业化,在组织修复和术后防粘连领域中具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例一制备的消旋聚乳酸医用屏蔽膜的表面扫描电镜(SEM)照片。
图2为本发明实施例一制备的消旋聚乳酸医用屏蔽膜在大鼠体内1周实验冰冻切片HE染色照片(×100)。
图3为本发明实施例一制备的消旋聚乳酸医用屏蔽膜在大鼠体内4周实验冰冻切片HE染色照片。
图4为本发明实施例一制备的消旋聚乳酸医用屏蔽膜在大鼠体内13周实验冰冻切片HE染色照片(×40)。
具体实施方式
实施例一:
1、将1.411g粘均分子量为20万的消旋聚乳酸(PDLLA)溶解于9ml三氯甲烷和1mlN,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中,室温磁力搅拌12h,得到浓度为9%(w/w)的聚乳酸电纺液,室温静置脱泡;
2、将经步骤1所制备的电纺液加入储液器中进行静电纺丝,起始电压为15KV,接收距离为20cm,出液速率为7ml/h,接收装置为表面附有锡纸的旋转不锈钢圆盘(直径150mm),圆盘转速为180rpm。纺丝过程中为了保证纤维具有较好的收率,按每消耗2ml的电纺液,将电压相应升高3KV的规律进行调节电压,即当电纺液用量为0~2ml时,电压为15 KV;当电纺液用量为2~4ml时,电压为18 KV;当电纺液用量为4~6ml时,电压为21 KV;当电纺液用量为6~8ml时,电压为24 KV;当电纺液用量为8~10ml时,电压为27 KV,按如此调压规律,电纺得到直径为150mm,厚度为0.4mm的电纺膜;
3、将步骤2得到的电纺膜置于真空干燥箱中,在温度为30℃的条件下恒温干燥24h后取出;
4、将干燥后的电纺膜置于浓度为25%(v/v)的乙醇溶液中浸泡30min,之后分别用去离子水浸泡三次,每次取去离子水200ml处理10min,最后在-35℃的低温下预冻4h后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥;
5、将冷冻干燥后的电纺膜置于两块内表面带有斜花纹的平板间在温度为30℃,压强为0.05MPa条件下进行热压;
6、将步骤5得到的直径为150mm,厚度为0.3mm的屏障膜剪裁成25mm×20mm大小,密封包装,然后用Co60辐射灭菌后即可得到消旋聚乳酸医用屏障膜。
对本实施例得到的聚乳酸医用屏障膜,参照GB/T 16886.5-2003并选择ADA和ISO均推荐使用的标准冻存库中的标准Hela细胞系对聚乳酸医用屏障膜的浸提液进行了体外细胞毒性检测实验。首先通过接种浓度梯度板的预实验确定吸光度值(OD)与细胞增殖线性关系最好的接种浓度,结果表明当接种浓度为每孔2000~4000Hela细胞时,细胞增殖良好并且接种3天后细胞未见明显接触抑制。
然后分别制备100%、50%、10%和5%四种不同浓度的浸提液,以检测细胞毒性是否与聚乳酸医用屏障膜溶出物有关,即溶出物浓度与细胞毒性的剂量依赖关系。同时设置了阴性对照组(细胞维持液+细胞组),阳性对照组(0.64%苯酚溶液+细胞组)和空白对照组(即调零组),每组均有6个复孔作为平行对照。将各组孔板置于恒温37℃及5%CO2浓度的孵箱内培养2天后取出,加入MTT处理后于倒置显微镜下观察,结果显示不同浓度浸提液组的孔内细胞形态未呈现较明显的差异,之后用酶标仪测定每孔的吸光度值(OD),如下表1。
表1 加样2天后各组OD值检测结果
通过测得的OD值根据公式(1) 计算各组细胞相对增殖率(RGR),如下表2。
表2 加样2天后各组RGR值计算结果
由表2可知实验组的RGR值介于96%~114%之间,除浓度为100%的实验组的RGR值为96%外,其余各实验组的RGR值均大于100%,而阳性对照组RGR值为0。根据以RGR值为基准的材料细胞毒性分级标准,RGR值大于100 %时,细胞毒性为0级;75%≤RGR≤99%时,细胞毒性为1级;50%≤RGR≤74%时,细胞毒性为2级;25%≤RGR≤49%时,细胞毒性为3级;1%≤RGR≤24%时,细胞毒性为4级;RGR≤0时,细胞毒性为5级。其中0级和1级被认为没有细胞毒性,2级为轻度细胞毒性,3级和4级为中度细胞毒性,5级为明显的细胞毒性。
本实验阳性对照组RGR值为0,具有明显的细胞毒性,即0.64%苯酚溶液细胞毒性为5级;而聚乳酸医用屏障膜RGR值介于96~114%之间,细胞毒性为0级或1级,即无细胞毒性。
对本实施例得到的聚乳酸医用屏障膜,用消毒后的手术剪刀裁成直径为7mm的试样,用75%的乙醇浸泡1h后再用pH=7.4的PBS缓冲液冲洗三次。取体重180~200克的健康SD大鼠18只,用3%戊巴比妥钠按50mg/Kg浓度进行腹腔麻醉,背部剃毛后用碘伏消毒,然后切开皮肤至深筋膜,向两侧分离皮下组织,植入直径7mm的聚乳酸医用屏障膜,用3-0缝合线将其固定于肌层,然后将皮肤缝合,用无菌敷料覆盖包扎并定期换药。实验鼠术后单笼饲养,并于术后1周、4周及13周任选3只SD大鼠切开皮肤取出植入试样。
将在不同时间点从大鼠体内取出的试样先置于4%的中性甲醛溶液中固定24h,再用30%的蔗糖溶液浸泡12h脱水,然后用包埋剂包埋并放入液氮中速冻后在-80℃条件下冷冻10h,之后采用冷冻切片机制备厚度为7μm的冷冻切片,最后采用苏木素-伊红染色法(HE染色法)对切片进行染色并在光学显微镜下观察。如图2、3、4HE染色照片所示,聚乳酸医用屏障膜植入SD大鼠体内1周、4周及13周后均起到了较好的屏蔽纤维组织长入的作用,并且整个体内试验的过程中SD大鼠没有出现明显的炎症反应。
实施例二:
1、将4.000g粘均分子量为13万的聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA,50:50)溶解于16ml四氢呋喃和4mlN,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中,室温磁力搅拌12h,得到浓度为0.2g/ml的电纺液,室温静置脱泡;
2、将经步骤1所制备的电纺液加入储液器中进行静电纺丝,起始电压为10KV,接收距离为15cm,出液速率为10ml/h,接收装置为表面附有锡纸的旋转不锈钢圆盘(直径100mm),圆盘转速为300rpm,纺丝过程中为了保证纤维具有较好的收率,按每消耗5ml的电纺液,将电压相应升高5KV的规律进行调节电压,即当电纺液用量为0~5ml时,电压为10KV;当电纺液用量为5~10ml时,电压为15 KV;当电纺液用量为10~15ml时,电压为20 KV;当电纺液用量为15~20ml时,电压为25 KV,按如此调压规律,得到直径为100mm,厚度为0.7mm的电纺膜;
3、将步骤2得到的电纺膜置于真空干燥箱中,在温度为35℃的恒温条件下干燥48h后取出;
4、将步骤3得到的干燥电纺膜置于浓度为20%(v/v)的乙醇溶液中浸泡45min,之后分别用去离子水浸泡三次,每次取去离子水250ml处理15min,最后在-35℃的低温下预冻4h后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥;
5、将冷冻干燥后的电纺膜置于两块内表面带有细花纹的平板间在温度为35℃,压强为2.0MPa条件下进行热压处理;
6、将步骤6得到的直径为100mm,厚度为0.2mm的屏障膜剪裁成30mm×25mm大小,密封包装,然后用Co60辐射灭菌后即可得到聚乳酸羟基乙酸共聚物医用屏障膜。
实施例三:
1、将2.723g粘均分子量为40.6万的聚乳酸(PLA)和1.167g粘均分子量为10万的聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA,70:25)溶解于18ml三氯甲烷和2mlN,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂中,室温磁力搅拌12h,得到浓度为12%(w/w)的电纺液,室温静置脱泡;
2、将经步骤1所制备的电纺液加入储液器中进行静电纺丝,起始电压为12KV,接收距离为20cm,出液速率为5ml/h,接收装置为表面附有锡纸的旋转不锈钢圆盘(直径80mm),圆盘转速为280rpm,纺丝过程中为了保证纤维具有较好的收率,按每消耗4ml的电纺液,将电压相应升高3KV的规律进行调节电压,即当电纺液用量为0~4ml时,电压为12KV;当电纺液用量为4~8ml时,电压为15 KV;当电纺液用量为8~12ml时,电压为18 KV;当电纺液用量为12~16ml时,电压为21KV;当电纺液用量为16~20ml时,电压为24KV,按如此调压规律,得到直径为80mm,厚度为0.8mm的电纺膜;
3、将步骤2得到的电纺膜置于真空干燥箱中,在温度为30℃的恒温条件下干燥36h后取出;
4、将步骤3得到的干燥电纺膜置于浓度为15%(v/v)的乙醇溶液中浸泡60min,之后分别用去离子水浸泡三次,每次取去离子水200ml处理20min,最后在-35℃的低温下预冻4h后在真空冷冻干燥机中冷冻干燥;
5、将冷冻干燥后的电纺膜置于两块内表面带有粗花纹的平板间在温度为40℃,压强为5.0MPa条件下进行热压处理;
6、将步骤6得到的直径为80mm,厚度为0.3mm的屏障膜剪裁成30mm×40mm大小,密封包装,然后用Co60辐射灭菌后即可得到医用屏障膜。
Claims (1)
1.一种静电纺丝制备医用屏障膜的方法,所述的医用屏障膜是由直径为纳米至亚微米级纤维构成的厚度为50μm~2.0mm的薄膜,其特征在于包括以下过程:
(1) 将粘均分子量为5万~150万的聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚羟基烷酸酯和聚丁二酸丁二醇酯其中的一种或一种以上的混合物,溶解于三氯甲烷、二氯甲烷、六氟异丙醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、1,4-二氧六环和丙酮其中的一种溶剂或一种以上的混合溶剂中,搅拌8~24小时,得到质量分数为1%~50%的电纺液;
(2) 以电纺液进行静电纺丝成膜,静电纺丝条件为:初纺电压为10~15KV,续纺电压按每消耗1毫升电纺液用量相应增加0.5~2.0KV进行调节,接收距离为5~50cm,出液速率为5~25ml/h,接收器为直径10cm~300cm的表面附有锡纸的旋转金属圆盘,圆盘转速为10~1000rpm,纺制完毕得到由直径为纳米至亚微米级纤维构成的厚度为100μm~3.0mm的无纺布形式的电纺膜;
(3) 将步骤(2)所制备的无纺布形式的电纺膜在温度15~45℃条件下恒温真空干燥24~72小时,得到干燥的电纺膜;
(4) 将步骤(3)所得的干燥电纺膜在体积分数为1%~75%的乙醇溶液中浸泡5~60分钟,然后用去离子水浸泡至水溶液中不含残留溶剂为止,冷冻干燥得到冻干电纺膜;
(5) 将步骤(4)所得的冻干电纺膜置于内表面带有花纹的两块平板之间,在温度为25~45℃和压强为0.1~5MPa条件下热压得到厚度为50μm~2.0mm的热压电纺膜;
(6) 将步骤(5)所得的热压电纺膜按照不同使用要求进行裁制封装,再经Co60辐射灭菌后得到医用屏障膜。
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