JP5162784B2 - 細胞培養基材及びその製造方法並びに細胞培養方法 - Google Patents
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Description
2.親水性骨格を含むポリマー鎖が、疎水性ポリマー骨格100重量部に対して5重量部以上グラフトされている請求項1記載の細胞培養基材。
3.表面の水接触角が25°〜60°である前項1または2に記載の細胞培養基材。
4.前項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養基材を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
5.以下の工程を含む細胞培養基材の製造方法。
(1)水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ(ε-カプロラクトン)の表面を作製する工程
(2)工程(1)で作製した表面にポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも1つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトする工程
6.工程(2)の親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフトがプラズマグラフト共重合によることを特徴とする前項5に記載の製造方法。
7.工程(2)で親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトすることにより、表面の水接触角を25°〜60°とすることを特徴とする前項5または6に記載の製造方法。
本発明の細胞培養基材は、疎水性ポリマー骨格に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしてなる表面を有する。
γS=γLcosΘ+γSL
(上記式において、γSは固体の表面張力、γLは液体の表面張力、γSLは固体/液体の界面張力、Θは接触角を示す。)
(A)あらかじめ高いエネルギー源により疎水性ポリマーの分子鎖全体にわたってポリマーラジカルを形成させ、反応性の官能基を形成する。その後、親水性骨格を含むポリマー鎖の水溶液中で縮合反応させる(参考:Z.Cheng, S-H.Tech, Biomaterials 25(2004)1991-2001)。この場合、親水性骨格を含むポリマー鎖の末端、あるいは側鎖の1つ以上は、疎水性ポリマー骨格に形成された反応性官能基と反応し得る必要がある。当該反応性の官能基としては、例えば、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基などが挙げられる。
(1)疎水性ポリマー表面の作製工程
工程(1)は、疎水性ポリマー表面を形成する工程である。疎水性ポリマーを、クロロホルム、テトラヒドロフランなどの溶剤に0.3〜1.0質量%となるように溶解し、疎水性ポリマー溶液を調製する。該疎水性ポリマー溶液を高分子基材上にスピンコートし、室温で静置乾燥させて膜厚30〜150nmの疎水性ポリマーを含む薄膜を形成させる。スピンコート条件は、最大回転数3000〜5000rpm、30〜60秒間とする。
工程(2)は、工程(1)で形成した疎水性ポリマー表面に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトする工程である。上記したようにグラフトする方法は特に限定されないが、ここでは、上述したプラズマグラフト重合による方法(A)を用いたグラフトについて説明する。
工程(1)で調製した疎水性ポリマーを含む薄膜を低圧プラズマ発生装置(例えば、Plasma Beam(Diner Electronic社製)、Micro Systems Apparatus(Roth & Rau社製)など)の反応器内に静置し、真空ポンプを用いて反応器内の気圧を1×10−3〜1×10−2mbarとする。反応器内の気体は窒素、アルゴン、アンモニア、水、水素、酸化硫黄などのガスを用い、ガス流量は10〜100cm3/秒とする。その後、プラズマ発生源(例えば、Electron Cyclotron Resonance(Roth & Rau社製)、ラジオ波発生器(Roth & Rau社製)など)を用い、100〜500Wの出力で、10〜600秒間疎水性ポリマーを含む薄膜を処理し、反応器内にプラズマを発生させる。この時、当該薄膜とプラズマ発生源との距離は、約100〜1000mmとする。
(ポリスチレン表面の調製)
実施例1および2では、疎水性ポリマーとしてポリスチレン(式1)を用いた。ポリスチレン(東洋スチレン社製:分子量約4300,000)をクロロホルム(WAKO CHEMICAL社より購入)に溶解させ、濃度0.6wt/wt%となるように溶解し、疎水性ポリマー溶液を調製した。該疎水性ポリマー溶液を10×20mm2シリコンウエハ(接触角測定用)、直径15mmのカバーガラス(細胞培養用)にスピンコートして、膜厚約65nmの薄膜を形成した。スピンコート条件は、最大回転数3000rpm、30秒間とし、スピンコート後は室温にて静置乾燥した。
スライドガラス上に形成したポリスチレンを含む薄膜を低圧プラズマ発生装置の反応器内に静置し、真空ポンプを用いて反応器内の気圧を5×10-3mbarとした。反応器内の気体は酸素ガスを利用し、ガス流量は10cm3/秒とした。その後、2.46GHzエレクトロン・サイクロトロン・レゾナンス型の有磁場マイクロ波発生源を用い、250Wの出力で反応器内にプラズマを発生させた。この時、試料とプラズマ発生源との距離は、約200mmとした。試料のプラズマ処理は30秒間行った。
(ポリε‐カプロラクトン表面の調製)
実施例3では、疎水性ポリマーとしてポリε‐カプロラクトン(式3)を用いた。ポリε‐カプロラクトン(WAKO CHEMICAL社より購入:重量平均分子量:70,000〜100,000)をクロロホルム(WAKO CHEMICAL社より購入)に溶解させ、濃度1.25wt/wt%となるように溶解して疎水性ポリマー水溶液を調製した。該疎水性ポリマー水溶液を10×20mm2シリコンウエハ(接触角測定用)、直径15mmのカバーガラス(細胞培養用)上にスピンコートして、膜厚約100nmのポリε‐カプロラクトンを含む薄膜を形成した。スピンコート条件は、最大回転数3000rpm、30秒間とし、スピンコート後は室温に静置乾燥した。
実施例1および2と同じ条件で、ポリε‐カプロラクトン表面に親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトした。なお、実施例3では、親水性骨格を含むポリマー鎖として、1つの末端がアミノ基を有するポリプロピレンオキサイド(以下PO)・ポリエチレンオキサイド(以下EO)共重合体[商品名:Jeffamine XTJ-506 分子量約1,000、共重合比(mol比)PO:EO=3:19 HUNTSMAN社製](式2)を用いた。
比較例1として、親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしなかった以外は実施例1と同様に作製したポリスチレン表面を形成した。
比較例2として、親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトしなかった以外は実施例2と同様に作製したポリε‐カプロラクトン表面を形成した。
(1)接触角測定
実施例1〜3および比較例1、2で調製した表面の水に対する静的接触角を接触角測定装置(DropMaster500、界面化学社製)を用いて測定した。その結果を表1に示す。
実施例1〜3および比較例1、2で調製した表面に対するタンパク質の吸着性は、フィブロネクチン(SIGMA Aldrich社より購入)を用い、表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance:以下SPR)システム(Biacore J、Biacore社製)を用いて評価した。
実施例1〜3および比較例1、2で調製した表面を、エチレンオキサイドガス滅菌(40℃、20分)した。次に滅菌した表面を24穴細胞培養皿(IWAKI社より購入)の底部に挿入し、細胞数40個/mm2のL6細胞(マウス骨格筋由来Cell Line:ATCC社より購入)を播種し、DMEM(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清)中で5%CO2存在下、37℃にて4日間培養した。リファレンスとして、未処理表面も同条件で実験を行った。なお、細胞数の計測は、培養1日目と4日目で行った。計測は、WSTアッセイキット(DOJINDO社製)を使用して行った。その結果を表1および図2に示す。
Claims (7)
- 水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ(ε-カプロラクトン)に、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも1つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトしてなる表面を有することを特徴とする細胞培養基材。
- 親水性骨格を含むポリマー鎖が、疎水性ポリマー骨格100重量部に対して5重量部以上グラフトされている請求項1記載の細胞培養基材。
- 表面の水接触角が25°〜60°である請求項1又は2に記載の細胞培養基材。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養基材を用いることを特徴とする細胞の培養方法。
- 以下の工程を含む細胞培養基材の製造方法。
(1)水接触角が75°〜100°であるポリスチレンまたはポリ(ε-カプロラクトン)の表面を作製する工程
(2)工程(1)で作製した表面にポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、またはそれらの誘導体若しくは共重合体の少なくとも1つの親水性骨格を含む、分子量500〜2000のポリマー鎖をグラフトする工程 - 工程(2)の親水性骨格を含むポリマー鎖のグラフトがプラズマグラフト共重合によることを特徴とする請求項5に記載の製造方法。
- 工程(2)で親水性骨格を含むポリマー鎖をグラフトすることにより、表面の水接触角を25°〜60°とすることを特徴とする請求項5または6に記載の製造方法。
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