CN102887976A

CN102887976A - 仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构共聚物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102887976A
Application number: CN2011102053739A
Authority: CN
Inventors: 宫永宽; 刘丽平; 党媛; 史素青
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2011-07-21
Filing date: 2011-07-21
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-07-21
Also published as: CN102887976B

Abstract

本发明公开了结构通式（

）所示的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物，其中m为10～1000的正整数，n为0～500的正整数，x为5～500的正整数；在m、n、x中，m摩尔百分数为30～90％，n为0～50％，x为10～70％；R₁、R₂、R₃为H或CH₃；R₄为碳原子数为4～18的烷烃基；V为含有2-300个碳原子链连接的邻苯二酚基团；W为含2～8个碳原子链连接的亲水基团，亲水基团是季铵基、磷酰胆碱基团、吡啶盐、磺酸基、磷酸基、羧酸基或硫酸基。本发明涂层结合牢固、几乎适用于如何材料的表面仿细胞外层膜结构的构建方法，可提高人工器官及相关材料、药物控释体系、分离材料及其它材料的表面亲水性能及生物相容性。

Description

仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构共聚物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物及其制备方法，具体涉及粘附型仿细胞膜结构（甲基）丙烯酸酯类共聚物，属于高分子化学与物理、表面科学及生物医用材料技术领域。

背景技术

磷酰胆碱是生物细胞外层膜的亲水基团，用含磷酰胆碱基团的亲水-亲油的两亲性聚合物涂覆修饰材料，在与水接触时其表面形成仿细胞膜结构，会被细胞认为是自体，可获得优良的生物相容性。

这类含磷酰胆碱基团聚合物涂层可通过物理吸附或化学键合附着于被修饰材料表面。然而，以物理吸附作用结合的两亲性聚合物涂层分子，在体内复杂环境中有可能发生溶解、降解等作用而流失；另一方面，涂层表面的微观聚集结构随自组装过程的条件及组装后的环境因素可发生某种程度的不可逆结构变化，影响此类材料表面性能及相关产品的开发和应用。

美国专利US 5,648,442使用含永久性正电荷侧基以及可与材料表面有较强附着性能的其它侧基的自由基聚合物对材料表面涂覆来赋予生物相容性。在提高涂层的结合稳定性方面，Kim等人（K.Kim，C. Kim，Y. Byun，J. Biomat. Sci. -Polymer Edition，2003, 14, 887) 在甲基丙烯酰基表面接枝聚合制备稳定的磷脂单分子层作为血液相容性材料。在聚丙烯腈不对称膜表面直接反应形成磷脂基团进行仿生表面改性（X. J. Huang, et al. Polymer，2006，47, 3141)，含磷酰胆碱基团的化合物被共价连接在羟基聚合物聚乙烯醇和甲基丙烯酸羟乙酯表面形成稳定的单分子涂层［J. A. Hayward, Biomaterials, 1986，7, 252)。中国专利申请CN01817377.2介绍了一种涂敷材料表面的方法，包括材料表面的功能化反应及表面聚合涂层的制备。获得的复合材料具有对于基材的粘合性、耐久性、亲水性、润湿性、生物相容性和渗透性等特性，可用于制造生物医学制品如眼用装置。CN1717464A 报道了一种将用带有醛基的磷酰胆碱化合物接枝到材料表面的改性方法，可明显提高材料的生物适应性及亲水性能。然而，通过表面化学反应来提供亲水基团的改性方法，对不同材料及表面形貌物体的改性效果有较大差异，通常较难获得足够的表面基团密度。

为利用涂覆法工艺简单，适应性强，改性效果显著等优点，将化学交联法被用来提高涂层的结合稳定性。Lewis等人用含有烷氧基硅烷可交联基团的四元共聚物来提高涂层的稳定性（1、A. L. Lewis, Z. L. Cumming, Biomaterials 2001，22, 99; 2、J.-P. Xu, J. Ji, W.-D. Chen, D.-Z. Fan, Y.-F. Sun, J.-C. Shen, European Polymer Journal ，2004，40, 291)。涂层在70～90℃加热4～9小时，使三甲氧基硅基团与另一组分（侧链）的端羟基反应得到交联固化的修饰涂层。然而,按照体系能量保持最低的原理，涂层在空气中加热，憎水基团将取向迁移到表面，形成疏水表面以降低表面能。这种交联的疏水表面结构与细胞外层膜的结构相反，形成反细胞外层膜结构的涂层表面。CN1916040报道了一种含可交联基团的磷酰胆碱聚合物，形成的涂层在含水液体中处理可得到仿细胞外层膜结构。但这种可交联聚合物在制备、涂层表面结构调整及交联固定各环节均难以控制，不易获得稳定的仿细胞外层膜结构涂层。

贻贝是一种广泛存在于海洋中的甲壳类生物，在复杂的海洋环境中可以牢固地附着于几乎任何表面上。仿照贻贝粘附蛋白主要成分邻苯二酚基团的万能粘附作用，Lee等人制备了邻苯二酚接枝的聚乙二醇及胶水（Langmuir, 2010, 26, 3790-3793，Nature, 2007, 448，338-341）。本发明将具有万能粘附作用的邻苯二酚基团引入到仿细胞膜结构聚合物侧链上，以获得双仿生共聚物进而构建仿细胞外层膜。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可粘附于绝大部分材料表面的含邻苯二酚和亲水基团的双仿生共聚物，以解决通常的物理吸附聚合物涂层不稳定、化学反应固定涂层过程复杂、以及改性效果不理想等不足。

本发明的另一目的是提供上述双仿生共聚物的制备方法；

本发明的还有一个目的是提供上述双仿生共聚物在制备仿细胞外层膜结构涂层方面的应用。

用含贻贝粘附蛋白主要成分邻苯二酚基团和亲水基团的双仿生共聚物，在含水溶液中可自动粘附在材料表面，形成仿细胞外层膜结构表界面。仿粘附蛋白的邻苯二酚基团在材料表面经疏水作用、配位作用、氧化聚合等形成与表面结合牢固的仿细胞外层膜结构，达到对材料表面改性的目的。

本发明的实现过程：

结构通式（

）表示的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物，

Figure 2011102053739100002DEST_PATH_IMAGE002

其中，m为10～1000的正整数，n为0～500的正整数，x为5～500的正整数；在m、n、x中，m摩尔百分数为30～90％，n为0～50％，x为10～70％；

R₁、R₂、R₃为H或CH₃；

R₄为碳原子数为4～18的烷烃基；

V为含有2-300个碳原子链连接的邻苯二酚基团；

邻苯二酚基团为

Figure 2011102053739100002DEST_PATH_IMAGE003

。

W为含2～8个碳原子链连接的亲水基团，亲水基团是季铵基、磷酰胆碱基团、吡啶盐、磺酸基、磷酸基、羧酸基或硫酸基，优选为2～8个碳原子链连接的磷酰胆碱基团。

上述仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物的制备方法，其将结构式（II）共聚物在有机溶剂中与多巴或多巴胺反应得到双仿生共聚物（I），有机溶剂选自二甲基亚砜、氯仿、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙酸乙酯、N、N-二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮、四氢呋喃、乙醇、甲醇、异丙醇；共聚物多巴胺化反应使用盐酸化多巴胺，并用三乙胺、三甲胺或二异丙基乙基胺作缚酸剂。

Figure 2011102053739100002DEST_PATH_IMAGE004

R₁、R₂、R₃为H或CH₃；

R₄为碳原子数为4～18的烷烃基；

Z为含有2-300个碳原子链连接的对硝基苯氧甲酰基活性酯；

W为含2～8个碳原子链连接的亲水基团，亲水基团是季铵基、磷酰胆碱基团、吡啶盐、磺酸基、磷酸基、羧酸基或硫酸基。

结构式（II）共聚物通过含亲水基团、对硝基苯氧甲酰基活性酯基团及烷烃基的丙烯酸可聚合单体共聚得到，反应如下，

上述仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物制备仿细胞外层膜结构涂层的方法：将共聚物溶于水或含水的有机溶剂，用浸渍或喷涂方法使聚合物在被修饰材料或器具表面均匀涂覆形成涂层，涂层在温度低于130℃热处理或水中浸泡处理增加涂层的稳定性；有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或其混合溶剂。

涂层在含水液体中浸泡，自动形成仿细胞外层膜结构界面，仿细胞外层膜结构涂层与水接触的后退角小于20度。将双仿生共聚物涂覆在材料表面后，表面与水接触的前进角可变到50~80度，后退角可变到5~20度。

本发明用含粘附蛋白主要成分多巴胺及亲水基团的两亲性共聚物涂覆材料表面构建生物相容性涂层，共聚物中的多巴胺基团与表面通过疏水、配位及共价反应牢固结合于材料表面，而亲水基团则位于表面或含水界面，自动形成稳定的、仿细胞外层膜结构的生物相容性涂层。本发明构建的材料表面仿细胞外层膜结构涂层，由于表面亲水基团的规整结构，使其具有较好的亲水性能和良好的生物相容性。这种构建方法简便、涂层结合牢固、几乎适用于如何材料的表面仿细胞外层膜结构的构建方法，可使人工器官及相关材料、药物控释体系、分离材料及其它材料的表面亲水性能及生物相容性明显提高，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 PMPA聚合反应及PMCA的合成反应方程式；

图2为为含磷酰胆碱基团和邻苯二酚基团聚合物的1HNMR图谱；

图3为本发明的双仿生共聚物涂层改性后各种基材表面的XPS扫描谱图；

图4为本发明的双仿生共聚物涂层改性前、后玻璃（A、B）、聚丙烯（C、D）、聚碳酸酯（E、F）、聚四氟乙烯（G、H）及不锈钢（I、J）表面血小板粘附结果的扫描电镜图。

具体实施方式

含磷酰胆碱基团的单体可按文献报道的方法（Ishihara et al. Polym. J, 22(5)，355-360，1990；Umeda et al. Makromol. Chem. 3: 457-459, 1982）合成。

如图1所示，上述双仿生共聚物的制备包括下述三个步骤： 1）含活性酯可聚合单体的制备；2) 含活性酯基团、亲水基团及憎水基团共聚物PMPA的制备；3) 双仿生聚合物PMCA的制备。

以对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酸聚乙二醇酯MEONP活性酯可聚合单体的制备为例，在100mL三颈圆底烧瓶中将10.80g甲基丙烯酸聚乙二醇酯和3.03g三乙胺溶于30mL氯仿中，-30℃下搅拌；滴加6.05g对硝基苯氧甲酰氯的30mL氯仿溶液，保持-30℃低温下搅拌反应2h。加入乙醚使沉淀，G4砂芯漏斗过滤除去三乙胺盐酸盐，得到淡黄色的油状对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酸聚乙二醇酯。

含磷酰胆碱基团W单体（M）、含活性酯基团的单体（P）及含憎水链R₄单体（A）按设计比例用无水乙醇溶解后加入三颈反应瓶。通氮气除氧后，加入热分解型自由基聚合引发剂，60～75℃聚合得到共聚物PMPA。减压蒸除大部分溶剂后，用4倍体积的乙醚进行沉淀，得到淡黄色的固体即为PMPA。

双仿生聚合物PMCA的制备：在通氮气的条件下，在无水有机溶剂中将PMPA共聚物与1.5倍当量的盐酸化多巴胺或多巴及三乙胺（二异丙基乙基胺），在反应烧瓶中于50～78℃反应12小时。产物溶液用pH 3.0-4.0的盐酸水溶液中透析除去杂质，冷冻干燥后得到多巴胺化的仿细胞膜结构共聚物，即双仿生共聚物PMCA。双仿生共聚物中亲水单元和邻苯二酚基团的含量可通过¹H NMR表征确定。

上述双仿生共聚物PMCA可用于制备仿细胞外层膜结构涂层。用双仿生共聚物制备仿细胞外层膜结构涂层采取如下方法进行。将双仿生共聚物溶于水、醇或其它有机溶剂的水溶液中，用浸渍或喷涂方法使聚合物在被修饰材料/器具表面均匀涂覆，得到表面结合牢固的表面仿细胞外层膜结构的涂层。

实施例1

含磷酰胆碱及活性酯基团共聚物P(MPC-MEONP)的制备：在氮气保护下，于250mL三颈瓶中加入100mL无水乙醇，2.58g对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酰聚乙二醇酯(MEONP，聚乙二醇碳原子为6)，2.95g甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈0.0522g，在65℃反应24h。减压蒸发除去三分之二溶剂后，用4倍溶液体积的乙醚进行沉淀，得到淡黄色的固体，即为P(MPC-MEONP)。¹H NMR测得MPC和MEONP组分的摩尔含量为69％和31％。

实施例2

含磷酰胆碱、活性酯基团及憎水基团共聚物PMPA的制备：在氮气保护下，于250mL三颈瓶中加入150mL无水乙醇，1.76g对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酰聚乙二醇酯(MEONP，聚乙二醇碳原子约为200)，3.98g甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，1.27g甲基丙烯酸十二烷基酯（LMA）和作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈0.0703g，在70℃反应24h。减压蒸发除去三分之二溶剂后，用截留分子量为6000的透析袋透析2天，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到淡黄色的PMPA固体。¹H NMR测得聚合物PMPA中MPC、MEONP和LMA各组分的摩尔百分含量分别为61％，18％和21％。

实施例3

含磷酰胆碱、活性酯及憎水基团共聚物PMPA的制备：在氮气保护下，于250mL三颈瓶中加入150mL无水异丙醇，3.52g对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酰聚乙二醇酯(MEONP，聚乙二醇碳原子为6)，3.98g甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)，1.27g甲基丙烯酸十二烷基酯（LMA）和作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈0.0812g，在70℃反应24h。减压蒸发除去三分之二溶剂后，用截留分子量为6000的透析袋透析2天，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到淡黄色的PMPA固体。¹H NMR测得MPC、MEONP和LMA各组分的摩尔百分含量分别为48％，37％和15％。

实施例4

含磷酰胆碱、邻苯酚基团和憎水基团共聚物PMCA的制备：在氮气保护下，于100mL三颈瓶中加入60mL无水异丙醇，2.66g PMPA（实施例3制备），0.416g的盐酸化多巴胺，0.31mL的三乙胺，60℃下反应12小时。减压蒸发除去三分之二溶剂后，用截留分子量为6000的透析袋透析2天，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到淡黄色的PMCA固体。¹H NMR测得聚合物中MPC、邻苯二酚基团和LMA的摩尔百分含量分别为49%、34%和17%。

实施例5

含磷酰胆碱及活性酯基团共聚物PMP的制备：在氮气保护下，于250mL三颈瓶中加入150mL无水乙醇，2.66g对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酰聚乙二醇酯(MEONP)，3.98g甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈0.0755g，在70℃反应24h。减压蒸发除去三分之二溶剂后，用截留分子量为6000的透析袋透析2天，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到淡黄色的PMP固体。¹H NMR测得MPC和MEONP的摩尔百分含量分别为88%和12%。

实施例6

含磷酰胆碱及活性酯基团共聚物PMP的制备：在氮气保护下，于250mL三颈瓶中加入150mL无水乙醇，2.84g对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酰聚乙二醇酯(MEONP，聚乙二醇碳原子为200)，1.96g甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和作为聚合引发剂的偶氮二异丁腈0.0983g，在70℃反应24h。减压蒸发除去三分之二溶剂后，用截留分子量为6000的透析袋透析2天，将透析袋中的溶液冷冻干燥，得到淡黄色的PMP固体。¹H NMR测得MPC和MEONP的摩尔百分含量分别为69%和31%。

实施例7

含磷酰胆碱及邻苯二酚基团共聚物的制备：在通氮气的条件下，于100mL三颈瓶中加入40mL无水1-甲基-2-吡咯烷酮，1.21gMEONP单元含量为12%的聚合物P(MPC-MEONP)，0.098g的盐酸化多巴胺，0.16mL的三乙胺，60℃下反应12小时。反应液在截留分子量为6000的透析袋中用pH 3.0-4.0的盐酸水溶液透析，冷冻干燥得到多巴胺化的仿细胞膜结构聚合物，即双仿生聚合物catechol-g-P(MPC-MEONP)。¹H NMR测得磷酰胆碱基团和邻苯二酚基团的摩尔百分含量分别为89％和11％。

实施例8

含磷酰胆碱及邻苯二酚基团共聚物的制备：在通氮气的条件下，于100mL三颈瓶中加入60mL无水1-甲基-2-吡咯烷酮，1.65g MEONP单元含量为31%的聚合物P(MPC-MEONP)，0.475g的盐酸化多巴胺，0.310mL的三乙胺，60℃下反应12小时。反应液在截留分子量为6000的透析袋中用pH 3.0-4.0的盐酸水溶液透析，冷冻干燥得到多巴胺化的仿细胞膜结构聚合物，即双仿生聚合物catechol-g-P(MPC-MEONP)。¹H NMR测得磷酰胆碱基团和邻苯二酚基团的摩尔百分含量分别为71％和29％。

实施例9

含亲水基团-季铵基(磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯SBMA)和邻苯酚基团共聚物的制备：在通氮气的条件下，于250mL三颈瓶中加入150mL无水乙腈，2.69g含季铵基的磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯SBMA，5.19g对硝基苯氧甲酰甲基丙烯酰聚乙二醇酯(MEONP)，60℃下反应24小时。反应液在截留分子量为6000的透析袋中用pH 3.0-4.0的盐酸水溶液透析，冷冻干燥得到含亲水性季铵基磺酸盐和活性酯的共聚物PSP。在通氮气的条件下，于100mL三颈瓶中加入60mL无水乙醇，1.43g 含亲水性季铵基磺酸盐和活性酯的共聚物PSP，0.415g的盐酸化多巴胺，0.286mL的三乙胺，60℃下反应12小时。反应液在截留分子量为6000的透析袋中用pH 3.0-4.0的盐酸水溶液透析，冷冻干燥得到多巴胺化的仿细胞膜结构聚合物，即双仿生聚合物catechol-g-P(SBMA-MEONP)。¹H NMR测得季铵基基团和邻苯二酚基团的摩尔百分含量分别为57％和43％。

实施例10

同实施例9方法，合成了邻苯酚含量为29%和13%的含有季铵基的磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯SBMA和邻苯酚基团的双仿生共聚物PSC。

Figure 2011102053739100002DEST_PATH_IMAGE006

实施例11

将干净的玻璃片、聚丙烯片、聚碳酸酯片、不锈钢片及聚四氟乙烯片分别浸入实施例8的双仿生共聚物的水溶液中。在浓度为5.0mg/mL，pH为8.5 的双仿生共聚物溶液中浸涂24h。室温干燥后于100摄氏度加热处理8h，涂覆前后表面与水接触的前进角及后退角如表2所示，表面元素含量变化如图3、表3所示。

Figure 2011102053739100002DEST_PATH_IMAGE008

实施例12

实施例10中涂覆改性后的表面置于60摄氏度甲醇中12小时和0.5%十二烷基苯磺酸钠(SDS)溶液中超声30分钟，之后测定水接触前进角和后退角如表4所示。

实施例13

实施例10中涂覆改性前后表面置于PBS中浸泡2h，之后再用PBS淋洗三次，用滤纸从样片的边上吸掉多余的PBS。用移液器移取20μL 富含血小板的血浆滴加在样片表面中央，在二氧化碳培养箱中37℃下孵育2h。用PBS淋洗样片，洗掉黏附不牢固的血小板。然后将样品片浸泡入2.5%的戊二醛溶液中进行固定1h后用PBS和蒸馏水淋洗。冷冻干燥后观察血小板的形貌和数量，扫描电镜照片如图4所示。双仿生共聚物涂覆改性后对血小板粘附的数量显著降低，说明血液相容性明显提高。

Claims

1.结构通式（

）表示的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物，

R₁、R₂、R₃为H或CH₃；

R₄为碳原子数为4～18的烷烃基；

V为含有2-300个碳原子链连接的邻苯二酚基团；

2.根据权利要求1所述的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物，其特征在于：W为2～8个碳原子链连接的磷酰胆碱基团。

3.权利要求1所述的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物的制备方法，其特征在于：将结构式（II）共聚物在有机溶剂中与多巴或多巴胺反应得到双仿生共聚物（I），

R₁、R₂、R₃为H或CH₃；

R₄为碳原子数为4～18的烷烃基；

Z为含有2-300个碳原子链连接的对硝基苯氧甲酰基活性酯；

4.根据权利要求3所述的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物的制备方法，其特征在于：结构式（II）共聚物通过含亲水基团、对硝基苯氧甲酰基活性酯基团及烷烃基的丙烯酸可聚合单体共聚得到，反应如下，

。

5.根据权利要求3所述的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物的制备方法，其特征在于：有机溶剂选自二甲基亚砜、氯仿、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙酸乙酯、N、N-二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮、四氢呋喃、乙醇、甲醇、异丙醇。

6.根据权利要求3所述的仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物的制备方法，其特征在于：共聚物多巴胺化反应使用盐酸化多巴胺，并用三乙胺、三甲胺或二异丙基乙基胺作缚酸剂。

7.权利要求1所述仿贻贝粘附蛋白和细胞膜结构双仿生共聚物制备仿细胞外层膜结构涂层的方法，其特征在于：将共聚物溶于水或含水的有机溶剂，用浸渍或喷涂方法使聚合物在被修饰材料或器具表面均匀涂覆形成涂层。

8.根据权利要求7所述制备仿细胞外层膜结构涂层的方法，其特征在于：有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、1-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二甲基甲酰胺或其混合溶剂。

9.根据权利要求7所述制备仿细胞外层膜结构涂层的方法，其特征在于：涂层在温度低于130℃热处理或水中浸泡处理增加涂层的稳定性。

10.根据权利要求7所述的制备仿细胞外层膜结构涂层的方法，其特征在于：涂层在水中浸泡，自动形成仿细胞外层膜结构界面，仿细胞外层膜结构涂层与水接触的前进角为50~80度，后退角为5~20度。