CN103588933B

CN103588933B - 多重仿生抗生物污染共聚物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103588933B
Application number: CN201310466647.9A
Authority: CN
Inventors: 孔佳美; 宫永宽
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2013-10-10
Filing date: 2013-10-10
Publication date: 2016-09-07
Anticipated expiration: 2033-10-10
Also published as: CN103588933A

Abstract

本发明公开了一种新型多重仿生抗生物污染共聚物，其中亲水单元为仿细胞膜结构甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱，疏水单元为细胞膜主要组成成分胆固醇，同时引入具有万能粘附功能的多巴胺来实现该共聚物在材料表面的粘附固定。本发明的多重仿生抗生物污染共聚物不仅可通过简单的物理粘附实现材料表面仿生改性，提高生物材料及器件的生物相容性，而且具有在水溶液中自组装形成胶束的能力，在生物医药领域有着广泛应用前景。

Description

多重仿生抗生物污染共聚物及其制备方法和应用

技术领域

本发明设计了一种新型多重仿生抗生物污染共聚物的制备方法及其应用，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

生物相容性是指植入动物体内的材料与肌体之间的适应性，包括组织相容性和血液相容性。植入体内的生物医用材料及各种人工器官、辅助装置等，必须无毒性、无致敏性、无刺激性、无遗传毒性和无致癌性，对生物体组织、血液、免疫等系统不产生不良反应。提高材料生物相容性是一个最终和总体的目标。通过表面改性提高生物相容性的方法和手段多种多样，可分为两大类：生物“活化”表面的方法和“钝化”表面的方法。

磷酰胆碱（也称磷酸胆碱，phosphorylcholine，PC ）基团是组成细胞外层膜基本单元卵磷脂的亲水端基，是细胞外层膜中的最外层基团。磷酰胆碱同时带有正、负两种电荷，可以与水分子形成较牢固的水合层。这种性质使富含磷酰胆碱基团的材料不易吸附及沉集蛋白质、脂质体、细胞等生物体成分。

基于聚合物胶束的药物控释系统是一类应用前景广阔的纳米载体，它同时具有亲水基团和疏水基团，在水中形成胶束，并对药物进行增溶和包裹。对其疏水性内核的筛选有利于携带不同性质的药物；而对其亲水性外壳的设计和优化则能使载药胶束体系逃避单核巨噬细胞的吞噬，实现在人体血液中的长循环，赋予其“隐形”性能。

利用MPC亲水性的特点，可在其分子链上引入生物亲和性较好的疏水基团，合成两亲性磷酰胆碱衍生物，其在水溶液中能通过自组装形成胶束，用于包埋疏水性的药物小分子或亲水性的多肽、蛋白质药物，从而达到控制释放药物的目的。

发明内容

本发明目的在于提供一种新型稳定性及耐受性好的多重仿生抗生物污染的两亲性共聚物；

本发明另一目的在于提供上述两亲性共聚物的制备方法；

本发明还有一个目的是提供上述多重仿生共聚物在构建仿细胞外层膜结构涂层和具有良好生物相容性的纳米级聚合物载体中的应用。

本发明的实现过程如下：

结构式（I）所示的两亲性共聚物，

（I）

共聚物中各单元的摩尔百分数x为30% ~ 70%，y为10% ~ 60%，z为10% ~ 40%，x +y + z = 100%；

V 为多巴胺;

W 为乙二胺化的胆固醇

。

上述两亲性共聚物的制备方法是以结构式（II）所示共聚物在有机溶剂中与多巴胺和乙二胺化的胆固醇反应得到，

（）

在x、y中，x摩尔百分数为30% ~ 70%，y摩尔百分数为30% ~ 70%；U 为对硝基苯氧甲酰基活性酯。

所述的有机溶剂选自二甲基亚砜、乙醇、氯仿、四氢呋喃、正丁醇。

所述的多巴胺为盐酸化多巴胺，并用三乙胺作缚酸剂。

上述两亲性共聚物可应用在医用材料表面改性中，具体来说，是将两亲性共聚物溶于四氢呋喃，用滴涂、浸涂或喷涂法使聚合物在被修饰材料或器具表面均匀涂覆，通过低于160℃的加热处理得到稳定涂层。

上述两亲性共聚物还可应用在制备抗生物污染两亲性共聚物胶束中，具体来说，是将两亲性共聚物溶于有机溶剂，通过溶剂挥发法或溶剂互溶扩散法制备得到自组装胶束平均粒径为90±50nm，多分散系数为0.126 ~ 0.319的胶束分散液，所述的有机溶剂选自四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、正丁醇。

本发明两亲性共聚物的亲水性单元为仿细胞膜结构甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（MPC），疏水性单元为细胞膜主要组成成分胆固醇（Cholesterol），同时含有粘附蛋白主要成分多巴胺。共聚物不同侧链上的胆固醇基团刚性的憎水结构和磷酰胆碱两性离子亲水基团赋予该共聚物明显的既亲水、又亲油的两亲性。其它侧链上的多巴胺基团则赋予该共聚物粘附性能，使该两亲性共聚物既能与基材形成稳定的涂层，又可在水溶液中形成稳定的胶束。

本发明的优点与积极效果：（1）本发明得到的新型多重仿生抗生物污染两亲性共聚物，以磷酰胆碱为亲水单元、胆固醇为刚性疏水单元，使得共聚物在具备仿细胞外层膜结构的同时，又结合了胆固醇的刚性结构和多巴胺的粘附性能，从而表现出优异的涂层稳定性。（2）本发明提供的仿细胞外层膜结构涂层构建方法简便、涂层结合牢固、几乎适用于任何材料的表面仿细胞外层膜结构的构建。由该方法所得的涂层亲水基团表面覆盖率高，具有良好的亲水性能和生物相容性，因此可广泛应用于材料表面的亲水化处理和生物医用材料表面的生物相容性修饰，获得优异的稳定性及生物相容性。该新型共聚物可使体内植入器件、分离材料及其他材料的表面亲水性能及生物相容性明显提高，具有广阔的应用前景。（3）本发明提供的纳米级自组装胶束，制备过程简单，条件温和；这种具有仿细胞外层膜结构的纳米颗粒作为药物载体，可以有效抑制蛋白吸附和血小板粘附，不易被单核巨噬细胞吞噬，从而延长在体内循环时间，提高药物利用率并降低毒副作用。

附图说明

图1 多重仿生两亲性嵌段聚合物PMNCC的核磁谱图（CDCl₃:CD₃OD=1:1）；

图2 经多重仿生共聚物PMNCC改性前后聚碳酸酯及聚四氟乙烯表面的动态接触角变化柱状图；

图3 经多重仿生共聚物PMNCC改性前后聚碳酸酯及聚四氟乙烯表面的牛血清白蛋白(BSA)和牛血纤维蛋白原(Fg ) 吸附量柱状图；

图4 经多重仿生共聚物PMNCC改性前后聚碳酸酯及聚四氟乙烯表面血小板吸附的扫描电镜图；

图5 两亲性自组装纳米胶束的粒径分布直方图；

图6 两亲性自组装纳米胶束扫描电镜照片。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例 1 乙二胺化胆固醇的制备

向250mL三颈圆底烧瓶中转移50mL的无水二氯甲烷和37.5mL的无水乙二胺，将反应温度调节至0-5℃恒温，调节磁力搅拌至深漩涡状。避光条件下称取5.0245g 的氯甲酸胆固醇酯，将其溶解于60mL的无水二氯甲烷中，溶解充分后将溶液转移至恒压滴液漏斗中，然后在冰浴且高速搅拌状态下将该溶液滴加到前述三颈圆底烧瓶中，滴加时间约为5.5h。滴加完毕后，室温条件下避光反应过夜。将反应液用等体积的蒸馏水萃取三次，除去乙二胺盐酸盐和乙二胺，向有机相中加入等体积的无水二氯甲烷，再用饱和食盐水萃取有机相三次，然后用大量无水硫酸镁干燥有机相过夜，除去水分。将干燥后的有机相减压抽滤除去硫酸镁固体，得到的清液在室温条件下避光旋蒸然后30℃下真空干燥，所得乳白色固体即为Chol-NH₂。产率为95%。

实施例 2 含活性酯可聚合单体MEONP的制备

向250mL三颈圆底烧瓶中加入17.0556g甲基丙烯酸聚乙二醇酯和4.8001g三乙胺，量取60mL氯仿倒入三颈烧瓶中，通过磁力搅拌使其充分溶解。称取9.6214g对硝基苯氧甲酰氯溶解于100mL氯仿中，将该溶液转移至恒压滴液漏斗中，使反应氛围保持-45℃~-50℃恒温，将对硝基苯氧甲酰氯缓慢滴加至反应三颈瓶内，滴加时间约为2h，在密封条件下继续反应约2h。最后将其转移至室温反应过夜。用旋转蒸发仪处理反应液至体积为50mL，再加入等体积的冷乙醚，先用布氏漏斗滤去大部分三乙胺盐沉淀，再用G4砂芯漏斗重复过滤三次，彻底除去沉淀。旋蒸反应液至体积为50mL，加入等体积氯仿，得到淡黄色的澄清溶液，用等体积的pH=3-4的盐酸水溶液对其萃取三次，以除去三乙。最后将溶液在30℃旋蒸至无液体蒸出。所得淡黄色粘稠液体即为活性酯单体MEONP。产率80%。

实施例 3 含磷酰胆碱及高含量活性酯基团共聚物P(MPC-MEONP) 的制备

氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中加入10mL无水乙醇，称取0.0378g AIBN溶于6mL THF，待完全溶解后取该溶液的四分之一体积转移至上述三颈瓶内，将反应温度调节至70℃~75℃恒温，打开磁力搅拌，保持该状态1h 。向恒压滴液漏斗内加入40mL溶有1.9630gMEONP 和0.5607g 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱（MPC）的无水乙醇溶液，以及余下四分之三体积AIBN 的THF溶液，待溶解充分后，将该溶液缓慢滴加至前述三颈瓶内，滴加完毕后，继续密封反应24h，得到淡黄色的透明溶液。减压旋蒸除去三分之二溶剂后，在截留分子量为3500的透析袋内用pH=3-4 的磷酸缓冲液透析2d，再将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到的乳白色絮状物即为共聚物PMN46。¹H-NMR 测得共聚物PMN 中MPC和MEONP各组分的摩尔百分含量分别为41%和59%。

实施例 4 含磷酰胆碱及低含量活性酯基团共聚物P(MPC-MEONP) 的制备

氮气保护下，向150mL三颈圆底烧瓶中加入10mL无水乙醇，称取0.0439g AIBN溶于6mL THF，待完全溶解后取该溶液的四分之一体积转移至上述三颈瓶内，将体系温度调节至70℃~75℃恒温，打开磁力搅拌，保持该状态1h 。向恒压滴液漏斗内加入30mL溶有1.4997gMEONP 和0.6989g MPC的无水乙醇溶液，以及余下四分之三体积AIBN 的THF溶液，待溶解充分后，将该溶液缓慢滴加至前述三颈瓶内，滴加完毕后，继续密封反应24h，得到淡黄色的透明溶液。减压旋蒸除去三分之二溶剂后，在截留分子量为3500的透析袋内用pH=3-4 的磷酸缓冲液透析2d，再将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到的乳白色絮状物即为共聚物PMN64。¹H-NMR测得共聚物PMN 中MPC和MEONP各组分的摩尔百分含量分别为62%和38%。

实施例 5 含磷酰胆碱、邻苯二酚基团和胆固醇的两亲性聚合物PMNCC433的制备

向100mL 三颈圆底烧瓶中加入15mL溶有0.4367g PMN46 （MPC:MEONP=4:6）的无水乙醇溶液，待PMN46完全溶解后，将体系温度调节至60℃~65℃恒温，用恒压滴液漏斗将25mL溶有0.2094g Chol-NH₂的四氢呋喃溶液缓慢滴加至三颈瓶内，滴加速度保持在约为1滴/5s，滴加完毕后继续反应12h。反应结束后，氮气保护下向三颈瓶内加入10mL溶有0.0851g 盐酸化多巴胺的乙醇溶液，同时用恒压滴液漏斗向反应液中缓慢滴加5mL溶有0.0312g 三乙胺的无水乙醇溶液，70℃~75℃恒温反应12h。反应液首先在截留分子量为3500的透析袋内用氯仿透析48h，再换用乙醇透析12h，然后换用pH=3-4 的乙醇水溶液透析12h ，最后用pH=3-4的磷酸缓冲液透析48h。将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到的白色絮状物即为两亲性聚合物PMNCC。¹H-NMR谱图如图1所示，通过δ 3.29处磷酰胆碱的特征峰、δ 5.37处胆固醇特征峰以及δ 6.5和δ 6.7处多巴胺特征峰的积分面积计算得，共聚物PMNCC433 中磷酰胆碱、胆固醇和邻苯二酚基团的摩尔百分含量分别为41%、28%和31%，且产物纯净，基本无杂质。

实施例 6 含磷酰胆碱、邻苯二酚基团和胆固醇的两亲性聚合物PMNCC622的制备

向100mL 三颈圆底烧瓶中加入15mL溶有0.4987g PMN64 （MPC:MEONP=6:4）的无水乙醇溶液，待PMN64完全溶解后，把反应温度调节至60℃~65℃恒温，用恒压滴液漏斗将20mL溶有0.1216g Chol-NH₂的四氢呋喃溶液缓慢滴加至三颈瓶内，滴加速度保持在约为1滴/5s，滴加完毕后继续反应12h。反应结束后，氮气保护下向三颈瓶内加入10mL溶有0.0489g 盐酸化多巴胺的乙醇溶液，同时用恒压滴液漏斗向反应液中缓慢滴加5mL溶有0.0261g 三乙胺的无水乙醇溶液，70℃~75℃恒温反应12h。反应液首先在截留分子量为3500的透析袋内用氯仿透析48h，再换用乙醇透析12h，然后换用PH=3-4 的乙醇水溶液透析12h ，最后用PH=3-4的磷酸缓冲液透析48h。将透析袋内的溶液冷冻干燥，得到的白色絮状物即为两亲性聚合物PMNCC。¹H-NMR 测得共聚物PMNCC622 中磷酰胆碱、胆固醇和邻苯二酚基团的摩尔百分含量分别为62%、21%和17%，且产物纯净，基本无杂质。具体算法同实施例5。

实施例 7 多重仿生聚合物抗生物污染涂层的构建及性能测试

将实施例6的多重仿生共聚物溶于四氢呋喃与水的体积比为4:1的混合溶剂中，然后以滴涂法的方式将此聚合物溶液均匀地涂覆于清洗干净的聚碳酸酯片和聚四氟乙烯片上，室温干燥后于110℃加热处理8h，涂覆前后表面与水接触的前进角及后退角变化如图2所示，疏水性较强的片基表面经本发明共聚物改性后亲水性明显增强，成功地实现了亲水改性；改性前后表面的稳定性测试如图2所示，在经过75%消毒酒精浸泡12h（Test-）以及在模拟人体环境的PBS中超声1h（Test-）后，涂层表面的动态接触角几乎没有改变，间接说明涂层稳定性良好；改性前后表面的蛋白质吸附实验结果如图3所示，改性后表面的蛋白质吸附量明显降低，表现出了良好的生物相容性；改性后表面的血小板粘附实验结果如图4所示，改性后表面的血小板粘附量大幅度降低，表现出了良好的血液相容性。

实施例 8 两亲性聚合物PMNCC433 的胶束化

用分析天平称取0.0203g PMNCC433，将其溶于6mL的四氢呋喃中，待其溶解完全后，将该溶液用10mL规格的注射器在搅拌状态下滴加至20mL的超纯水中，滴加速度保持在1d/5s。滴加完毕后，继续在室温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，最后得到无沉积且乳光明显的胶束溶液。得到的胶束溶液用动态光散射仪测试得到的粒径数据如图5所示，胶束的平均数均水合粒径为50nm，多分散系数为0.150。

实施例 9 两亲性聚合物PMNCC622 的胶束化

用分析天平称取0.0199g PMNCC622，将其溶于6mL的四氢呋喃中，待其溶解完全后，将该溶液用10mL规格的注射器在搅拌状态下滴加至20mL的超纯水中，滴加速度保持在1d/5s。滴加完毕后，继续在室温下搅拌过夜，使有机溶剂挥发，最后得到无沉积且乳光明显的胶束溶液。得到的胶束溶液用动态光散射仪测试得到的粒径数据如图5所示，胶束的平均数均水合粒径为40nm，多分散系数为0.126。取一定体积纳米胶束溶液，稀释至0.3mg/mL。然后用移液器移取少量稀释后的胶束溶液滴加到干净的玻璃片上，在-50℃冷冻干燥24 h，将所得样品喷金后，用扫描电镜观察样品（结果如图6 所示）。

Claims

1.结构式（I）所示的两亲性共聚物，

（I）

共聚物中各单元的摩尔百分数x为30% ~ 70%，y为10% ~ 60%，z为10% ~ 40%，x + y +z = 100%；

V 为多巴胺;

W 为如下结构所示的胆固醇衍生物

。

2.权利要求1所述的两亲性共聚物的制备方法，其特征在于：以结构式（II）所示共聚物在有机溶剂中与多巴胺和胆固醇衍生物反应得到，

（II）

在x、y中，x摩尔百分数为30% ~ 70%，y摩尔百分数为30% ~ 70%；U 为对硝基苯氧基。

3.根据权利要求2所述的两亲性共聚物的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂选自二甲基亚砜、乙醇、氯仿、四氢呋喃、正丁醇。

4.根据权利要求2所述的两亲性共聚物的制备方法，其特征在于：所述的多巴胺为盐酸化多巴胺，并用三乙胺作缚酸剂。

5.权利要求1所述的两亲性共聚物在医用材料表面改性中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：将两亲性共聚物溶于四氢呋喃，用滴涂、浸涂或喷涂法使聚合物在被修饰材料或器具表面均匀涂覆，通过低于160℃的加热处理得到稳定涂层。

7.权利要求1所述的两亲性共聚物在制备抗生物污染两亲性共聚物胶束中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：将两亲性共聚物溶于有机溶剂，通过溶剂挥发法或溶剂互溶扩散法制备得到自组装胶束平均粒径为90±50nm，多分散系数为0.126 ~0.319的胶束分散液，所述的有机溶剂选自四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、正丁醇。