CN108342358A - 一种捕获癌细胞的涂层以及构建方法 - Google Patents

一种捕获癌细胞的涂层以及构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种捕获癌细胞的涂层以及构建方法，该方法包括：(1)聚多巴胺介导层的构建；(2)柔性伸长链聚乙二醇(PEG)涂层的构建；(3)含有活性酯基团的两性离子聚合物(PMEN91)涂层的构建；(4)肿瘤靶向配体(叶酸)涂层的构建。本发明具有适用范围广、制备方法简单易行、癌细胞捕获固定快、制备成本低等优势。

Description

一种捕获癌细胞的涂层以及构建方法
技术领域
本发明涉及材料技术领域，尤其涉及一种捕获癌细胞的涂层以及构建方法。
背景技术
癌症是世界范围内影响人类健康的主要疾病之一。众所周知，癌症的早期准确诊断不仅能够提高患者的生存率，而且可以帮助临床医生确定最适合病人的治疗策略，从而避免治疗不足或过量。然而，传统的检测手段存在局限性。例如，对于大多数案例，蛋白质和基因标记物存在灵敏度或者特异性不够高的问题，从而无法真正实现癌症早期准确诊断。因此，为进一步提高人们生活和健康水平，迫切需要建立灵敏度高、特异性好的癌症早期诊断方法。
循环肿瘤细胞(CTCs)是从原发性肿瘤或转移性部位脱离并作为转移细胞在外周血中循环的癌细胞。作为“肿瘤液体活检”的角色，检测和分析CTCs将为评估疾病状态提供重要的信息。然而，由于在大量血液细胞中CTCs的含量非常低，鉴别患者血液样品中的CTCs在技术上是具有挑战性的。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提出了一种在聚多巴胺介导层表面构建锚定的两性离子聚合物仿细胞外层膜结构、及接枝聚乙二醇长链外端耦合肿瘤靶向配体的组合涂层。该涂层能在短时间内高效将癌细胞从正常细胞和癌细胞的混合液中筛选出来并将其稳定地固定在表面上。由该涂层改性的材料将应用在癌症相关领域，如靶向药物传递系统或作为循环肿瘤细胞(CTCs)分离的底物涂层。
一种捕获癌细胞的涂层，包括涂层基底，在涂层基底的表面浸涂有聚多巴胺的介导层、在介导层的表面接枝有柔性长链二羧基聚乙二醇，在柔性长链二羧基聚乙二醇的末端羧基耦合有肿瘤靶向配体。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层，在介导层的表面不仅接枝有柔性长链二羧基聚乙二醇，而且接枝有两性离子聚合物。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层，所述介导层上的聚多巴胺层厚度为1～3nm；介导层上接枝的聚乙二醇层平均厚度为0.3～1.8nm、耦合的靶向配体密度为0.001～0.8nmol/cm2。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层，所述介导层上接枝的两性离子聚合物层厚度为1.5～3.6nm。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层，所述基底可以为玻璃、金属、塑料、陶瓷或复合材料。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层，所述肿瘤靶向配体为叶酸分子、RGD(Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、cRGDyK(Cyclo(Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)，环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)、cRGDfK(Cyclo(Arg-Gly-Asp-Tyr-Lys)，环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)、GRGDS(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)一种或几种。
一种捕获癌细胞的涂层构建方法，包括以下步骤：
(1)将涂层基底于多巴胺水溶液中浸涂形成聚多巴胺介导层；
(2)在聚多巴胺介导层的表面接枝柔性长链二羧基聚乙二醇构成抗生物污染涂层；
(3)在抗生物污染涂层伸展出的聚乙二醇末端羧基耦合肿瘤靶向配体，从而形成与癌细胞协同作用的靶向配体涂层。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层构建方法，所述步骤(2)包括：在聚多巴胺介导层的表面分别接枝柔性长链二羧基聚乙二醇和两性离子聚合物，最终形成仿细胞膜立体结构的抗生物污染涂层；
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层构建方法，所述柔性长链二羧基聚乙二醇的密度通过羧基聚乙二醇浓度：0.2～3mg/mL，反应温度：20℃～80℃及反应时间：20min～5h来调控。
进一步地，如上所述的捕获癌细胞的涂层构建方法，步骤(1)中浸涂的方法为：将涂层基底于多巴胺溶液浓度为0.2～1.5mg/mL，pH为6.0～6.8的溶液中反应1～8h，形成1～3nm结合稳定的聚多巴胺介导层。
生物活性表面是用生物分子功能化的表面，用于与生物物体的特异性相互作用。这些生物活性分子包括酶、抗体、核酸、抗生素和肽。它们的靶标是多样的，包括小生物分子、蛋白质、DNA分子、微生物甚至哺乳动物细胞。这样的表面在各种生物医学应用中是非常重要的，例如组织工程、生物传感器、人工植入物、药物递送系统以及肿瘤诊断。生物活性表面需要精心设计，使表面不仅具有足够数量的生物活性分子与其靶标相互作用而且能够抑制与其他分子的非特异性相互作用。
防污聚合物聚乙二醇(PEG)由于其良好的亲水性和柔顺性，不仅具有优异的抗非特异性蛋白吸附效果，而且末端功能化的PEG链可与肿瘤靶向配体连接，这为靶向配体和肿瘤细胞的特异性结合提供很大帮助。
磷酰胆碱作为两性离子聚合物中的一种，是细胞外层膜中带有等量正、负电荷的两性离子亲水官能团，可以结合大量的水分子形成一层水合层，表现出很好的生物相容性及抗污作用。
本发明提供的捕获癌细胞的涂层构建方法以及原理如下：
首先，将清洗干净的材料于多巴胺水溶液中浸涂形成聚多巴胺介导层；其次，用活化的二羧基聚乙二醇(HOOC-PEG-COOH)与聚多巴胺涂层表面的氨基反应固定在介导层；再其次，将经过多巴胺和二羧基聚乙二醇改性过的片基浸入到含活性酯基团的两性离子聚合物的乙醇溶液中，通过加热反应使亲水聚合物的活性酯基团与聚多巴胺涂层表面剩余的氨基发生酰胺化反应，将强亲水两性离子聚合物共价键合在材料表面；最后，将靶向配体分子与涂层表面二羧基聚乙二醇的末端共价结合，最终得到具有抗生物污染及肿瘤靶向性的组合涂层。
本发明聚多巴胺涂层表面的部分氨基与二羧基聚乙二醇的一端羧基反应，形成低表面密度的羧基聚乙二醇分子刷。分子刷密度用羧基聚乙二醇浓度：0.2～3mg/mL，反应温度：20℃～80℃及反应时间：20min～5h来调控。聚多巴胺涂层表面剩余氨基与含有活性酯基团的两性离子聚合物通过酰胺化反应锚定在表面形成具有仿细胞膜立体结构的组合抗生物污染涂层。
在聚多巴胺涂层表面接枝低表面密度的羧基聚乙二醇分子刷及锚定两性离子聚合物形成仿细胞膜立体结构的抗生物污染涂层后，在伸展出的聚乙二醇末端羧基耦合氨基化的叶酸分子、多肽肿瘤细胞靶向配体，形成与癌细胞高效协同作用的靶向配体壳层。多肽配体与叶酸分子的比例，可依据癌细胞的类型进行调整优化。肿瘤细胞靶向多肽包括RGD、cRGDyK、cRGDfK、GRGDS。
组合涂层表面培养正常细胞1h后，经缓冲溶液以20μL/min的流速淋洗，在淋洗液冲洗的范围内，所有正常细胞都能够被冲洗掉；而表面培养癌细胞1h后，同样流速条件下淋洗，在淋洗液冲洗的范围内，几乎全部癌细胞保留在表面。实验结果可说明该组合涂层可用于实验室分选细胞。
有益效果：
(1)适用范围广，本申请可在玻璃、金属、塑料、陶瓷及复合材料表面形成稳定的具有肿瘤细胞靶向性结合的涂层。
(2)制备方法简单易行。采用逐步浸涂法，通过控制材料在溶液中浸泡的时间、浓度、温度等条件对材料进行改性，而且细胞实验也可通过简单的操作方法得到相应的实验结果。
(3)癌细胞捕获固定快。将正常细胞和癌细胞以接近100:1的比例进行混合，以5μL/min的流速将混合细胞注射到该涂层改性片基的表面，通过体外细胞实验结果发现，该捕获癌细胞的涂层可在短时间内高效地将肿瘤细胞靶向固定在表面，而抗正常细胞的粘附。这将作为循环肿瘤细胞(CTCs)分离的底物涂层具有重要的应用。
(4)制备方法可控性、重复性高。体外细胞实验装置简单，可控性高，同时改性材料可重复多次利用，从而降低了成本。
附图说明
图1为改性涂层基底表面的静态接触角测量图；
图2为改性不锈钢表面的静态接触角测量图；
图3为改性聚丙烯(PP)表面的静态接触角测量图；
图4为改性聚四氟乙烯(PTFE)表面的静态接触角测量图；
图5为改性载玻片表面的原子力显微镜3D形貌图；
图6为改性载玻片表面培养正常细胞后的荧光显微镜照片；
图7为改性载玻片表面培养癌细胞的荧光显微镜照片；
图8为改性载玻片表面注射混合细胞的荧光显微镜照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的捕获癌细胞的涂层构建方法主要包括以下步骤：
(1)用piranha溶液(30％H2O2/95％H2SO4＝1:3)、蒸馏水超声清洗拟改性的涂层基底；
(2)聚多巴胺介导层的构建：将涂层基底浸入0.2～1.5mg/mL的多巴胺水溶液(pH6.0～6.8)中1～8h，表面自动形成1～3nm厚度的聚多巴胺介导层；
(3)把聚多巴胺介导层在20℃～80℃下浸于0.2～3.0mg/mL羧基聚乙二醇水溶液中20min～5h，通过酰胺化反应在聚多巴胺表面键合聚乙二醇，形成低密度向外伸展的柔性长链；
(4)将步骤(3)制备得到的涂层浸于配制成的0.5～3mg/mL的PMEN91聚合物的乙醇溶液中反应6～24h，在表面形成既含有两性离子聚合物的亲水界面又有向外伸展的PEG亲水壳层；
(5)将肿瘤靶向配体与涂层表面聚乙二醇末端羧基共价结合，得到一种具有两性离子仿细胞外层膜结构和柔性长链分子(聚乙二醇)连接肿瘤靶向配体的组合涂层。
实施例：
聚多巴胺介导涂层的构建：
(1)将载玻片(1×1cm2)用piranha溶液(30％H2O2/95％H2SO4＝1:3)超声洗涤2h，然后蒸馏水超声洗涤30min×4，烘干待用。
(2)将清洗干净的载玻片浸没于pH为6.5多巴胺(DA)溶液中3h，形成具有一定厚度的聚多巴胺涂层。反应完成后用蒸馏水浸泡片基10min,取出后冷风吹干备用。
柔性伸长链聚乙二醇(PEG)涂层的构建：
用pH为6.5的缓冲溶液配制聚乙二醇溶液，浓度为2mg/mL。将涂有聚多巴胺涂层的载玻片聚乙二醇水溶液中，50℃下酰胺化反应1h，在聚多巴胺表面键合向外伸展的低密度聚乙二醇柔性长链。反应完成后用蒸馏水浸泡片基10min,取出后冷风吹干备用。
含有活性酯基团的两性离子聚合物(PMEN91)涂层的构建：
在涂有聚多巴胺及羧基聚乙二醇的片基表面，60℃经酰胺化反应共价结合浓度为2mg/mL的PMEN91乙醇溶液，三乙胺调pH＝7.0，反应24h。反应完成后用蒸馏水浸泡片基10min,除去结合不牢固或未反应完全的两性离子聚合物，冷风吹干备用。
肿瘤靶向配体(叶酸)涂层的构建：
0.2mg/mL的靶向配体叶酸与涂层中聚乙二醇末端羧基在50℃下共价结合3h。反应完成后用二甲基亚砜(DMSO)溶剂浸泡片基10min,取出后冷风吹干备用。
图1为改性载玻片表面的静态接触角测量图；图2为改性不锈钢表面的静态接触角测量图；图3为改性聚丙烯(PP)表面的静态接触角测量图；图4为改性聚四氟乙烯(PTFE)表面的静态接触角测量图，通过图1～4的静态接触角测量结果来看，该组合涂层的构建具有适用范围广的特点。即可在玻璃、不锈钢、聚丙烯、甚至超疏水材料聚四氟乙烯表面形成稳定的具有肿瘤细胞靶向性结合的涂层。
图5为不同涂层改性载玻片表面的原子力显微镜形貌图，图5中通过使用原子力显微镜层层表征涂层表面粗糙度的大小发现，空白载玻片的表面比较平整，粗糙度Rq＝0.24nm；而PDA涂层表面具有类似沟壑的形貌，原因在于多巴胺在氧化过程中会发生自聚，形成聚多巴胺涂层，粗糙度也会随之而变，聚多巴胺涂层的Rq＝1.29nm；在PDA涂层上构建PEG聚合物，其粗糙度变为2.23nm，并且表面形成均匀分布的直立柱状结构，其原因在于HOOC-PEG-COOH具有较长的链段，具有一定的运动活性，会在表面形成类似聚合物刷的结构；两性离子聚合物涂层Rq＝1.59nm，因为PMEN91聚合物不具有长链段结构，又是吸附饱和的状态，在表面形成致密的聚合物涂层；靶向配体叶酸涂层Rq＝1.98nm，由于HOOC-PEG-COOH具有较长的链段,通过将末端羧基进行活化和氨基化叶酸进行反应，使得靶向配体结合在表面上。综合以上分析，构建不同聚合物其形貌具有较大差异，可以证明涂层构建的成功性。
实验例1：
改性片基表面培养正常细胞实验过程：
在改性载玻片表面培养正常细胞，实验前先将放入24孔板的1×1cm2片基表面用灭菌的PBS(pH＝7.0)缓冲溶液润湿，30min后于每孔加入1mL新鲜制备的正常细胞分散液，将24孔板放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，1h后将片基轻轻取出转入新的24孔板，经缓冲溶液以20μL/min的流速淋洗片基表面，并使用倒置荧光显微镜拍摄图片。
见图6所示，图6显示分别在两性离子聚合物涂层和靶向配体叶酸涂层改性载玻片表面培养正常细胞，1h后分别将片基轻轻取出转入新的24孔板，经缓冲溶液以20μL/min的流速淋洗片基表面，并使用倒置荧光显微镜拍摄图片。对比拍摄前后的照片发现，经缓冲溶液冲洗后表面基本无正常细胞残留，进而可以说明由该组合涂层改性的载玻片具有抗生物粘附的作用。
实验例2：
改性片基表面培养混合细胞实验过程：
选定生长密度相同的正常细胞和癌细胞，将新鲜制备的未染色正常细胞和染色的癌细胞分散液按一定比例混合(100:1)，以5μL/min的流速将混合细胞注射到改性片基的表面,1h后将片基表面用缓冲液淋洗，使用倒置荧光显微镜拍摄图片。
见图7、图8所示，图7为改性载玻片表面培养癌细胞的荧光显微镜照片，图8为改性载玻片表面培养混合细胞的荧光显微镜照片，图7显示分别在两性离子聚合物涂层和靶向配体叶酸涂层改性载玻片表面培养癌细胞，1h后分别将片基轻轻取出转入新的24孔板，经缓冲溶液以20μL/min的流速淋洗片基表面，并使用倒置荧光显微镜拍摄图片。对比拍摄前后的照片发现，在两性离子聚合物涂层改性的片基表面培养癌细胞经缓冲溶液冲洗后表面基本无细胞残留，即说明两性离子聚合物涂层在表面发挥了抗生物粘附的作用。而靶向配体叶酸涂层改性的片基表面培养癌细胞经经缓冲溶液冲洗后，在淋洗液淋洗的范围内，几乎所有的癌细胞都很好的结合在表面上，说明靶向配体能将癌细胞稳定特异性结合在表面上。图8倒置荧光显微镜照片显示，将未染色的正常细胞和染色的癌细胞以接近(100:1)的比例混合后，以5μL/min的注射流速注射到由靶向配体叶酸涂层改性片基的表面上，1h后将表面再经20μL/min的缓冲液冲洗发现，染色的癌细胞基本稳定存在于表面上，而正常细胞几乎完全被冲洗掉。说明靶向配体叶酸涂层改性的片基能从正常细胞和癌细胞的混合液中将癌细胞分选出来。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种捕获癌细胞的涂层，其特征在于，包括涂层基底，在涂层基底的表面浸涂有聚多巴胺的介导层、在介导层的表面接枝有柔性长链二羧基聚乙二醇，在柔性长链二羧基聚乙二醇的末端羧基耦合有肿瘤靶向配体。
2.根据权利要求1所述的捕获癌细胞的涂层，其特征在于，在介导层的表面不仅接枝有柔性长链二羧基聚乙二醇，而且接枝有两性离子聚合物。
3.根据权利要求1所述的捕获癌细胞的涂层，其特征在于，所述介导层上的聚多巴胺层厚度为1～3nm；介导层上接枝的聚乙二醇层平均厚度为0.3～1.8nm、耦合的靶向配体密度为0.001～0.8nmol/cm2。
4.根据权利要求3所述的捕获癌细胞的涂层，其特征在于，所述介导层上接枝的两性离子聚合物层厚度为1.5～3.6nm。
5.根据权利要求1所述的捕获癌细胞的涂层，其特征在于，所述基底可以为玻璃、金属、塑料、陶瓷或复合材料。
6.根据权利要求1所述的捕获癌细胞的涂层，其特征在于，所述肿瘤靶向配体为叶酸分子、RGD、cRGDyK、cRGDfK、GRGDS一种或几种。
7.一种捕获癌细胞的涂层构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将涂层基底于多巴胺水溶液中浸涂形成聚多巴胺介导层；
(2)在聚多巴胺介导层的表面接枝柔性长链二羧基聚乙二醇构成抗生物污染涂层；
(3)在抗生物污染涂层伸展出的聚乙二醇末端羧基耦合肿瘤靶向配体，从而形成与癌细胞协同作用的靶向配体涂层。
8.根据权利要求7所述的捕获癌细胞的涂层构建方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：在聚多巴胺介导层的表面分别接枝柔性长链二羧基聚乙二醇和两性离子聚合物，最终形成仿细胞膜立体结构的抗生物污染涂层。
9.根据权利要求7所述的捕获癌细胞的涂层构建方法，其特征在于，所述柔性长链二羧基聚乙二醇的密度通过羧基聚乙二醇浓度：0.2～3mg/mL，反应温度：20℃～80℃及反应时间：20min～5h来调控。
10.根据权利要求7所述的捕获癌细胞的涂层构建方法，其特征在于，步骤(1)中浸涂的方法为：将涂层基底于多巴胺溶液浓度为0.2～1.5mg/mL，pH为6.0～6.8的溶液中反应1～8h，形成1～3nm结合稳定的聚多巴胺介导层。
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