JP2010530955A - 二重機能性非汚染表面および材料 - Google Patents

Abstract

二重機能性非汚染表面および材料、二重機能性非汚染表面および材料を製造するための方法、二重機能性非汚染表面および材料を含むデバイス。二重機能性表面は、非特異的タンパク質吸着および細胞接着を阻止する非汚染表面である。二重機能性表面および材料は、特異的な生物活性をそれらに付与する、共有結合された生体分子（例えば標的結合パートナー）を含む。該表面および材料は、医学的診断、生体材料およびバイオプロセッシング、組織工学ならびに薬物送達に有用である。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００６年１２月２９日に出願された、米国仮出願第６０／８８２，８２１号（これは、その全体が明白に本明細書に援用される）の利益を主張する。

政府ライセンス権
本発明は、海軍研究所により授与された契約第Ｎ０００１４０４１０４０９の下に政府支援により為されたものである。政府は、本発明のある特定の権利を有する。

タンパク質吸着および細胞接着に対する抵抗性を有する表面は、高度な特異性を有するバイオセンサおよび優れた適合性を有する生体材料の開発に重要である。現在、ＯＥＧ自己集成単層（ＳＡＭ）またはポリ（メタクリル酸ＯＥＧ）などのオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）系材料またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系材料が、最も広く使用されている非汚染材料である。最近の研究により、ＯＥＧ ＳＡＭの非汚染特性は、それらの強い水和能力および密に充填された構造にあるとされている。別の広く使用されている非汚染材料は、細胞膜の外層に見られる、ＰＣ頭部を含むバイオミメティックホスホリルコリン（ＰＣ）系材料である。ＰＣで改変されたポリマーまたは表面は、タンパク質吸着を低減することが示された。最近、ポリ（メタクリル酸スルホベタイン）（ポリＳＢＭＡ）グラフト表面は、表面開始原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）法を介して表面からグラフトされた場合に低いタンパク質吸着性を有することが出願人によって示された。

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析の多くの用途では、抗体をＳＰＲセンサに固定することが必要である。複雑な生体溶液から検体を検出するのに、抗体が固定されたＳＰＲセンサが使用された。検体シグナルを最大限にしながら非特異的タンパク質吸着を排除することがＳＰＲセンサにとって重要である。それらのほとんどがカルボキシメチル化デキストラン、カルボキシメチル化ヒアルロン酸、ポリアクリル酸およびＤＬ−ポリアクリル酸などのカルボン酸基を有する異なるポリマーが、ＳＰＲ金表面に固定された。しかし、これらすべてのポリマーは、タンパク質抵抗性材料でなく、それは、それらが複雑な生体溶液から非特異的タンパク質を吸着し、対象となる検体からのシグナルを遮蔽し得ることを意味する。通常、抗体の固定後に表面をブロックするのにＢＳＡなどのタンパク質が使用され、それによって非特異的結合が減少し得るが、効率の低下およびｉｎ ｖｉｖｏ試験に対するいくつかの望ましくない反応がもたらされ得る。

バイオセンサまたはバイオ材料の用途では、リガンド固定のための豊富な官能基を与えながら、バックグラウンドとして非汚染表面または材料を有することが望ましい。カルボン酸（またはアミノ）およびヒドロキシル末端オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）自己集成単層（ＳＡＭ）またはカルボキシメチルデキストランポリマーの混合物が現在バイオセンサ用途に使用されている。細胞および組織応答を制御するために、修飾可能部および非汚染ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーまたは低汚染ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）もしくはポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルクロリン）（ポリＭＰＣ）部を含む共重合体が調製された。しかし、余剰（または未反応）官能基は、センサの特異性または生体材料の生体適合性を低下させ得る。

したがって、タンパク質またはリガンド固定のための活性官能基を有する非汚染生体材料が必要である。本発明は、これらの必要性を満たすことに努め、関連するさらなる利点を提供する。

本発明は、二重機能性非汚染表面、二重機能性非汚染表面を製造するための方法、および二重機能性非汚染表面を含むデバイスを提供する。

一態様において、本発明は、生体分子が共有結合された非汚染表面を有する基板を提供する。一実施形態において、基板は、
（ａ）各ポリマーが複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、各ポリマーが実質的に電気的に中性である、基板の表面に結合された複数のポリマーと、
（ｂ）複数のポリマーに共有結合され、標的分子に対して親和性を有する複数の標的結合パートナーとを含む改変表面を有する。

一実施形態において、複数のポリマーは、表面に共有結合される。一実施形態において、複数のポリマーは、複数のアルキレン部分を含む単層を通じて表面に共有結合され、表面にブラシを形成する。一実施形態において、ポリマーは、ポリ（カルボキシベタイン）である。

別の態様において、本発明は、表面を改変して、生体分子が共有結合された非汚染表面を与えるための方法を提供する。一実施形態において、該方法は、複数の標的結合パートナーを、表面に結合された複数のポリマーに共有結合させることであって、標的結合パートナーが標的分子に対して親和性を有し、各ポリマーが複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、各ポリマーが実質的に電気的に中性であることを含む。

一実施形態において、複数の標的結合パートナーを複数のポリマーに共有結合させることは、ポリマーと標的結合パートナーの間にアミド結合を形成することを含む。一実施形態において、複数の標的結合パートナーを複数のポリマーに共有結合させることは、カルボン酸基の一部を活性化エステルに変換し、活性化エステルと、アミノ基を有する標的結合パートナーとを反応させることを含む。一実施形態において、活性化エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。一実施形態において、ポリマーは、ポリ（カルボキシベタイン）である。

別の態様において、非汚染性である材料および生体分子が共有結合された材料が提供される。一実施形態において、架橋ポリマーが提供される。別の実施形態において、ブロック共重合体が提供される。

架橋ポリマーは、複数の標的結合パートナーが共有結合されている。架橋ポリマーは、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、該ポリマーは、実質的に電気的に中性であり、標的結合パートナーは、標的分子に対して親和性を有する。一実施形態において、架橋ポリマーは、架橋ポリ（カルボキシベタイン）である。一実施形態において、架橋ポリマーは、ヒドロゲルである。架橋ポリマーを製造するための方法も提供される。

ブロック共重合体は、第１の親水性ブロックおよび第２の疎水性ブロックを含む。ブロック共重合体は、標的分子に対して親和性を有する複数の標的結合パートナーが共有結合されている。親水性ブロックは、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、親水性ブロックは、実質的に電気的に中性である。一実施形態において、親水性ブロックは、ポリ（カルボキシベタイン）である。一実施形態において、ブロック共重合体は、微小粒子またはナノ粒子の形である。ブロック共重合体を製造するための方法も提供される。

他の態様において、二重機能性非汚染表面を含むデバイスが提供される
本発明の先述の態様および付随の利点の多くは、添付の図面と併用すると、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるため、より容易に理解されるであろう。

本発明の代表的な二重機能性表面の概略図である。 本発明の代表的な二重機能性表面の概略図である。 正に荷電した骨格を有する代表的な両性イオン性ポリマーの合成を示す。 表面開始原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によってポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）（ＣＢＭＡ）で被覆された表面を調製し、該ポリマーにタンパク質を共有結合させるための代表的な方法の概略図である。 ＳＰＲ測定による、ＰＢＳ溶液（１５０ｍＭおよびｐＨ７．４）からの１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび２０ｕｇ／ｍＬ抗ｈＣＧのポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面への吸着を示す。 ＳＰＲ測定による、ＰＢＳ溶液（１５０ｍＭおよびｐＨ７．４）からの１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび２０ｕｇ／ｍＬ抗ｈＣＧの、固定された抗ｈＣＧを有するポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面への吸着を示す。 ＳＰＲ測定による、ＰＢＳ溶液（１５０ｍＭおよびｐＨ７．４）からの１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび４０ｕｇ／ｍＬ抗ｈＣＧの、固定された抗ｈＣＧを有するポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面への吸着を示す。 活性化ポリ（ＣＢＭＡ）被覆表面への最終抗体固定レベルに対する抗体固定緩衝液の影響を示す。 代表的なポリ（ＣＢＭＡ）被覆表面へのｐＨ８．０における抗体の固定に対する典型的な応答を示す。 活性化細胞白血球接着分子（抗ＡＬＣＡＭ）に対する抗体が固定された表面と５０％血漿中のサルモネラに対する固定された抗体（抗Ｓａｌｍ）を有する対照表面とにおける活性化細胞白血球接着分子（ＡＬＣＡＭ）の検出を比較する。 ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中それぞれ１０μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの抗体濃度を有する流動緩衝液による抗ＡＬＣＡＭおよび抗ＳａｌｍのＴＳＴＵ活性化ポリ（ＣＢＡＡ）グラフト表面への固定化に対応するセンサグラムである。 図１１Ａは、ＰＢＳ中フィブリノーゲンを１ｍｇ／ｍＬの濃度で注入することによるカルボン酸残基の非活性化後のポリ（ＣＢＡＡ）の非汚染特性の制御を示し、図１１Ｂは、測定（抗ＡＬＣＡＮ）チャネルと対照（抗Ｓａｌｍ）チャネルにおけるＡＬＣＡＭ結合（１００ｎｇ／ｍＬ）に対するセンサ応答を比較する。 図１２Ａおよび１２Ｂは、２４時間後のウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）接着の顕微鏡画像であり、図１２Ａは、２４時間にわたってフィブロネクチン溶液中にインキュベートされた不活性化架橋ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲルへのＢＡＥＣ接着を示し、図１２Ｂは、２４時間にわたってフィブロネクチン溶液中にインキュベートされたＥＤＣ／ＮＨＳ活性化ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲルへのＢＡＥＣ接着を示す。 図１３Ａは、タンパク質アッセイのための本発明の代表的なプラットフォームおよび方法の概略図であり、図１３Ｂは、タンパク質アッセイのための従来のプラットフォームの概略図である。 １００％血清、１００％血漿および１ｍｇ／ｍｌフィブリノーゲンを含む複合媒体に対する、表面の超低汚染を示すタンパク質アッセイに有用な本発明の代表的なＣＢＡＡポリマー表面のＳＰＲセンサグラムを比較する。 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）撮像による本発明の代表的なタンパク質マイクロアレイの空間分解画像であり、暗から明への明暗度の変化は、表面上のタンパク質結合を表し、抗ｈＣＧおよび抗サルモネラタンパク質が、マイクロコンタクトプリンティングロボットを使用して５００μｍスポットでプリントされ、カラム１、３、４および６は、抗ｈＣＧであり、カラム２および５は、抗サルモネラである。 抗ｈＣＧタンパク質スポット上の１０ｍｇ／ｍＬｈＣＧの特異的検出に有用な本発明の代表的なＣＢＡＡポリマー表面のＳＰＲセンサグラムを比較し、対照抗サルモネラタンパク質スポットまたはバックグラウンドに検出が観察されない。

本発明は、二重機能性非汚染表面、二重機能性非汚染表面を製造するための方法、および二重機能性非汚染表面を含むデバイスを提供する。本発明の二重機能性表面は、非特異的タンパク質吸着および細胞接着を阻止する非汚染（例えば、低汚染または超低汚染）表面である。本発明の二重機能性表面は、特異的な生物活性を表面に付与する共有結合された生体分子（例えば標的結合パートナー）をも含む。本発明の二重機能性表面は、非汚染性であり、固定された生体分子を含むため、感応性の特異的結合または特異的結合測定を必要とし、同時に非特異的タンパク質結合および細胞接着に対する抵抗性を必要とする任意の方法またはデバイスに有用である。本発明の二重機能性表面は、医学的診断用途、生体材料および組織工学ならびに医薬送達に有用である。

本発明の一態様において、二重機能性表面が提供される。該表面は、非特異的タンパク質吸着および細胞接着を阻止または防止し、標的分子に対する特異的結合を可能にする二重機能を有する。

本発明の表面は非汚染性であり、それは、表面が非特異的タンパク質吸着および細胞接着を阻止または防止することを意味する。フィブリノーゲン吸着レベル（すなわち、単位面積当たり表面に吸着するフィブリノーゲンの量）を測定することによって、非特異的タンパク質吸着量を測定することができる。本発明の表面は、約３０ｎｇ／ｃｍ^２未満のフィブリノーゲンを吸着する。一実施形態において、該表面は、約１０ｎｇ／ｃｍ^２未満のフィブリノーゲン吸着量を有する。一実施形態において、該表面は、約５ｎｇ／ｃｍ^２未満のフィブリノーゲン吸着量を有する。一実施形態において、該表面は、約３ｎｇ／ｃｍ^２未満のフィブリノーゲン吸着量を有する。一実施形態において、該表面は、約０．３ｎｇ／ｃｍ^２未満のフィブリノーゲン吸着量を有する。

本発明の表面の非汚染性は、表面を構成する材料、およびそれらの充填密度によるものである。本発明の実施において、非汚染表面は、二重機能性材料を基板の表面にコーティングまたは共有結合させることによって、表面から調製される。したがって、本発明の表面は、改変表面（または被覆表面）である。

本発明の表面を製造するのに有用な二重機能性材料は、非汚染特性を表面に付与するとともに、固定された生体分子（例えば、抗体などのタンパク質）と好適に反応する１つ以上の官能基を含む材料である。これらの二重機能性材料の代表的な官能基としては、カルボン酸基およびアミノ基等が挙げられる。以下に詳細に記載するように、一実施形態において、二重機能性材料は、表面に結合（例えば共有結合）させることができ、末端カルボン酸基を有する両性イオン性材料である。これらの末端カルボン酸基は、生体分子に存在する１つ以上のアミノ基に結合するために活性化され得る。本実施形態において、カルボン酸基を活性エステル（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）に変換し、次いで１つ以上のアミノ基（例えば、タンパク質のリジン残基のアミノ基）と反応させてアミド結合を形成することによって、タンパク質を表面に固定して、本発明の二重機能性表面を与える。

表面の非汚染機能は、表面に結合された材料によって表面に付与される。上記のように、これらの材料は、両性イオン性材料を含む。該表面を製造するのに有用な好適な材料としては、それぞれ全体が参考として本明細書で援用される２００６年７月２５日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８９８８（Ｓｕｐｅｒｌｏｗ−Ｆｏｕｌｉｎｇ Ｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｘｙｂｅｔａｉｎｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ）；２００７年８月７日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７５４０９（Ｍｉｘｅｄ Ｃｈａｒｇｅ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ）；および２００７年１１月１９日出願のＵ．Ｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６０／９８９，０７３（Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｘｙｂｅｔａｉｎｅ Ｅｓｔｅｒｓ）に記載されているポリマーおよび共重合体が挙げられる。

一実施形態において、本発明は、
（ａ）ポリマーの各々が複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、各ポリマーが実質的に電気的に中性である、基板の表面に接着された複数のポリマーと、
（ｂ）複数のポリマーに共有結合され、標的分子に対して親和性を有する複数の標的結合パートナーとを含む改変表面を有する基板を提供する。

本実施形態において、改変表面を構成する材料は、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を有するポリマーを含む。ポリマーは、ポリマーが、カルボン酸基および正に荷電した基の両方を含む反復単位を含む単独重合体であり得る。ポリマーは、また、２種類の反復単位、すなわちカルボン酸基を含む反復単位および正に荷電した基を含む反復単位を含む共重合体であり得る。正に荷電した基は、ペンダント基（すなわちポリマー骨格からのペンダント）であり得るか、またはポリマー骨格に存在し得る。ポリマーは、実質的に電気的に中性である。本明細書に用いられているように、「実質的に電気的に中性」という用語は、実質的に同数の正電荷および負電荷を有するポリマーを指す。本明細書に描写および記載されているカルボン酸基（−ＣＯ_２Ｈ）は、ポリマーの電気的中立性を判断する目的でカルボン酸塩基（−ＣＯ_２ ⁻）と見なされることが理解されるであろう。本発明の改変表面を構成するポリマーの電気的中立性は、一部に、本発明の表面の非汚染特性の原因になっている。

本実施形態において、本発明に有用なポリマー、およびそれらを含むように改変された表面は、カルボン酸基を含み、これらのカルボン酸基の一部は、さらなる化学反応、具体的には生体分子（例えば標的結合パートナー）のポリマー、つまりは改変表面への固定に利用可能である。上述のように、ある実施形態において、利用可能なアミノ基（−ＮＨ_２）を有する生体分子をポリマーの利用可能なカルボン酸基に共有結合させて、安定なアミド結合（−ＣＯＮＨ−）を通じて生体分子を固定することができる。本発明の実施において、利用可能なカルボン酸基を有するポリマーの一部を結合に向けて活性化し、次いで生体分子に共有結合して、表面固定生体分子を与える。本発明の表面に固定される生体分子の程度を、反応条件（例えば、カルボキシル基活性化の程度ならびに固定のために活性化表面に曝される生体分子の濃度および量）を通じて容易に制御することができる。固定された生体分子（例えば標的結合パートナー）を有する本発明の代表的な非汚染表面の概略図を図１Ａに示す。

代表的な二重機能性表面５を図１Ｂに示す。図１Ｂを参照すると、カルボン酸基を有する複数のポリマー２０が、複数のリンカー１５を通じて基板１０に結合される。ポリマーは、基板１０の表面上に単層を形成することができる。カルボン酸基の一部は、標的結合パートナー２５をポリマー２０に共有結合させるために標的結合パートナー２５のアミノ基とのアミド結合を形成するのに使用される。基板１０へのポリマー２０のコーティングは、表面５を非汚染性にし、固定された標的結合パートナー２５は、標的分子に結合親和性を与える。

図１Ｂに示されるように、ポリマーを、直接または複数のリンカーを通じて結合させることができる。一実施形態において、本発明の基板は、表面に共有結合された（例えば自己集成）単層を含み、単層は、複数のアルキレン部分を含み、ポリマーは、複数のアルキレン部分に共有結合される。

表面に対する標的分子の結合親和性は、表面に固定された標的結合パートナーに起因する。それぞれ結合対メンバーと称する標的結合パートナーおよび標的分子は、結合対を形成する。各結合対メンバーは、他のメンバーを特異的に結合させる分子である。一実施形態において、標的結合パートナーは、Ｋ_ｄが約１０^−８未満の標的分子に対して親和性を有する。

結合対メンバーは、限定することなく、タンパク質、ペプチド、タンパク質、多糖類もしくは少糖類、糖タンパク質、脂質およびリポタンパク質および核酸、ならびに抗生剤、抗炎症剤または細胞接着媒介物質などの規定の生物活性を有する合成有機もしくは無機分子を含む任意の好適な分子であり得る。

本発明の表面に固定することができるタンパク質の例としては、リガンド結合タンパク質、レクチン、ホルモン、受容体および酵素が挙げられる。代表的なタンパク質としては、抗体（モノクロナル、ポリクロナル、キメラ、単鎖または他の組換え形）、それらのタンパク質／ペプチド抗原、タンパク質−ペプチドホルモン、ストレプタビジン、アビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、成長因子およびそれらのそれぞれの受容体、ＤＮＡ結合タンパク質、細胞膜受容体、エンドソーム膜受容体、核膜受容体、ニューロン受容体、視覚受容体ならびに筋肉細胞受容体が挙げられる。本発明の表面に固定することができる代表的なオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、およびＲＮＡアーゼＰに対する外部ガイド配列を含み、短オリゴヌクレオチドプライマーから全遺伝子までのサイズに及ぶことができる。

標的化合物に特異的に結合する他の標的結合パートナーとしては、受容体に結合する糖タンパク質上の多糖類または少糖類、例えば、炎症性媒介物質Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンに対するリガンド上の炭水化物、ならびにリボザイム、アンチセンス、ＲＮＡアーゼＰに対する外部ガイド配列、およびアプタマーなどの、相補配列に結合する核酸配列が挙げられる。

一実施形態において、標的結合パートナーは抗体であり、標的分子は、抗体に対する抗原である。本実施形態において、本発明の表面は、抗原に特異的に結合し、非特異的タンパク質吸着を阻止する。一実施形態において、標的結合パートナーは、細胞接着を促進することが可能なタンパク質であり、標的分子は細胞である。本実施形態において、本発明の表面は、細胞に特異的に結合し、非特異的タンパク質吸着および非特異的細胞接着を阻止する。

本明細書に記載されている材料および方法を使用して、様々な基板を二重機能性にすることができる。二重機能性にすることができる代表的な表面としては、金属および金属酸化物表面、セラミック表面、合成および天然ポリマー表面、ガラス表面、繊維ガラス表面、シリコン／シリカ表面ならびに炭素系材料表面が挙げられる。代表的な天然ポリマー表面としては、コラーゲン、繊維素、および組織工学の使用に好適な他の炭水化物表面が挙げられる。代表的な炭素系材料表面としては、炭素繊維、ナノチューブおよびバルキーボール表面が挙げられる。

好適な基板としては、バイオセンサ、バイオプローブ、およびｉｎ ｖｉｖｏデバイスを含む生物医学デバイスなどの医学的診断用途；バイオプロセスまたはバイオ分離のための膜、移植可能デバイス、義肢および組織骨格などの生体材料および組織工学用途；ならびに粒子およびナノ粒子などの薬物送達用途に有用な基板が挙げられる。

一実施形態において、本発明は、両性イオン性ポリマーをＳＰＲ表面に対してグラフトした後、標的結合パートナーを固定して、二重機能性表面を与えたＳＰＲセンサを提供する。

上述のように、本発明の改変表面を製造するのに有用な好適なポリマーとしては、両性イオン性モノマー（ならびに両性イオン性モノマーに変換することが可能なモノマー、例えば両性イオン性モノマーの前駆体）から誘導されたポリマーが挙げられる。両性イオン性モノマーは、典型的には、同数の正電荷および負電荷（例えばそれぞれ１つずつ）を含む電気的に中性のモノマーである。本発明の実施において、好適なポリマーとしては、表面を非汚染性にし、結合対のメンバーを固定するために反応性官能基を表面上に設けることが可能である、両性イオン性モノマーまたは両性イオン性モノマーに対する前駆体から誘導された任意のポリマーが挙げられる。

ある実施形態において、ポリマーは、自己集成単層を通じて表面に共有結合され、自己集成単層は、複数のアルキレン部分を含む。

一実施形態において、ポリマーは、両性イオン性モノマーから調製された単独重合体であり、式：

［式中、
Ｂは、

［式中、Ｒは、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択され；Ｅは、置換または無置換のアルキレン、−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｏ−および（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）ＮＲ^２−からなる群より選択され、ｐは、０〜１２の整数であり、Ｒ^２は、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択される］からなる群より選択され；
Ｌは、場合により１個以上の酸素原子を含む直鎖状または分枝状アルキレン基であり；
Ｐは、

［式中、Ｒ^３およびＲ^４は、水素、および置換または無置換のアルキル基からなる群より独立して選択され、Ｒ^５は、置換または無置換のアルキレン基、フェニレン基およびポリエーテル基からなる群より選択され、ｍは、１〜７の整数である］からなる群より選択され；
ｘは、３〜１０００の整数である］を有する。

一実施形態において、ポリマーは、ポリ（カルボキシベタイン）である。アクリル酸カルボキシベタイン、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシドおよびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーから好適なポリ（カルボキシベタイン）を調製することができる。一実施形態において、モノマーは、メタクリル酸カルボキシベタインである。本発明に有用なカルボキシベタインポリマーを製造するための代表的なモノマーとしては、２−カルボキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２’−メタクリロイルオキシエチル）エタンアミニウム分子内塩などのメタクリル酸カルボキシベタイン；アクリル酸カルボキシベタイン；カルボキシベタインアクリルアミド；カルボキシベタインビニル化合物；カルボキシベタインエポキシド；およびヒドロキシル、イソシアネート、アミノまたはカルボン酸基を有する他のカルボキシベタイン化合物が挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、ポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）（ポリ（ＣＢＭＡ））である。

原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合および遊離ラジカル重合を含む重合法によってポリ（カルボキシベタイン）を調製することができる。重合のための従来のあらゆるラジカル開始剤を使用することができる。

別の実施形態において、ポリマーは、ポリマー骨格内の正電荷およびペンダントカルボン酸基を有し、式：

［式中、
Ｒは、水素、および置換、また無置換のアルキルからなる群より選択され；
Ｌ_１およびＬ_２は、独立して、場合により１個以上の酸素原子を含む直鎖状または分枝状アルキレン基であり；
ｘは、３〜１０００の整数である］を有する。

正に荷電した骨格を有する代表的な両性イオン性ポリマー３を図２に示されるように得ることができる。図２を参照すれば、アジリジンを出発材料としてポリマー３を合成することができる。Ｎ−メチルアジリジンモノマーは、アジリジンのメチル化によって得られる。正に荷電した骨格を有する中間体ポリマー１は、Ｎ−メチルアジリジンモノマーの開環重合を通じて得られる。ポリマー１の四級化（ｑａｕｔｅｒｎｉｚａｔｉｏｎ）によって、メチルエステルをペンダント基とする中間体ポリマー２が提供される。メチルエステルの加水分解によって所望の両性イオン性ポリマー３が得られる。

別の実施形態において、ポリマーは、混合荷電共重合体であり、一般式：

［式中、
Ｂ_１およびＢ_２は、

［式中、Ｒは、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択され；Ｅは、置換または無置換のアルキレン、−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｏ−および−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）ＮＲ^２−からなる群より選択され、ｐは、０〜１２の整数であり、Ｒ^２は、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択される］からなる群より独立して選択され；
Ｌは、場合により１個以上の酸素原子を含む直鎖状または分枝状アルキレン基であり；
Ｐ_１は、正に荷電した基であり；
Ｐ_２は、カルボン酸基であり；
ｍは、３〜１０００の整数であり；
ｎは、３〜１０００の整数である］を有する。

本実施形態において、Ｐ_１は、芳香族環における窒素またはＮＲ_５Ｒ_６であり、Ｒ_５およびＲ_６は、独立して、置換または無置換のアルキル基である。

正に荷電した単位（Ｐ_１含有単位）を、正に荷電したペンダント基を有するモノマーから誘導することができる。本発明のポリマーにおける正に荷電した単位を誘導するのに使用できる代表的なモノマーとしては、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル、メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル、塩化［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリエチルアンモニウムおよびＮ−アセチルグルコサミンが挙げられる。

本発明に有用な混合荷電共重合体またはそれらの前駆体を基板表面上に直接合成することができる。反対に荷電した基を有するモノマーから原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を介して混合荷電共重合体を表面上にグラフトすることができる。表面上にグラフトされた共重合体は、非汚染特性を有する実質的に電気的に中性のポリマーブラシを形成することができる。

一実施形態において、負に荷電した単位がアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導され、正に荷電した単位がメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル（ＤＭ）から誘導される。一実施形態において、負電荷単位がアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導され、正に荷電した単位がメタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル（ＤＥ）から誘導される。一実施形態において、負に荷電した単位がアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導され、正に荷電した単位が塩化［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム（ＴＭ）から誘導される。一実施形態において、負に荷電した単位がアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導され、正に荷電した単位がメタクリル酸２−アミノエチル塩酸塩（ＮＨ２）から誘導される。

上記表面のいずれについても、複数のポリマーが、表面上に単層を形成することができる。

別の態様において、本発明は、表面を非汚染性にし、標的分子に対して親和性を有するようにする、表面を改変するための方法を提供する。

一実施形態において、表面を改変するための方法は、複数の標的結合パートナーを、基板の表面に結合する（例えば共有結合された）複数のポリマーに共有結合させることを含む。標的結合パートナーは、標的分子に対して親和性を有する。ポリマーは、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、ポリマーは、実質的に電気的に中性である。これらの方法に有用なポリマーとしては、本発明の表面に関して以上に詳細に記載したポリマーが挙げられる。一実施形態において、ポリマーはポリ（カルボキシベタイン）である。

ある実施形態において、複数の標的結合パートナーを複数のポリマーに共有結合させることは、ポリマーと標的結合パートナーの間にアミド結合を形成することを含む。一実施形態において、複数の標的結合パートナーを複数のポリマーに共有結合させることは、カルボン酸基の一部を活性化エステルに変換し、活性化エステルと、アミノ基を有する標的結合パートナーとを反応させることを含む。利用可能なアミノ基を含むように改変されたポリマーについては、複数の標的結合パートナーを複数のポリマーに共有結合させることは、標的結合パートナーのカルボン酸の一部を活性化エステルに変換し、活性化エステルと、利用可能なアミノ基を有する表面のポリマーとを反応させることを含む。

一実施形態において、活性化エステルは、以下に記載するように調製されたＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。

好適な標的結合パートナーとしては、本発明の表面に関して以上に詳細に記載したものが挙げられる。

本発明は、本発明の方法によって調製された改変表面を有する、以上に記載した基板を提供する。

上述のように、生体分子のアミノ基とさらに結合するための活性化中間基を形成することによって、ポリマーのカルボン酸基を活性化させることができる。カルボン酸基の任意の活性化形態を本発明に使用することができる。代表的な活性化中間基としては、カルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、ウラン塩、イソチオシアネート、イソシアネート、アジ化アシル、Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）、塩化スルホニル、アルデヒド、エポキシドアリール化基、イミドエステルおよび無水物が挙げられる。一実施形態において、テトラフルオロホウ酸Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム（ＴＳＴＵ）を使用して、ポリマー上のカルボン酸基を活性化ウロニウム塩に変換する。別の実施形態において、カルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学）を使用して、ポリマー上のカルボン酸基を活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに変換する。

一実施形態において、酸性条件下（例えばｐＨ２．５〜６）でカルボン酸基をＮ−ブロモスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）で処理することによってカルボン酸基を活性化ＮＨＳエステルに変換した。塩基性条件下（例えばｐＨ７．４〜１１）で、活性化ＮＨＳエステルを標的結合パートナーのアミノ基と結合させてアミド結合を形成した。

アルキレンリンカーを通じてポリマーを表面に結合させることができる。アルキレンリンカーを介するポリマーの基板の表面上へのグラフトは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加フラグメンテーション連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合および遊離ラジカル重合などの任意の従来の重合法を介するものであってよい。

基板表面上のＳＡＭは、表面重合のための優れたプラットフォームである。一実施形態において、アルキレンリンカーを含むラジカル開始剤末端自己集成単層（ＳＡＭ）を基板表面上に形成することができ、ポリマーは、ラジカル開始剤末端自己集成単層を介して表面上にグラフトされる。この方法において、基板表面にラジカル開始剤で終端されたＳＡＭを被覆することができ、ラジカル開始剤は、アルキレンリンカーを介して表面に結合される。アルキレンリンカーは、任意の置換または無置換のアルキレンであり得る。一実施形態において、アルキレンリンカーは、Ｃ２−Ｃ３０アルキレンである。次いで、ポリマーをＳＡＭ上に形成して、基板表面に非汚染ポリマー被膜を設ける。原子移動ラジカル重合は、ＳＡＭ末端においてラジカル開始剤により開始される。

一実施形態において、アルキレンリンカーを有するヒドロキシル末端単層を基板表面上に形成することができ、続いてそれをラジカル開始剤末端単層に変換する。

ポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）を含む代表的な二重機能性表面を実施例１に記載し、その調製を図３に示す。

表面開始ＡＴＲＰ法を介して開始剤が被覆された基板表面上にポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）をグラフトすることによって、代表的な非汚染表面を調製した（図３）。臭化ブロモイソブチリルとメルカプトウンデカノールを反応させることによってブロモイソ酪酸ω−メルカプトウンデシルを合成した。金基板を、ブロモイソ酪酸ω−メルカプトウンデシルを含有する溶液に浸すことによって、自己集成を介して開始剤を金基板に固定した。メタクリル酸２−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）エチルとβ−プロピオラクトンを反応させることによって、ＣＢＭＡモノマーの１つである２−カルボキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２’−メタクリロイルオキシエチル）エタンアミニウム分子内塩を合成した。ＡＴＲＰを介して、ＣＢＭＡモノマーをラジカル開始剤末端ＳＡＭからグラフトした。ＣｕＢｒおよび２，２’−ビピリジン（ＢＰＹ）をそれぞれ触媒およびリガンドとして使用した。反応をメタノールと水の混合溶媒中で室温にて穏やかな条件下に維持した。典型的なＡＴＲＰ重合の後、均質なカルボキシベタインポリマーブラシを表面にグラフトした。ポリマー層の厚さは、偏光解析法で測定した場合に約１０−１５ｎｍであった。

タンパク質吸着量を波長インターロゲーションに基づく表面プラズモン共鳴センサ（ＳＰＲ）で測定した。タンパク質吸着量は、タンパク質注入前で緩衝液洗浄後の波長シフトで定義される。タンパク質注入後の波長シフトは、バルク屈折率の変化によるものである。図４に示されるように、ポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面上のサイズおよび等電点（ｐＩ）が異なる３種類のタンパク質、すなわちヒトフィブリノーゲン（３４０ｋＤ、ＰＩ＝５．５）、リゾチーム（１４ｋＤ、ＰＩ＝１２）およびｈＣＧ（３７ｋＤ、ＰＩ＝４５）の吸着量が、０．３ｎｇ／ｃｍ^２未満（０．０２ｎｍ未満の波長シフト、ＳＰＲセンサの検出限界）まで低下したことが示された。この吸着レベルは、この吸着レベルは、密に充填されたＯＥＧ ＳＡＭ、または表面開始ＡＴＲＰを介してポリ（ＣＢＭＡ）で被覆された表面について認められたものと同じである。したがって、ポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面は、非特異的タンパク質吸着に対して強い抵抗性を有する。

表面上の単層形成に続いて、代表的な標的結合パートナー、すなわちヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）に対するモノクロナル抗体（ｍＡｂ）を、図３に示されるように、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学作用を介してｍＡｂのアミンをポリ（ＣＢＭＡ）のカルボキシル基に対して反応させることによって、ポリ（ＣＭＢＡ）ブラシで被覆された表面上に共有結合により固定した。

固定後に、エタノールアミンで未反応のＨＮＳを除去した。ｈＣＧの注入後のＳＰＲ応答は、タンパク質の吸着量が、固定されたｍＡｂを有さない対照ポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面上より、固定された抗ｈＣＧを有するポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面上の方がはるかに多いことを示している。図５は、１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび２０μｇ／ｍＬのｈＣＧを含むＰＢＳ溶液で表面を２２分間にわたって処理した場合における、固定された抗ｈＣＧを有するポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面上のタンパク質吸着量を示す。図６は、１ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび４０μｇ／ｍＬのｈＣＧを含むＰＢＳ溶液で表面を２２分間にわたって処理した場合における、固定された抗ｈＣＧを有するポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面上のタンパク質吸着量を示す。ＳＰＲスペクトルの波長シフトは、１．６ｎｍであり、約２４ｎｍ／ｃｍ^２のｈＣＧ吸着量に対応する。同時に、リゾチームおよびフィブリノーゲンのいずれの吸着量も両表面上で同じ（０．３ｎｇ／ｃｍ^２未満）であり、それは、表面が抗ｈＣＧ固定後も依然として非汚染性であることを示している。したがって、固定された抗ｈＣＧを有するポリ（ＣＢＭＡ）グラフト表面は、非特異的タンパク質吸着および特異的タンパク質に対する結合の双方に対して抵抗性を有する二重機能性表面である。

表面上のポリ（カルボキシベタイン）のカルボン酸基の活性化は、後の標的結合パートナーの固定に重要である。高いタンパク質固定レベルを達成するために、カルボン酸基の活性化および標的結合パートナーの固定のための条件を最適化する必要がある。

実施例２に示されるように、溶媒としてｐＨ３．３の水／ＨＣｌを使用して、ＮＨＳ／ＥＤＣ法を用いたポリマーのカルボン酸基の最適な活性化（最大量のＮＨＳエステル）をｉｎ ｓｉｔｕで達成した。ポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）で被覆された表面を、新たに調製したＮＨＳ（０．０５Ｍ）およびＥＤＣ（０．２Ｍ）の溶液を３０℃で注入することによって活性化した。２つの異なる抗体、すなわち活性化細胞白血球接着分子に対するモノクロナル抗体（抗ＡＬＣＡＭ）およびサルモネラに対するポリクロナル抗体（抗Ｓａｌｍ）を、５０ｕｇ／ｍＬの抗体濃度にて様々なｐＨ条件下で活性化ＣＢＡＡ表面の異なるスポットに固定した。次いで、非共有結合リガンドを表面から除去した。

抗体の固定に対するｐＨの影響を図７に示す。固定条件のｐＨが高いほど、固定されたタンパク質の量が多くなることが図７から明らかである。ｐＨ８．０における抗体の固定に対する典型的な応答を図８に示す。図９は、抗ＡＬＣＡＭ固定表面と５０％血漿中抗Ｓａｌｍが固定された対照表面とにおけるＡＬＣＡＭの検出を比較する。

実施例３に記載されているようにカルボン酸基をＴＳＴＵで処理することによって、ポリ（メタクリル酸カルボキシベタイン）のカルボン酸基の活性化を達成することができる。特注の４チャンネル分光学的表面プラズモン共鳴センサを使用して、ポリ（ＣＢＡＡ）表面の機能化を監視した。

最初に、ＡＴＲＰ法を介して、ポリ（ＣＢＡＡ）チップをポリ（ＣＢＡＡ）エステルの形で調製した。次いで、ポリ（ＣＢＡＡ）−エステル表面を加水分解して、両性イオン性非汚染ポリ（ＣＢＡＡ）表面を達成する。グラフトされたポリ（ＣＢＡＡ）エステルを有するセンサチップ表面をミリＱ水で洗浄し、濾過空気で乾燥させ、ＳＰＲセンサに組み込んだ。ポリ（ＣＢＡＡ）表面にｐＨ１２の０．１ＭのＮａＯＨを２時間流すことによって加水分解をｉｎ ｓｉｔｕで実施した。ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１ｍｇ／ｍＬの濃度で表面粘着性の強いタンパク質（フィブリノーゲン）を注入することによって加水分解の効果を監視した。ポリ（ＣＢＡＡ）エステル表面を完全に加水分解するのに２時間が十分な時間であることが判明した。

両性イオン性ポリ（ＣＢＡＡ）表面をＴＳＴＵ（５ｍｇ／ｍＬ）のＤＭＦ溶液に２時間浸した。その後、表面をエタノールで洗浄し、濾過空気で乾燥させた。チップをＳＰＲセンサに直接組み込んだ。２つの抗体のモデルシステムを使用して、表面グラフトポリ（ＣＢＡＡ）の機能化を実証した。活性化細胞白血球接着分子に対する抗体（抗ＡＬＣＡＭ）を測定チャネル内に固定し、サルモネラに対する抗体（抗Ｓａｌｍ）を参照チャネル内に固定した。固定をｐＨ５．０の１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中にてｉｎ ｓｉｔｕで実施した。抗体濃度は、それぞれ１０μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬであり、インキュベーション時間は、１５分であった。

図１０は、ＴＳＴＵで活性化されたポリ（ＣＢＡＡ）センサの表面上にＡＬＣＡＭおよびサルモネラ抗体を固定するセンサ応答を示す。ランニング緩衝液は、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウムであり、抗体の濃度は、それぞれ１０ｕｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬであった。図１１は、抗ＡＬＣＡＭ固定表面、および非標的抗原、すなわちフィブリノーゲンを使用した低バックグラウンドノイズ（または低非特異的結合）を使用したＡＬＣＡＭの検出を示す。１０ｍＭのリン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）を５時間流すことによって残留するＮＨＳ−エステルをカルボン酸塩基に戻した。１ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノーゲンを参照チャネルに注入して、加水分解の効果および超非汚染特性を調べた（図１１Ａ）。次いで、ＰＢＳ緩衝液においてＡＬＣＡＭ抗原の検出を実施した。１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＡＬＣＡＭの溶液を測定および参照チャネルに１０分間注いだ。図１１Ｂは、測定（抗ＡＬＣＡＭ）チャネルおよび対照（抗Ｓａｌｍ）チャネルにおけるＡＬＣＡＭ結合に対するセンサ応答を示す。ＡＬＣＡＭ抗原を抗ＡＬＣＡＭ表面に特異的に結合させた。これらの結果は、非活性化プロセスが成功し、機能化ポリ（ＣＢＡＡ）表面がその超非汚染特性を維持しながら、抗ＡＬＣＡＭの生物活性を保ったことを証明している。

他の態様において、本発明は、表面を非汚染性にするのに有用である、標的結合パートナーが固定された材料を提供する。これらの材料は、表面を被覆するのに使用できるポリマー材料である。これらの材料を基板表面と独立して使用することができる。これらの材料を粒子に成形し、粒子の形で使用することができる。本発明の代表的な材料としては、標的結合パートナーが固定された架橋ポリマー（例えばヒドロゲル）および標的結合パートナーが固定されたブロック共重合体（例えば、微小粒子およびナノ粒子）が挙げられる。

一実施形態において、本発明は、複数の標的結合パートナーが共有結合された架橋ポリマー（例えばヒドロゲル）を提供する。

一実施形態において、架橋ポリマーは、複数の標的結合パートナーが共有結合されている。架橋ポリマーは、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を有し、実質的に電気的に中性である。標的結合パートナーは、標的分子に対して親和性を有する。

架橋ポリマーを構成するポリマーとしては、本発明の表面に関して上述したものが挙げられる。

一実施形態において、架橋ポリマーは、架橋ポリ（カルボキシベタイン）ヒドロゲルである。カルボキシベタインを、アクリル酸カルボキシベタイン、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシド、およびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーから調製することができる。一実施形態において、モノマーは、メタクリル酸カルボキシベタインである。

代表的な架橋ポリマーを、塩酸メタクリル酸アミノエチル（ＮＨ２）、メタクリル酸（２−（ジメチルアミノ）エチル（ＤＭ）、メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル（ＤＥ）および塩化２−（メタクリロイルオキシ）エチルトリメチルアンモニウム（ＴＭ）を含む正に荷電した化合物、ならびにアクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）を含む負に荷電した化合物から調製することができる。

一実施形態において、架橋ポリマーＮＨ２／ＣＡは、アクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導された負に荷電した単位および塩酸メタクリル酸２−アミノエチル（ＮＨ２）から誘導された正に荷電した単位を有する。一実施形態において、架橋ポリマーＤＭ／ＣＡは、アクリル酸２−カルボキシエチルから誘導された負に荷電した単位およびメタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル（ＤＭ）から誘導された正に荷電した単位を有する。一実施形態において、架橋ポリマーＤＥ／ＣＡは、アクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導された負に荷電した単位およびメタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル（ＤＥ）から誘導された正に荷電した単位を有する。一実施形態において、架橋ポリマーＴＭ／ＣＡは、アクリル酸２−カルボキシエチル（ＣＡ）から誘導された負に荷電した単位および塩化［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム（ＴＭ）から誘導された正に荷電した単位を有する。

標的結合パートナーの架橋ポリマーへの固定を本発明の表面について上述したように実施することができる。例えば、架橋ポリマーの表面上で利用可能なカルビン酸基に対してタンパク質のアミノ基を反応させることによって、標的結合パートナーをポリマー上に固定することができる。標的結合パートナーとしては、本発明の表面に関して上述したものが挙げられる。

本発明は、ポリマーに共有結合された複数の標的結合パートナーを有する架橋ポリマーを製造するための方法を提供する。

一実施形態において、表面改変架橋ポリマーを製造するための方法は、
（ａ）１つ以上のモノマーと架橋剤とを共重合して架橋ポリマーを与えることにおいて、架橋ポリマーが、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を有する架橋ポリマーを含み、架橋ポリマーが実質的に電気的に中性であること、および
（ｂ）複数の標的結合パートナーを架橋ポリマーに共有結合させることを含む。

該方法において、複数の標的結合パートナーを架橋ポリマーに共有結合させることを、本発明の表面の調製について上述した材料および方法を使用して実施することができる。

好適な架橋剤としては、ビニル型ポリマー架橋に広く使用されるものが挙げられる。一実施形態において、架橋剤は、ジメタクリル酸テトラエチレングリコールである。

本発明の代表的な架橋ポリマーヒドロゲル、すなわち架橋ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲルを実施例４に記載されているように調製した。メタクリル酸カルボキシベタインモノマーをジメタクリル酸テトラエチレングリコール（ＴＥＧＤＭＡ）中に添加した後に、メタ重亜硫酸ナトリウムおよび過硫酸アンモニウムで開始される遊離ラジカル重合を行うことによって、透明ヒドロゲルを調製した。重合後、残留化学物質を除去するための当該技術分野で既知の十分に確定された手順に従ってゲルを調製した。ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲルは、無細胞毒性であることが判明し、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）エンドトキシンアッセイキット（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国メリーランド州ウォーカーズビル）を使用すると０．０６単位（ＥＵ）／ｍＬ未満のエンドトキシンを含有していた。ヒドロゲルを叩いてディスクにした。

次いで、架橋ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲルをその二重機能性について評価した。ポリ（ＣＢＭＡ）系ヒドロゲルをＥＤＣ／ＮＨＳ活性化によって改変した後、フィブロネクチン結合して、固定されたフィブロネクチンで修飾された改変ヒドロゲルを与えた。フィブロネクチンは、細胞接着を促進することが可能なタンパク質である。タンパク質結合に続いて、ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、フィブロネクチン改変ヒドロゲルディスクおよびＥＤＣ／ＮＨＳ活性化されていないヒドロゲルディスクの両方の上で培養した。２時間〜３日間の培養の間に細胞形態を観察した。図１２Ａに示されるように、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化されていないポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲルディスク上に接着細胞が観察されなかったが、フィブロネクチン結合前にＥＤＣ／ＮＨＳで活性化された表面にＢＡＥＣが観察された（図１２Ｂ）。これらの結果により、ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲル自体は、細胞接着に対して強い抵抗性を有し、タンパク質または他のリガンドで容易に固定され得ることが証明される。

別の実施形態において、本発明は、複数の標的結合パートナーが共有結合されたブロック共重合体を提供する。ブロックポリマーは、第１の親水性ブロックと第２の疎水性ブロックを有する。親水性ブロックは、複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、実質的に電気的に中性である。複数の標的結合パートナーをブロック共重合体に共有結合させることを、本発明の表面および架橋ポリマーの調製について上述した材料および方法を使用して実施することができる。これらのブロック共重合体を有利には微小粒子およびナノ粒子の形で使用することができる。

ジブロック共重合体は、一般式［疎水性モノマー］_ｌ−ブロック−［親水性モノマー］_ｍ共重合体を有し、ｌは、１０−３０の整数であり、ｍは、１０〜１００の整数である。一実施形態において、親水性ブロックは、ポリ（カルボキシベタイン）である。

一実施形態において、ポリ（ＣＢＭＡ）などのカルボキシベタイン成分をポリ（酸化プロピレン）（ＰＰＯ）などの疎水性成分とともに含む十分に確定されたジブロック共重合体が、メチル（ＣＨ_３）末端ＳＡＭなどのアルキル末端ＳＡＭで被覆された表面上に吸着される。本実施形態では、疎水性ポリマー部が疎水性表面に結合し、親水性スルホベタイン成分が、例えば、表面と接触する水溶液に曝される。

本発明のジブロック共重合体を、長さの異なる様々なカルボキシベタインをベースとした親水性部分および長さの異なる任意の好適な疎水性部分で構成することができ、該ジブロック共重合体をあらゆる好適な重合方法によって調製することができる。

本発明に有用なカルボキシベタインポリマーを製造するための代表的なモノマーとしては、２−カルボキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２’−メタクリロイルオキシエチル）エタンアミニウム分子内塩などのメタクリル酸カルボキシベタイン；アクリル酸カルボキシベタイン；カルボキシベタインアクリルアミド；カルボキシベタインビニル化合物；カルボキシベタインエポキシド；およびヒドロキシル基、イソシアネート基、アミノ基またはカルボン酸基を有する他のカルボキシベタイン化合物が挙げられる。本発明の共重合体のための疎水性成分としてあらゆる疎水性ポリマー鎖を使用することが可能である。代表的な疎水性成分としては、ポリ（酸化プロピレン）（ＰＰＯ）、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸塩、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタンおよびポリアミドが挙げられる。

一実施形態において、２つのブロック共重合体を一緒に使用することができる。一実施形態において、第１のジブロック共重合体は、［疎水性モノマー］_ｌ−ブロック−［親水性モノマー］_ｍ共重合体を含む。一実施形態において、第１のジブロック共重合体は、［酸化プロピレン］_ｌ−ブロック−［メタクリル酸カルボキシベタイン］_ｍ共重合体を含む。一実施形態において、第２のジブロック共重合体は、［疎水性モノマー］_ｌ−ブロック−［親水性モノマー］_ｎ共重合体を含む。一実施形態において、第２のジブロック共重合体は、［酸化プロピレン］_ｌ−ブロック−［メタクリル酸カルボキシベタイン］_ｎ共重合体を含む。これらのポリマーでは、ｌは１０−３０の整数であり、ｍは１０−１００の整数であり、ｎは１０−５０の整数であり、ｍはｎより大きい。

本発明の材料および方法を有利には様々な用途に使用することができる。一実施形態において、本発明の材料および方法を使用して、タンパク質アッセイを実施するためのタンパク質アレイを調製することができる。

従来のタンパク質アレイ上では、タンパク質の非特異的吸着が日常的に観察され、バックグラウンドレベルが高くなる。その問題は、血液、組織または細胞溶解液などの複合タンパク質溶液が使用されるときに特に顕著である。非標的タンパク質の非特異的吸着は、あらゆるセンサ表面の特異性を低下させ、結果の信頼性を低くする。本発明の材料からおよび方法により製造されるタンパク質アレイのための表面プラットフォームを使用することの利点としては、（ａ）血清および血漿における非汚染特性が優れていること、（ｂ）タンパク質固定のための官能基が豊富であること、および（ｃ）タンパク質固定のための活性化表面を自動的に非活性化して超低汚染バックグラウンドに戻すことができることが挙げられる。既存の表面化学作用でこれらの独特の特性のすべてを兼ね備えているものはない。

図１３Ａは、本発明の材料および方法を使用したアレイ（タンパク質アレイのためのｐＣＢＭＡをベースとした表面プラットフォーム）の概略図である。金被覆表面またはガラススライドにＡＴＲＰを介してｐＣＢＭＡがグラフトされる。上記の２ステップのＮＨＳ／ＥＤＣ化学作用を用いて、表面（すなわち両性イオン性カルボキシベタイン基のカルボン酸成分）を活性化することができる。次いで、スポッターを使用して、タンパク質が表面上に直接スポットされる。チップは、緩衝液で自動的に非活性化され、活性化カルボン酸成分がその本来のカルボン酸イオンに戻って、Ｐｃｂｍａの非汚染バックグラウンドがもたらされる。図１３Ｂは、タンパク質アレイのための従来の混合ＣＯＯＨ／ＯＨ ＯＥＧ ＳＡＭ表面プラットフォームの概略図であり、タンパク質固定後の最終段階のみを示す。血清または血漿のような複合媒体からの非特異的タンパク質結合は、タンパク質アレイ表面上の過剰または未反応のＣＯＯＨ基の存在に非常に敏感である。従来の表面化学作用に固有の問題は、それらが２つの個別的な官能基および非汚染基を含むことである。

代表的なタンパク質アレイの調製およびタンパク質アレイを実行する上でのその使用が実施例５に記載されている。

以下は、本明細書に用いられている略語の一覧である。

略語
ＡＩＢＮ アゾビスイソブチロニトリル
ＡＬＣＡＭ 活性化細胞白血球接着分子
ＡＴＲＰ 原子移動ラジカル重合
ＢＡＥＣ ウシ大動脈血管内皮細胞
Ｃ１２ メタクリル酸ラウリル
ＣＡ アクリル酸２−カルボキシエチル
ＣＢＭＡ メタクリル酸カルボキシベタイン
ＤＥ メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル
ＤＭ メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
Ｅ グルタミン酸
ＥＤＣ Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＴ １，２−エタンジチオール
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＧＬ メタクリル酸グリコール酸エチル
ｈＣＧ ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ＩＢ メタクリル酸イソブチル
Ｍｅ メタクリル酸メチル
ＮＨ_２ 塩酸メタクリル酸２−アミノエチル
ＮＨＳ Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＮＨＳエステル Ｎ−スクシンイミドエステル
ＰＥＧ メタクリル酸ポリ（エチルグリコール）
ＲＡＦＴ 可逆的付加開裂連鎖移動
ＳＡＭ 自己集成単層
ＳＰ ３−スルホプロピルメタクリル酸カリウム塩
ＳＰＲ 表面プラズモン共鳴
ＴＣＰＳ 組織培養ポリスチレン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ メタクリル酸２，２，２−トリフルオロエチル
ＴＭ 塩化［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム
ＴＳＴＵ テトラフルオロホウ酸Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウラニウム
以下の実施例は、例示の目的で示され、本発明を限定するものではない。

材料．ヒト血漿フィブリノーゲンおよび鶏卵白リゾチームをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。ヒト血漿フィブリノーゲンをＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米国カリフォルニア州テメキュラ）から購入した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびそのモノクロナルマウス抗体（ｍＡｂ；イソ型ＩｇＧｌ）をＳｃｒｉｐｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。メタクリル酸２−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）エチル（ＤＭＡＥＭ、９８％）、β−プロピオラクトン（９５％）、臭化第一銅（９９．９９９％）、臭化ブロモイソブチリル（９８％）、１１−メルカプト−１−ウンデカノール（９７％）、２，２’−ビピリジン（ＢＰＹ９９％）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ＨＰＬＣグレード）、ＮＨＳおよびＥＤＣをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：０．０１Ｍのリン酸塩、０．１３８Ｍの塩化ナトリウム、０．００２７Ｍの塩化カリウム、ｐＨ７．４）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。エタノール（無水２００プルーフ）をＡＡＰＥＲ Ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。最小抵抗率が１８．０ＭΩ・ｃｍのミリポア浄水システムを使用して、実験に使用する水を浄化した。反応および洗浄用ＴＨＦを使用前にナトリウムで乾燥させた。

実施例１
非汚染ポリ（ＣＢＭＡ）コーティングを有する代表的な二重機能性表面
ヒト血漿フィブリノーゲンおよび鶏卵白リゾチームをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。ヒト血漿フィブリノーゲンをＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（米国カリフォルニア州テメキュラ）から購入した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）およびそのモノクロナルマウス抗体（イソ型ＩｇＧｌ）をＳｃｒｉｐｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。メタクリル酸２−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）エチル（ＤＭＡＥＭ、９８％）、β−プロピオラクトン（９５％）、臭化第一銅（９９．９９９％）、臭化ブロモイソブチリル（９８％）、１１−メルカプト−１−ウンデカノール（９７％）、２，２’−ビピリジン（ＢＰＹ９９％）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、ＨＰＬＣグレード）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．０１Ｍのリン酸塩、０．１３８Ｍの塩化ナトリウム、０．００２７Ｍの塩化カリウム、ｐＨ７．４）をＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。エタノール（無水２００プルーフ）をＡＡＰＥＲ Ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。最小抵抗率が１８．０ＭΩ・ｃｍのミリポア浄水システムを使用して、実験に使用する水を浄化した。反応および洗浄用ＴＨＦを使用前にナトリウムで乾燥させた。

真空下の電子ビーム蒸着によって、ＳＰＲガラスチップを接着促進クロム層（厚さ２ｎｍ）および表面プラズモン活性金層（４８ｎｍ）で被覆した。ＳＡＭ調製前に、基板を報告された方法のように処理した。既に発表されている方法を用いて、臭化ブロモイソブチリルと１１−メルカプト−１−ウンデカノール開始剤の反応を介して、のブロモイソ酪酸ω−メルカプトウンデシルを合成した。

メタクリル酸２−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）エチルとβ−プロピオラクトンの反応によってＣＢＭＡを合成した。ＡＴＲＰ表面開始重合は、我々の先の文献に報告された。

既に発表された方法を用いて、臭化ブロモイソブチリルと１１−メルカプト−１−ウンデカノールの反応を介してブロモイソ酪酸メルカプトウンデシルを合成した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：４．１５（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ，ＯＣＨ_２）、２．５１（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，ＳＣＨ_２）、１．９２（ｓ，６Ｈ，ＣＨ_３）、１．５７−１．７２（ｍ，４Ｈ，ＣＨ_２）、および１．２４−１．４０（ｍ，１６Ｈ，ＣＨ_２）
ＣＢＭＡの合成．メタクリル酸カルボキシベタイン（ＣＢＭＡ）モノマー、２−カルボキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２’−メタクリロイルオキシエチル）エタンアミニウム分子内塩を、メタクリル酸２−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）エチル（ＤＭＡＥＭ、９８％）とβ−プロピオラクトン（９５％）の反応によって合成した。１０ｍＬの乾燥アセトン中０．８７ｇ（１２ｍｍｏｌ）のβ−プロピオラクトンを、１．５７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のＤＭＡＥＭを５０ｍＬの乾燥アセトンに溶解させた溶液に一滴ずつ添加した。反応物を窒素保護下で１５℃にて約５時間撹拌した。白色沈殿を５０ｍＬの乾燥アセトンおよび１００ｍＬの乾燥エーテルで洗浄した。製造物を減圧下で乾燥させて、ＣＢＭＡモノマーを得た。モノマーを重合前に２−８℃に維持した。収率：９１％。

ＳＰＲセンサ上の表面開始重合．真空下の電子ビーム蒸着によって、ＳＰＲガラスチップを接着促進クロム層（厚さ２ｎｍ）および表面プラズモン活性金層（４８ｎｍ）で被覆した。ＳＡＭ調製前に、基板を純粋のエタノールで洗浄し、ＵＶ光で浄化し、水および純粋のエタノールで洗浄した。金被覆基板を１ｍＭのブロモイソ酪酸ω−メルカプトウンデシルの純粋エタノール溶液に室温で２４時間浸漬させることによって開始剤ＳＡＭを形成した。重合前に、基板を純粋のエタノールで濯ぎ、その後ＴＨＦで濯ぎ、窒素流中で乾燥させた。

ＣｕＢｒ、および固定された開始剤を有する基板を窒素保護下で乾燥箱内の反応管内に入れた。隔膜ゴム栓で密封された管を取り出した。次いで、窒素保護下でシリンジを使用して、ＣＢＭＡおよびＢＰＹの脱気溶液（１：１の容量比の純水とメタノール）を管に移した。反応後、基板を除去し、エタノールおよび水で濯ぎ、試料を終夜水中に維持した。ＰＢＳ緩衝液による濯ぎをも適用して、試験前に未結合のポリマーを除去する。典型的な重合では、基板と、２５ｍＬのＣＨ_３ＯＨ／Ｈ_２Ｏ（容量比１：１）中７．５ｍｍｏｌのＣＢＭＡ、２ｍｍｏｌのＢＰＹおよび１ｍｍｏｌのＣｕＢｒとを反応させた。典型的なＡＴＲＰ重合の後、均質のカルボキシベタインポリマーブラシをＳＰＲセンサの金表面上にグラフトした。ポリマー層の厚さは、偏光解析法で測定すると約１０−１５ｎｍである。

ＳＰＲ分析およびタンパク質吸着量．タンパク質吸着量を波長インターロゲーションに基づく特注の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサで測定した。ＳＰＲチップ（３２×１８×２ｍｍ）をプリズムの基部に貼りつけ、屈折率整合液（Ｃａｒｇｉｌｌｅ）を使用して光学的接触を確立した。実験中に液体試料を収容するために、４つの独立した平行流路を有する４チャネル流動セル（接触面積：それぞれ１７×３ｍｍ）を使用した。蠕動ポンプ（Ｉｓｍａｔｅｃ）を利用して、液体試料を流動セルの４つのチャネルに送達した。ＰＢＳ中１．０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲン溶液を０．０５ｍＬ／分の流速でセンサ表面に流した。ＳＰＲ検出器を使用して、タンパク質−表面相互作用をリアルタイムで監視した。波長シフトを利用して、表面濃度（または単位面積当たりの質量）の変化を測定した。

ＳＰＲセンサによって測定できるシグナルの最小の変化は、０．０２ｎｍ（すなわち、使用した特注のＳＰＲセンサでは０．００２ｎｍである基線ノイズの標準偏差の１０倍）以下であった。通常の分子では、約８００ｎｍの動作波長において、１分間のＳＰＲ波長シフトは、表面上の約１５ｎｇ／ｃｍ^２の吸着量に相当する。各表面に対して、少なくとも３つの試料をタンパク質吸着について測定した。

偏光解析法．分光偏光解析装置（Ｓｅｎｔｅｃｈ ＳＥ−８５０、ＧｍｂＨ）を使用して偏光解析を行った。サンプル調製は、ＸＰＳの実験と同じである。５つの個別のスポットを可視領域において３つの異なる入射角（５０、６０および７０度）で測定した。同一バッチの金被覆チップをＵＶ−オゾンクリーナーで２０分間浄化し、エタノールおよびミリポア水で洗浄し、窒素で乾燥させた。無処理の金被覆チップを対照として使用した。調査する膜の厚さを、想定屈折率が１．４５のコーシー層モデルを使用して測定した。

ポリ（ＣＢＭＡ）グラフトＳＰＲセンサ上の抗ｈＣＧの固定．ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学を使用して、抗体のアミンをポリ（ＣＢＭＡ）のカルボキシル基に対して反応させることによって、ポリマーブラシの表面上にモノクロナルマウス抗ｈＣＧを固定した。２ｍｇ／ｍＬのＮＨＳおよび２ｍｇ／ｍＬのＥＤＣをジオキサン／水（ｖ／ｖ１４：１）の混合溶媒に含む新たに調製した溶液中でＳＰＲチップを室温で１時間インキュベートすることによって、ポリ（ＣＢＭＡ）グラフトＳＰＲセンサ表面を活性化させた。次いで、基板を溶液から取り出し、１８．２ＭΩｃｍのＤＩ水で濯ぎ、窒素流で乾燥させた。ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧの１０μＬの液滴を表面上に滴下させ、表面をガラスカバースリップで被覆し、次いでｍＡｂを活性化表面とともに高湿環境において４℃で約２４時間インキュベートすることによって、抗ｈＣＧ ｍＡｂを活性化表面に結合させた。抗体機能化基板を１８．２ＭΩｃｍのＤＩ水で洗浄し、続いて過剰の活性化部位を１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）によって１０分間にわたってブロックして、あらゆる未反応ＮＨＳを除去した。

実施例２
代表的なポリ（ＣＢＡＡ）被覆表面に対する標的結合パートナーの固定の最適化
ＮＨＳ／ＥＤＣ法を用いたカルボン酸塩の最適な活性化を、溶媒としてｐＨ３．３の水／ＨＣｌを使用してｉｎ ｓｉｔｕで達成した。手短に述べると、新たに調製したＮＨＳ（０．０５Ｍ）およびＥＤＣ（０．２Ｍ）の溶液を３０℃の温度で１０分間にわたって注入することによって、ポリマー表面を活性化させた。２つの異なる抗体、特に、活性化細胞白血球接着分子に対するモノクロナル抗体（抗ＡＬＣＡＭ）およびサルモネラに対するポリクロナル抗体（抗Ｓａｌｍ）を、抗体濃度を５０ｕｇ／ｍＬとして様々なｐＨ条件下で活性化ポリ（ＣＢＡＡ）被覆表面の異なるスポット内に固定した。流速は、５０ｕｌ／分、Ｔ＝３０Ｃであり、インキュベーション時間は、約１５分であった。その後、表面を１０ｍＭのＰＢ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．８（ＰＢＮａ）で処理して、すべての非共有結合リガンドを除去した。抗体の固定に対するランニング緩衝液のｐＨの影響を図７に示す。ｐＨ８．０における抗体の固定に対する典型的な応答を図８に示す。図９は、抗ＡＬＣＡＭ固定表面および固定された５０％血漿中抗Ｓａｌｍを有する対照表面上のＡＬＣＡＭの検出を示す。ＣＢＡＡモノマーの合成およびポリ（ＣＢＡＡ）表面のグラフティングは、上記実施例１に記載したＣＢＭＡと同様である。

実施例３
ポリ（ＣＢＡＡ）が被覆され、ＴＳＴＵで活性化された二重機能性表面を有する代表的なセンサ
本実施例では、ＴＳＴＵ法を用いて機能化された非汚染ポリ（ＣＢＡＡ）コーティングをベースとする二重機能性表面を有するＳＰＲセンサを完成した。特注の４チャネル分光表面プラズモン共鳴センサを使用して、ポリ（ＣＢＡＡ）表面の機能化を監視した。

最初に、ＡＴＲＰ法を介してポリ（ＣＢＡＡ）チップをポリ（ＣＢＡＡ）エステルの形で調製した。次いで、ポリ（ＣＢＡＡ）−エステル表面を加水分解して、両性イオン性非汚染ポリ（ＣＢＡＡ）表面を達成する。グラフトされたポリ（ＣＢＡＡ）エステルを有するセンサチップ表面をミリＱ水で洗浄し、濾過空気で乾燥させ、ＳＰＲセンサに組み込んだ。ポリ（ＣＢＡＡ）表面にｐＨ１２の０．１ＭのＮａＯＨを２時間流すことによって加水分解をｉｎ ｓｉｔｕで実施した。ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１ｍｇ／ｍＬ の濃度の表面接着性が強いタンパク質（フィブリノーゲン）を注入することによって、加水分解の効果を調べた。ポリ（ＣＢＡＡ）エステル表面を完全に加水分解するのに２時間が十分な時間であることが判明した。

両性イオン性ポリ（ＣＢＡＡ）表面をＴＳＴＵ（５ｍｇ／ｍＬ）のＤＭＦ溶液に２時間浸した。その後、表面をエタノールで洗浄し、濾過空気で乾燥させた。チップをそのままＳＰＲセンサに組み込んだ。２つの抗体のモデルシステムを使用して、表面グラフトポリ（ＣＢＡＡ）の機能化を実証した。活性化細胞白血球接着分子に対する抗体（抗ＡＬＣＡＭ）を測定チャネル内に固定し、サルモネラに対する抗体（抗Ｓａｌｍ）を参照チャネル内に固定した。固定をｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中にてｉｎ ｓｉｔｕで実施した。抗体濃度は、それぞれ１０ｕｇ／ｍＬおよび５０ｕｇ／ｍＬであり、インキュベーション時間は、１５分であった。

図１０は、ＴＳＴＵ法で活性化されたポリ（ＣＢＡＡ）センサの表面上にＡＬＣＡＭおよびサルモネラ抗体を（それぞれ１０および５０ｕｇ／ｍｌで）２回固定するセンサ応答を示す。図１１は、抗ＡＬＣＡＭ固定表面、および非標的抗原（すなわちこの場合はフィブリノーゲン）を使用した低バックグラウンドノイズ（または低非特異的結合）を使用したＡＬＣＡＭの検出を示す。１０ｍＭのリン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．５を５時間流すことによって、残留するＮＨＳ−エステルをカルボン酸塩基に戻した。１ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノーゲンを参照チャネルに注入して、加水分解の効果および超非汚染特性を調べた（図１１Ａ）。次いでＰＢＳ緩衝液中でＡＬＣＡＭ抗原の検出を実施した。１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＡＬＣＡＭの溶液を測定および参照チャネルに１０分間注いだ。図１１Ｂは、測定（抗ＡＬＣＡＭ）および対照（抗Ｓａｌｍ）チャネルにおけるＡＬＣＡＭ結合に対するセンサ応答を示す。ＡＬＣＡＭ抗原を抗ＡＬＣＡＭ表面に特異的に結合させた。これらの結果は、非活性化プロセスが成功し、機能化ポリ（ＣＢＡＡ）表面がその超非汚染特性を維持したとともに、抗ＡＬＣＡＭの生物活性を保ったことを示唆している。

実施例４
代表的なカルボキシベタインヒドロゲルの調製
本実施例では、ポリ（ＣＢＭＡ）ヒドロゲル、ならびにタンパク質吸着および細胞接着に対するその抵抗性について記載する。２．７ＭのＣＢＭＡモノマーをジメタクリル酸テトラエチレングリコール（ＴＥＧＤＭＡ）（５．９モル％）に添加することによって、そして混合溶液（エチレングリコール／エタノール／Ｈ_２Ｏ＝３：１：１容量比）中メタ重亜硫酸ナトリウム（１．２モル％）および過硫酸アンモニウム（２．６モル％）によって開始される遊離ラジカル重合を介してＣＢＭＡヒドロゲルを調製した。反応を、０．４ｍｍのＰＴＦＥスペーサで隔てられた一対のガラス基板の間で３７℃にて１２時間実施した。重合後、ゲルを多量のＤＩに３日間浸し、水を毎日交換して、残留化学物質を除去した。次いで、ゲルをさらに２日間にわたって毎日交換される滅菌ＰＢＳ溶液中で平衡させた。ヒドロゲルを叩いて、直径が５ｍｍのディスクとし、使用するまで滅菌緩衝液中に保管した。

ヒドロゲルディスクをジオキサン／水（１４：１）混合物中２ｍｇ／ｍｌのＮＨＳおよび２ｍｇ／ｍｌのＥＤＣのジオキサンに室温で１時間浸した。ヒドロゲルディスクは、ジオキサン／水溶液による浸漬中に収縮した。ディスクを溶液から取り出し、ミリポア水に浸漬させて再び膨張させ、ミリポア水で濯ぎ、さらに３０分間ＰＢＳ緩衝液に浸漬させた。試料を１００μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液に４℃で２４時間浸した。

ウシ大動脈血管内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、組織培養ポリスチレンフラスコ上の５％ＣＯ_２を含む高湿度雰囲気中で、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸および２％のペニシリンストレプトマイシン溶液が補給されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に継続的に成長するように維持した。１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄することによってＢＡＥＣをフラスコ表面から除去した後、分離のために２ｍＬのトリプシン／エチレンジアミン四酢酸（０．０５％・０．５３ｍＭ）中でインキュベートした。細胞を分離した後、細胞を８ｍＬのＤＭＥＭに懸濁させ、懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心させた。上澄みを除去し、細胞を、５％または１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭで１０５個／ｍＬの最終濃度に希釈した。ヒドロゲルディスクを２４ウェルプレートにおいてＰＢＳによって洗浄し、２ｍＬの細胞懸濁液を各ウェルに添加した。次いで、細胞を試料とともに５％ＣＯ_２の高湿度雰囲気中にて３７℃で３日間インキュベートした。２時間〜３日間の培養の間に、１０倍の対物レンズを使用した、デジタルカメラが装備されたＮｉｋｏｎ ＴＥ２００位相差顕微鏡を使用して、細胞の形態および増殖を観察した。血球計を使用して細胞接種密度を測定した。細胞培地および試薬をＧｉｂｃｏ（米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）から入手した。

実施例５
ＣＢＡＡをベースとする代表的なタンパク質アレイ
偏光コントラストを用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）撮像センサを使用して特異的タンパク質結合事象を監視するために、マイクロコンタクトプリンティングロボット（Ｓｐｏｔｂｏｔ、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ Ｉｎｃ．）を使用して、ポリＣＢＡＡ表面上のタンパク質マイクロアレイを製造した。該アレイを図１３Ａに概略的に示す。ＳＰＲ撮像センサは、ＳＰＲシグナルの空間分解リアルタイム変化の測定を可能にする強度変調に基づく。図１４は、それぞれ毎分３０マイクロリットルでＣＢＡＡ表面上を５分間流された３つの複合マトリックス（１００％血清、１００％血漿および１ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン）からのタンパク質吸着に対応する３つのセンサグラムを示す。それらのセンサグラムにおいて、最初の５分間は、ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を流した後に複合媒体の各々を添加することによって確定された基線である。複合媒体は、有意なＳＰＲのシフトを引き起こす異なるＲＩを有する。５分後、バックグラウンド屈折率が本来の基線の収集時のものと同一になるように溶液を再びＰＢＳに変化させる。複合媒体の添加前後の基線のいずれのシフトも表面に結合された定量測定タンパク質を表す。図１４から、１００％血漿または１ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンからの測定可能な結合がなく。１００％血清は最小限の結合を有する。

ＣＢＡＡ表面をマイクロアレイパターンの２つの抗体で特異的に機能化した。図１５は、表面上の抗体のＳＰＲ画像を示す。バックグラウンドとタンパク質スポットの輝度の差は、固定されたタンパク質の量を定量的に表す。最初に、ＣＢＡＡ表面と、０．１ＭのＥＤＣおよび０．０５ＭのＮＨＳをｐＨ３．３の１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中に含む溶液とを３０分間反応させることにより該表面を活性化させることによってタンパク質マイクロアレイを製造した。直径５００μｍのステルスピンを備えたマイクロコンタクトプリンティングロボットを使用して、抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）および抗サルモネラ抗体を活性化ポリマー表面上にプリントし、３０分間反応させた。次いで、過剰のタンパク質を表面から洗い流し、活性ＮＨＳエステルを加水分解してカルボン酸に戻して、表面を、固有の非汚染特性を有するその両性イオン性状態に戻すために、ｐＨ９．０の１００ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液に１００ｍＭのヒドロキシルアミンを溶解させた溶液にマイクロアレイチップを約１８時間にわたって浸漬させることによって活性化バックグラウンドを非活性化した。図１６は、抗ｈＣＧを含むスポット上に１０μｇ／ｍｌのｈＣＧが特異的に検出されるが、対照抗サルモネラスポットまたはバックグラウンド上に検出が観察されないことを示す。ＣＢＡＡ表面は、非汚染バックグラウンドを有するだけでなく、タンパク質−タンパク質結合事象の検出を可能にするタンパク質で特異的に機能化され得る。表面化学作用は、特に、検出が一般に血液のような複合生物媒体中で実施される生体医学的診断に広範な用途を有する。ＳＰＲなどの多くの新しい非標識法が普及したが、非汚染バックグラウンドおよび特異的表面がないため、特異的および非特異的結合のデコンボリューションが困難である。

実例となる実施形態を図示および記載したが、本発明の趣旨および適用範囲から逸脱することなく、様々な変更を加えることができることが理解されるであろう。

排他的財産または特権が主張される本発明の実施形態を以下のように規定する。

Claims (29)

1. 改変表面を有する基板であって、
   （ａ）各ポリマーが複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、各ポリマーが実質的に電気的に中性である、基板の表面に結合された複数のポリマーと、
   （ｂ）複数の該ポリマーに共有結合され、標的分子に対して親和性を有する複数の標的結合パートナーと
   を含む基板。
2. 前記複数のポリマーが前記表面に共有結合される、請求項１に記載の基板。
3. 前記複数のポリマーが、複数のアルキレン部分を含む単層を介して前記表面に共有結合される、請求項１に記載の基板。
4. 前記ポリマーが、式：
   

   

   ［式中、
   Ｂは、
   

   

   ［式中、Ｒは、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択され；Ｅは、置換または無置換のアルキレン、−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｏ−および−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）ＮＲ^２−からなる群より選択され、ｐは、０〜１２の整数であり、Ｒ^２は、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択される］からなる群より選択され；
   Ｌは、場合により１個以上の酸素原子を含む直鎖状または分枝状アルキレン基であり；
   Ｐは、
   

   

   ［式中、Ｒ^３およびＲ^４は、水素、および置換または無置換のアルキル基からなる群より独立して選択され、Ｒ^５は、置換または無置換のアルキレン基、フェニレン基およびポリエーテル基からなる群より選択され、ｍは、１〜７の整数である］からなる群より選択され；
   ｘは、３〜１０００の整数である］を有する、請求項１に記載の基板。
5. 前記ポリマーが、式：
   

   

   ［式中、
   Ｒは、水素、および置換、また無置換のアルキルからなる群より選択され；
   Ｌ_１およびＬ_２は、独立して、場合により１個以上の酸素原子を含む直鎖状または分枝状アルキレン基であり；
   ｘは、３〜１０００の整数である］を有する、請求項１に記載の基板。
6. 前記ポリマーが、式：
   

   

   ［式中、
   Ｂ_１およびＢ_２は、
   

   

   ［式中、Ｒは、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択され；Ｅは、置換または無置換のアルキレン、−（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）Ｏ−および（ＣＨ_２）_ｐＣ（Ｏ）ＮＲ^２−からなる群より選択され、ｐは、０〜１２の整数であり、Ｒ^２は、水素、および置換または無置換のアルキルからなる群より選択される］からなる群より独立して選択され；
   Ｌは、場合により１個以上の酸素原子を含む直鎖状または分枝状アルキレン基であり；
   Ｐ_１は、正に荷電した基であり；
   Ｐ_２は、カルボン酸基であり；
   ｍは、３〜１０００の整数であり；
   ｎは、３〜１０００の整数である］を有する、請求項１に記載の基板。
7. Ｐ_１が芳香族環における窒素またはＮＲ_５Ｒ_６であり、Ｒ_５およびＲ_６が、独立して、置換または無置換のアルキル基である、請求項６に記載の基板。
8. 前記複数のポリマーが前記表面上にブラシを形成する、請求項１に記載の基板。
9. 前記ポリマーがポリ（カルボキシベタイン）である、請求項１に記載の基板。
10. 前記標的結合パートナーが、酵素、抗体、抗原、受容体およびリガンドからなる群より選択される、請求項１に記載の基板。
11. 前記標的結合パートナーが、タンパク質、ペプチド、核酸および糖からなる群より選択される、請求項１に記載の基板。
12. 表面を改変するための方法であって、該方法は：
    複数の標的結合パートナーを、表面に結合された複数のポリマーに共有結合させる工程を包含し、該標的結合パートナーが標的分子に対して親和性を有し、各ポリマーが複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、各ポリマーが実質的に電気的に中性である、方法。
13. 前記複数の標的結合パートナーを前記複数のポリマーに共有結合させる工程が、該ポリマーと該標的結合パートナーの間にアミド結合を形成することを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記複数の標的結合パートナーを前記複数のポリマーに共有結合させる工程は、カルボン酸基の一部を活性化エステルに変換し、該活性化エステルとアミノ基を有する標的結合パートナーとを反応させることを含む、請求項１２に記載の方法。
15. 前記活性化エステルがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、請求項１２に記載の方法。
16. 前記複数のポリマーが前記表面上にブラシを形成する、請求項１２に記載の方法。
17. 前記ポリマーがポリ（カルボキシベタイン）である、請求項１２に記載の方法。
18. 前記標的結合パートナーが、酵素、抗体、抗原、受容体およびリガンドからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
19. 請求項１２〜１８のいずれか１項の方法によって調製される改変表面を有する、基板。
20. 複数の標的結合パートナーが共有結合された架橋ポリマーであって、該架橋ポリマーは複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、該架橋ポリマーは実質的に電気的に中性であり、該標的結合パートナーは標的分子に対して親和性を有する、架橋ポリマー。
21. 前記架橋ポリマーが架橋ポリ（カルボキシベタイン）である、請求項２０に記載の架橋ポリマー。
22. 前記架橋ポリ（カルボキシベタイン）が、アクリル酸カルボキシベタイン、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシドおよびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーから調製される、請求項２１に記載の架橋ポリマー。
23. 前記標的結合パートナーが、酵素、抗体、抗原、受容体およびリガンドからなる群より選択される、請求項２１に記載の架橋ポリマー。
24. 前記架橋ポリマーがヒドロゲルである、請求項２１に記載の架橋ポリマー。
25. 標的分子に対して親和性を有する複数の標的結合パートナーが共有結合されたブロック共重合体であって、該ブロック共重合体は第１の親水性ブロックおよび第２の疎水性ブロックを有し、該親水性ブロックは複数のカルボン酸基および複数の正に荷電した基を含み、該親水性ブロックは実質的に電気的に中性である、ブロック共重合体。
26. 前記親水性ブロックがポリ（カルボキシベタイン）である、請求項２５に記載のブロック共重合体。
27. 前記ポリ（カルボキシベタイン）が、アクリル酸カルボキシベタイン、カルボキシベタインアクリルアミド、カルボキシベタインビニル化合物、カルボキシベタインエポキシドおよびそれらの混合物からなる群より選択される１つ以上のモノマーから調製される、請求項２５に記載のブロック共重合体。
28. 前記標的結合パートナーが、酵素、抗体、抗原、受容体およびリガンドからなる群より選択される、請求項２５に記載のブロックポリマー。
29. 前記ブロック共重合体が微小粒子またはナノ粒子の形である、請求項２５に記載のブロックポリマー。

Images