JP2006266746A - バイオセンサー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 表面に金属層を有し、該金属層に、直接又は中間層を介して、アセトアセチル基含有親水性高分子が結合している基板から成るバイオセンサー。
【選択図】 なし
Description
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、末端に反応性基を有するアルカンチオール又はその酸化体であるジスルフィドを用いて金属表面に密な層を形成させた後、アルカンチオール末端の反応性基と、アセトアセチル基含有水溶性高分子とを反応させることにより得られる。
好ましくは、アセトアセチル基をアミノ酸と反応させることによりカルボン酸が導入されている。
好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは表面プラズモン共鳴分析に使用される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
本発明のバイオセンサーは、表面に金属層を有し、該金属層に、直接又は中間層を介して、アセトアセチル基含有水溶性高分子が結合している基板から成ることを特徴とする。
エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類:アクリルアミド、メタクリルアミド、N−アクリロイルモルホリン、N,N−ジメチルアクリルアミド、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(もしくはその塩)等、
芳香族単量体:スチレン、ビニルトルエン、p−t−ブチルスチレン、p−ビニル安息香酸、ビニルナフタレン等、
その他のビニル単量体:エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、N−ビニルピロリドン、N−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。
ノニオン性基を有するモノマー:2−ヒドロキシエチルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、2−ヒドロキシ−3−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、1,4−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、1−ブテニルアルコール等。
アニオン性基を有するモノマー:ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸、スルホエチルメタクリレート、スチレンスルホン酸、アクリル酸、メタクリル酸、2−(ホスホノエチルオキシ)エチルメタクリレート等。
カチオン性基を有するモノマー:[2-(アクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド、 [2−(メタクリロイルオキシ)エチル]トリメチルアンモニウムクロリド等、
両性イオン基を有するモノマー: [2−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−(3−スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド 、2−[(メタクリロイルオキシ)エチル]ホスホリルコリン等。
δ=(ΣEcoh/ΣV)1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のSP値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー(1:1):21.0に対する溶剤2−フェノキシエタノール:25.3、ポリメチルメタクリレート:20.3に対する溶剤アセトニトリル:22.9、ポリスチレン:21.6に対する溶剤トルエン:18.7である。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、DNA(cDNAを含む)、RNAのいずれも使用できる。DNAの種類は特に限定されず、天然由来のDNA、遺伝子組換え技術により調製した組換えDNA、又は化学合成DNAの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはプロテインG、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例は、アセトアセチル基含有水溶性高分子を用いたセンサーチップの製造方法である。
(1)金表面基板の作製
縦8mm×横80mm×厚さ0.5mmのガラス基板に、平行平板型6インチ用スパッタ装置(アルバック(株)社製SH−550)を用いて基板上にクロムの厚さが1nm、
さらにクロム上に金の厚さが50nmになるようにスパッタ製膜を行った。この基板をModel-208UV-オゾンクリーニングシステム(TECHNOVISION INC.)で30分処理し、金表面基板を作製した。
特許文献1に記載の方法を応用して、金表面にヒドロゲルを作成した。(1)で作成した金表面基板をペトリ皿(内径16cm)中に置いた。5.0mMの11−ヒドロキシウンデカンチオール(同仁化学製)を溶解したエタノール/水(80/20)を表面に注いだ。ペトリ皿を40℃の振盪インキュベーターで20分間インキュベートした。表面を5×50mlの水、50mlのエタノール/水(80/20)、及び5×50mlの水で洗浄した。さらに、20mlの0.4M水酸化ナトリウム及び20mlのジエチレングリコールジメチルエーテル中2.0mlのエピクロロヒドリンの溶液に接触させた。25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応を進行させた。表面を2×50mlのエタノール及び5×50mlの水で洗浄した。40.5mlの水に13.5gのデキストラン(T500,Pharmacia)を溶解し、4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加した溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に注いだ。次に25℃の振盪インキュベーターで20時間インキュベートした後、表面を15×50mlの50℃の水で洗浄した。ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解し、デキストラン処理表面に注ぎ、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした後、水洗した。さらにもう一度、上記のブロモ酢酸溶液による反応・28℃16時間インキュベート・水洗を繰り返すことで、試料1を得た。
(1)で作成した金表面基板をペトリ皿(内径16cm)中に置いた。4.0mMの8−ヒドロキシオクタンチオール(同仁化学製)および1.0mMの11−アミノウンデカンチオール(同仁化学製)を溶解したエタノール/水(80/20)を表面に注ぎ、ペトリ皿を40℃の振盪インキュベーターで20分間インキュベートした。表面を5×50mlの水、50mlのエタノール/水(80/20)、及び5×50mlの水で洗浄した。アセトアセチル化ポリビニルアルコールであるゴーセファイマーZ200H(日本合成化学(株)社製)を10質量%溶解したアルカリ溶液(pH10.0、NaOHにより調整)を表面に注ぎ、ペトリ皿を60℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を5×50mlの水で洗浄することで、試料2を得た。
1Mのグリシン水溶液(pH8.5、NaOHによりpH調整)を、試料2と同様の操作で得られた表面に注ぎ、ペトリ皿を60℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を5×50mlの水で洗浄することで、試料3を得た。
1Mの5−アミノ吉草酸水溶液(pH8.5、NaOHによりpH調整)を、試料2と同様の操作で得られた表面に注ぎ、ペトリ皿を60℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を5×50mlの水で洗浄することで、試料4を得た。
本実施例は、実施例1で得られたセンサーチップに対するニュートラルアビジン(PIERCE製)の固定化に関するものである。
実施例1で製造されたセンサーチップ1、3、4に対し、0.4MのEDC(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide)および0.1MのNHS (N-Hydroxysuccinimide)を含む水溶液を30分接触させ、次にHBS-Nバッファー(ビアコア社製、pH7.4)で洗浄した。なお、HBS-Nバッファーの組成は、HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic Acid)0.01mol/l(pH7.4)、NaCl 0.15mol/lである。次にセンサーチップ1〜4を本発明の表面プラズモン共鳴装置に設置した。センサーチップをセットする位置は、レーザー光の当たる中心位置が縦方向は中央に、横方向は端部から40mmの位置にセットした。チップ上にはポリプロピレン製の部材を被せることにより、幅(縦方向)1mm、長さ(横方法)7.5mm、深さ1mmのセルを作成した。セル内をニュートラルアビジン溶液(100μg/ml、HBS-Nバッファー)に置換し、30分静置後、HBS-Nバッファーに置換した。以上の操作により、N-アビジンをセンサーチップ表面に共有結合で固定化した。NHSエステル化されたセンサーチップ1について、ニュートラルアビジンの添加前と添加後HBS-Nバッファー置換終了から3分後の共鳴シグナル(RU値)変化量を結合量の基準として、センサーチップ2〜4のニュートラルアビジンの添加前と添加後HBS-Nバッファー置換終了から3分後の共鳴シグナル(RU値)変化量(すなわちニュートラルアビジンの結合量)を、相対値で評価した。得られた結果を表1に示す。
本実施例は、実施例2で得られたニュートラルアビジンが固定化されたセンサーチップ1〜4と、D-ビオチン(ナカライテスク製)との相互作用測定に関するものである。
実施例2の測定後、セル内をエタノールアミン・HCl溶液(1M、pH8.5)に置換し、ニュートラルアビジンと反応せずに残存した、活性化されたCOOH基をブロックした。次に、セル内をD-ビオチン(1μg/ml、HBS-Nバッファー)に置換し、10分間静置後、HBS-Nバッファーに置換した。
Claims (14)
- 表面に金属層を有し、該金属層に、直接又は中間層を介して、アセトアセチル基含有親水性高分子が結合している基板から成るバイオセンサー。
- アセトアセチル基含有親水性高分子がアセトアセチル基含有ポリビニルアルコールである、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 末端に反応性基を有するアルカンチオール又はその酸化体であるジスルフィドを用いて金属表面に密な層を形成させた後、アルカンチオール末端の反応性基と、アセトアセチル基含有水溶性高分子とを反応させることにより得られる、請求項1又は2に記載のバイオセンサー。
- アセトアセチル基をアミノ酸と反応させることによりカルボン酸が導入されている、請求項1から3の何れかに記載のバイオセンサー。
- 中間層の膜厚が0.1nm以上500nm以下である、請求項1から4の何れかに記載のバイオセンサー。
- 金属が金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである、請求項1から5の何れかに記載のバイオセンサー。
- 非電気化学的検出に使用される、請求項1から6の何れかに記載のバイオセンサー。
- 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項1から7の何れかに記載のバイオセンサー。
- 表面に金属層を有する基板の表面に、直接又は中間層を介して、アセトアセチル基含有水溶性高分子を化学的に結合する工程を含む、請求項1から8の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
- アセトアセチル基あるいはアセトアセチル基をアミノ酸と反応させることにより導入されたカルボン酸に生理活性物質が共有結合により結合している、請求項1から8の何れかに記載のバイオセンサー。
- 請求項1から8の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法。
- 生理活性物質が共有結合により表面に結合している請求項1から8の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項12に記載の方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項12又は13に記載の方法。
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