JP2006234705A - バイオセンサー - Google Patents
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Abstract
【課題】 多量の生理活性物質を固定化したバイオセンサーを提供すること。
【解決手段】 架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を表面に固定化した基板からなるバイオセンサー。
【選択図】 なし
【解決手段】 架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を表面に固定化した基板からなるバイオセンサー。
【選択図】 なし
Description
本発明は、バイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに用いるためのバイオセンサー及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)測定技術、水晶発振子マイクロバランス(QCM)測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。SPR測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。QCM測定技術は水晶発振子の金電極(デバイス)上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ngレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子(nmレベル)表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴(SPR)を例として、説明する。
一般に使用される測定チップは、透明基板(例えば、ガラス)、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が10以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている(特許文献1を参照)。 上記のチップにおいては、生理活性物質を基板の表面に固定化し、固定化された生理活性物質に被験物質を接触させてSPR信号の変化を測定することにより、当該分子間の相互作用を分析できる。しかしながら、従来のチップにおいては、生理活性物質の固定量が十分ではなく、リガンドを相互作用させた際のSPR信号の変化量が十分なものにならない場合があり、信頼性の高い測定が困難となるという問題があった。
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、多量の生理活性物質を固定化したバイオセンサーを提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、基板の表面に、予め架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を固定化することによって、多量の生理活性物質を基板に固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を表面に固定化した基板からなるバイオセンサーが提供される。
好ましくは、基板は金属表面又は金属膜である。
好ましくは、金属表面又は金属膜が、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
好ましくは、金属表面又は金属膜が、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用され、さらに好ましくは、表面プラズモン共鳴分析に使用される。
好ましくは、架橋した生理活性物質は生理活性を有している。
好ましくは、架橋した生理活性物質は生理活性を有している。
本発明の別の側面によれば、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を基板の表面に固定化することを含む、上記した本発明のバイオセンサーの製造方法が提供される。
好ましくは、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質の生理活性を確認し、生理活性を有する架橋された生理活性物質を基板の表面に固定化する。
好ましくは、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質の生理活性を確認し、生理活性を有する架橋された生理活性物質を基板の表面に固定化する。
本発明のさらに別の側面によれば、架橋した生理活性物質が表面に固定化されている本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
本発明のバイオセンサーの表面には多量の生理活性物質が固定化されており、これによりアナライトを相互作用させた場合のSPR信号変化の増幅が可能である。
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明のバイオセンサーは、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を表面に固定化した基板からなることを特徴とする。
本発明のバイオセンサーは、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を表面に固定化した基板からなることを特徴とする。
本発明において生理活性物質を架橋するために用いる架橋剤は、当該生理活性物質を架橋することができるものであれば、特に限定されないが、通常は、当該生理活性物質(リガンド)と反応しうる官能基を複数有する化合物であり、水もしくは水と相溶性のある溶媒(例えばメタノール、エタノール、DMSO、DMF、アセトン)に可溶なものが好ましい。
ここで言う生理活性物質(リガンド)と反応しうる官能基としては、−OH、−SH、−COOH、−NR1R2(式中、R1及びR2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す)、−CHO、−NR3NR1R2(式中、R1、R2及びR3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す)、−NCO、−NCS、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはC1〜C10程度であり、好ましくはC1〜C6である。また、カルボン酸の活性エステルも好ましく用いられる。
本発明で用いる架橋剤は架橋する生理活性物質の種類に応じて適宜選択することができる。蛋白質の架橋剤としては、例えば、カルボン酸活性化エステル、エポキシ、アルデヒド(例えば、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アクリルアルデヒドなど)、及びエチレングリコールビス(サクシンイミジルサクシネート)などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において好ましくは、架橋剤を用いて架橋した生理活性物質の生理活性を確認し、生理活性を有する架橋された生理活性物質を基板の表面に固定化する。ここで言う生理活性を確認する方法としては、当業者に公知の常法により当該生理活性物質の生理活性を測定する場合、アフィニティークロマトを用いて生理活性を有する生理活性物質(リガンド)のみを単離する場合などが挙げられる。
生理活性を測定するとは、例えば、生理活性物質が酵素であれば、その酵素活性を測定することなどが挙げられる。生理活性を測定する場合、(架橋反応後の生理活性)÷(架橋反応前の生理活性)、を求めることにより表面に固定化した生理活性物質(リガンド)の固定量、アナライトの反応量、反応比率を較正することができる。
また、アフィニティークロマトを用いて生理活性を有する生理活性物質(リガンド)のみを単離する方法は、当業者に公知の方法で実施することができる。例えば、生理活性物質が抗体である場合には、抗原を固定化したカラムを用意し、架橋した生理活性物質(即ち、架橋化抗体)を当該カラムに通し、カラムに吸着した架橋化抗体を回収することにより、生理活性を有する抗体を単離することができる。
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素/基質、酵素/補酵素、抗原/抗体、ホルモン/レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、0.1nm以上500nm以下であるのが好ましく、特に1nm以上200nm以下であるのが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上10nm以下であるのが好ましい。
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはBK7等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
本発明において好ましくは、基板は、疎水性高分子化合物又はポリヒドロキシ高分子化合物でコーティングした金属表面又は金属膜であるか、あるいは自己組織化膜を有する金属表面又は金属膜である。以下、疎水性高分子化合物、ポリヒドロキシ高分子化合物及び自己組織化膜について説明する。
本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度(25℃)が10%以下、より好ましくは1%以下、最も好ましくは0.1%以下である。
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、1種類のモノマーから成るホモポリマーでも、2種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。
浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。
浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、N,N−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、2−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。
基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−20℃以上100℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは0.01%以上30%以下、さらに好ましくは0.1%以上10%以下である。
固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは1秒以上24時間以下、さらに好ましくは3秒以上1時間以下である。
疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のSP値(単位:(J/cm3)1/2)と疎水性高分子化合物のSP値との差が、1以上20以下であることが好ましく、3以上15以下であることがさらに好ましい。SP値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、SP値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーEcohとモル容積Vは、Fedorsが規定した値を使用した(R.F.Fedors、Polym.Eng.Sci.、14(2)、P147、P472(1974))。
δ=(ΣEcoh/ΣV)1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のSP値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー(1:1):21.0に対する溶剤2−フェノキシエタノール:25.3、ポリメチルメタクリレート:20.3に対する溶剤アセトニトリル:22.9、ポリスチレン:21.6に対する溶剤トルエン:18.7である。
δ=(ΣEcoh/ΣV)1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のSP値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー(1:1):21.0に対する溶剤2−フェノキシエタノール:25.3、ポリメチルメタクリレート:20.3に対する溶剤アセトニトリル:22.9、ポリスチレン:21.6に対する溶剤トルエン:18.7である。
基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは1秒以上24時間以下、さらに好ましくは3秒以上1時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−20℃以上100℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは0.1nm以上500nm以下であり、特に好ましくは1nm以上300nm以下である。
本発明で用いることができるポリヒドロキシ高分子化合物としては、例えば多糖類(例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース)、または合成高分子化合物(例えばポリビニルアルコール)などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
本発明においては、好ましくは、平均分子量1万以上200万以下のポリヒドロキシ高分子化合物が用いられる。好ましくは2万以上200万以下、さらに好ましくは3万以上100万以下、最も好ましくは20万以上80万以下のポリヒドロキシ高分子化合物を用いることができる。
ポリヒドロキシ高分子化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、1〜90%のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ高分子化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド/ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ESCA(electron spectroscopy for chemical analysis)でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率(以下、F/O値と呼ぶ)を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なF/O値をカルボキシ化率100%とし、任意の条件でカルボキシ化した時のF/O値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
ポリヒドロキシ高分子化合物は有機分子X1−R1−Y1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子X1−R1−Y1について詳細に説明する。
X1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド(−SSR11Y11、−SSR1Y1)、スルフィド(−SR11Y11、−SR1Y1)、ジセレニド(−SeSeR11Y11、−SeSeR1Y1)、セレニド(SeR11Y11、−SeR1Y1)、チオール(−SH)、ニトリル(−CN)、イソニトリル、ニトロ(−NO2)、セレノール(−SeH)、3価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸(−COSH、−CSSH)が好ましく用いられる。
R1(とR11)は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖(枝分かれしていない)であり、場合により二重及び/又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
Y1とY11はポリヒドロキシ高分子化合物を結合させるための基である。Y1とY11は好ましくは同一であり、ポリヒドロキシ高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
有機分子X1−R1−Y1の具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−1−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
本発明のバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした膜中の基板から最も遠い側」という意味である。
本発明のバイオセンサーにおいては、上記した官能基に生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。
本発明のセンサー用基板に固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであって、架橋剤で架橋できるものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちIgG、IgM、IgA、IgE、IgDを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でO抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、DNA(cDNAを含む)、RNAのいずれも使用できる。DNAの種類は特に限定されず、天然由来のDNA、遺伝子組換え技術により調製した組換えDNA、又は化学合成DNAの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン(ストレプトアビジン)、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはリコンビナントプロテインA、リコンビナントプロテインG、リコンビナントプロテインL、リコンビナントプロテインA/G、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはリコンビナントプロテインA、リコンビナントプロテインG、リコンビナントプロテインL、リコンビナントプロテインA/G、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び/又は測定のために使用することができる。
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び/又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴(SPR)測定技術、水晶発振子マイクロバランス(QCM)測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる(例えば特開平6−167443号公報参照)。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがp偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがp偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
この全反射減衰(ATR)が生じる入射角、すなわち全反射減衰角(θSP)より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角(θSP)を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平11−326194号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角(θSP)を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
また、全反射減衰(ATR)を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第47巻 第1号(1998)の第21〜23頁および第26〜27頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層(表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層)上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角(θSP)の角度を測定している。
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角(θSP)を測定し、該全反射減衰角(θSP)の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトIgG抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトIgG抗体を特定物質として用いることができる。
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰(θSP)の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角(θSP)の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角(θSP)の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる(本出願人による特願2000−398309号参照)。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角(θSP)の角度変化量の測定を行っている。
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開2001−330560号公報に記載されている。
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の実験は、特開2001−330560号公報の図22に記載の装置(以下 本発明の表面プラズモン共鳴測定装置と呼ぶ)及び同公報の図23に記載の誘電体ブロック(以下、本発明の誘電体ブロックと呼ぶ)を用いて行った。さらに、特願2003−330927号に記載の測定チップ(ヒドロゲル被覆チップ)を用いた。
実施例1;4-アーム-ポリエチレングリコールサクシイミジルグルクレート(以下4PEGとする)(Polymer Source社製)とBSA(Sigma社製)の反応と反応物の検出
100mM HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl-1-pipazinyl)ethanesulfonic acid(以下HEPESと記す) 溶液を用いて2E-5M〜2E-3M 4PEG溶液を調製する。同様に、100mM HEPES溶液を使用し2×10-5〜2×10-3BSA溶液を調製する。マイクロチューブに各濃度のBSA溶液500μlを採取し、次にそのマイクロチューブを攪拌し、各濃度の架橋剤4PEG 500μlを徐々に添加する。その後、室温で1時間 シェーカー上で反応を行った。反応混合物が架橋されているかを検証するために、SDS-PAGE(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行った。使用したゲルは、eパジェル(ATTO社 アクリルアミド濃度5-20%)で、20mA、約80分間電気泳動を行った。泳動終了後のゲルは、蛍光染色試薬(Amersham社製 Deep Purple)を用いて染色し、検出はフルオロイメージアナライザー(富士写真フィルム社製FLA-8000)で行った。
100mM HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl-1-pipazinyl)ethanesulfonic acid(以下HEPESと記す) 溶液を用いて2E-5M〜2E-3M 4PEG溶液を調製する。同様に、100mM HEPES溶液を使用し2×10-5〜2×10-3BSA溶液を調製する。マイクロチューブに各濃度のBSA溶液500μlを採取し、次にそのマイクロチューブを攪拌し、各濃度の架橋剤4PEG 500μlを徐々に添加する。その後、室温で1時間 シェーカー上で反応を行った。反応混合物が架橋されているかを検証するために、SDS-PAGE(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行った。使用したゲルは、eパジェル(ATTO社 アクリルアミド濃度5-20%)で、20mA、約80分間電気泳動を行った。泳動終了後のゲルは、蛍光染色試薬(Amersham社製 Deep Purple)を用いて染色し、検出はフルオロイメージアナライザー(富士写真フィルム社製FLA-8000)で行った。
以上の操作により、架橋剤なしBSAの分子量バンドが約66,000に検出されたが、架橋剤と反応させたBSAの分子量バンドはスメヤーとなり約66,000〜400,000の間で検出された。
実施例2;架橋化BSAの固定化
測定チップに架橋化BSAを固定化し、相互作用測定は表面プラズモン共鳴測定装置を用いて行った。
(1)ヒドロゲル被覆チップの作製
ヒドロゲルは有機分子X−R−Yを介して金属膜に付着させることができる。有機分子X−R−Yについて詳細に説明する。
測定チップに架橋化BSAを固定化し、相互作用測定は表面プラズモン共鳴測定装置を用いて行った。
(1)ヒドロゲル被覆チップの作製
ヒドロゲルは有機分子X−R−Yを介して金属膜に付着させることができる。有機分子X−R−Yについて詳細に説明する。
Xは金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド
(−SSR'Y"、−SSRY)、スルフィド(−SR'Y"、−SRY)、ジセレニド(−SeSeR'Y"、
−SeSeRY)、セレニド(SeR'Y"、−SeRY)、チオール(−SH)、ニトリル(−CN)、イ
ソニトリル、ニトロ(−NO2)、セレノール(−SeH)、3価リン化合物、イソチオシアネ
ート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸(−COSH、
−CSSH)が好ましく用いられる。
(−SSR'Y"、−SSRY)、スルフィド(−SR'Y"、−SRY)、ジセレニド(−SeSeR'Y"、
−SeSeRY)、セレニド(SeR'Y"、−SeRY)、チオール(−SH)、ニトリル(−CN)、イ
ソニトリル、ニトロ(−NO2)、セレノール(−SeH)、3価リン化合物、イソチオシアネ
ート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸(−COSH、
−CSSH)が好ましく用いられる。
R(とR')は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖(枝分かれしていない)であり、場合により二重及び/又は三重結合を含む炭化水素鎖である。鎖の長さは10原子を越えることが好ましい。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
YとY"はヒドロゲルを結合させるための基である。YとY"は好ましくは同一であり、ヒドロゲルに直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
有機分子X−R−Yの具体例としては、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどが挙げられる。
(2)有機低分子化合物(本文中のX−R−Yに相当)を介してヒドロゲルで被覆された測定チップの作成
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208UV−オゾンクリーニングシステム(TECHNOVISION INC.)で30分間処理した後、エタノール/水(80/20)で溶解した11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
金属膜として50nmの金が蒸着された本発明の誘電体ブロックをModel-208UV−オゾンクリーニングシステム(TECHNOVISION INC.)で30分間処理した後、エタノール/水(80/20)で溶解した11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールの5.0mM溶液を金属膜に接触するように添加し、25℃で18時間表面処理を行った。その後、エタノールで5回、エタノール/水混合溶媒で1回、水で5回洗浄を行った。
次に、11−ヒドロキシ-1-ウンデカンチオールで被覆した表面に10重量%のエピクロロヒドリン溶液(溶媒:0.4M水酸化ナトリウム及びジエチレングリコールジメチルエーテルの1:1混合溶液)を接触させ、25℃の振盪インキュベーター中で4時間反応を進行させた。その後表面をエタノールで2回、水で5回洗浄した。次に、25重量%のデキストラン(T500,Pharmacia)水溶液40.5mlに4.5mlの1M水酸化ナトリウムを添加し、その溶液をエピクロロヒドリン処理表面上に接触させた。次に振盪インキュベーター中で25℃で20時間インキュベートした。表面を50℃の水で10回洗浄した。続いて、ブロモ酢酸3.5gを27gの2M水酸化ナトリウム溶液に溶解した混合物を上記デキストラン処理表面に接触させて、28℃の振盪インキュベーターで16時間インキュベートした。表面を水で洗浄し、その後上述の手順を1回繰り返した。このサンプルをヒドロゲル被覆チップと呼ぶ。
(2)架橋化BSAの固定化
上記(1)で作製したヒドロゲル被覆チップに、1−エチル−2,3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(400mM)とN−ヒドロキシスクシンイミド(100mM)との混合液を添加し、20分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。なお、HBS-Nバッファーの組成は、HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid)0.01mol/l(pH7.4)、NaCl0.15mol/lである。次に架橋化BSA(1mg/ml、10mM CaCl2含有HBS−Nバッファー)を添加し、30分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。
更に、エタノールアミン・HCl溶液(1M,pH8.5)測定チップに添加後、HBS−Nバッファー(ビアコア社製)で洗浄することにより、架橋化BSAと反応せずに残存したCOOH基をブロックした。
上記(1)で作製したヒドロゲル被覆チップに、1−エチル−2,3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(400mM)とN−ヒドロキシスクシンイミド(100mM)との混合液を添加し、20分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。なお、HBS-Nバッファーの組成は、HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid)0.01mol/l(pH7.4)、NaCl0.15mol/lである。次に架橋化BSA(1mg/ml、10mM CaCl2含有HBS−Nバッファー)を添加し、30分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。
更に、エタノールアミン・HCl溶液(1M,pH8.5)測定チップに添加後、HBS−Nバッファー(ビアコア社製)で洗浄することにより、架橋化BSAと反応せずに残存したCOOH基をブロックした。
以上の操作により、架橋化BSAを測定チップ表面に共有結合で固定した。架橋化BSAの添加前と洗浄後の共鳴シグナル(RU値)変化量を架橋化BSA固定量(RU値)とした。架橋化BSA固定による共鳴シグナル変化量は、8,750RUであった。同様な操作を未反応BSAで行った共鳴シグナル変化量は、2,500RUであった。上記の結果から架橋化BSAを用いることにより、固定化量を増大できることが示された。
実施例3;4-アーム-ポリエチレングリコールサクシイミジルグルクレート(以下4PEGとする)(Polymer Source社製)とトリプシン(Worthington社製)の反応と反応物の検出
100mM HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl-1-pipazinyl)ethanesulfonic acid(以下HEPESと記す) 溶液を用いて2×10-5〜2×10-3 4PEG溶液を調製する。同様に、100mM HEPES溶液を使用し2E-5M〜2E-3Mトリプシン溶液を調製する。マイクロチューブに各濃度のトリプシン溶液500μlを採取し、次にそのマイクロチューブを攪拌し、各濃度の架橋剤4PEG 500μlを徐々に添加する。その後、室温で1時間 シェーカー上で反応を行った。反応混合物が架橋されているかを検証するために、SDS-PAGE(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行った。使用したゲルは、eパジェル(ATTO社 アクリルアミド濃度5-20%)で、20mA、約80分間電気泳動を行った。泳動終了後のゲルは、蛍光染色試薬(Amersham社製 Deep Purple)を用いて染色し、検出はフルオロイメージアナライザー(富士写真フィルム社製 FLA-8000)で行った。
100mM HEPES(2-[4-(2-Hydroxyethyl-1-pipazinyl)ethanesulfonic acid(以下HEPESと記す) 溶液を用いて2×10-5〜2×10-3 4PEG溶液を調製する。同様に、100mM HEPES溶液を使用し2E-5M〜2E-3Mトリプシン溶液を調製する。マイクロチューブに各濃度のトリプシン溶液500μlを採取し、次にそのマイクロチューブを攪拌し、各濃度の架橋剤4PEG 500μlを徐々に添加する。その後、室温で1時間 シェーカー上で反応を行った。反応混合物が架橋されているかを検証するために、SDS-PAGE(SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を行った。使用したゲルは、eパジェル(ATTO社 アクリルアミド濃度5-20%)で、20mA、約80分間電気泳動を行った。泳動終了後のゲルは、蛍光染色試薬(Amersham社製 Deep Purple)を用いて染色し、検出はフルオロイメージアナライザー(富士写真フィルム社製 FLA-8000)で行った。
以上の操作により、架橋剤なしトリプシンの分子量バンドが約24,000に検出されたが、架橋剤と反応させたトリプシンの分子量バンドはスメヤーとなり約24,000〜120,000の間で検出された。
実施例4;架橋化トリプシンの固定化
測定チップに架橋化トリプシンを固定化し、相互作用測定は表面プラズモン共鳴測定装置を用いて行った。
実施例2で作製したものと同じヒドロゲル被覆チップに、1−エチルー2,3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(400mM)とN−ヒドロキシスクシンイミド(100mM)との混合液を添加し、20分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。次に架橋化BSA(1mg/ml、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファー)を添加し、30分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。
更に、エタノールアミン・HCl溶液(1M,pH8.5)測定チップに添加後、HBS−Nバッファー(ビアコア社製)で洗浄することにより、架橋化トリプシンと反応せずに残存したCOOH基をブロックした。
測定チップに架橋化トリプシンを固定化し、相互作用測定は表面プラズモン共鳴測定装置を用いて行った。
実施例2で作製したものと同じヒドロゲル被覆チップに、1−エチルー2,3ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(400mM)とN−ヒドロキシスクシンイミド(100mM)との混合液を添加し、20分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。次に架橋化BSA(1mg/ml、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファー)を添加し、30分間静置後、10mM CaCl2 含有HBS−Nバッファーで洗浄した。
更に、エタノールアミン・HCl溶液(1M,pH8.5)測定チップに添加後、HBS−Nバッファー(ビアコア社製)で洗浄することにより、架橋化トリプシンと反応せずに残存したCOOH基をブロックした。
以上の操作により、架橋化トリプシンを測定チップ表面に共有結合で固定した。架橋化トリプシンの添加前と洗浄後の共鳴シグナル(RU値)変化量を架橋化トリプシン固定量(RU値)とした。架橋化トリプシン固定による共鳴シグナル変化量は、7,000RUであった。同様な操作を未反応トリプシンで行った共鳴シグナル変化量は、1,750RUであった。上記の結果から架橋化トリプシンを用いることにより、固定化量を増大できることが示された。
Claims (11)
- 架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を表面に固定化した基板からなるバイオセンサー。
- 基板が金属表面又は金属膜である、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 金属表面又は金属膜が、金、銀、銅、白金又はアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項2に記載のバイオセンサー。
- 非電気化学的検出に使用される、請求項1から3の何れかに記載のバイオセンサー。
- 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項1から4の何れかに記載のバイオセンサー。
- 架橋した生理活性物質が生理活性を有している、請求項1から5の何れかに記載のバイオセンサー。
- 架橋剤を用いて架橋した生理活性物質を基板の表面に固定化することを含む、請求項1から6の何れかに記載のバイオセンサーの製造方法。
- 架橋剤を用いて架橋した生理活性物質の生理活性を確認し、生理活性を有する架橋された生理活性物質を基板の表面に固定化する、請求項7に記載の方法。
- 架橋した生理活性物質が表面に固定化されている請求項1から6の何れかに記載のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項9に記載の方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項9又は10に記載の方法。
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WO2018008100A1 (ja) * | 2016-07-06 | 2018-01-11 | 株式会社日立製作所 | 化学分析装置及びこれに用いる基材構造体 |
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2005
- 2005-02-28 JP JP2005052416A patent/JP2006234705A/ja active Pending
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