JP2006214937A - バイオセンサーを用いた分析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 バイオセンサーを用いて、センサーの測定範囲に流路を接することなく、多数のリガンドとアナライトの組合せを同時に評価できる分析方法を提供すること。
【解決手段】 金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーの表面において、層流により複数のリガンドを固定した後、該層流に実質的に直交する層流でアナライトを流すことを特徴とする、バイオセンサーを用いたリガンドとアナライトとの相互作用の分析方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、バイオセンサーを用いた分析方法、より詳細には、金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーを用いたリガンドとアナライトとの相互作用の分析方法に関する。

現在、臨床検査等で、免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来の方法では、操作が煩雑であり、また、標識物質が必要となる。そこで近年、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が報告または使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金などの微粒子の機能化表面を使用した測定技術などである。ＳＰＲ測定技術は、センサーチップの金属膜表面に接する媒質の誘電率変化、即ち、屈折率変化を、共鳴角度の変化として測定することが可能であり、金属膜表面近傍に固定化した生理活性物質と検体物質間の相互作用を、定量的に測定することが可能な方法である。ＱＣＭ測定技術は、水晶発振子の金電極上における物質の吸脱着を、発振子の振動数変化として測定することが可能であり、金電極表面に生理活性物質を固定化すれば、検体物質との相互作用を定量的に測定することができる。また、金などの微粒子表面に生理活性物質を固定させれば、検体物質との相互作用を、微粒子の沈降や色の変化として測定することができる。

上記したＳＰＲ測定技術により金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーを用いてリガンドとアナライトとの相互作用の分析する場合、送液をいかにして行うかが一つの問題になる。例えば、特許文献１には、流路の形状と液の送液方法により複数の送液パターンを形成することができるという報告があるが、層流を用いてひとつのバイオセンサー上にパターニングする技術は知られていなかった。また、従来、流路を作る方法として、PDMS（ポリジメチルシロキサン）がよく用いられるが、PDMSがセンサー表面に接触すると、その後その部分に非特異吸着が生じて良好なデータが得られないと言う欠点があった。

米国特許出願公開US2003/0022388A1

本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、バイオセンサーを用いて、センサーの測定範囲に流路を接することなく、多数のリガンドとアナライトの組合せを同時に評価できる分析方法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーの表面において、層流により複数のリガンドを固定した後、該層流に実質的に直交する層流でアナライトを流すことによって、バイオセンサーにおいて多数のリガンドとアナライトの組合せの相互作用を同時に評価できることを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーの表面において、層流により複数のリガンドを固定した後、該層流に実質的に直交する層流でアナライトを流すことを特徴とする、バイオセンサーを用いたリガンドとアナライトとの相互作用の分析方法が提供される。

好ましくは、リガンド及びアナライトの層流のレイノルズ数（Ｒｅ）はそれぞれ０より大きく５０００以下である。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は疎水性高分子化合物でコーティングされている。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなる。
好ましくは、金属膜の厚さは０．５ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。

好ましくは、疎水性高分子化合物のコーティング厚さは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。
好ましくは、非電気化学的検出によりリガンドとアナライトとの相互作用の分析し、さらに好ましくは、表面プラズモン共鳴分析によりリガンドとアナライトとの相互作用の分析する。

好ましくは、誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている上記の測定チップに形成されているバイオセンサーを用いる。

好ましくは、固定される各々のリガンドの液流は、ポリエチレングリコール誘導体の溶液で分離されている。

本発明により、バイオセンサーにおいて多数のリガンドとアナライトの組合せについてそれらの相互作用を同時に評価できる分析方法を提供することが可能になった。本発明の分析方法においては、測定部に流路が接しないため流路表面に劣化が無く、繰り返し使用することが可能である。また、パターン化を同時に行うことができるので、センサー表面の準備が容易である。

以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明によるバイオセンサーを用いたリガンドとアナライトとの相互作用の分析方法においては、金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーの表面において、層流により複数のリガンドを固定した後、該層流に実質的に直交する層流でアナライトを流すことを特徴とする。

本発明で言う層流とは、隔壁を有さない状態で、流線が交わらない、同じ流速の部分が層をなして流れる流れであり、複数の液を混合することなく流す方法と定義する。即ち、マクロスケールで見ると撹乱などあらゆる乱れの因子が能動的に抑止され、ミクロスケールで見ると撹乱が能動的に促進される流れであり、好ましくはレイノルズ数Ｒｅ＝ｕｄ／μが０より大きく５０００以下の流れ、より好ましくは０より大きく３０００以下の流れ、さらに好ましくは０より大きく２０００以下の流れ、特に好ましくは０より大きく７００以下の流れを指す。ここでｕは平均流速、ｄは管の直径、μは流体の動粘性率を指す。また、中空管の断面形状が円でない場合、該中空管内径は等面積の円の直径を指すものとする。

本発明では、固定される各々のリガンドの液流が、ポリエチレングリコール誘導体の溶液で分離されていることが好ましい。

本発明で言う「実質的に直交する層流」とは、リガンドの層流に対してアナライトの層流が実質的に直交していることを意味する。リガンドの層流の進行方向とアナライトの層流の進行方向がなす角度は、一般的には３０〜１５０度であり、好ましくは４５〜１３５度であり、さらに好ましくは６０〜１２０度であり、特に好ましくは８０〜１００度であり、最も好ましくは９０度である。即ち、本発明で言う「実質的に直交する」とは、９０度の角度で完全に直交する場合のみならず、斜めの角度で直交している場合も含むものとする。

本発明の分析方法の概要を図１に示す。図１の上部の図には、上から順番にリガンド１を含む液、ＰＥＧ溶液、リガンド２を含む液、ＰＥＧ溶液及びリガンド３を含む液を層流として左側から右側へと流すことが示されている。これにより、リガンド１、２及び３がバイオセンサーの表面に列をなして固定化される。次に、図２の下部の図には、図１の上部に示したリガンドを固定化したバイオセンサーに対して、アナライト１を含む液、ブランク液、アナライト２を含む液、ブランク液及びアナライト３を含む液を層流として上側から下側へと流すことが示されている。図１の実施態様では、リガンドの層流とアナライトの層流とは９０度の角度で直交している。この操作により、リガンド１、２及び３とアナライト１、２及び３との相互作用を１回の操作で同時に評価することが可能となる。

本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。

本発明で用いるバイオセンサーは、疎水性高分子化合物でコーティングされていることが好ましい。本発明で用いる疎水性高分子化合物は、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。

疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。

本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。

疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。

浸漬法は、基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させた後に、前記疎水性高分子化合物溶液を含まない液に接触させる方法でコーティングを行う。好ましくは、疎水性高分子化合物溶液の溶剤と疎水性高分子化合物を含まない液の溶剤とは、同一の溶剤である。

浸漬法では、疎水性高分子化合物のコーティング用溶剤を適切に選択することで、基板の凹凸、曲率、形状などに依らず基板表面に均一なコーティング厚みの疎水性高分子化合物層が得られる。

浸漬法のコーティング用溶剤は特に限定されず、疎水性高分子化合物の一部を溶解すれものであれば任意の溶剤を用いることができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等のホルムアミド系溶剤、アセトニトリル等のニトリル系溶剤、フェノキシエタノール等のアルコール系溶剤、２−ブタノン等のケトン系溶剤、トルエン等のベンゼン系溶剤などを使用することができるが、これらに限定されない。

基板に接触させる疎水性高分子化合物の溶液は、疎水性高分子化合物が完全に溶解しても、疎水性高分子化合物の不溶解成分を含む懸濁液でもよい。液温は、疎水性高分子化合物の一部が溶解する液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を疎水性高分子化合物の溶液に接触させている間に液温を変動させても良い。溶液の疎水性高分子化合物濃度に特に制限はないが、好ましくは０．０１質量％以上３０質量％以下、さらに好ましくは０．１質量％以上１０質量％以下である。

固体基板を疎水性高分子化合物溶液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。

疎水性高分子化合物を含まない液としては、溶剤自身のＳＰ値（単位：(Ｊ／ｃｍ³)^1/2）と疎水性高分子化合物のＳＰ値との差が、１以上２０以下であることが好ましく、３以上１５以下であることがさらに好ましい。ＳＰ値は、分子間の凝集エネルギー密度の平方根で表され、溶解度パラメーターとも呼ばれる。本発明では、ＳＰ値δは下記式で算出した。各官能基の凝集エネルギーＥｃｏｈとモル容積Ｖは、Ｆｅｄｏｒｓが規定した値を使用した（Ｒ．Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ、Ｐｏｌｙｍ．Ｅｎｇ．Ｓｃｉ．、１４（２）、Ｐ１４７、Ｐ４７２（１９７４））。
δ＝（ΣＥｃｏｈ／ΣＶ）^1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のＳＰ値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー（１：１）：２１.０に対する溶剤２−フェノキシエタノール：２５.３、ポリメチルメタクリレート：２０.３に対する溶剤アセトニトリル：２２.９、ポリスチレン：２１.６に対する溶剤トルエン：１８.７である。

基板を、疎水性高分子化合物を含まない液に接触させる時間は特に制限されないが、好ましくは１秒以上２４時間以下、さらに好ましくは３秒以上１時間以下である。液温は、溶剤が液体状態であれば特に制限はないが、−２０℃以上１００℃以下が好ましい。基板を溶剤に接触させている間に液温を変動させてもよい。揮発させにくい溶剤を使用する場合、溶剤を除去する目的で、該溶媒に接触させた後、互いに溶解する揮発性溶剤で置換してもよい。

疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。

本発明で用いるバイオセンサーは、金属表面又は金属膜を疎水性高分子化合物でコーティングしたものであることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。

金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、０．５ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのがより好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上、１０ｎｍ以下であるのが好ましい。

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。

本発明で用いるバイオセンサーにおいては、基板の最表面に生理活性物質を固定化することができる官能基を有することが好ましい。ここで言う「基板の最表面」とは、「基板から最も遠い側」という意味であり、さらに具体的には、「基板上にコーティングした疎水性高分子化合物中の基板から最も遠い側」という意味である。

好ましい官能基としては−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹及びＲ²は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＣＨＯ、−ＮＲ³ＮＲ¹Ｒ²（式中、Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。

最表面にそれらの官能基を導入する方法としては、それらの官能基の前駆体を含有する疎水性高分子を金属表面あるいは金属膜上にコーティングした後、化学処理により最表面に位置する前駆体からそれらの官能基を生成させる方法が挙げられる。例えば−ＣＯＯＣＨ₃基を含有する疎水性高分子化合物であるポリメチルメタクリレートを金属膜上にコーティングした後、その表面をＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）に４０℃１６時間接触させると、最表面に−ＣＯＯＨ基が生成する。

上記のようにして得られたバイオセンサー用表面において、上記の官能基を介して生理活性物質（リガンド）を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。

バイオセンサー用表面上に固定される生理活性物質（リガンド）としては、測定対象物（アナライト）と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。

免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。

酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。

微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。

非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。

生理活性物質が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生理活性物質のアミノ基、チオール基等を利用し、金属表面の官能基に共有結合させることで行うことができる。

上記のようにして生理活性物質（リガンド）を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質（アナライト）の検出及び／又は測定のために使用することができる。

即ち、本発明によれば、生理活性物質（即ち、リガンド）が固定化されたバイオセンサーを用いて、これに被験物質（即ち、アナライト）を接触させることにより、該バイオセンサーに固定化されている生理活性物質と相互作用する物質を検出及び／又は測定する方法が提供される。
被験物質（アナライト）としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。

本発明では、バイオセンサー用表面に固定化されている生理活性物質（リガンド）と被験物質（アナライト）との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。

本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。

表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。

表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。

表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。

なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。

上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。

この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。

そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。

また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。

上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。

なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。

また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。

試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。

なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。

さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。

バイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例
検出装置として、SPRイメージャー（GWC社製）を用いて実験を行った。
＜測定表面の作成＞
厚さ1mm、18mm×18mmのSF10製透明ガラス基板上にクロム1nmを蒸着した後、金を50nm蒸着した。その基盤をModel-208ＵＶ−オゾンクリーニングシステム（TECHNOVISION INC.）で5分間処理した後、10mMの7-カルボキシ-1-ヘプタンチオールのエタノール溶液に16時間浸漬し、7-カルボキシ-1-ヘプタンチオールの自己組織化表面を作成した。更に、４００ｍＭの１−エチル−２，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドのエタノール溶液と１００ｍＭのペンタフルオロフェノールのエタノール溶液の1：1混合液中に25℃で30分静置した。表面を純水で洗浄後、直ちに下記操作を行った（図２）。

上記形状の流路を基盤表面に固定し、シリンジポンプにより、下記 (1)〜(5)の液を毎分20μlで液を送液した。この際、下記 (1)〜(5)の液は層流として流される。また、レイノルズ数Ｒｅ＝ｕｄ／μは６８０である。

反対側は、開放として各液を回収した。流した液は、下記に示す。
(1) プロテインＡ（シグマ社製）100ｍｇをｐＨ４．５の酢酸バッファー100ｍｌに溶解。
(2) メトキシPEG-NH2（Shearwater社製：分子量3400）10ｇをｐＨ８．５のホウ酸バッファー100ｍｌに溶解。
(3) トリプシン（ワシントン社製）100ｍｇをｐＨ４．５の酢酸バッファー100ｍｌに溶解。
(4) (2)と同様
(5) ビオチンヒドラジド（ピアス社製）100ｍｇをｐＨ８．５のホウ酸バッファー100ｍｌに溶解。

＜測定＞
上記で使用した流路を下図のように配置して、まず、流路にHBS-EPを満たした。なお、HBS-EPバッファーの組成は、ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid）0.01mol/l（ｐＨ7.4）、ＮａＣｌ0.15mol/l、ＥＤＴＡ 0.003mol/l、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０ 0.005質量％である。その段階を０点として記録し、シリンジポンプにより、下記(6)〜(10)の液を毎分20μlで液を5分送液した。この際、下記 (6)〜(10)の液は層流として流される。また、レイノルズ数（Ｒｅ＝ｕｄ／μ）は５００である。その後、明確に結合が見えた部分と結合が見えなかった部分を表１に示した（図３）。

反対側は、開放として各液を回収した。流した液は、下記に示す。
(6) 抗トリプシン抗体（ノルディック社製）1ｍｇを１００ｍｌのＨＢＳ−ＥＰに溶解。
(7) ポリエチレングリコール（和光製：平均分子量６００）１０ｇを１００ｍｌのＨＢＳ−ＥＰに溶解。
(8) マウスIgG（シグマ社製）1ｍｇを１００ｍｌのＨＢＳ−ＥＰに溶解。
(9) (7)と同様
(10) アビジン（ナカライテスク社製）1ｍｇを１００ｍｌのＨＢＳ−ＥＰに溶解。

表１の結果に示す通り、本発明の分析により、複数のリガンドとアナライトとの相互作用を１回の操作で同時に評価することができた。

図１は、本発明の分析方法の概要を示す。 図２は、実施例におけるリガンドの層流を示す。 図３は、実施例におけるアナライトの層流を示す。

Claims (10)

1. 金属表面あるいは金属膜を有するバイオセンサーの表面において、層流により複数のリガンドを固定した後、該層流に実質的に直交する層流でアナライトを流すことを特徴とする、バイオセンサーを用いたリガンドとアナライトとの相互作用の分析方法。
2. リガンド及びアナライトの層流のレイノルズ数（Ｒｅ）がそれぞれ０より大きく５０００以下である、請求項１に記載の分析方法。
3. 金属表面あるいは金属膜が疎水性高分子化合物でコーティングされている、請求項１又は２に記載の分析方法。
4. 金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなる、請求項１から３の何れかに記載の分析方法。
5. 金属膜の厚さが０．５ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項４に記載の分析方法。
6. 疎水性高分子化合物のコーティング厚さが０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下である、請求項３から５の何れかに記載の分析方法。
7. 非電気化学的検出によりリガンドとアナライトとの相互作用の分析する、請求項１から６の何れかに記載の分析方法。
8. 表面プラズモン共鳴分析によりリガンドとアナライトとの相互作用の分析する、請求項１から７の何れかに記載の分析方法。
9. 誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを前記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように、かつ、種々の入射角成分を含むようにして入射させる光学系と、前記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態を検出する光検出手段とを備えてなる表面プラズモン共鳴測定装置に用いられるための測定チップであって、上記誘電体ブロックと上記金属膜とから構成され、上記誘電体ブロックが、前記光ビームの入射面、出射面および前記金属膜が形成される一面の全てを含む１つのブロックとして形成され、この誘電体ブロックに前記金属膜が一体化されている上記の測定チップに形成されているバイオセンサーを用いる、請求項１から８の何れかに記載の分析方法。
10. 固定される各々のリガンドの液流が、ポリエチレングリコール誘導体の溶液で分離されている、請求項１から９の何れかに記載の分析方法。
    
    
    

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