JP2005525554A - バイオセンサ用途のための受容体（例えば、ポリヌクレオチド、抗体など）を有する高分子電解質複合体（例えば、両性イオンポリチオフェン） - Google Patents

Abstract

本発明は、共役高分子電解質と、標的生体分子検体に特異的な１つ以上の受容体分子との間で形成される複合体に関し、前記高分子電解質と前記受容体とは、非共有結合的に結合されており、生体分子相互作用に対するプローブとして使用可能である。本発明は、生体分子の選択された特性を決定する方法にも関する。これにより、上記のような複合体を標的生体分子検体に露呈することにより、検体と受容体が相互作用し、受容体と検体間の相互作用に応答した前記高分子電解質の特性の変化が検出される。検出された変化を用いて前記生体分子の前記選択された特性を決定する。

Description

本発明は、両性イオン共役高分子電解質に基づいた材料における鎖内および鎖間プロセスの変化を検出することによる生体分子相互作用の検出方法に関する。

生体分子相互作用を選択的に検出することのできる材料を開発することは、それらのモレキュラー・エレクトロニクスとバイオセンサに対する大きな潜在能力から益々注目されてきている。この点に関して、ポリ（チオフェン）やポリ（ピロール）などの共役ポリマー（ＣＰ）は、非特異的相互作用のみならず、検体／受容体相互作用を、観察可能な応答（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）に結び付けるために用いることができる。ＣＰに基づくセンサは、集合的な組織応答による増幅によって、非常に小さい摂動にも感受性を有するために、小分子に基づくセンサと比べて重要となる利点を有する。ＣＰを生体分子のための検出エレメントとして使用可能にするためには、ポリマーは水性環境にも適応できなければならない。これは、光誘起変化または励起移動に向けた状態へのそれらの衝撃を介して生体分子を検出するために最近使用されているような共役（および場合によっては発光）高分子電解質を調製することによって達成される。共役高分子電解質は、非常に高い感度での測定を可能にするが、これらの材料における光学または電子工学的プロセスを、生物特異的相互作用の追跡のために用いることができれば、将来、ゲノミクスおよびプロテオミクス用として普及すると考えられる。

共役ポリマーの物理的および化学的特性は、３位に適当な側鎖を導入することにより、修飾することができる。ビオチンと様々な炭水化物を提示するポリチオフェン誘導体を合成したところ、ストレプトアビジンと種々の細菌およびウィルスとの結合に応答して、比色変化が起こることが示されている。現在実証されている系では、共役ポリマーの側鎖への受容体の共有結合が用いられている。したがって、受容体の共有結合を必要としない方法が望ましく、そのような系が開発されている。例えば、Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ、Ｍ．，Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｍ，Ｈｏ，Ｈ−Ａ、特許出願ＷＯ０２０８１７３５（２００２年）を参照されたい。しかしながら、静電力が主力を占める相互作用に基づいた、ポリアニオン性またはポリカチオン性共役高分子電解質を用いる上記方法は、検体の標識が必要となる場合もある。検体の標識または受容体の共有結合を一切含まない方法は興味深い。

特許出願ＷＯ０２０８１７３５（２００２年） Ｂｏｉｓｓｉｎｏｔ、Ｍ．，Ｌｅｃｌｅｒｃ，Ｍ，Ｈｏ，Ｈ−Ａ

このように分子の相互作用を検出するためのより簡単でより感度の高い方法が未だ必要とされている。したがって、検体の標識や受容体の共有結合なしで、分子との多様な相互作用を生み出し、分子相互作用を検出することが可能な共役高分子電解質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ）に基づく方法が望まれている。

したがって、本発明の目的は、上記および他の需要に合う手段および方法を提供することにある。

上記の目的は、第１の態様において、共役高分子電解質と、標的生体分子検体に特異的な１つ以上の受容体分子との間の複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）によって達成され、前記高分子電解質と前記受容体とは、互いに非共有結合的に結合しており、生体分子相互作用のためのプローブとして使用することができる。

本発明の目的のために、「プローブ」という用語は、複合体内の受容体と、目的の受容体と相互作用するもう一方の種（例えば、分子、細胞、ウィルス、細菌、胞子、微生物、ペプチド、炭水化物、拡散、脂質、薬剤、抗原、抗体、タンパク質、酵素、毒素、任意の有機高分子またはこれらの分子の組み合わせ）との間で起こる生体分子相互作用に対し、外部手段によって検出可能な複合体の少なくとも１つの特性の変化によって応答可能である請求項１に記載したような任意形態の複合体のことを意味する。

適切には、高分子電解質は、チオフェン、ピロール、アニリン、フラン、フェニレン、ビニレンまたはそれらの置換型からなる共重合体または単独重合体を含む。好ましくは、共役高分子電解質は、１つ以上の両性イオン側鎖官能性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）を有する。

本発明のさらなる態様において、生体分子の 選択された特性を決定するためのバイオセンサ装置が提供され、該装置は、上記同定された種の複合体と、前記複合体のための基板とを含み、前記複合体は前記標的検体に露呈可能である。このバイオセンサ装置は請求項１４に記載されている。本発明のさらに別の態様において、生体分子の選択された特性を判定するための方法が提供され、該方法は、上記複合体を、標的生体分子検体に露呈させて、該検体と受容体とを相互作用させる工程と、受容体と検体との間の相互作用に対する応答による前記高分子電解質の特性の変化を検出する工程と、検出された変化を用いて、前記生体分子の前記選択された特性を決定する工程とを含む。この方法は請求項１７に記載されている。

多数の生体分子相互作用を同定したい場合はマイクロアレイの形態で実施することができ、これも本発明のさらなる態様に含意される。この実施には、請求項２２に記載のように、検出系を表面上にアンカー（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）およびパターニングする必要がある。

一般的に、本発明は、両性イオン共役高分子電解質と受容体との間の新奇な複合体に関し、該高分子電解質は、前記受容体に対する担体として機能して検体を標識したり、受容体を担体に共有結合させたりする必要がない。上記複合体は、生体分子相互作用に応答するためのプローブとして用いられる。本発明はまた、このような複合体を含むバイオセンサ装置、および分子相互作用の検出方法に関するものでもある。

本発明は、１つ以上の受容体分子と複合体を形成する両性イオン高分子電解質に基づいている。この複合体は、共有結合ではなく、両性イオン共役ポリマーと受容体分子との間の、水素結合、静電および非極性相互作用に基づいている。この結合を、本明細書では非共有結合と呼び、さらにその性質が共有性でない、いかなるタイプの結合をも含む。

本発明は、両性イオン共役高分子電解質の骨格のコンフォメーション変化、両性イオン共役高分子電解質鎖の解離または集合を誘引する、両性イオン共役高分子電解質／受容体分子複合体の変化、または受容体分子の正味荷電の変化を利用している。さらに、両性イオン共役高分子電解質の骨格のコンフォメーション変化、両性イオン共役高分子電解質鎖の解離または集合は、両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間のプロセスを変化させる。これらの変化を、溶液中または表面上で検出することができる。

とりわけ本発明は、限定はされないが、ＤＮＡ（塩基対形成）、タンパク質（抗原／抗体）、糖タンパク質、またはより短い、目的に合うように設計されたペプチドを介して、生物特異的認識の検出を行うことを可能にする。

新奇な複合体は、適切には、例えば高分子電解質をバイオセンサセル内の基板上に固定化することによって、バイオセンサ装置の活性部分として、具現化することができる。適切にはバイオセンサ装置は、前記基板のための適切な容器を含み、高分子電解質と受容体の間の複合体が基板上に形成される。

しかしながら、例えば、複合体を溶液中に提供し、複合体溶液流と検体溶液を混合しながら、フローセルを通過させるなどの、他の構成とすることも可能である。相互作用は、様々な分析技術によって監視することができる。

上で検討した特性を示すポリマーの例としては、ポリ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボキシル−３−オキサペンチル］−２，５−チオフェニレンハイドロクロライド）（ＰＯＷＴ、図１参照）が挙げられる。このポリマーは両性イオン側鎖を保持する最初のポリチオフェンであり、その研究では１つのポリマー鎖内、および隣接するポリマー鎖間において、静電相互作用および水素結合パターンが異なることによる、興味深い光学的および電子的プロセスが示されている（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．；Ｅｋｅｂｌａｄ，Ｐ．Ｏ．；Ｈｊｅｒｔｂｅｒｇ，Ｔ．；ＷｅｎｎｅｒｓｔｒｏｕＭ，Ｏ．；Ｉｎｇａｎａｓ，Ｏ． Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９１年、３２，５４６〜５４８頁；Ｂｅｒｇｇｒｅｎ，Ｍ．；Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｐ．；ＦａｇｅｒｓｔｒｏｕＭ，Ｊ．；Ｉｎｇａｎａｓ，Ｏ．；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．；Ｗｅｍａｎ，Ｈ．；Ｇｒａｎｓｔｒｏｕｍ，Ｍ．；Ｓｔａｆｓｔｒｏｕｍ，Ｓ．；Ｗｅｎｎｅｒｓｔｒｏｕｍ，Ｏ．；Ｈｊｅｒｔｂｅｒｇ，Ｔ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９９９年、３０４，８４〜９０頁．Ｎｉｌｓｓｏｎ、Ｋ．Ｐ．Ｒ．；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．；Ｉｎｇａｎａｓ，Ｏ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ：Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ Ｍａｔｔｅｒ ２００２年、１４、１００１１〜１００２０頁を参照されたい）。両性イオン側鎖による相互作用は、ポリマー骨格を強制的に、代替のコンフォメーション、ポリマー鎖の解離または集合に適応させる。特に、ポリマー鎖の解離と集合は、新奇な鎖内および鎖間プロセスを誘導する。鎖内プロセスは、ポリマー鎖内の光学的および電子的プロセスに関連づけられ、鎖間プロセスは、隣接するポリマー鎖間の光学的および電子的プロセスに関連づけられる。このようにして、新奇な鎖内および鎖間プロセスによって、ポリカチオン性またはポリアニオン性共役高分子電解質にはこれまで見られなかった、新奇な光学的吸収および発光特性が付与される。

様々なｐＨにおいてアニオン性またはカチオン性に荷電する両性イオン側鎖の官能基は、ポリチオフェン誘導体を、負または正に荷電したオリゴマーおよびポリマーと高分子電解質複合体を形成するのに適したものとする。さらに、両性イオン基は、様々な分子と多様な水素結合パターンを生み出す。

以下の本発明の詳細な説明では、両性イオン共役高分子電解質、受容体分子、検体、検出方法、共役高分子電解質と受容体の固定化、アレイおよびラインを個別に扱っている。本発明は最後に、その利用性を実証する数々の実験によって例示される。

Ｉ 両性イオン共役ポリマー
本発明は、単独重合体または共重合体を形成するモノマーである、チオフェン、ピロール、アニリン、フラン、フェニレン、ビニレンまたはそれらの置換型から誘導される重合体（ｍｅｒｓ）から成る最小５重合体の様々な共役高分子電解質に関する。さらに、アニオン性、カチオン性または両性イオンの側鎖官能性を有するモノマーも本発明の範囲に含まれる。側鎖の官能性は、限定はされないが、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖類、核酸、またはそれらの組み合わせまたは化学的に修飾された誘導体に由来する。本発明の共役高分子電解質は、１つの側鎖官能性を含むものであっても、２つ以上の異なる側鎖官能性を含むものであってもよい。様々なｐＨにおいてアニオン性またはカチオン性に荷電する両性イオン共役高分子電解質の官能基は、当該高分子電解質誘導体を、負または正に荷電したオリゴマーおよびポリマーと高分子電解質複合体を形成するのに適したものにする。さらに、両性イオン基は、様々な分子と多様な水素結合パターンを生み出す。

ＩＩ 受容体分子
本発明の両性イオン高分子電解質は、１つ以上の受容体と複合体を形成する（図２）。この複合体は、共有結合なしに、両性イオン共役ポリマーと受容体分子との間の水素結合、静電的および非極性相互作用に基づいて形成される。受容体分子は、検体に対する認識部位として、あるいはリン酸化などの酵素反応を行うためのアンカーとして機能する。広範な受容体分子を用いることができ、分子の選択は共役ポリマーへの親和性と、所望の検体の認識特性のみによって制限される。適切な受容体分子としては、限定はされないが、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、薬剤、抗原、抗体、タンパク質、任意の有機ポリマーまたは目的の検体と相互作用可能なこれらの分子の組み合わせが挙げられる。

受容体分子は、目的の共役ポリマーと相互作用するように、化学的に修飾してもよい。広範にわたる化合物（例えば、炭水化物、タンパク質、核酸および他の化学基）の誘導化方法は周知である。たとえば、アミノ酸側鎖は、極性および非極性基、あるいは水素結合能を有する基を含むように容易に修飾することができる。

ＩＩＩ 検体
１つ以上の検体の結合または露呈によって、共役高分子電解質／受容体分子複合体は、受容体分子の正味荷電が変化するかまたは変更される。

共役高分子電解質／受容体分子複合体の荷電、または受容体分子の正味荷電の変化は、両性イオン共役高分子電解質の骨格のコンフォメーション変化、高分子電解質鎖の解離または集合を誘導し、これによって両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスが変更される。

適切な検体としては、限定はされないが、細胞、ウィルス、細菌、胞子、微生物、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、薬剤、抗原、抗体、タンパク質、酵素、毒素、任意の有機ポリマー、または目的の受容体と相互作用するこれらの分子の組み合わせが挙げられる。

検体は、目的の受容体と相互作用するように、化学的に修飾してもよい。多岐にわたる化合物（例えば、炭水化物、タンパク質、核酸および他の化学基）の誘導化方法は周知である。たとえば、アミノ酸側鎖は、極性および非極性基、あるいは水素結合能を有する基を含むように容易に修飾することができる。

ＩＶ 検出方法
すでに示したように、本発明は、両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスの変化を利用するものである。これらの変化は、蛍光、フォースタ（Ｆｏｕｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放射光（ｅｍｉｔｔｅｄ ｌｉｇｈｔ）の消失、吸収、インピーダンス、屈折率、質量変化、粘弾性、厚みの変化、または他の物理的特性によって観察することができる。両性イオン共役高分子電解質の骨格のコンフォメーション変遷、高分子電解質鎖の解離または集合によって、両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスが変化する。例えば、異なる２つ以上の波長における放射光の強度比の変化として検出することができる（図３）。放射光の強度は、蛍光光度計によって記録することができ、検出器内の光子の流れを強化することによって感度を高めることができる。このことは、励起源としてレーザを用いることによって達成できる。

蛍光変化は、蛍光顕微鏡または共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）顕微鏡を用いて検出してもよい。励起または放射フィルタの組み合わせを用いて、画像をＣＣＤカメラ（実施例７および９を参照）、ビデオカメラ、通常のカメラまたはポラロイドカメラによって記録してもよい。画像は、コンピュータの画像処理ソフト、画像相関分光法（ＩＣＳ）または他の手段によって解析することができる。

インピーダンスの変化は、インピーダンス分光法を用いて検出することができる。本発明によれば、両性イオン共役ポリマーを、例えばポリ［３，４−（エチレンジオキシ）チオフェン］／ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ）などの導電性ポリマーハイドロゲルマトリックス内部に固定化することができる。抵抗、キャパシタンスおよびインダクタンスの変化は、水性環境内での両性イオン共役高分子電解質、受容体または検体分子によって追跡することができる。

表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）によって、屈折率の小さな変化を検出することができる。屈折率の変化は、両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスが、受容体と検体分子との間の相互作用によって、あるいは受容体分子の正味荷電の変化によって変更されたときに起こる。これらの相互作用は、高分子電解質鎖の集合を提供し、屈折率の変化として検出される。

ＱＣＭ−Ｄ（Ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ ａｎｄ ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ）は、吸着質量および液体中の分子の吸着された層の粘弾性を測定するための感受性が高く、多目的に使用可能な技術である。受容体と検体分子との間の相互作用または受容体分子の正味荷電の変化による、両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスは、質量または粘弾性における変化をもたらし、したがってＱＣＭ−Ｄまたは他の技術によって検出可能である。

検体分子が、固体支持体に吸着された両性イオン共役高分子電解質と複合化された受容体分子と相互作用すると、厚みにおける変化が生じる。楕円偏光法、画像化またはゼロ偏光解析法（ｎｕｌｌ ｅｌｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）は、試料の誘電性を感知するために偏光を用いる光学的技術であり、数分の一オングストロームレベルでの厚みの変化を検出するために用いることができる。これらの技術は、両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスの変化を測定するために用いることができる。

受容体および検体分子の両性イオン共役高分子電解質との相互作用は、電気的および電気化学的方法によって検出することもできる。ゲルまたは網目状の両性イオン共役高分子電解質を形成することによって、各ポリマー鎖が網目内のすべての鎖と（間接的に）接触している三次元物体が得られる。両性イオン共役高分子電解質が半導体状態にある場合（例えば、発光特性が用いられている場合など）には、かなり導電性が低くなるため、ゲルを浸している水性媒質のイオン導電率と容易に区別することが難しい。したがって、網目内で電気伝導を許容する高感度マクロ分子の高導電性ゲルを形成することが望ましい。金属ポリマーおよび高い導電性を付与する共役鎖の添加は、導電性を変えるだけでなく、鎖の機械的特性および幾何学形状までも変えてしまうことになるため、発光検出の作業時における機構を妨害するという難点がある。この問題に対する解決策としては、一方の成分Ａが高導電性を与え、他方の成分Ｂが生物特異的相互作用を行うような２成分ポリマーゲルを使用することがある。これらの成分を適切に組み合わせると、前記相互作用によるゲルの幾何学形状の変化によって、成分Ｂと生体分子の相互作用を検出可能にできる。成分Ａは、高度にドープされたポリマーの水性分散液であってよく、両性イオン共役高分子電解質である成分Ｂを組み合わせて、ゲルを作製するようにしてもよい。これらのゲルのＤＣまたはＡＣ導電性を２点および４点プローブ法を用いて、インピーダンス分光法によって測定することによって、検体への結合または露呈によるコンダクタンス、または受容体の正味荷電変化を追跡することができる。

両性イオン共役高分子電解質の鎖内および鎖間プロセスは、受容体と検体分子との相互作用、または受容体分子の正味荷電の変化によって変更され、得られる複合体の電気化学的性質に変化をもたらし、そのような変化を生体分子用の電気化学的検出器を構築するために用いることができる。生体分子の存在下で形成されるハイドロゲルの還元電位の変化を用いて、相補的生体分子が存在することを検出する。受容体が共有結合された共役ポリマーを用いる同様の装置が、Ｋｏｒｒｉ−Ｙｏｕｓｓｏｕｆｉ，Ｈ．らによって、「バイオエレクトロニクスに向けて：オリゴヌクレオチド官能化ポリピロールに基づく特異的ＤＮＡ認識」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７年，１１９、７３８８〜７３８９頁に検討されている。

上記の方法は、生物試料の組成の「画像」を与える、マイクロアレイの形態で具現することもできる。

Ｖ 共役ポリマーおよび受容体の固定化
本発明の両性イオン共役高分子電解質、両性イオン共役高分子電解質／受容体分子複合体、または受容体分子は、限定はされないが、シリコンウエハ、ガラス（例えばスライドグラス、ガラスビーズ、ガラスウエハなど）、シリコーンゴム（ｓｉｌｉｃｏｎ ｒｕｂｂｅｒ）、ポリスチレン、ポリエチレン、テフロン、シリカゲルビーズ、金、インジウム錫酸化物（ＩＴＯでコートした材料、例えばガラスまたはプラスチック）、フィルタ紙（例えば、ナイロン、セルロース、およびニトロセルロース）、標準的なコピー用紙または別形（ｖａｒｉａｎｔｓ）、および分離媒体または他のクロマトグラフ媒体を含む様々な固体支持体上に固定化することができる。固体支持体への両性イオン共役高分子電解質の転移は、限定はされないが、ディップコーティング、スピンコーティング、密着焼き付け、スクリーン印刷、インクジェット技術、噴霧、ディスペンシング（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）、およびソフトリソグラフィまたはＢｉａｃｏｒｅ（商品名）装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、スウェーデン国アプサラ）を用いたミクロ流体印刷を用いて達成することができる。両性イオン共役高分子電解質の固定化は、高温下における固体支持体への物理的接着によって、あるいはヒドロゲルマトリックス中への取り込みによっても達成される。

本発明の両性イオン共役高分子電解質の固定化は、ミクロタイタープレートを用いた高効率スクリーニング（ＨＴＳ）および他の所望の特性に適合するように、その使いやすさ、装置への組立（例えば、アレイまたは平行ライン）、安定性、堅牢性、蛍光応答性を向上させることが望ましい。

本発明の受容体分子は、両性イオン共役高分子電解質と一緒に固定化する（すなわち、高分子電解質溶液と混合する）こともできる。受容体分子を固定化するための他の方法としては、受容体分子を両性イオン共役高分子電解質の下部または上部に配置することが挙げられる。両性イオン共役高分子電解質と混合された受容体分子の、固体支持体への転移は、限定はされないが、ディップコーティング、スピンコーティング、密着焼き付け、スクリーン印刷、インクジェット技術、噴霧、ディスペンシングおよびソフトリソグラフィ（実施例１０）またはＢｉａｃｏｒｅ（商品名）装置（実施例８）を用いたミクロ流体印刷（実施例９）を使用して達成することができる。受容体分子を両性イオン共役高分子電解質の下部に配置する場合には、受容体分子は、上述のように高分子電解質と混合する場合と同様に、固体支持体に転移させる必要がある。受容体分子を両性イオン共役高分子電解質の上部に配置する場合には、高分子電解質を固体支持体に固定化した後に行うこと以外は同様の方法で実施される。受容体分子は、検体のための認識部位として、あるいは、リン酸化などの酵素反応を行うためのアンカーとして機能する。

固体支持体に固定化する間の、本発明の両性イオン共役高分子電解質および受容体に対する溶媒としては、限定はされないが、水、緩衝水溶液、メタノール、エタノールおよびその組み合わせが挙げられる。この段階において他の種類の支持ポリマーも添加することができる。

受容体分子が下部にある固体支持体に固定化されている場合には、本発明の両性イオン共役高分子電解質の上部において、あるいはこれとともに、非共有結合的相互作用を介して高分子電解質との複合体を形成している（図２）。複合体は、共有化学作用ではなく、両性イオン共役高分子電解質と受容体分子との間の水素結合、静電的および非極性相互作用に基づいて形成されている。本発明の両性イオン共役高分子電解質への受容体の固定化は、ミクロタイタープレートを用いた高効率スクリーニング（ＨＴＳ）および他の所望の特性に適合するように、その使いやすさ、装置への組立（例えば、アレイまたは平行ライン）、安定性、堅牢性、蛍光応答性を向上させることが望ましい。受容体分子は、本発明の実施に先だって、検体の検出のためにカチオン性またはアニオン性共役ポリマー上に固定化されているが［１５］、共有結合化学作用を介してではなく、両性イオン共役高分子電解質と受容体分子の間の水素結合、静電的および非極性相互作用に基づいた固定化はまだ実現されていない。

両性イオン共役高分子電解質および受容体分子は、固体支持体の上部のポリマーマトリックス内部に取り込んでもよいし、溶液中で自由に浮遊していてもよい。両性イオン共役ポリマーのゲルまたは網目を形成し、本発明の各両性イオン共役高分子電解質鎖を、（間接的に）網目内のすべての鎖と接触させるようにしてもよい。これらのポリマーマトリックスは、両性イオン共役高分子電解質を、他のポリマー、例えば限定はされないが、ポリ［３，４−（エチレンジオキシ）チオフェン］／ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ）、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ−４−ビニルピリジン（ＰＶＰｙ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アニリン）（ＰＡＮＩ）、またはそれらの組み合わせと混合することによって実現することができる。これらのポリマー混合物を水で膨潤させることにより、ハイドロゲルが得られる。これは、生物起源の受容体および検体分子を用いる場合に興味深い。本発明の両性イオン共役高分子電解質は、固体支持体に固定化する、もしくは後で転移させる前に、上記ポリマーと混合することができる。目的の受容体分子は、両性イオン共役高分子電解質と一緒に、あるいはこれに続いて転移させることができる。所望の場合、必要な場合、あるいは他の理由によって、マイクロアレイまたは平行ライン形式を用いることができる。本発明のある実施形態において、この網目またはハイドロゲルの手法を用いて、受容体と検体分子の間の相互作用による、あるいは受容体分子の正味荷電の変化による両性イオン共役高分子電解質鎖のコンフォメーション変化および集合を検出することができる。これらの変化は、吸収、蛍光、電気的特性、インピーダンスを検出することによって、あるいは他の手段によって検出することができる。

ＶＩ アレイまたはライン
本発明によれば、各スポットまたはライン内に同一または異なる受容体分子を有する両性イオン共役高分子電解質の大きなアレイまたは平行ラインによって、単独のセンサまたは溶液に基づいた手法の短所を克服することができる。アレイまたは平行ラインの手法は、１つまたは異なる受容体に対して１つまたは異なる検体の並行分析を容易に行うことの打開策となる。アレイまたはラインを用いる主たる目的は、数ある質および特性のなかでも、使いやすさ、携帯性、定量化、選択性を高めることにある。この手法を用いて、我々は多成分試料を測定できるかどうか、また部分的に選択的なセンサスポットを用いることができるかどうかを探求することができる。また、２つ以上の目的試料を同時に分析して、チップ上での濃度決定を行い、バックグラウンドを研究する機会が提供される。両性イオン共役高分子電解質および／または受容体分子を、任意の大きさの個体支持体上に任意の選択パターン（アレイ、ライン、スポット、ポストなど）で固定化することによって、小型で、携帯可能で、読みとりや解釈の簡単な装置を構築することができる。

多数のアレイを使用する場合には、多数の生体分子に対して、多かれ少なかれ同時に検出を実施する必要がある。このような検出は、多くの別個の検出器エレメント（またはプローブ）が小さな表面領域上に一体化されて、検出を大量に並行して実施できるようにしたマイクロアレイの形態で行われることが多い。それぞれの別個の検出器を、単に両性イオン共役高分子電解質と生体分子とを混合するだけで構築できるようにしたので、検出器アレイ（マイクロアレイ）内の何千もの検出器それぞれを作製するための共有結合化学の必要性を無くすことができる。我々は、両性イオン共役高分子電解質および両性イオン共役高分子電解質／生体分子複合体を、エラストマースタンプを用いてミクロ密着印刷によって印刷することができる（図９）。マイクロアレイ表面上への転移は、両性イオン共役高分子電解質溶液をスポッティングすることにより、あるいは高分子電解質溶液をインク噴霧（ｉｎｋ ｊｅｔｔｉｎｇ）することにより、あるいは上述の他の方法によって行うこともできる。これらの工程は、多画素マイクロアレイを作製するために必要不可欠である。

（実験）
（実施例１） 溶液中のＤＮＡハイブリダイゼーションの光学的検出
脱イオン水中に０．５ｍｇ／ｍＬのＰＯＷＴを含むストック溶液を調製し、３０分間インキュベートした。５０μＬのポリマー溶液を６４μＬのＤＮＡ溶液（１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡ−３’、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）と混合した。１５分間インキュベートした後、試料を脱イオン水、ストックバッファ溶液（リン酸ナトリウムｐＨ７．５）、および、１．０等量の各ヌクレオチド（５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＧ−３、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）で希釈して、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む１５００μＬの最終体積とした。試料を５分間インキュベートし、吸収スペクトルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ９ ＵＶ／ＶＩＳ／ＮＩＲ分光計によって記録した。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、最大吸収の短波長側への移動、および長波長側での肩部の減少によって検出される（図３）。最大吸収の移動は、ＰＯＷＴ骨格のコンフォメーション変化によるものであり、長波長側における肩部の減少は、ＰＯＷＴ鎖の分離によるものである。

（実施例２） 溶液中のＤＮＡハイブリダイゼーションの蛍光検出
脱イオン水中に０．５ｍｇ／ｍＬのＰＯＷＴを含むストック溶液を調製し、３０分間インキュベートした。１０μＬのポリマー溶液を１２．８μＬのＤＮＡ溶液（１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡ−３’、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）と混合した。１５分間インキュベートした後、試料を脱イオン水、ストックバッファ溶液（リン酸ナトリウムｐＨ７．５）、および、１．０等量の各ヌクレオチド（５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＧ−３、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）で希釈して、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む１５００μＬの最終体積とした。試料を５分間インキュベートし、発光スペクトルをＩＳＡ Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ ｓｐｅｘ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２装置によって記録した。ＤＮＡハイブリダイゼーションは、発光の増大、および最大発光の短波長側への移動によって検出される（図４）。二本鎖ＤＮＡが形成されると、５４０ｎｍにおける発光（鎖内プロセス）が増大し、６７０ｎｍにおける発光（鎖間プロセス）が減少する。

（実施例３） 溶液中の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の蛍光検出
脱イオン水中に０．５ｍｇ／ｍＬのＰＯＷＴを含むストック溶液を調製し、３０分間インキュベートした。１０μＬのポリマー溶液を１２．８μＬのＤＮＡ溶液（１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡ−３’、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）と混合した。１５分間インキュベートした後、試料を脱イオン水、ストックバッファ溶液（リン酸ナトリウムｐＨ７．５）、および、１．０等量の各ヌクレオチド（５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＴＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＧ−３’、５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＧ−３’、５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＧＴＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＧ−３’、５’−ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＡＣ ＣＴＴ ＣＡＡ ＴＣＡ ＴＧ−３’または５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡ−３’、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）で希釈して、１０ｍＭリン酸ナトリウムを含む１５００μＬの最終体積とした。試料を５分間インキュベートし、発光スペクトルをＩＳＡ Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ ｓｐｅｘ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２装置によって記録した。波長５４０ｎｍ／５８５ｎｍおよび５４０ｎｍ／６７０ｎｍにおける発光強度比の差を計算した。５４０ｎｍおよび５８５ｎｍにおける発光は、鎖内プロセスによるものであり、６７０ｎｍにおける発光は鎖間プロセス（ＰＯＷＴ鎖の集合）によるものである。波長５４０ｎｍ／５８５ｎｍおよび５４０ｎｍ／６７０ｎｍにおける発光強度比の差は、ＤＮＡ鎖間のミスマッチの程度によって影響されることから、１つ、２つまたは３つのミスマッチを有するヌクレオチドは容易に検出できる（表１）。表１は、１．２８ｎｍｏｌの様々なオリゴヌクレオチドを、２３．１ｎｍｏｌのＰＯＷＴと１．２８ｎｍｏｌの一本鎖オリゴヌクレオチドとの混合物に添加した際の、波長５４０ｎｍ／５８５ｎｍおよび５４０ｎｍ／６７０ｎｍにおける発光強度の比の差を示したものである。

ａ：５４０ｎｍおよび５８５ｎｍ、または５４０ｎｍおよび６７０ｎｍにおける発光の強度の比
ｂ：比の差は、式Ｒａｔｉｏ_{ｃｏｍｐｌｍｅｎｔａｒｙ}−Ｒａｔｉｏ_ｘ（式中、ｘは目的の二本鎖ＤＮＡ配列を示す）の式より算出される。
ｃ：１０の独立して実施した実験に対する平均値および標準偏差

（実施例４） 溶液中における合成ペプチドの自己集合の光学的検出
脱イオン水中に３．７ｍｇ／ｍＬのＰＯＷＴを含むストック溶液を調製し、３０分間インキュベートした。１０μＬのポリマー溶液を、それぞれ１０μＬまたは２０μＬの負に荷電したペプチド（ＮＨ２−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｉ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ｈ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ａ−Ｆ−Ｅ−Ａ−Ｆ−Ｅ−Ｒ−Ａ−Ｇ−ＣＯＯＨ）または正に荷電したペプチド（ＮＨ２−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｑ−Ｌ−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｋ−Ｒ−Ａ−Ｇ−ＣＯＯＨ）溶液（２．２ｍｇ／ｍＬ）と混合し、脱イオン水で最終体積が３００μＬとなるように希釈した。１５分間インキュベートした後、試料をストックバッファ溶液（リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）および１０μＬ脱イオン水または１０μＬの正／負ペプチド溶液（２．２ｍｇ／ｍＬ）で希釈して、２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む２０００μＬの最終体積とした。試料を室温で１０分間インキュベートし、吸収スペクトルをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ９ ＵＶ／ＶＩＳ／ＮＩＲ分光計で記録した。ＪＲ２Ｋの添加によって最大吸収が短波長側に移動すると、ＰＯＷＴ骨格が平面状ではなく、ＰＯＷＴ鎖が分離していることを示し、ＪＲ２Ｅの添加により最大吸収が長波長側に移動すると、ＰＯＷＴ骨格が平面状であり、ＰＯＷＴ鎖が集合していることを示す（表２）。ＪＲ２ＥおよびＪＲ２Ｋは、４ヘリックス束を形成するように個別に設計されたものであり、この構造の形成はＰＯＷＴに対する最大吸収の変化によって検出することができる（表２）。表２は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中で１０分間インキュベートした後の、ＰＯＷＴおよびＰＯＷＴ／ペプチド複合体に対する、最大吸収と、５４０ｎｍ／６１０ｎｍにおける発光の強度の比を示したものである。

（実施例５） 溶液中における合成ペプチドの自己集合の蛍光検出
脱イオン水中に３．７ｍｇ／ｍＬのＰＯＷＴを含むストック溶液を調製し、３０分間インキュベートした。１０μＬのポリマー溶液を、それぞれ１０μＬまたは２０μＬの負に荷電したペプチド（ＮＨ２−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｉ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ｈ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ａ−Ｆ−Ｅ−Ａ−Ｆ−Ｅ−Ｒ−Ａ−Ｇ−ＣＯＯＨ）または正に荷電したペプチド（ＮＨ２−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ａ−Ｉ−Ｋ−Ａ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｈ−Ｌ−Ｋ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｌ−Ｋ−Ｋ−Ｑ−Ｌ−Ｋ−Ｑ−Ａ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｋ−Ｒ−Ａ−Ｇ−ＣＯＯＨ）溶液（２．２ｍｇ／ｍＬ）と混合し、脱イオン水で最終体積が３００μＬとなるように希釈した。１５分間インキュベートした後、試料をストックバッファ溶液（リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）および１０μＬ脱イオン水または１０μＬの正／負ペプチド溶液（２．２ｍｇ／ｍＬ）で希釈して、２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む２０００μＬの最終体積とした。試料を室温で１０分間インキュベートし、発光スペクトル（図５、表２）をＩＳＡ Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ ｓｐｅｘ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２装置で記録した。ＪＲ２Ｋの添加によって最大発光が短波長側に移動し、発光強度が増大すると、ＰＯＷＴ骨格が平面状ではなく、ＰＯＷＴ鎖が分離していることを示し、ＪＲ２Ｅの添加により最大発光が長波長側に移動し、発光強度が減少すると、ＰＯＷＴ骨格が平面状であり、ＰＯＷＴ鎖が集合していることを示す（図５）。ＪＲ２ＥおよびＪＲ２Ｋは、４ヘリックス束を形成するように個別に設計されたものであり、この構造の形成はＰＯＷＴに対する最大発光およびＰＯＷＴからの発光の強度の変化によって検出することができる（図５）。５４０ｎｍおよび６１０ｎｍにおける発光は、鎖内プロセスによるものであり、６７０ｎｍにおける発光は鎖間プロセス（ＰＯＷＴ鎖の集合）によるものである。波長５４０ｎｍ／６１０ｎｍおよび５４０ｎｍ／６７０ｎｍにおける発光強度比の差は、ＰＯＷＴと異なるペプチド間で異なる複合体が形成されることに影響される（表２）。たとえば、ＰＯＷＴ／ＪＲ２Ｅ（受容体）の鎖内および鎖間プロセスは、ＪＲ２Ｋ（検体）を加えることで明らかに変化する。

（実施例６） 溶液中の炭酸脱水酵素の蛍光検出
脱イオン水中に０．５ｍｇ／ｍＬのＰＯＷＴを含むストック溶液を調製し、３０分間インキュベートした。１０μＬのポリマー溶液を、５μＬの負に荷電したペプチド（ＮＨ２−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ａ−Ｉ−Ｅ−Ａ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ｈ−Ｌ−Ｅ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ａ−Ａ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｋ−Ｑ−Ｌ−Ｅ−Ｑ−Ａ−Ｆ−Ｅ−Ａ−Ｆ−Ｅ−Ｒ−Ａ−Ｇ−ＣＯＯＨ、炭酸脱水酵素用の受容体で修飾した）溶液（２．２ｍｇ／ｍＬ）と混合し、脱イオン水で最終体積が１００μＬとなるように希釈した。１５分間インキュベートした後、試料をストックバッファ溶液（リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）および４０μＬ脱イオン水または４０μＬの炭酸脱水酵素溶液（６．４ｍｇ／ｍＬ）で希釈して、２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む１０００μＬの最終体積とした。試料を室温で５分間インキュベートし、発光スペクトル（図５、表２）をＩＳＡ Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ ｓｐｅｘ ＦｌｕｏｒｏＭａｘ−２装置で記録した。炭酸脱水酵素がペプチドに結合する場合には発光強度は増大する（図６）。このことは、炭酸脱水酵素（検体）がペプチド（受容体）に結合すると、ポリマー鎖の鎖内および鎖間プロセス、特にポリマー鎖の分離／集合が変化することを明瞭に示している。

（実施例７） 表面上のハイドロゲルスポット内におけるＤＮＡハイブリダイゼーションの蛍光検出
ＰＯＷＴの０．５μＬの液滴（０．５ｍｇ／ｍＬ）をポリスチレン表面上に落とし、１０分間乾燥させた。ポリマー液滴を、それぞれモノマーを基準として０．５等量の５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ ＡＧＡ−３’または５’−ＴＣＴ ＡＡＣ ＣＴＣ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’（ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）を含む０．５μＬのＤＮＡ溶液と交差させた。ポリマー／一本鎖ＤＮＡハイドロゲルを乾燥させた後、スポットをバッファ溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）中で、１０ｎｍｏｌの５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ ＡＧＡ−３’（ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入）とともに２時間インキュベートした。スポットからの蛍光は、ＣＣＤカメラ（Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲ）を備えたエピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡Ａ２００ Ｍｏｔ）によって、４０５／３０ｎｍ帯域フィルタ（ＬＰ４５０、露出時間：１５００ミリ秒）、４７０／４０ｎｍ帯域フィルタ（ＬＰ５１５、露出時間：１５００ミリ秒）および５４６／１２ｎｍ帯域フィルタ（ＬＰ５９０、露出時間：５００ミリ秒）を用いて記録した。ＤＮＡハイブリダイゼーションによるＰＯＷＴの鎖内および鎖間プロセスの変更は、ＰＯＷＴからの発光の色および強度の変化として観察される（図７）。

（実施例８） 表面プラスモン共鳴（ＳＲＰ）による表面上のＤＮＡハイブリダイゼーションの検出
裸の金センサチップを、５ｍｇ／ｍＬＰＯＷＴのミリＱ水溶液を用いてスピン成形（１０００ｒｐｍ、３０秒）した。フィルムは、チップを７５℃で５分間加熱することにより焼き戻した。最後に、チップを糊または接着剤条片を用いてセンサチップ支持体上に取り付けた。一般に、３度の注入からなる一連の注入を行った。最初の注入は、ｓｓＤＮＡ（５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ ＡＧＡ−３’、ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入））によってポリマーをキャラクタライズするため、２回目の注入は非特異的結合が起こっていないことを確認するため、最後の注入は、それぞれ５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ ＡＧＡ−３’または５’−ＴＣＴ ＡＡＣ ＣＴＣ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’（ＳＧＳＤＮＡ（スウェーデン、コーピング）より購入））を用いてＤＮＡハイブリダイゼーションの形における特異的結合を証明することを目的としている。まず最初に、ポリマーフィルムを脱気したミリＱ水で膨潤させ、次に、０〜１Ｍの範囲の塩濃度（ＮＡＣｌ）を有する脱気した２０ｍＭリン酸ｐＨ７，４バッファ（ＰＢＳ）中で平衡化した。注入されたＤＮＡを、泳動バッファと同一のバッファ中に溶解し、濃度を常に１μＭ前後とした。温度はすべての実験の間中、２５℃に設定した。ハイブリダイゼーション事象は、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ（スウェーデン国アプサラ）社製のＢｉａｃｏｒｅＸ機器を用いて監視した。この機器は、大体のサイズが０．５×２．５ｍｍの２つの流路を有する。手動での充填が必要であり、最大注入体積は１００μＬである。図８に示されるように、標的鎖（受容体）に相補的なＤＮＡ鎖を注入した後に、応答単位（ＲＵ）に大規模な増大が検出された。応答単位は、非相補的ＤＮＡの注入による変化はわずかであったことから、ＤＮＡハイブリダイゼーションが検出されていることが明確に示される。

（実施例９） ミクロ流体路によって調製されたアレイ中でのＤＮＡハイブリダイゼーションの蛍光検出
２成分シリコーンゴム（ポリ（ジメチルシロキサン）、ＰＤＭＳ）であるＳｙｌｇａｒｄ１８４（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、英国）を用いて、ＰＯＷＴを固体表面上に転移させるために用いられるエラストマースタンプを作製する。プレポリマーと、硬化剤とを、製造業者によって提供される指示書に従って混合する。次にこれを、シリコンウエハの上部に構造エレメントとして負のフォトレジストＳＵ−８（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ ＩＮＣ．、英国マサチューセッツ州ニュートン）を用いてフォトリソグラフィによって作成した鋳型に注ぐ。硬化は、１３０℃で少なくとも２０分間加熱することによって行った。構造物の高さは１８マイクロメートルであり、基板は、アンモニアとＨ_２Ｏ_２とをそれぞれ５％ずつ含んだ沸騰水溶液中で洗浄（ＴＬ−１洗浄）したＳｉウエハとした。鋳型に対する幾何学形状は、ＣｌｅＷｉｎバージョン２．５１（ＷｉｅＷｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で設計し、Ｃｒマスクに転移させ、これをフォトリソグラフィ工程において使用した。ＳＵ−８構造を鋳型であるシリコンウエハ上に現像した後、シラン化（ジメチル−ジクロロシラン）を行って、ＳＵ−８鋳型の適当な表面エネルギーを得た。ＰＯＷＴの溶液（メタノール中、１０ｍｇ／ｍＬ）を、予めＴＬ−１洗浄によって洗浄し、１０秒間の酸素プラズマ処理によって改質しておいたガラス表面上にスピンコート（２６００ｒｐｍ）した。フィルムを７５℃で５分間焼き戻した。１００μｍの広いチャンネルを有するＰＤＭＳスタンプを１０秒間の酸素プラズマ処理により改質し、ポリマーフィルム上に配置した。チャンネルに所望のヌクレオチド溶液（脱イオン水中、２０ｎｍｏｌの５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ ＡＧＡ−３’または５’−ＴＣＴ ＡＡＣ ＣＴＣ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＣＴ−３’）を充填し、スタンプを除去するまで室温にて乾燥させた。第１のものと同様にして改質した、第２のＰＤＭＳスタンプを、第１のものに対し垂直なチャンネルを有するポリマーフィルム上に配置した。これらのチャンネルを、２０ｎｍｏｌの５’−ＡＧＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＡＧ ＧＴＴ ＡＧＡ−３’を含むバッファ溶液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で充填し、室温で乾燥させた。ＰＤＭＳスタンプを除去し、交点（１００×１００μｍ）からの蛍光を、ＣＣＤカメラ（Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲ）を備えたエピ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ倒立顕微鏡Ａ２００ Ｍｏｔ）を用いて、４０５／３０ｎｍ帯域フィルタ（ＬＰ４５０、露出時間：７５０ミリ秒（ｍｓ））、４７０／４０ｎｍ帯域フィルタ（ＬＰ５１５、露出時間：１５００ミリ秒）および５４６／１２ｎｍ帯域フィルタ（ＬＰ５９０、露出時間：３５００ミリ秒）を用いて記録した。ＤＮＡハイブリダイゼーションによるＰＯＷＴの鎖内および鎖間プロセスの変更は、ＰＯＷＴからの発光の色および強度の変化として観察される（図７）。

（実施例１０） ＰＯＷＴのミクロ密着印刷
二成分シリコーンゴム（ポリ（ジメチルシロキサン）、ＰＤＭＳ）であるＳｙｌｇａｒｄ １８４（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ、英国）を用いて、ＰＯＷＴを固体表面に転移させるために用いるエラストマースタンプを作製した。プレポリマーと、硬化剤とを、製造業者によって提供される指示書に従って混合する。次にこれを、シリコンウエハの上部に構造エレメントとして負のフォトレジストＳＵ−８（ＭＩＣＲＯ ＣＨＥＭ ＩＮＣ．、英国マサチューセッツ州ニュートン）を用いてフォトリソグラフィによって作製した鋳型上に注ぐ。硬化は、１３０℃で少なくとも２０分間加熱することによって行った。構造物の高さは１８マイクロメートルであり、基板は、アンモニアとＨ_２Ｏ_２とをそれぞれ５％ずつ含んだ沸騰水溶液中で洗浄（ＴＬ−１洗浄）したＳｉウエハとした。鋳型に対する幾何学形状は、ＣｌｅＷｉｎバージョン２．５１（ＷｉｅＷｅｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で設計し、Ｃｒマスクに転移させ、これをフォトリソグラフィ工程において使用した。ＳＵ−８構造を鋳型であるシリコンウエハ上に現像した後、シラン化（ジメチル−ジクロロシラン）を行って、ＳＵ−８鋳型の適当な表面エネルギーを得た。ＰＤＭＳスタンプを１０秒間プラズマ処理してから、ＰＯＷＴの水系溶液中（５ｍｇ／ｍＬ）でディップコーティングした。Ｎ_２によりポリマーをスタンプの上部で乾燥させた。予めＴＬ−１洗浄しておいたガラス基板上、あるいは１０秒間の酸素プラズマ処理によって改質されたポリスチレン表面上に、２０〜２５分間、スタンプの表面を裏向けにしておいた。いずれの基板もスタンプを接触させる前に湿らせておいた。スタンプを除去した後、図９に示したようにＰＯＷＴは部分的にガラスに転移されていた。

（実施例１１） ハイドロゲルの電気的検出
一本鎖オリゴヌクレオチド分子（ｓｓＤＮＡ）との両性イオン共役ポリマーを調製する際には、別のＤＮＡ分子を認識する検出能力を用いる。共役両性イオンポリマーを、脱イオン水中で、０．１等量（モノマーを基準として）の一本鎖オリゴヌクレオチドと混合する。ガラス支持体上の、必要に応じて任意の方法でパターニングすることのできる金電極をエタノールで洗浄する。これらの電極の上面に、導電性ポリマーの分散液（ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ、Ｂａｙｅｒ ＡＧ製、商品名Ｂａｙｔｒｏｎ）を堆積させる。両性イオンポリマー／オリゴヌクレオチド複合体を、溶液成形、密着印刷、インクジェット印刷あるいは他の方法によって、ポリマー上に転移させる。得られた層は、電気化学的方法またはインピーダンス分光法によって、２または４点耐性測定を用いて分析する。

両性イオンポリチオフェン誘導体である、ポリ（３−［（Ｓ）−５−アミノ−５−カルボキシル−３−オキサペンチル］−２，５−チオフェニレンハイドロクロライド）（ＰＯＷＴ）の化学構造を示した図である。 本発明に従う方法を示す概略図である。 １０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）中で１．１６μｍｏｌのＰＯＷＴ（モノマー基準で）を、０ｍｏｌ（□）、６．４ｎｍｏｌ（◇）のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡ−３’）と５分間インキュベートした後の、あるいは同じバッファ系において６．４ｎｍｏｌの相補的オリゴヌクレオチド（△）とインキュベートした後の吸収スペクトルを示したものである。 １０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）中で２３．１ｎｍｏｌのＰＯＷＴ（モノマー基準で）を、０ｍｏｌ（□）、１．２８ｎｍｏｌ（◇）、および２．５６ｎｍｏｌ（×）のオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴ ＧＡＴ ＴＧＡ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＡＣ ＣＡ−３’）とともに５分間インキュベートした後の、あるいは同じバッファ系において１．２８ｎｍｏｌの相補的オリゴヌクレオチド（△）とインキュベートした後の発光スペクトルを示したものである。すべての発光スペクトルは、４００ｎｍの励起によって記録された。 ２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．４）中で１００ｎｍｏｌのＰＯＷＴ（モノマー基準で）（×）を、１．０等量の正に荷電したペプチド、ＪＲ２Ｋ（◇）、１．０等量の負に荷電したペプチド、ＪＲ２Ｅ（△）、０．５等量のＪＲ２Ｅ＋０．５等量のＪＲ２Ｋ（□）、０．５等量のＪＲ２Ｋ＋０．５等量のＪＲ２Ｅ（■）、２．０等量のＪＲ２Ｋ（◆）、および、２．０等量のＪＲ２Ｅ（▲）とともに１０分間インキュベートした後の発光スペクトルを示したものである。すべての発光スペクトルは、４００ｎｍの励起によって記録された。 ４．９μＭの炭酸脱水酵素に対する受容体部位を持つ合成ペプチドを添加した場合（細線）、および１３μＭの炭酸脱水酵素を添加した後（太線）の、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．５）中における２６．１ｎｍｏｌのＰＯＷＴの発光スペクトルである。 ＰＯＷＴ／ＤＮＡ複合体の蛍光画像を示す図である。相補的ＤＮＡ（左下）および非相補的ＤＮＡ（右下）の結合後のＰＯＷＴおよび一本鎖ＤＮＡのハイドロゲル。相補的ＤＮＡ（左上）または非相補的ＤＮＡ（右上）の結合後の、ＰＯＷＴと一本鎖ＤＮＡの交点（１００×１００μｍ）。蛍光は、ＣＣＤカメラ（Ａｘｉｏｃａｍ ＨＲ）を備えたエピ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒ倒立顕微鏡Ａ２００ Ｍｏｔ）を用いて記録した。 ＰＯＷＴ／金チップにおけるＤＮＡハイブリダイゼーション事象について、ＢｉａｃｏｒｅＸ機器を用いてモニターしたものである。以下のものを（順に）注入し、洗い流した。ｓｓＤＮＡ１（キャラクタリゼーション、１５４０ＲＵ）、ｓｓＤＮＡ１（非相補的、３０ＲＵ）、ｓｓＤＮＡ２（相補的、８６０ＲＵ）。０．１５Ｍ ＰＢＳバッファを用いた。 ＰＯＷＴのミクロ密着印刷を示した図である。１００×１００μｍのポリエチレン四方を囲む２５μｍ幅のラインを有する、プラズマエッチングポリエチレン上のＰＯＷＴの四角い網目である。反射光における光学顕微鏡。

Claims (23)

1. 共役高分子電解質と、標的生体分子検体に特異的な１つ以上の受容体分子との間の複合体であって、前記高分子電解質と前記受容体とは、非共有結合的に結合されており、生体分子相互作用に対するプローブとして使用可能であることを特徴とする複合体。
2. 前記共役高分子電解質は、チオフェン、ピロール、アニリン、フラン、フェニレン、ビニレンまたはそれらの置換型からなる共重合体または単独重合体を含むことを特徴とする請求項１に記載の複合体。
3. 前記共役高分子電解質は、１つ以上の両性イオン側鎖官能性を有することを特徴とする請求項１または２に記載の複合体。
4. 前記両性イオン側鎖官能性は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、神経伝達物質、単糖類、核酸、またはそれらの組み合わせおよび化学的に修飾された誘導体を含むことを特徴とする請求項３に記載の複合体。
5. 前記両性イオン官能性は、１つ以上のアニオン性およびカチオン性側鎖官能性を含むことを特徴とする請求項３または４に記載の複合体。
6. 前記受容体分子は、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、薬剤、抗原、抗体、タンパク質、有機ポリマー、または前記標的検体と相互作用可能な分子の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
7. 前記共役高分子電解質は、固体支持体に閉じ込められているか、吸着または共有結合されていることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
8. 前記共役高分子電解質は溶液であることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
9. 溶媒として、水、有機溶媒、バッファ系またはそれらの組み合わせが用いられることを特徴とする請求項８に記載の複合体。
10. 前記固体支持体は、シリコンウエハ、ガラス、スライドグラス、ガラスビーズ、ガラスウエハ、シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレン、フッ素化炭化水素ポリマー、シリカゲルビーズ、金、インジウム錫酸化物でコートした材料、ナイロン、セルロースまたはニトロセルロースから作製されたフィルタ紙、標準的なコピー用紙または別形、および分離媒体または他のクロマトグラフィー用媒体を含むことを特徴とする請求項７に記載の複合体。
11. 前記共役高分子電解質は、ポリマーマトリックス内に取り込まれていることを特徴とする請求項１に記載の複合体。
12. 前記ポリマーマトリックスは、ポリ［３，４−（エチレンジオキシ）チオフェン］／ポリ（スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ／ＰＳＳ）、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロライド）（ＰＤＡＤＭＡＣ）、ポリ−４−ビニルピリジン（ＰＶＰｙ）、ポリ（ピロール）（ＰＰｙ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アニリン）（ＰＡＮＩ）またはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１１に記載の複合体。
13. 前記標的生体分子検体は、細胞、ウィルス、細菌、胞子、微生物、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、薬剤、抗原、抗体、タンパク質、酵素、毒素、有機ポリマー、または前記受容体と相互作用可能な分子の組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の複合体。
14. 生体分子の選択された特性を決定するためのバイオセンサ装置であって、
    請求項１から１３のいずれかに記載の複合体と、
    前記複合体に対する基板であって、前記複合体を前記標的生体分子検体に露呈可能である基板と
    を含むことを特徴とするバイオセンサ装置。
15. 前記バイオセンサ装置は、容器と、前記容器の表面に固定化された高分子電解質とを含むことを特徴とする請求項１４に記載のバイオセンサ装置。
16. 前記容器はフローセルであることを特徴とする請求項１４に記載のバイオセンサ装置。
17. 生体分子の選択された特性を決定する方法であって、
    請求項１から１３のいずれかに記載の複合体を、標的生体分子検体に露呈して、検体と受容体とを相互作用させる工程と、
    受容体と検体の間の相互作用に応答して、前記高分子電解質の特性の変化を検出する工程と、
    検出された変化を用いて、前記生体分子の前記選択された特性を決定する工程と
    を含むことを特徴とする方法。
18. 前記特性の変化は、蛍光、フォースタ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、放射光の消失、吸収、インピーダンス、屈折率、質量、粘弾性、厚みまたは他の物理的特性を測定することによって検出されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 請求項１から１３のいずれかに記載の複合体が、基板表面、好ましくは適切な容器に取り付けられることを特徴とする、バイオセンサ装置の製造方法。
20. 前記複合体は、
    ｉ）ディップコーティング、スピンコーティング、密着印刷、スクリーン印刷、インクジェット技術、噴霧、ディスペンシング、およびソフトリソグラフィを用いたミクロ流体印刷、またはそれらの組み合わせから選択される方法によって、共役高分子電解質を前記表面に転移させること、および
    ｉｉ）適切な受容体と前記高分子電解質の間で複合体を形成すること
    によって、取り付けられることを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
21. 両性イオン共役高分子電解質は、高温において固体支持体への物理的接着によって、あるいはハイドロゲルマトリックス中への取り込みによって固定化されることを特徴とする請求項１９または２０に記載の製造方法。
22. 固体支持体に固定化された請求項１から１３のいずれかに記載の複合体からなる複数のスポット、アレイまたはラインを含むことを特徴とするバイオセンサ装置。
23. 前記複数のスポット、アレイまたはラインは、エラストマースタンプを用いたミクロ密着印刷によって、両性イオン共役高分子電解質溶液をスポッティングすることによって、あるいは共役高分子電解質溶液を固体支持体上にインク噴霧することによって印刷されることを特徴とするバイオセンサ装置。
    

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