JP7333462B2 - 共重合体およびその製造方法、測定装置ならびに測定用担体 - Google Patents

共重合体およびその製造方法、測定装置ならびに測定用担体 Download PDF

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Description

本開示は、測定装置に用いられる高分子膜を形成する共重合体およびその製造方法、当該高分子膜を備えた測定装置および測定用担体に関する。
測定対象物質（例えば、生体分子）の濃度を測定する測定装置の一例として、弾性表面波センサが特許文献１に開示されている。このような測定装置は、検体に含まれる測定対象物質と相互作用する物質（例えば、抗体）が固定された検出部を備えている。上記検出部には、検体に含まれる測定対象物質と相互作用する物質を固定するために、高分子膜が形成されることが多い。
日本国特開２００８－２８６６０６号公報
測定装置の検出部に形成される高分子膜には、上記の相互作用する物質を固定でき、かつ、高い化学的安定性を有することが要求されている。
一実施形態に係る共重合体は、下記式（１）で表される第１構造単位および下記式（２）で表される第２構造単位を含む共重合体である。
Figure 0007333462000001
 （式（１）中、
Ｒ１は水素原子またはメチル基である。
Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
ｘ１は１～４の整数である。）
Figure 0007333462000002
 （式（２）中、
Ｒ４は水素原子またはメチル基である。
Ｒ５およびＲ６は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
ｘ２は１～４の整数であり、ｙは３～７の整数である。）
一実施形態に係る共重合体の製造方法は、下記式（１）で表される第１構造単位および下記式（２）で表される第２構造単位を含む共重合体の製造方法であって、
Figure 0007333462000003
 （式（１）中、
Ｒ１は水素原子またはメチル基である。
Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
ｘ１は１～４の整数である。）
Figure 0007333462000004
 （式（２）中、
Ｒ４は水素原子またはメチル基である。
Ｒ５およびＲ６は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
ｘ２は１～４の整数であり、ｙは３～７の整数である。）
下記式（３）で表される構造単位を含む重合体を、下記式（４）で表される化合物と式（５）で表される化合物と反応させる工程を含み、
Figure 0007333462000005
 （式（３）中、
Ｒ７は水素原子またはメチル基である。
Ｒ８およびＲ９は各々独立して炭素数１～４のアルキル基である。
ｚは１～４の整数である。）
Figure 0007333462000006
 （式（４）中、ｙは３～７の整数である。）
Figure 0007333462000007
 上記工程が、上記式（３）で表される構造単位を含む重合体を、上記式（４）で表される化合物と反応させてから、上記式（５）で表される化合物と反応させる工程である、共重合体の製造方法である。
本開示に係る測定装置の一例を示す概略図である。 上記測定装置が備えるセンサを示す平面図である。 図１に示す検出部２３が備える高分子を示す概念図である。 本開示に係る測定用担体の一例を示す平面図である。 参考例１における、各ポリマーのＴＧプロファイルの測定結果を示すグラフである。 本開示に係る共重合体の重合度と非特異的吸着量との関係を示すグラフである。 本開示に係る共重合体中のＣＢＭＡ１の割合と抗体固定化量との関係を示すグラフである。 本開示に係る共重合体中のＣＢＭＡ１の割合と血清に含まれる成分の非特異的吸着量との関係を示すグラフである。
〔実施形態１〕
以下、図面を適宜に用いて、本開示に係る測定装置に備えられるセンサについて説明する。図１に、本実施形態に係る測定装置１００のセンサ２の概略を示す。
測定装置１００は、測定対象（検体）から特定の物質（第１物質）を標的として検出することができる。第１物質５は、例えば、生体内物質である。上記生体内物質の例として、タンパク質、ＤＮＡ、酵素反応の基質等を例示することができる。測定装置１００は、第１物質を検出可能なセンサ２および測定装置１００を制御することができる制御装置６を備える。
センサ２は、例えば、弾性波、ＱＣＭ（Quartz Crystal Microbalance）、ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance）、またはＦＥＴ（Field Effect Transistor）などを利用するセンサであればよい。すなわち、センサ２は、電気信号と弾性波、ＱＣＭ、ＳＰＲ、ＦＥＴなどを相互に変換することができればよい。一実施形態に係るセンサ２は、弾性波を利用するセンサである。すなわち、一実施形態に係る測定装置１００は、センサ２を用いることによって、第１物質の存在に基づく弾性波の変化を電気信号の変化として検出することができる。センサ２は、下記高分子膜１を除いては、従来周知の方法によって作製すればよいまた、この場合、識別情報に含まれる検査情報には、弾性波の初期位相、および基板２２の方位など、弾性波を利用するセンサに特有の情報が含まれてよい。
本実施形態の測定装置１００では、センサ２は外部端子２１を有している。センサ２は外部端子２１を介して、測定装置１００を制御する制御装置６と電気的に接続することができる。すなわち、センサ２と制御装置６は、外部端子２１を介して互いに電気信号を入出力することができる。そのため、制御装置６は、センサ２から入力された電気信号に基づいて、例えば、第１物質を検出することができる。制御装置６は、例えば、検体に含まれる第１物質の濃度を算出してもよい。または、制御装置６は、例えば、第１物質を同定してもよい。制御装置６および外部端子２１は、従来周知の技術によって作製すればよい。また、センサ２と制御装置６を電気的に接続する構成は、外部端子２１に限定されない。例えば、センサ２と制御装置６が電気的に接続することができるのであれば、センサ２と制御装置６は、端子などにより物理的に接続されなくてもよい。例えば、センサ２と制御装置６は、電磁誘導によって電気的に接続されてもよい。
センサ２は、使い捨てのカートリッジであってもよい。これによれば、測定後にセンサ２を洗浄する工程が不要となり、不十分な洗浄による測定結果への影響を排除することができる。
図２に、センサ２の平面図を示す。センサ２は、基板２２と、基板２２上に位置した検出部２３と、参照部２４と、基板２２上に検出部２３を挟むように配された一対の第１ＩＤＴ（Inter Digital Transducer）電極２５ａと、一対の第２ＩＤＴ電極２５ｂを備える。検出部２３、参照部２４、一対の第１ＩＤＴ電極２５ａ、および一対の第２ＩＤＴ電極２５ｂは、基板２２上に位置してよい。
（基板）
基板２２は、例えば圧電性を有する基板である。具体的には、基板２２は、例えば水晶基板である。基板２２は、弾性波を伝搬することができるのであれば、水晶基板に限られない。すなわち、基板２２は、弾性波を伝搬することができる任意の材料で構成されればよい。例えば、基板２２は、金、銀、銅、白金およびアルミニウム等の金属、タンタル酸リチウム、水晶などの圧電性を有する単結晶を含む基板であってもよい。また、基板２２は、従来周知の手法により作製されればよい。
（検出部）
検出部２３には、第１物質５と反応する物質（第２物質）が固定されている。したがって、検出部２３において、検体に含まれる第１物質と固定された第２物質とが反応することができる。検出部２３は、第１物質と第２物質とを反応させることによって、基板２２の弾性波の伝搬特性が変化する。具体的には、検出部２３は、例えば、第１物質と第２物質とを反応させることで、基板２２にかかる重量、あるいは基板２２の表面に接触する液体の粘度が変化する。これらの変化の大きさは、第１物質と第２物質の反応量に相関する。また、弾性波の特性（例えば位相、振幅、あるいは周期等）は、検出部２３を伝搬することで変化する。特性の変化の大きさは、例えば、基板２２にかかる重量の大きさ、あるいは基板２２の表面に接触する液体の粘度の大きさなどと相関する。したがって、センサ２は、弾性波の特性の変化に基づいて、第１物質を検出することができる。具体的には、測定装置１００は、例えば検体に含まれる第１物質の濃度を測定することができる。検出部２３の詳細については後述する。
一対の第１ＩＤＴ電極２５ａは、一対の第１ＩＤＴ電極２５ａ間に弾性波を発生させることができる。発生した弾性波のうち、基板２２の表面を伝搬する弾性波は、弾性表面波（SAW：Surface Acoustic Wave）ともいう。一対の第１ＩＤＴ電極２５ａは、基板２２において、検出部２３を挟むように位置していればよい。一実施形態に係る測定装置１００において、一対の第１ＩＤＴ電極２５ａの一方に電気信号が入力される。入力された電気信号は、検出部２３に向かって伝搬する弾性波に変換されて一方の第１ＩＤＴ電極２５ａから発信される。発信された弾性波は、検出部２３を通過する。他方の第１ＩＤＴ電極２５ａは、検出部２３を通過した弾性波を受信することができる。受信された弾性波は、電気信号に変換される。一対の第１ＩＤＴ電極２５ａは、例えば、金、クロムまたはチタンなどの金属材料で形成されていればよい。また、一対の第１ＩＤＴ電極２５ａは、単一の材料で構成された単層の電極、または複数の材料で構成された多層の電極であってもよい。
センサ２は、検出部２３および一対の第１ＩＤＴ電極２５ａの組合せを２つ以上有していてもよい。この場合、測定装置１００は、例えば、組合せごとに異なる種類の標的物質を検出してもよい。または、測定装置１００は、例えば、同じ種類の標的物質を複数の組合せで検出し、それぞれの検出結果を比較してもよい。
図３に、検出部２３が備える高分子膜１を示す概念図を示す。検出部２３において、基板２２上にポリマー３を含む高分子膜１が固定されている。さらに、高分子膜１上に、第１物質５と反応する物質（第２物質４）が固定されている。
高分子膜１は、特異的吸着性が高くなるように調整された膜であり、非特異的吸着を低減するように調整された膜である。
（第１物質と第２物質）
第１物質５と第２物質４との反応は、センサ２の出力に変化をもたらす反応であればよい。このような反応として、例えば、酸化還元反応、酵素反応、抗原抗体反応、化学吸着、分子間相互作用、またはイオン間相互作用などによって第１物質５と第２物質４とが結合する反応であってもよい。あるいは、第１物質５と第２物質４との反応は、酵素反応等によって新たな物質（第３物質）を生成する反応であってもよい。
検出部２３に固定される第２物質４は、第１物質５に応じて適宜選択すればよい。例えば、第１物質５が検体中の特定のタンパク質、ＤＮＡ、または細胞などである場合は、第２物質４は、抗体、ペプチド、またはアプタマーなどを用いてもよい。また、例えば、第１物質５が抗体である場合は、第２物質４は抗原を用いてもよい。また、例えば、第１物質５が基質である場合は、第２物質４は酵素を用いてもよい。
測定装置１００は、標的である第１物質５を間接的に検出してもよい。例えば、第１物質５に類似する物質を第２物質４として検出部２３に固定してもよい。すなわち、例えば、第１物質５を抗原とする抗体と第１物質５とを予め反応させ、反応しなかった抗体を固定された第２物質４と反応させてもよい。この場合、測定装置１００は、例えば、抗体の量が既知であれば、検出された抗体の量から間接的に第１物質５の量を算出することができる。
（ポリマー）
ポリマー３は高分子膜１を構成する。以下に、本開示の態様のポリマー３の一例（以下、「本実施形態のポリマー」と略記する）について説明する。
本実施形態のポリマーは、下記式（１）で表される第１構造単位および下記式（２）で表される第２構造単位を含む共重合体である。
Figure 0007333462000008
 （式（１）中、
Ｒ１は水素原子またはメチル基である。
Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
ｘ１は１～４の整数である。）
Figure 0007333462000009
 （式（２）中、
Ｒ４は水素原子またはメチル基である。
Ｒ５およびＲ６は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
ｘ２は１～４の整数であり、ｙは３～７の整数である。）
第１構造単位は、例えば、Ｎ－（カルボキシメチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－［（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）－オキシ］エタナミニウム（ＣＢＭＡ１）に由来する構造単位であってもよい。
第２構造単位は、例えば、下記式（８）で表される化合物に由来する構造単位であってもよい。
Figure 0007333462000010
 （式（８）中、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ｘ２およびｙはそれぞれ、式（２）中のＲ４、Ｒ５、Ｒ６、ｘ２およびｙと同義である。）
ここで、本実施形態のポリマーは、化学的に安定な、式（１）で表される第１構造単位を有することにより、高分子膜の化学的安定性を向上させることができる。また、本実施形態のポリマーは、第２物質４との反応性が良好な、式（２）で表される第２構造単位中のカルボキシル基を有することにより、第２物質４が固定し易くなる。したがって、これら２つの構造単位を有する本実施形態のポリマーによって、第２物質４を固定し易く、化学的に安定な高分子膜を製造することができる。また、本実施形態のポリマーは、高い熱安定性、耐加水分解性を有する。
本実施形態のポリマーをバイオセンサ等の測定装置に使用するときは、高い化学的安定性を持たせつつ、第２物質４との反応性を良好とさせる点で、上記共重合体に含まれる第１構造単位および第２構造単位の合計の含有割合が８０モル％以上であってもよく、９０モル％以上であってもよく、９５モル％以上であってもよい。
本実施形態のポリマーは、高い化学的安定性を持たせつつ、非特異的吸着を低減させる点で、上記共重合体に含まれる第１構造単位の割合は、５０モル％以上であってもよく、６０モル％以上であってもよく、８０モル％以上であってもよい。また、上記割合は、９５モル％以下であってもよく、９０モル％以下であってもよい。
本実施形態のポリマーに関して、非特異的吸着を低減しつつ、第２物質４との反応性を良好とさせる点で、上記共重合体に含まれる第１構造単位に対する第２構造単位のモル比（第２構造単位／第１構造単位）が、１以下であってもよく、０．７以下であってもよく、０．３以下であってもよい。また、検体に含まれる測定対象物質と相互作用する物質との反応性を発現させるために、上記モル比は、０．０５以上であってもよく、０．１以上であってもよい。
本実施形態のポリマーに関して、第２物質４との反応性を良好とさせる点で、上記共重合体に含まれる第２構造単位の割合は、５モル％以上であってもよく、１０モル％以上であってもよく、２０モル％以上であってもよい。また、非特異吸着低減の観点で、上記割合は、５０モル％以下であってもよく、４５モル％以下であってもよく、４０モル％以下であってもよい。
本実施形態のポリマーは、本開示の効果を損なわない範囲で、第１構造単位および第２構造単位以外の構成単位を有していてもよい。例えば、本実施形態のポリマーは、下記式（３）で表される第３構造単位をさらに含んでいてもよい。
Figure 0007333462000011
 （式（３）中、
Ｒ７は水素原子またはメチル基である。
Ｒ８およびＲ９は各々独立して炭素数１～４のアルキル基である。
ｚは１～４の整数である。）
第３構造単位は、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルアミノエチル（メタ）アクリレート等に由来する構造単位であってもよい。
本実施形態のポリマーは、非特異的吸着の低減の点で、上記共重合体に含まれる第３構造単位の割合は、２０モル％以下であることであってもよく、１０モル％以下であってもよく、５モル％以下であってもよい。
本実施形態のポリマーの主鎖の少なくとも一方の末端は、基板２２（測定基板１２）への高分子膜への固定のし易さの点で、チオール基またはジチオエステル基を有していてもよく、チオール基であってもよい。
本実施形態のポリマーの数平均重合度は、膜形成密度の点で、２５以上であってもよく、５０以上であってもよく、２００以上であってもよい。第１物質５が尿に含まれる物質であるときは、本実施形態のポリマーは高分子量であってもよい。また、本実施形態のポリマーは、ランダム共重合体、ブロック共重合体またはグラフト共重合体の何れであってもよい。
上記第１構造単位および上記第２構造単位を含む共重合体は、従来公知の有機分析手法により同定することができる。例えば、当該共重合体は、ＮＭＲ（Nuclear Magnetic Resonance）によって同定されてもよい。または、例えば、液体クロマトグラフによって同定されてもよい。または、例えば、赤外分光法により同定されてもよい。すなわち、当該共重合体を同定する場合、これらの手法を実施可能な装置を用いればよい。当該共重合体を同定することが可能であれば、同定手法及び装置は、これらの手法及び装置に限定されるものではない。
＜製造方法＞
本実施形態のポリマーの製造方法は、ラジカル重合等の公知の重合方法によって製造することが可能である。以下に、本実施形態のポリマーの製造方法の一例を示す。
本実施形態のポリマーの製造方法の一例は、中間体の合成工程（ステップ１および２）、中間体の脱保護工程（ステップ３）、ポリマーの末端をチオール基（ＳＨ基）に置換する置換工程（ステップ４）を含む。以下、各工程を説明する。
＜ステップ１および２：中間体の合成工程＞
本工程では、上記式（３）で表される第３構造単位を含む重合体（以下、「出発重合体」と略記する場合がある）を、式（４）で表される化合物および式（５）で表される化合物と反応させる工程によって、中間体を合成する。中間体は式（６）で表される構造単位および式（７）で表される構造単位を含む重合体である。
Figure 0007333462000012
 （式（４）中、ｙは３～７の整数である。）
Figure 0007333462000013
Figure 0007333462000014
 （式（６）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびｘ１はそれぞれ、式（１）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびｘ１と同義である。）
Figure 0007333462000015
 （式（７）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、ｘ２およびｙはそれぞれ、式（２）中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、ｘ２およびｙと同義である。）
出発重合体は、市販品であってもよいし、合成して得られたものであってもよい。出発重合体に含まれる第３構造単位の割合は、８０モル％以上であってもよく、９０モル％以上であってもよい。
出発重合体の一例は、以下の化学式（９）で表される重合体である。
Figure 0007333462000016
 （式（９）中、ｎは２５～１０００の整数である。）
出発重合体は例えば、ＲＡＦＴ重合（可逆的付加開裂連鎖移動重合）により合成することができる。出発重合体は、ＤＭＡＥＭＡ（メタクリル酸２－（ジメチルアミノ）エチル）等のモノマーを出発材料として、ＲＡＦＴ剤および重合開始剤を用いるＲＡＦＴ重合によって合成することができる。ＲＡＦＴ重合によって得られた重合体は、末端にジチオエステル基を有するため、後述のチオール基への置換工程（ステップ４）を簡便かつ短時間で行うことができる。
ＲＡＦＴ剤の例として、ジチオエステル、トリチオカルボナート、ジチオカルバメートおよびジチオカルボナート等が挙げられる。重合開始剤の例として、過硫酸塩、過酸化物およびアゾ化合物等を挙げることができる。ＲＡＦＴ重合で用いる反応溶媒、反応触媒、反応温度、および、反応時間等に関しては、実施例の記載、および、ＲＡＦＴ重合の一般的な条件等も参照することができる。
反応制御の点で、出発重合体を、式（４）で表される化合物と反応させてから、式（５）で表される化合物と反応させる。組成比率の制御の点で、出発重合体に、式（４）で表される化合物と式（５）で表される化合物を別々に反応させてもよい。
出発重合体と式（４）で表される化合物との反応条件として、反応温度は反応促進の点から、４０℃以上であってもよく、６０℃以上であってもよく、溶媒の還流温度であってもよい。反応溶媒は、極性溶媒であればよく、反応溶媒としてＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、アセトニトリル、メタノール、エタノールなどが例示されるが、エタノールであってもよい。共重合比制御の観点から、式（４）で表される化合物を加える量は、出発重合体に含まれるアミノ基の量に対して所望の第２構造体の共重合比率を乗じた量としてもよい。例えば、第２構造体の共重合比率を２０％としたい場合には、出発重合体に含まれるアミノ基の量に対して、０．２を乗じた量の式（４）で表される化合物を加えてもよい。式（４）で表される化合物のすべてを出発重合体のアミノ基と反応させる観点から、反応時間は６時間以上であってもよく、１２時間以上であってもよく、２４時間以上であってもよい。
出発重合体と式（４）で表される化合物とを反応させて得た反応物と、式（５）で表される化合物との反応条件に関して、反応温度は、反応促進の点から０℃以上であってもよく、１０℃以上であってもよく、２０℃以上であってもよい。反応溶媒は、極性溶媒であればよく、反応溶媒としてＤＭＦ、アセトニトリル、メタノール、エタノールなどが例示されるが、エタノールであってもよい。出発重合体と式（４）で表される化合物とを反応させて得た反応物に含まれるアミノ基の、式（５）で表される化合物との反応割合を向上させる観点から、式（５）で表される化合物を加える量は、出発重合体と式（４）で表される化合物とを反応させて得た反応物に含まれるアミノ基の量に対して、１．１倍以上であってもよく、１．２倍以上であってもよく、１．３倍以上であってもよい。一方で、廃棄物量低減の観点から、式（５）で表される化合物を加える量は、出発重合体と式（４）で表される化合物とを反応させて得た反応物に含まれるアミノ基の量に対して、３倍以下であってもよく、２倍以下であってもよい。出発重合体と式（４）で表される化合物とを反応させて得た反応物に含まれるアミノ基の、式（５）で表される化合物との反応割合を向上させる観点から、反応時間は、１時間以上であってもよく、２時間以上であってもよく、６時間以上であってもよい。反応を終了した後に、再沈殿精製により、未反応の式（５）で表される化合物を含む不純物を除去してもよい。
＜ステップ３：中間体の脱保護工程＞
本工程では、上記工程で得られた中間体の保護基（tert-ブチル基）を除去する（脱保護工程）。中間体の脱保護工程によって、本実施形態のポリマーが得られる。例えば、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）等の強酸を作用させることにより、保護基を除去することができる。脱保護工程で用いる反応溶媒、反応触媒、反応温度、および、反応時間等に関しては、実施例の記載、および、脱保護処理するときの一般的な条件等も参照することができる。
本工程によって得られるポリマーの一例は、以下の化学式（１０）で表される重合体である。
Figure 0007333462000017
 （式（１０）中、ｎは２５～１０００の整数である。）
＜ステップ４：ポリマー末端のチオール基への置換工程＞
本工程では、ポリマー主鎖の末端をチオール基に置換する。ポリマー主鎖の末端をチオール基に置換することによって、基板２２（測定基板１２）にポリマーを固定し易くなる。式（３）で表される第３構造単位を含む重合体がＲＡＦＴ重合により得られた重合体であるときは、ステップ３で得られたポリマーの末端はジチオエステル基を有する。当該ポリマーを含む溶液にエタノールアミンを添加することによって、ジチオエステル基がチオール基に置換される。チオール基への置換工程で用いる反応溶媒、反応触媒、反応温度、および、反応時間等に関しては、実施例の記載、および、チオール基への置換するときの一般的な条件等も参照することができる。
本工程によって得られるポリマーの一例は、以下の化学式（１１）で表される重合体である。
Figure 0007333462000018
 （式（１１）中、ｎは２５～１０００の整数である。）
ポリマー３を基板２２に固定化する方法として、例えば、溶媒にポリマー３を溶解させて得られたポリマー溶液を基板２２に塗布し乾燥させる方法、放射線または紫外線によるグラフト重合、基板２２の官能基との化学反応等が挙げられる。これらの方法によって、基板２２上にポリマー３から構成される高分子膜１が形成される。
第２物質４をポリマー３（高分子膜１）上に固定する方法として、例えば、ポリマー３が有するカルボキシル基に第２物質４を共有結合させる方法が挙げられる。例えば、ポリマー３を、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と反応させる（ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化）。そして、ポリマー３が有するカルボキシル基がＮＨＳエステル基に置換する。この活性化されたＮＨＳエステル基に第２物質４のアミノ基を反応させることによって、第２物質４がポリマー３（高分子膜１）上に固定される。ポリマー３のＮＨＳ／ＥＤＣ活性化は、基板２２に固定化する前に行ってもよく、基板２２の固定化後に行ってもよい。本実施形態のポリマーは、高い化学的安定性を有するため、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化によって分解が起こり難い。したがって、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化に伴う分解物に起因する非特異的吸着を低減することができる。
〔実施形態２〕
以下、図面を適宜に用いて、一実施形態に係る測定用担体について説明する。説明の便宜上、上記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を繰り返さない。図４に、本実施形態に係る測定用担体１１の概略構成を示す。測定用担体１１の例として、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着）用のプレート等が挙げられる。
測定用担体１１は、検体に含まれる標的物質（第１物質５）を特異的に捕捉するための検出領域３１およびブロッキング剤等を非選択的に吸着させる非検出領域３２を測定基板１２の表面に備えている。検出領域３１には、高分子膜１が固定されている。
高分子膜１上には、実施形態１で説明した高分子膜１と同様に、第１物質５と反応する第２物質４が固定されている。非検出領域３２には、非特異的吸着性が高まるように調整された膜を固定していてもよい。
（測定用担体の使用例）
まず、検出領域３１の高分子膜１に所望の第２物質４を固定する。また、非検出領域３２に、ブロッキング剤を非選択的に吸着させる。その後、検体を検出領域３１に接触させることにより、検体に含まれる標的物質である第１物質５が第２物質４と反応し、当該反応を検出試薬によって検出する。検出試薬の例として、酸化還元物質、蛍光物質、酵素および色素化合物等が挙げられる。
（測定基板）
測定基板１２は、例えば、金、銀、銅、白金およびアルミニウム等の金属；ポリエチレンおよびポリプロピレン等のプラスチック；酸化チタン、シリカ、ガラスおよびセラミック等の無機素材；などであればよい。測定基板１２は、これらの例に限定されない。
測定基板１２の形状は、例えば、板状、粒子、微小構造体およびマイクロタイタープレート等であればよい。測定基板１２の形状は、これらの例に限定されない。
（測定キット）
高分子膜１が固定された測定基板１２と、第２物質４と、検出試薬とを含む測定キットも本開示の範囲に含まれる。第２物質４は、製品の製造時において高分子膜１に予め固定されていてもよいし、測定前にユーザによって固定されてもよい。
本実施形態に係る測定キットは、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、上述した、第２物質４および検出試薬以外の成分を備えていてもよい。また、バッファー等を備えていてもよい。また、本実施形態に係る測定キットは、複数の異なる試薬を、適切な容量および／または形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本実施形態に係る測定キットには、上記第１物質５と第２物質４との反応の検出を得るための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙もしくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、または磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスクまたはＣＤ－ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
以上、本開示に係る発明について、諸図面および実施例に基づいて説明してきた。しかし、本開示に係る発明は上述した各実施形態に限定されるものではない。すなわち、本開示に係る発明は本開示で示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本開示に係る発明の技術的範囲に含まれる。つまり、当業者であれば本開示に基づき種々の変形または修正を行うことが容易であることに注意されたい。また、これらの変形または修正は本開示の範囲に含まれることに留意されたい。
以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。以下の実施例において、ＣＢＭＡ１とは、Ｎ－（カルボキシメチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２－［（２－メチル－１－オキソ－２－プロペン－１－イル）－オキシ］エタナミニウムのことである。ＣＢＭＡ３とは、上記式（８）で表される化合物であって、式（８）中、Ｒ４～Ｒ６がそれぞれメチル基であり、ｘ２が２であり、ｙが３である化合物である。
〔実施例１〕共重合体の熱安定性の評価
次に示す３種類の共重合体Ａ～Ｃ、およびＣＢＭＡ２（（２－カルボキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－［２’－（メタクリロイル）オキシエチル］エタナミニウム（３－［［２－（メタクリロイルオキシ）エチル］ジメチルアンモニオ］プロピオナート）））のホモポリマー（ｐ（ＣＢＭＡ２））に関して、その熱安定性を評価した。
共重合体Ａ：ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との共重合体であって、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が８対２であり、重合度が５０である共重合体
共重合体Ｂ：ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との共重合体であって、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が８対２であり、重合度が２００である共重合体
共重合体Ｃ：ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との共重合体であって、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が６対４であり、重合度が５０である共重合体
熱安定性の評価は、熱重量示差熱分析装置を用い、以下の測定条件にて行った。
測定装置：リガク製ＥＶＯ－ＴＧ ８１２０
測定条件：昇温速度：１０℃/分
測定温度：室温～７００℃
雰囲気：窒素
測定容器：Ｐｔ
レファレンス：Ａｌ２Ｏ３
サンプル量：約４ｍｇ
評価結果を図５に示す。
図５において、１００℃に昇温するまですべてのポリマーの重量が減少したのは、ポリマーに吸着している水の蒸発に起因する。共重合体Ａ～Ｃは、１００～１３０℃まで重量が一定しており、熱安定性が高いことが分かった。これらのうち、共重合体ＡおよびＢは、１５０℃まで重量が一定しており、熱安定性が特に高いことが分かった。
〔実施例２〕ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化に対する共重合体の安定性の評価
抗体および酵素等の第２物質４を固定するとき、ポリマー（高分子膜）に、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）と反応させる（ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化）。下記共重合体ＤおよびＣＢＭＡ２のホモポリマーのＮＨＳ／ＥＤＣ活性化に対する安定性を評価した。
共重合体Ｄ：ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との共重合体であって、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が８対２であり、重合度が１００である共重合体
各ポリマーの粉末を、濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮＨＳ、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＣ・ＨＣｌ、３７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ混合溶液に溶解して１０分間活性化処理した。ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化前後のポリマー中の－Ｎ＋（ＣＨ３）２－および－Ｎ（ＣＨ３）２の量を測定した。その結果を表１に示す。表１中の％はモル％である。表１中の各数値は、ポリマー中の－Ｎ＋（ＣＨ３）２－および－Ｎ（ＣＨ３）２の含有量を１００モル％としたときの割合である。ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化は３回行い、表１中の数値は、３回実施した後の数値である。
Figure 0007333462000019
表１に示すように、共重合体Ｄについては、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化前後で－Ｎ＋（ＣＨ３）２－の量が変化しなかった。これに対して、ＣＢＭＡ２のホモポリマーについては、ＮＨＳ／ＥＤＣ活性化後に－Ｎ＋（ＣＨ３）２－の量が減少し、－Ｎ（ＣＨ３）２が増加した。これらの結果から、共重合体ＤはＮＨＳ／ＥＤＣ活性化によって分解が起こり難いことが分かった。
〔実施例３〕ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が８対２であるポリマー（共重合体）の調製
以下の合成スキームに従って、共重合体を調製した。
Figure 0007333462000020
＜１．ポリマーＡ１の合成＞
ポリマーＡ１は、ＲＡＦＴ重合によって合成した。モノマーのＮ，Ｎ－ジメチルアミノエチルメタクリル酸（ＤＭＡＥＭＡ）を５００ｍｍｏｌ／Ｌ、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を３ｍｍｏｌ／Ｌ、４－シアノ－４－（チオベンゾイル）スルファニルペンタン酸（ＣＴＡ）を１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにトルエンに溶解させ、脱酸素下、６０℃で２４時間反応させた。反応後、ヘキサンとイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）との混合溶媒（ヘキサン／ＩＰＡ＝９／１（体積比））を投入した。そして、沈殿物を濾過して乾燥させることによってポリマーＡ１（ｎ＝５０）を得た。得られたポリマーＡ１の重合度は、ＮＭＲ分光法により測定した。下記測定条件で得られた１Ｈ－ＮＭＲスペクトルにおける、末端のベンゼン環に由来する７．５０ｐｐｍ～８．５０ｐｐｍのピークの面積と三級アミンのメチル基についたプロトンに由来する２．３０ｐｐｍ付近のピークの面積との比率から算出した。
測定装置：ブルカーバイオスピン株式会社 ＡＤＶＡＮＣＥＩＩＩ ＨＤ ４００型
測定条件：溶媒：重水
温度：３０℃
基準：Ｈ２Ｏピークを４．７０ｐｐｍとする
積算：３００回
また、ｎ（重合度）＝２５、１００または２００であるポリマーＡ１を作製した。表２に、ｎ＝２５、５０、１００または２００であるポリマーＡ１を合成したときに使用したＤＭＡＥＭＡ、ＡＩＢＮおよびＣＴＡの濃度を示す。
Figure 0007333462000021
＜２．ポリマーＡ１と化合物Ｂ１との反応（Ｓｔｅｐ＿１）＞
エタノール５ｍＬに、ポリマーＡ１中のモノマー繰り返しユニットの量が５．０ｍｍｏｌとなるよう溶解させた溶液にＢ１を１．０ｍｍｏｌ加え、還流しながら１８時間反応させた。
＜３．化合物Ｂ２との反応（Ｓｔｅｐ＿２）＞
Ｓｔｅｐ＿１の反応後の溶液に、Ｂ２を４．５ｍｍｏｌ加え、室温で８時間～１０時間反応させたのち、ヘキサン／イソプロピルアルコール＝９／１（体積比）の混合溶媒に投入し、得られた沈殿物を回収し、乾燥させ、ポリマーＣ１の固体を得た。
＜４．保護基の削除（Ｓｔｅｐ＿３）＞
ポリマーＣ１中のモノマー繰り返しユニットの量の濃度が０．７５ｍｏｌ／Ｌとなるように、Ｓｔｅｐ＿２で得られたポリマーＣ１の固体をＴＦＡに溶解させ、室温で８時間反応させた。反応後溶媒を留去し、ポリマーＦ１の乾固物を得た。
＜５．ポリマー末端のＳＨ基への置換（Ｓｔｅｐ＿４）＞
Ｓｔｅｐ＿３により得られたポリマーＦ１を５０ｍｇ／ｍＬとなるよう水に溶解させ、当該ポリマーに対し３０倍モル量のエタノールアミンと、当該ポリマーに対し等モル量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）とを加え、室温で１時間反応させた。溶媒留去後、得られた固体をメタノールに溶解させ、テトラヒドロフランに投入し、得られた沈殿物を回収した。さらに、得られた沈殿物を水に溶解させた水溶液を作成し、半透膜で作られた袋に充填した。得られた水溶液の入った袋を、大過剰の水に浸漬することで透析による不純物の除去を行った。透析後、半透膜で作られた袋中の水溶液を凍結乾燥により乾燥させ、ポリマーＥ１の固体を得た。
得られたポリマーをＮＭＲ分光法により分析した結果、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率は８対２（ＣＢＭＡ１／ＣＢＭＡ３＝８／２）であった。分析条件は下記の条件で行った。
測定装置：ブルカーバイオスピン株式会社 ＡＤＶＡＮＣＥＩＩＩ ＨＤ ４００型
測定条件：溶媒：重水
温度：３０℃
基準：Ｈ２Ｏピークを４．７０ｐｐｍとする
積算：３００回
ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３の比率の算出方法：
ＣＢＭＡ１ユニットにおける四級アミンのメチル基についたプロトンに由来する３．３０ｐｐｍ～３．３５ｐｐｍのピーク面積と、ＣＢＭＡ３ユニットにおける四級アミンのメチル基についたプロトンに由来する３．２０ｐｐｍ～３．２５ｐｐｍのピーク面積との比率からＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率を算出した。
〔実施例４〕ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が６対４であるポリマー（共重合体）の調製
「２．ポリマーＡ１と化合物Ｂ１との反応（Ｓｔｅｐ＿１）」において、化合物Ｂ１の添加量を２ｍｍｏｌに変更し、「３．化合物Ｂ２との反応（Ｓｔｅｐ＿２）」において、化合物Ｂ２の添加量を３．５ｍｍｏｌに変更した以外は、実施例３と同じ合成スキームに従って、共重合体（ポリマーＥ１）を調製した。得られたポリマーをＮＭＲ分光法により分析した結果、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率は６対４（ＣＢＭＡ１／ＣＢＭＡ３＝６／４）であった。
〔実施例５〕共重合体の重合度と非特異的吸着量との関係
ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との共重合体であって、ＣＢＭＡ１とＣＢＭＡ３との比率が８対２である共重合体（共重合体Ｅと総称する）の重合度と非特異的吸着量との関係を調べた。具体的には、重合度の異なる共重合体Ｅからなる高分子膜を検体である尿と接触させ、当該高分子膜への尿成分の非特異的吸着量を下記条件により測定した。
測定装置：ＧＥヘルスケア社製 Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００
測定条件：ランニング緩衝液：ＨＢＳ－Ｐ
温度：２５℃
流速：１０ｕＬ／分
検体接触時間：９分(検体注入量 ９０ｕＬ)
表面にポリマー膜を形成させたＳＰＲチップを用い、検体注入後９分間ランニング緩衝液を流した後のＳＰＲ信号値と、検体注入前のＳＰＲ信号値との差分を非特異的吸着量とした。
ポリマー膜を形成させたＳＰＲチップの作成条件：ＳＩＡ ｋｉｔ Ａｕ（ＧＥヘルスケア社製）をピラニア溶液で洗浄後、ポリマーを濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した５０％メタノール溶液に１８時間浸漬し、ポリマー膜を形成させた。その後、チップをｍｉｌｌｉ－Ｑで洗浄し、窒素流にて乾燥させた。
図６にその結果を示す。図６に示すように、共重合体Ｅの重合度が高まるのに伴って、尿成分の非特異的吸着量が減少した。この結果から、本実施例の共重合体Ｅからなる高分子膜の非特異的吸着量を低減するためには、共重合体Ｅの重合度を高めればよいことが明らかとなった。
〔実施例６〕共重合体中のＣＢＭＡ１の割合と抗体固定化量または血清非特異的吸着量との関係
以下の４つの重合体を用いて、共重合体中のＣＢＭＡ１の割合と抗体固定化量または血清に含まれる成分の非特異的吸着量（血清非特異的吸着量）との関係を評価した。４つの重合体の重合度はそれぞれ２００である。
（１）ＣＢＭＡ１のホモポリマー（ＣＢＭＡ１の割合が１００％）
（２）ＣＢＭＡ３のホモポリマー（ＣＢＭＡ１の割合が０％）
（３）実施例４で調製した共重合体Ｅ（ＣＢＭＡ１の割合が６０％）
（４）実施例５で使用した共重合体（ＣＢＭＡ１の割合が８０％）
抗体固定化量は、ＳＰＲ装置によって測定した。また、検体を尿から血清に変更する以外は実施例５と同様の手順で血清非特異的吸着量を測定した。
測定装置：ＧＥヘルスケア社製 Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００
測定条件：ランニング緩衝液：ＨＢＳ－Ｐ
温度：２５℃
流速：１０ｕＬ／分
抗体溶液接触時間：９分(抗体溶液注入量 ９０ｕＬ)
表面にポリマー膜を形成させた後、活性化処理を行ったＳＰＲチップを用い、抗体注入後、０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ＝９）を１５分流した後のＳＰＲ信号値と、抗体溶液注入前のＳＰＲ信号値との差分を抗体固定化量とした。
・ポリマー膜を形成させたＳＰＲチップの作成条件：ＳＩＡ ｋｉｔ Ａｕ（ＧＥヘルスケア社製）をピラニア溶液で洗浄後、ポリマーを濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解した５０％メタノール溶液に１８時間浸漬し、ポリマー膜を形成させた。その後、チップをｍｉｌｌｉ－Ｑで洗浄し、窒素流にて乾燥させた。
・活性化処理条件：ポリマー膜を形成したＳＰＲチップに、０．２ｍｏｌ／Ｌ ＮＨＳ、０．３ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＣ・ＨＣｌ、３７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ混合溶液を滴下し、１０分間活性化処理した。１０分後、この溶液を除去しｍｉｌｌｉ－Ｑで２０秒洗浄し、窒素流にて乾燥させた。
各重合体の抗体固定化量の測定結果を図７、血清非特異的吸着量の測定結果を図８に示す。また、表３は実施例６の結果をまとめた表である。
Figure 0007333462000022
表３中、「ＣＢＭＡ１の割合」は、重合体に含まれるＣＢＭＡ１の割合を示す。各評価項目は以下のように基準を設定した。
＜抗体固定化量の評価基準＞
Ａ：抗体固定化量が高い（１０００ＲＵ超）。
Ｂ：測定装置または測定用担体の高分子膜の使用に十分な抗体固定化量である（２５０～１０００ＲＵ）。
Ｃ：測定装置または測定用担体の高分子膜の使用には適さない抗体固定化量である（２５０ＲＵ未満）。
＜血清非特異的吸着量の評価基準＞
Ａ：血清非特異的吸着量が低い（８００ＲＵ未満）。
Ｂ：測定装置または測定用担体の高分子膜の使用に許容される血清非特異吸着量である（８００～１３００ＲＵ）。
Ｃ：血清非特異的吸着量が多い（１３００ＲＵ超）。
＜総合評価＞
Ａ：「抗体固定化量」または「血清非特異的吸着量」の評価項目に「Ｃ」が存在せず、測定装置または測定用担体の高分子膜への使用として適する。
Ｂ：「抗体固定化量」または「血清非特異的吸着量」の評価項目に「Ｃ」が存在し、測定装置または測定用担体の高分子膜への使用として適さない。
ＣＢＭＡ１の割合が６０％の重合体およびＣＢＭＡ１の割合が８０％の重合体は、表３に示すように総合評価がＡとなり、測定装置または測定用担体の高分子膜への使用として適することが分かった。
一方、ＣＢＭＡ１のホモポリマー（ＣＢＭＡ１の割合が１００％の重合体）は、血清非特異的吸着量は低減されていた一方、抗体固定化量が低く、総合評価がＢとなった。また、ＣＢＭＡ３のホモポリマー（ＣＢＭＡ１の割合が０％の重合体）は、抗体固定化量が高かった一方、血清非特異的吸着量が多く、総合評価がＢとなった。
以上の実施例から、上記式（１）で表される第１構造単位および上記式（２）で表される第２構造単位を含む共重合体によれば、高い化学的安定性を有する。よって、従来材料と比較して、より取り扱い易く、かつ、検体に含まれる測定対象物質と相互作用する物質を固定できる高分子膜を製造できることが示された。
本開示は、高分子膜が形成された検出部を備える測定装置、測定用プレートに利用することができる。
１ 高分子膜
２ センサ
３ ポリマー
４ 第２物質
５ 第１物質
６ 制御装置
１１ 測定用担体
１２ 測定基板
２１ 外部端子
２２ 基板
２３ 検出部
２４ 参照部
２５ａ 第１ＩＤＴ電極
２５ｂ 第２ＩＤＴ電極
２６ 流路部材
２７ 供給口
２８ 排出口
３１ 検出領域
３２ 非検出領域
１００ 測定装置

Claims (8)

  1. 下記式（１）で表される第１構造単位および下記式（２）で表される第２構造単位を含み、
    （式（１）中、
    Ｒ１は水素原子またはメチル基である。
    Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
    ｘ１は１～４の整数である。）
    （式（２）中、
    Ｒ４は水素原子またはメチル基である。
    Ｒ５およびＲ６は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
    ｘ２は１～４の整数であり、ｙは３～７の整数である。）
    前記共重合体に含まれる前記第１構造単位の割合は、５０モル％以上９５モル％以下であり、
    前記共重合体に含まれる前記第２構造単位の割合は、５モル％以上５０モル％以下である、共重合体。
  2. 前記共重合体に含まれる前記第１構造単位および前記第２構造単位の合計の含有割合が８０モル％以上である、請求項１に記載の共重合体。
  3. 前記共重合体に含まれる前記第１構造単位に対する前記第２構造単位のモル比（第２構造単位／第１構造単位）が１以下である、請求項１または２に記載の共重合体。
  4. 下記式（３）で表される第３構造単位をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の共重合体。
    （式（３）中、
    Ｒ７は水素原子またはメチル基である。
    Ｒ８およびＲ９は各々独立して炭素数１～４のアルキル基である。
    ｚは１～４の整数である。）
  5. 前記共重合体の少なくとも一方の末端が、チオール基またはジチオエステル基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の共重合体。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載の共重合体を含む高分子膜を備える測定装置。
  7. 請求項１～５のいずれかに記載の共重合体を含む高分子膜を備える測定用担体。
  8. 下記式（１）で表される第１構造単位および下記式（２）で表される第２構造単位を含む共重合体の製造方法であって、
    （式（１）中、
    Ｒ１は水素原子またはメチル基である。
    Ｒ２およびＲ３は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
    ｘ１は１～４の整数である。）
    （式（２）中、
    Ｒ４は水素原子またはメチル基である。
    Ｒ５およびＲ６は各々独立して水素原子または炭素数１～４のアルキル基である。
    ｘ２は１～４の整数であり、ｙは３～７の整数である。）
    下記式（３）で表される構造単位を含む重合体を、下記式（４）で表される化合物と式（５）で表される化合物と反応させる工程を含み、
    （式（３）中、
    Ｒ７は水素原子またはメチル基である。
    Ｒ８およびＲ９は各々独立して炭素数１～４のアルキル基である。
    ｚは１～４の整数である。）
    （式（４）中、ｙは３～７の整数である。）
    前記工程が、前記式（３）で表される構造単位を含む重合体を、前記式（４）で表される化合物と反応させてから、前記式（５）で表される化合物と反応させる工程であり、
    前記共重合体に含まれる前記第１構造単位の割合は、５０モル％以上９５モル％以下であり、
    前記共重合体に含まれる前記第２構造単位の割合は、５モル％以上５０モル％以下である、共重合体の製造方法。
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