JPS6339909A - 分散重合体およびそれらの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分散重合体、それらの製造方法およびそれら
の使用に関する。本発明の分散重合体は、ビニル単量体
（そのうちの一つは、Ｎ−アルキルベタインアクリルア
ミド化合物またはＮ−アルキルベタインアクリルエステ
ル、または対応するメタクリル酸のベタイン構造を有す
る誘導体である）の共重合体が外層に形成されたラテッ
クス粒子で構成されている。これより、本発明のラテッ
クスの表面にあるアルデヒド基に由来する反応性基に遊
離アミノ基を有する低分子量または高分子量の生物活性
物質を結合することにより生物活性分散重合体が得られ
る。これらの生物活性ラテックス接合体（フンシュゲー
ト）は、血清学的または免疫学的アッセイに本質的に適
している。

血清学的または免疫学的アッセイの感度を、適宜の免疫
学的試薬を担持する担体粒子を用いることにより増大さ
せることができることは知られている。使用できる生物
学的担体材料例は、赤血球または細胞培養で得られる細
胞である。直径０．０２〜５μｍのラテックス粒子もま
た同じ目的に用いられる。

更に、芯体（コア）／外殻（シェル）を有する重合体ラ
テックスの場合に、免疫学的アッセイのために生物活性
物質を共有結合的に固定化するのに適しかつ好ましいの
は強イオン性の性質をもたない親水性成分であることが
知られている（欧州特許出願第６５０６９号参照）。

欧州特許出願第８０６１４号はアミド基を介して結合さ
れたアセタール基を含むラテックス粒子を開示している
。水性媒質中で予め調製されたラテックス芯体を、まず
、アミド基を介して結合されたアセタール基を含むビニ
ル単量体で杉潤させ、次いでこれらビニル単量体（それ
らは十分非水溶でなければならない）を、現水性または
イオン性であってよい他の単量体と共重合させるという
ものである。このタイプの試薬は、例えば、ネフェロ計
測定または濁度測定によるＣ−反応性タンパクの測定に
用いることができる。この場合、血清検体に緩衝液で高
度に（通常１：１００）希釈され、それによってさもな
ければ誤った陽性あるいは誤った陰性結果を与えるであ
ろう干渉性血清タンパクは無視できるようになる。

一般に、この手順は、診断検査に利用できる検体の被分
析物質、すなわち例えばＣ−反応性タンパクの濃度が５
１１ｆ／を以上のときに用いることができる。しかしな
がら、１μｙ／ｌ〜５０μＥｌ／ｌの範囲の微量タンパ
ク濃度を測定しようとする場合、検体の４１！ｍ液希釈
はさほどに高くすべきではない。

何故なら、そのようにしないと検出されるべきタンパク
混合物の濃度が低くなり過ぎて検出感度が不十分となる
からである。

しかしながら従来技術のラテックス調製物の場合には検
出感度を上げることは容易には可能ではなく、また、例
えばミオグロビンおよびその他の物質の測定に対しては
十分な機能的アッセイが得られる。

感度を増加しようとすると、比較的短時間で基準曲線測
定のためのシグナルが非特異的に増加してしまい、その
ために評価がもはや不可能になってしまう。その理由は
、被分析物質の共存なしに、このタイプの不安定試薬中
の個々の粒子が凝集しあい、そのために散乱光シグナル
または吸光度が増加してしまうからである。

今般、驚くべきことに、予め調製されたラテックス芯体
を水性媒質中で、アミド基を介して結合したアセタール
基を含むアクリルまたはメタクリル単量体およびベタイ
ン様構造要素を有するアクリルまたはメタクリル単量体
と共に共重合させることによって使用担体粒子を調製し
ておけば、前述の従来技術の欠点を克服できることを見
出した。

すなわち、本発明は、式Ｉ 〔式中、ｎは１〜６；Ｒ１はＨまたはＣＨ３、そしてお
よび２は（ＣＨ２）ｐ−”’であり、そしてｐは１〜３
であり、またＸ、Ｙおよび２は同一かまたは異なる）で
ある〕 で示される末端アセタールを有する単量体、および式■ 〔式中、ＲはＨまたはＣＨ３、ｘは−ＭＨまたは一〇、
Ｙは５ｏ３−またはｃｏｏ−１２は−（ｃｕ２）ｋ−％
（（ＣＨ２）、−１り２−はＨまたは１〜３Ｃ−アルキ
ル）、１は０〜６、ｂは０〜１、Ｃは１〜１２である〕 −で示される単量体から調製された共重合体が表面に存
在するラテックスから構成される担体粒子を水性媒質中
に含む分散液に関する。

本発明の分散液（またはラテックス）は、単量体から既
知の方法により単独−または共重合体として得ることの
できる通常の慣用ラテックス粒子をシード（■・ｄ）分
散液として共重合を行うことにより調製することができ
る。

本発明の分散液のためのシード分散液として用　　゛い
られるラテックスは非フイルム形成性重合体とすべきで
ある。「非フイルム形成性」重合体ラテックス粒子とは
、この文脈において適用される使用条件下にフィルムを
形成することなく、また合体することのないものである
と理解される。炭素環式芳香族モノビニリデン単量体例
えばスチレン、ビニルトルエンおよびビニルナフタレン
などのほか、これらの単量体相互の混合物および／また
はこれらの単量体とメチルメタクリレートおよびアクリ
ロニトリルとの混合物から構成される重合体が好ましい
。特に好ましいシード分散液はポリスチレンラテックス
である。

基本的に、粒子直径０．０２〜２μｍ１好ましくは０．
０５〜０．５μｍの予め調製されたラテックスを、ラテ
ックス表面の最大単分子被覆に必要な量の約２０〜８０
％の乳化剤と混合することにより調製される。

ラテックス表面の最大被嚢を生じる乳化剤量を決めるた
めの測定は、表面張力計を用いて行われる。それらは例
えば、工、Ｐｈｒｍａおよび８．−Ｒ。

Ｃｈｅｗ　、　ｔｈ＠、Ｔｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏ１
１ｏｉｌ　ａｎＬ工ｎｔｅｒｆａｏｅＳｏｉｅｎａｅ、
　Ｔｏｌ、　７４　（１９７９）、　９０〜１０２頁に
発表され、そしてＳ、　Ｈ，Ｍａｒｏｎ、　Ｍ、　１．
１ｌｅｒおよび工、１１ｆ。

Ｕｌｅｖｉｔａｈ、　ｔｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ
ａｔｉｏｎ　＆！Ｌ（Ｌ　Ｘｎｔｅｒ−ｆａａ＠５ｃｉ
ｅｎｃｅ、　Ｔｏｌ、　９　（１９５４）、　８９〜１
０４頁に初めて公表された。

適当な乳化剤例は、好ましくは１０〜２０個の炭素原子
を有する長鎖脂肪族アルコール、またはそのアルキル基
が好ましくは６〜１２個の炭素原子を有するアルキルフ
ェノール、またはそのアルキル基が好ましくは分枝した
各５〜１０１１１の炭素原子を有するアルキル基である
リアルキルフェノールまたはトリアルキルフェノールと
のポリグリコールエーテルである。これらの例としては
、エチレンオキサイドとラウリルアルコール、ステアリ
ルアルコール、オレイルアルコール、ココナツ脂肪アル
コール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、ジ−
イソプロピルフェノール、トリーイソプロピルフェノー
ル、ｖ　−ｔ　−ブチルフェノールおよびトリーｔ−ブ
チルフェノールとの反応生成物が挙げられる。エチレン
オキサイドとポリプロピレングリコールまたはポリブチ
レングリフールとの反応生成物も同様に適している。

イオン性乳化剤のうちでも、陰イオン性乳化剤が特に適
し、殊に、アルキルスルホネート、アリールサルフェー
トまたはアルキルアリールスルホネートの、および所僅
により特定の炭化水素基と陰イオン基の間にオキシエチ
レン単位を有する適当なサルフェート、ホスフェートま
たはホスホネートのアルカリ金属またはアンモニウム塩
が適している。これらの列としては、ナトリウムドデシ
ルサルフェート、ナトリウムラウリルサルフェート、ナ
トリウムオクチルフェノールグリコールエーテルサル７
エート、ナトリウムドデシルベンゼンスルホネート、ナ
トリウムラウリルジグリコールサルフェート、アンモニ
ウムトリー七−プチルフェノールはンタグリコールサル
フエートおよびアンモニウムトリーｔ−ブチルフェノー
ルオクタグリコールサルフェートなどが挙げられる。ナ
トリウムドデシルサルフェートを用いるのが好ましい。

重合は、ラジカル形成性開始剤、例えばＲルオΦシト化
合物または脂肪族アゾ化合物の存在下に、自体知られた
方法により行われる。

使用されるべき開始剤は、水溶性であるのが好ましく、
またそれは、（単量体総量に墓づき）α０５〜１０重ｆ
ｆｉ％、好ましくは０．１〜３重量％の量で用いられる
。既知のラジカル形成性開始剤としては例えば、過酸化
水素、イルオキシジ硫酸の、またははルオキシジ燐酸の
アルカリ金属またはアンモニウム塩、例えばイルオキシ
ジ硫酸ナトリウム、イルオキシジ硫酸カリウム、および
はルオキシジ硫酸アンモニウムなどのほか、アルキルヒ
ドロはルオキシド例えばｔ−ブチルヒドロペルオキシド
、ジアルキルはルオキシド例えばり−ｔ−ブチルはルオ
キシド、ジアシルはルオキシド例えばジアセチルはルオ
キシド、リラウロイルはルオキシドおよびジベンゾイル
ペルオキシド、およびアゾジイソブチ四ニトリル、アゾ
ジカルボナミドおよびアゾーｒ、ｒ’−ビス（４−シア
ノ官軍ａｌ）などが挙げられる。イルオキシジ硫酸のア
ルカリ金属またはアンモニウム塩、例えばはルオキシジ
硫酸ナトリウム、カリウムおよびアンモニウムなどを用
いるのが好ましい。

開始剤は、適切な場合には、還元剤、特に還元作用を有
する含硫黄酸のアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属
塩と共に用いられる。適切かつ好ましいのは、亜硫酸塩
、重亜硫酸塩、ピ田亜硫酸塩、亜ニチオン酸塩、チオ硫
酸塩およびホルムアルデヒドスルホキシレートである。

更に、グルコースおよびアスコルビン酸を用いることも
可能である。。

ベタイン構造基を含む式■の単量体およびアセタール基
を含む式■の単量体、そして適切な場合には、更なる成
分例えばスチレン、ビニルナフタレンまたはビニルトル
エンおよびメタクリル酸、アクリル酸またはクロトン酸
より成る単量体混合物を、乳化剤およびラジカル開始剤
を含む攪拌シード分散液に滴加する。分散液の温度は、
＋１００〜＋１２０℃、好ましくは＋５０〜＋９０℃で
ある。

ベタイン構造基を含む単量体として適しているのは、式
■のベタイン、および非脂肪族窒素塩基に由来するその
他の重合性のビニルまたはアリルベタイン、例えば１−
（３−スルホプロピル）−２−ビニルピリジニウムベタ
インなどである。Ｎ−（３−スルホプロピル）　−Ｎ、
Ｎ−ジアルキル−Ｎ−アルキルアクリル酸またはメタク
リル化合物を用いるのが好ましい。

Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクリルオキシエ
チル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウムベタインおよびＮ
−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクリルアミドプロ
ピル−Ｈ２Ｎ−ジメチルアンモニウムベタインが特に好
ましい。

式Ｉの化合物はアセタール基を含む単量体として用いら
れ、そしてＮ　−（２−ジアルコキシエチル）−アクリ
ルアミドまたは−メタクリルアミド（ここでアルキル＝
０１〜ＣＢ　）を用いるのが好ましい。Ｎ−（２−ジ−
ｎ−ペントキシエチル）−アクリルアミドまたは−メタ
クリルアミドが特に好ましい。

式■および■の単１体は、混合物としてシード分散液に
添加されるが、その単量体混合物は、１０〜９０重量％
、好ましくは２５〜７０重量％の量の式■のベタイン、
および９０〜１０重量％、好ましくは７０〜２５重置％
の量の式Ｉのアセタール化合物より成る。

（全混合物に基づき）ｓｏｏｎ％までのスチレン、ビニ
ルナフタレンまたはビニルトルエンを単量体混合物に添
加してもよい。更にまた、単量体混合物は、適切な場合
にはその外に、（全混合物に基づき）３０重ｆｆｉ％ま
でのメタクリル酸、アクリル酸またはクロトン酸を含ん
でいてもよい。

（全混合物に基づき）９０重ｆｆｉ％までのジメチルホ
ルムアミドまたはその他の粘度を低下させる適当な物質
を単量体から成る混合物に添加するのが有利である。水
性乳化剤溶液を添加することにより単量体混合物から乳
濁液を形成するのが特に有利である。この文脈において
、（全混合物に基づき）９０重ｆｆｉ％までの水性乳化
剤溶液（これは２重ｆｆｉ％までの乳化剤を含む）を添
加することができる。適当な乳化剤は、既に記述したと
ころである。

単量体混合物は、シード分散液および単量体混合物の総
量に基づき９０〜５重量％、好まししは４０〜１０重量
％の量でシード分散液に添加される。

シード重合は本質的に常法により行うことができる。し
かしながら本発明の方法の好ましい態様は、重合条件下
すなわち＋１０〜＋１２０℃、好ましくは＋５０〜＋９
０℃の温度でラテックス芯体の懸濁液に単量体混合物を
連続攪拌しながら滴下して加えることより成るメタリン
グ方法（ｍｅｔｓｒｒｉｎｇｐｒＯＱｔ１８８　）であ
る。

次いで、過剰の単量体、開始剤および乳化剤の残渣を既
知の方法により重合体から除去する。その重合体は例え
ばＮａＨＣＯ３緩衝液（０，０１〜０．０５　重量％）
に対して透析するのが有利である。

本発明による生物活性分散液（以下ラテックス接合体と
も称される）を調製するには、前述のシード重合ラテッ
クス粒子の懸濁液を５以下の、好ましくは３以下のｐｇ
に調節し、そして、結合されるべき免疫活性物質例えば
抗体または抗原とインキュベートする。タンパク上のア
ミノ基と本発明のラテックス粒子上の遊離アルデヒドと
の間の不安定な結合を既知の方法により還元する。ナト
リウムシアノボロハイドライドの中性緩衝液中の溶液を
この目的に用いるのが好ましい。すべての未結合免疫活
性物質またはその他の不純物を反応混合物から除去する
。これは遠心分離により、または適当な膜（メングレン
）上での洗浄により行うのが有利である。

本発明のシード重合ラテックスは、特に安定である点で
卓越している。それらは、特に感度のよい試薬の調製に
適しているが、これに対し既知の分散液、特に高検出感
度のものは比較的はんの短時間後に非特異的凝集を受け
やすい。

このため、ネフロ計測定または濁度測定による測定にお
いては、散乱光または吸光度シグナルの増加をきたす。

従って従来技術により調製された試薬の試薬ブランクは
数時間内に、固定時間濁度測定方法による測定がもはや
可能でなくなる程までに増大する。従来技術の試薬を様
々なＣＲＰ　９度で用いて得られる基準曲縁の変化を第
１図に示す。

図中曲線ａ）はその調製直後の試薬を用いて得られたも
のであり、また曲？ｆｓｂ）は、その試薬を３時間貯蔵
した後に得られたものである。本発明の試薬についての
対応する基準曲線を第３図に示す。従来技術により調製
された試薬とは対照的に、本発明による試薬は低い試薬
ブランクを示ししかも長時間にわたってそれが変わらな
い。

本発明のラテックス・試薬の顕著な安定性は、また、そ
の試薬を水性分散液の形で数ケ月（少くとも３ケ月）間
室温で貯蔵した後も、得られる試薬ブランクが実質的に
不変であり、また基準曲線が実質的に同一であるという
事実によつ【も示される。

従来技術により調製された試薬と比較した場合の本発明
の試薬のもう一つの長所は、更に、様々な患者血清を用
い【測定する場合ＶＣ１Ｎ！ｌ定値が血清マトリクスに
より実質的に影響されないという事実によっても示され
る。このことは、従来技術により例えばＣＲＦを測定す
る場合よりも相当に低い血清希釈液を測定に用いること
ができることを意味する。このことはまた、それを用い
れば、血清中のある種のタンパクについては相当な低濃
度を測定できることを意味する。第４図は、１００〜２
．５００μ９／Ｌの範囲で測定されたミオグロビンにつ
いての基準曲線を示し、また本発明試薬のこの長所を示
し【いる。

規定量の精製ミオグロビンを用いてスパイキングした様
々な患者の検体についての従来技術の試薬により得られ
た数値は異なっている（第１表参照）。第２表と比較す
れば、この点に関しても本発明によるラテックス試薬に
より顕著な改善の得られることがわかる。更に、干渉に
対する低い受容性は、本発明のラテックス試薬を用いた
場合の変動率の数値が低いことによって示される。

本発明によるラテックス調製物に例えば、す、Ｊ！−ゼ
、α−フェトプロティン（ＡｌＦＦ　）　、フェリチン
、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ　）　、免疫グロ
ブリンＥ１α１−ミクログロブリン、β２−ミクログロ
ブリンおよび妊娠持具β１−糖タンパク、ヒト絨毛ゴナ
トトロピン（β−ＨＣＧ　）に対する抗体などを担持さ
せることにより、相当する有利な性質をもった更なる本
発明の試薬が得られる。また、本発明の試薬の調製には
モノクローナル抗体を有利に用いることもできる。

同様にして、ラテックス調製物に細菌またはウィルスタ
ンパク例えばストレプトリジン０、ストレプトコッカス
Ｂ抗原、Ｈ，インフルエンザ抗原、ニューモフツカス（
ｐｎ＠ｕｍｏａｏｏｏｕｓ　）抗原１梅毒抗原、トキソ
プラズマ抗原、ＨＢ−ムｇ１風疹抗原、ヘルペス抗原お
よび破傷風抗原などを担持させ、そしてこれら本発明の
抗原担持試薬により相当する抗体を検出することができ
る。

最後に、本発明によるラテックス調製物に、誘導体化し
たハプテン、例えばホルモンまたは薬剤、例えばチロキ
シン（Ｔ４）、）リョードチロニン（Ｔ５）、フルチゾ
ール、−／ａゲステロン、テストステロン、ゲンタマイ
シンおよびジゴキシンなどを担持させることができ、そ
れによって阻害アッセイによりすなわち適当な抗体を同
時使用することにより前記ハプテンの濃度を測定できる
生物活性分散重合体すなわち本発明試薬が得られる。

本発明によるラテックス調製物は、調製が簡単であり、
また緩和な条件下に高感度免疫活性物質に結合して診断
試薬を与える。本発明による分散重合体、およびそれよ
り調製されるそれらの生物活性ラテックス、およびラテ
ックス接合体および試薬は、従来技術のそれらに比べ安
定している。

それらはマトリクス効果による干渉に対する感受性が無
く、またそれらを用いてネフロ計測定または濁度測定に
よる測定を行うと、従来技術に比べ、誤って陽性結果ま
たは誤って陰性結果を与えることが激減しほとんどなく
なる。ミオグロビン不含血清を精製ミオグロビンでドー
プした場合、本発明による試薬を用いて得られる数値は
、はとんど変わらず、また理論値に近い。

本発明のラテックス接合体は、粒度変化を測定するすべ
ての診断手順に用いることができ、例えば、肉眼的ラテ
ックス凝集アッセイによる諸物質の定性的および準定量
的測定に、および直接または競合的凝集アッセイまたは
ラテックスハプテン阻害アッセイにおける微量タン／（
りのネフロ計測定または濁度測定による測定に用いるこ
とができる。

実施例 １　シードとし【のポリスチレン芯体（シード重合体）
上でのＮ−（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクリルア
ミドプロピルーＭ、Ｍ−ジメチルアンモニウムベタイン
の重合 １ｔ１−のポリスチレンラテックス（固体含有率３６％
）、および６７．９−の蒸留水および５０ηのナトリウ
ムドデシルサルフェートを、気体導入管および気体導出
管および磁気撹拌棒を備えた円筒状ガラス容器に入れそ
して溶解するまで攪拌した。

多重的に排気し窒素を充填することにより不活性気体雰
囲気を重合容器に導入した。そのラテックス懸濁液混合
物を水浴中で連続攪拌しながら＋７０℃に加熱した。１
−のはルオキシジ硫酸カリウム溶液（蒸留水中１６ｗｑ
／ｄ　）を添加した。

０、４　ｄのスチレン、０．１５−のＮ−（２−ジーｎ
−はントキシエチル）−メタクリルアミド、０．０１−
のメタクリル酸、および０．３−のＮ−（３−スルホプ
ロピル）−Ｎ−メタクリルアミドプロピル−Ｎ−ジメチ
ルアンモニウムベタイン、および（これら単量体の溶解
度を向上するための）１−のりメチルホルムアミＦから
単量体混合物を調製した。

その単量体混合物を、激しく攪拌されたポリスチシンラ
テックス懸濁液に６０分間かけて徐々に滴加した。その
重合体混合物の温度は＋７０℃に保った。単量体を滴下
して加えた後、その混合物を前記温度で更に４時間攪拌
した。次いで、その分散液を室温まで冷却し、そしてひ
だ付きフィルタを通して一過した。７４−のラテックス
懸濁液が得られた。次に、これを重炭酸す）　ＩＪウム
緩割溶液（０，２５Ｊｉ’／　Ｌ、　ｐＨ８，０〜８．
２）に対して２０時間透析した。８８艷のラテックス懸
濁液（固体含有率４．５％）が得られた。

２、　ポリスチレン芯体上でのＮ−（３−スルホプロピ
ル）−Ｎ−メタクリルオキシエチル−Ｎ、Ｎ−ジメチル
アンモニウムベタインの重合重合は、実施例１と同様の
方法により行った。

１１．１−のポリスチレンラテックス（固体含有率３６
％）、および６７．９−の蒸留水および５０ηのナトリ
ウムドデシルサルフェートの混合物を調製した。これを
重合容器に入れ、そして実施例１と同様に、窒素芥囲気
で覆った。更に１−のはルオキシジ硫酸カリウム溶液（
蒸留水中１６ｇｑ／ｒＪ　）を添加し、そしてその混合
物を＋７０℃に加熱した。０．４−のスチレン、０．２
−のＮ−（２−ジ−ｎ−ペントキシエチル）−メタクリ
ルアミドおよび０．２１１１９のＮ−（３−スルホゾロ
ビル）−Ｎ−メタクリルオキシ−エチル−Ｎ、Ｎ−ジメ
チルアンモニウムベタイン、および０．４−のα１％強
度のナトリウムドデシルサルフェート溶液から水性乳濁
液を調製した。

この単量体の乳濁液を、激しく攪拌されたポリスチレン
ラテックス分散液に＋７０℃で６０分間かけて徐々に滴
下して加えた。次にその混合物を同じ温度に更に４時間
攪拌した。室温まで冷却し、そしてひだ付きフィルタを
通して濾過した後、７６−の重合体が得られた。次にそ
れを重炭酸す）　ＩＪウム緩衝液（０，２５１１／　Ｌ
ＳｌｌＨ８，０〜８．２）に対して２２時間透析した。

８１−のラテックス分散液（固体含有率５．１％）が得
られた。

３ａ）　　ラテックス重合体への抗−〇ＲＰ抗体の結合
実施例１における如＜Ｍ−Ｃ５−スルホプロピル）−Ｎ
−（メタクリルアミドプロピル−Ｍ、Ｈ−ジメチルアン
モニウムベタインを用いて調製された、あるいは実施例
２における如＜Ｎ−（３−スルホゾロビル）−Ｎ−メタ
クリルオキシエチル−Ｎ、Ｍ−ジメチルアンモニウムベ
タインを用いて調製された重合体に抗−〇ＲＰ抗体を結
合させた。

各々の場合に、使用重合体を蒸留水で、固体含有率が４
．５重量％となるように希釈した＠ウサギを精製ＣＲＰ
で免疫して得られた抗血清を既知の方法によるイオン交
換クロマトグラフィにより精製した。次にそれを濃縮し
てタンパク含量を７０ｑ／−とした。

２ｍの前記ラテックス重合体を０．０５７ｄの抗−ＣＲ
Ｐ抗体溶液と混合した。これにα０６ｄのＩＨＨＣＡを
添加してｐＨを約２とした。室温で３０分間インキュベ
ーションの後、０．５ｍの１Ｍホスフェート緩衝液（ｐ
Ｈ６，５）および０．５−の水性ナトリウムシアノボロ
ハイドライド溶液（２５ｑ／ｖ）を添加しそして十分混
合した。次にその混合物を室温で１時間インキエベート
した。この時間が経過後、その混合物を約ｓｏ、ｏｏｏ
ｘｙで２時間遠心分離した（　Ｂ＠ｅｋｍａｎｎ遠心分
離器、２０，０００ｒＩ）ｍ）ｏその上清を捨てた。残
留物を２ｄのグリシン／　Ｍ＆Ｃ２緩衝液（０，１Ｍ　
ＧｌＦ、　０．１７　Ｍ　）ｉａｃＡ　、　０．５％エ
ピコサオキシエチレンソルビタンラウレート（”Ｔｗｅ
ｅｎ　２０　）、ｐＨ８，２）に再懸濁した。次にその
懸濁液を３秒間超音波（Ｂｒｏｎｓｏｎ　Ｂ　１５型超
音波装！ｌり処理した。

３ｂ）　　血清検体中のＣＲＦ濃度の測定実施例３＆）
と同様にしてＪ［されたＣＲＰ　ｆ！Ａ定試薬を、４瓜
量外のＰ］ｅＧ　６０００を含むグリシン／ＮａＣｔ暖
衝液（０，１Ｍグリシン、α１７Ｍ　ＭａＣｌ、　　０
．５Ｍｍ％エイコサオキシエチレンソルビタンラウレー
）　（ＲＴｗｅｅｎ　２．０　）、ＰＨ８，２）を用い
【固体含有率が０．０２２５％となるまで希釈した。こ
のようにして得られたラテックス試薬を十分混合した後
使用待機状態とした。

使用標準は、（Ｅ＊ｈｒｉｎｇ　ｗ＠ｒｋｓ人Ｇ社製の
）ＬＮ−ＣＲＰ標阜とした。ノック内差入物によれば、
この標準血清は８．６ｑ／ｄのＣＲＰを含有する。この
標準を０．９％強度ＮｈＣＬ溶液で１：８０に希釈した
後、０．９％強度のＮａＣｔ溶液を用いて、段階的に倍
々希釈した。このようにして標準となる一連の暫減ひ濃
度が得られた。

測定にあたっては、患者血清をα９％強度ＮａＣ２溶液
中で１：１００に希釈し、そして２００μｔの患者血清
希釈液または標準血清希釈液を市販のキュベツト（５ａ
ｒａｔｅｄｔ　、　ａＫ６７７４２使用）中で使用待機
中の５００μｔのラテックス試薬と混合した。測定は、
］１ｐｐｅｎ＋１ｏｒｆ　１１０１　Ｍ光度計を用い３
３４　ｍｍで固定時間法による濁度測定原理によって行
われる。各キュベツトについてｔ１＝１５秒および’ｔ
２＝３００秒後の吸光度を測定した。標準白ｍ測定につ
いての基準曲線を両対数紙にプロットしそしてこの上で
患者血清の測定値を評価した。

第３図は典型的基準曲線を示す。

第１図は、調製直後（曲線ａ）および３時間貯蔵後（曲
線ｂ）に得られる従来技術の試薬を用いた、ＯＲＰ含有
血清についての基準曲線を示す。

従来技術の試薬を用いた場合の血清（１１ｏ。

希釈、２４ｒｔｖ／ｌ　ＣＲＰ含有）についての、ΔＯ
Ｄ測定値（光学密度差）の試薬調製後の時間に対する依
存性を第２図に示す。

４＆）　　ラテックス重合体への抗ミオグロビン抗体の
結合 実施例１における如＜Ｎ−（３−スルホプロピル）−Ｎ
−メタクリルアミドプロピル−Ｎ、Ｎ　−１メチルアン
モニウムベタインを用いて調製された、あるいは、実施
例２における如＜Ｍ−（５−スルホプロピル）−Ｎ−メ
タクリルオ中シヱチルーＮ、Ｎ−ジメチルアンモニウム
ベタインを用いて調製された重合体に抗ミオグロビン抗
体を結合した。

各場合に用いた重合体金固体含有率が４．５１１１％と
なるまで蒸留水で希釈した。ウサギを精製ミオグロビン
で免疫することにより得られた抗血清を既知の方法によ
るアフイニティクロマトグラフイによって＋１１　した
。次にそれを１０ｗｌ１／ｄのタンパク含量となるまで
濃縮した。

２−の前述のラテックス重合体を０．３５　ｍの抗ミオ
グロビン抗体溶液と混合した。これにα０６−のＩＮＨ
ＣＡｔ−添加してｐＨを約２とした。室温で３０分間イ
ンキュベーション後、０．５−の１Ｍホスフェート緩衝
液（ｐＨ６，５）および０．５４の水性ナトリウムシア
ノボロハイドライド溶液（２５η／−）を添加し、そし
て十分混合した。次にその混合物を室温で１時間インキ
ュベートした。この時間の経過後、その混合物を約ｓｏ
、ｏｏｏｘｙで２時間遠心分離した（　Ｂｅｏｋｍａｎ
ｎ遠心分離器、２０，０００ｒｐｍ　）　。その上清を
捨てた。

残留物を２−のグリシン／ｙｈｃｔ緩衝液（０，１ＭＧ
１７１０．１７Ｍ　ＮａＣＡ　、　０．５％エイフサオ
キシェチレ’／’／にビタンラウレート（”Ｔｖｅｅｎ
　２０　）、ｐａ８．２）に懸濁した。次いでその懸濁
液を３秒間超音波（Ｂｒｏｎｓｏｎ　Ｂ　１５超音波装
ｆｉ）処理した。

４′ｂ）血清検体中のミオグロビン濃度の測定実施例４
ａ）と同様に調製されたミオグロビン測定試薬を、Ｑ、
１７Ｍ　ＮｈＣＬ、　０．１創Ｉのオクチルフェノール
テトラコサエチレングリフールエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ
　Ｘ−４０５）および４重１％のＰＩＣＧ　６０００を
含む０．０５Ｍホスフェート侵出液（ｐＨ７，２）を用
いて固体含有率０．０２２５％となるまで希釈した。

このようにして得られたラテックス試薬を十分混合した
後使用待機状態とした。

測定にあたっては、ミオグロビンの０．９％強度Ｎ＆Ｃ
２溶液中の４．５％強度溶液（分光光度計により測定）
０．５５５−を９４４５−のミオグロビン不合人血清に
添加し、そして十分混合した。この血清をミオグロビン
標準として用い、そして更に１ミオグロビン不含人血清
を用いて段階的に倍々希釈した。このようにして標準と
なる一連の暫減ミオグロビン濃度を得た。標準血清をα
９％強度Ｈａ（’を溶液を用いて１：５希釈し、そして
２００μＬのその血清希釈液を市販のセミミクロキュベ
ツト中で５００μｔの使用待機状態のラテックス試薬と
混合した。測定はＫｐｐｅｎａｏｒｆ　１１０１　Ｍ光
度計を用いて３３４　ｎｍにおいて固定時間法による濁
度測定原理によって行った。各キュベツトについてｔ１
＝１５秒およびｔｚ＝３００秒後の吸光度を測定した。

標準血清測定についての基準曲線を両対数紙にプロット
した。典型的な基準曲線を第４図に示す。

第１表 平均　　＝１８３μ９／Ｌ＝９１％回収率実際の値＝２
００μ９／を 変動率　＝１９％ 各々２００μｆｉ／Ｌのミオグロビンでスノ擢イクしで
ある血清検体についての実施例４ｂ）の濁度測度アッセ
イにおける測定値。これらの測定は従来技ｉＫより調製
された試薬を用いて行った。

第２表 本発明による試薬を用いた濁度測定アッセイにおける測
定値 平均　　＝２２０μｇ／ｊ＝１１０％回収率実際の値＝
２００μｍ１／を 変動率　＝８．６％ 各々２００μｍ１／ｌのミオグロビンでスパイクした血
清検体についての実施例４）の潤度測定アッセイにおけ
る測定値。それらの測定は、本発明による試薬を用いて
行った。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来技術の試薬を用いたＣＲＰ含有血清につい
【の基準曲線を示す。 第２図は、従来技術の試薬を用いてＣＲＰ含有血清を測
定したときの、ΔＯＤ測定値（光学密度差）の試薬調製
後の時間に対する依存性を示す図である。 第３図は、本発明の試薬を用いたＣＲＰ含有血清につい
ての基準曲線を示す。 第４図は、本発明の試薬を用いたミオグロビン含有血清
についての基準曲線を示す。 特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名 箔１図 ΔＯＤ（Ｅ） ＵＰｇｚｚ　ＣＲＰ 第２区 躬３図 ΔＯＤ　［Ｅ） 濃度、Ｌｑ／ＪＩ　ＣＲＰ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）式 I ▲数式、化学式、表等があります▼式 I 〔式中、ｎは１〜６、Ｒ＿１はＨまたはＣＨ＿３、そし
   てＲ＿２およびＲ＿３は同一かまたは異なり、そして−
   （ＣＨ＿２）＿ｍ−ＣＨ＿３（ｍ＝０〜７）または▲数
   式、化学式、表等があります▼（Ｘ、ＹおよびＺは（Ｃ
   Ｈ＿２）＿ｐ−ＣＨ＿３であり、そしてｐは１〜３であ
   り、またＸ、ＹおよびＺは同一かまたは異なる）である
   〕 で示される単量体、および式II ▲数式、化学式、表等があります▼式II 〔式中、ＲはＨまたはＣＨ＿３、Ｘは−ＮＨまたは−Ｏ
   、ＹはＳＯ＿３＾−またはＣＯＯ＾−、Ｚは−（ＣＨ＿
   ２）＿ｋ−＾＋Ｎ〔（ＣＨ＿２）＿ｍ−Ｈ〕＿２−（ｋ
   ＝１〜１２、ｍ＝１〜６）、またはＺは▲数式、化学式
   、表等があります▼（Ｒ′＝Ｈまたは１〜３Ｃアルキル
   ）、ａは０〜６、ｂは０〜１、ｃは１〜１２である〕 で示される単量体から形成される共重合体がその表面に
   存在するラテックス粒子から構成される分散重合体。 ２）式 I の化合物と、式IIの化合物とより成る単量体
   混合物を水性媒質中シード分散液の存在下に重合させる
   ことにより得られる分散重合体。 ３）使用される式IIの単量体がＮ−（ω−スルオアルキ
   ル）−Ｎ−アクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキ
   ルアンモニウムベタイン、Ｎ−（ω−スルホアルキル）
   −Ｎ−メタクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−ジアルキル
   アンモニウムベタインまたは相当するＮ−（ω−カルボ
   キシアルキル）化合物である特許請求の範囲第１項記載
   の分散重合体。 ４）使用される式IIの単量体が次の化合物、すなわちＮ
   −（３−スルホプロピル）−Ｎ−メタクリルオキシエチ
   ル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ−（３
   −スルホプロピル）−Ｎ−メタクリルアミドプロピル−
   Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムベタインまたは相当する
   アクリル化合物のうちの少くとも一種である特許請求の
   範囲第１項記載の分散重合体。 ５）使用される式IIの単量体が、１−（３−スルホプロ
   ピル）−２−ビニルピリジニウムベタインである特許請
   求の範囲第１項記載の分散重合体。 ６）使用される式 I の単量体がＮ−（２−ジアルコキ
   シアルキル）−アクリルアミドまたは−メタクリルアミ
   ド（ここでアルキル＝Ｃ＿１〜Ｃ＿８）である特許請求
   の範囲第１項記載の分散重合体。 ７）使用される式 I の単量体がＮ−（２−ジ−ｎ−ペ
   ントキシエチル）−メタクリルアミドである特許請求の
   範囲第１項記載の分散重合体。 ８）乳化剤とラジカル開始剤を、０．０２〜２μｍの粒
   子直径を有するラテックスから構成されるシード分散液
   に添加し、次いで＋１０℃〜＋１２０℃の温度で撹拌し
   ながら、式IIの化合物と式 I の化合物を含む単量体混
   合物を単量体混合物を滴下して加えることより成る特許
   請求の範囲第１項記載の分散重合体の製造方法。 ９）単量体混合物が式IIの化合物として、Ｎ−（ω−ス
   ルホアルキル）−Ｎ−アクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ
   −ジアルキルアンモニウムベタイン、Ｎ−（ω−スルホ
   アルキル）−Ｎ−メタクリルアミドアルキル−Ｎ，Ｎ−
   ジアルキルアンモニウムベタインまたは相当するＮ−（
   ω−カルボキシアルキル）化合物を含み、また使用され
   る式 I の化合物がＮ−（２−ジアルコキシアルキル）
   −アクリルアミドまたは−メタクリルアミド（ここでア
   ルキルはＣ＿１〜Ｃ＿８）である特許請求の範囲第８項
   記載の方法。 １０）単量体混合物が式IIの化合物としてＮ−（３−ス
   ルホプロピル）−Ｎ−メタクリルオキシエチル−Ｎ，Ｎ
   −ジメチルアンモニウムベタイン、Ｎ−（３−スルホプ
   ロピル）−Ｎ−メタクリルアミドプロピル−Ｎ，Ｎ−ジ
   メチルアンモニウムベタインまたは相当するアクリル化
   合物を含み、そして使用される式 I の化合物がＮ−（
   ２−ジ−ｎ−ペントキシエチル）−アクリルアミドまた
   は−メタクリルアミドである特許請求の範囲第８項記載
   の方法。 １１）単量体混合物が化合物IIとして、１−（３−スル
   ホプロピル）−２−ビニルピリジニウムベタインを含み
   、そして使用される式 I の化合物がＮ−（２−ジ−ｎ
   −ペントキシエチル）−アクリルアミドまたは−メタク
   リルアミドである特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２）単量体混合物が全混合物を基準として５０重量％
   までのスチレン、ビニルナフタレンまたはビニルトルエ
   ンを付加的に含む特許請求の範囲第８項記載の方法。 １３）単量体混合物が、全混合物を基準として３０重量
   ％までのメタクリル酸、アクリル酸またはクロトン酸を
   付加的に含む特許請求の範囲第８項記載の方法。 １４）単量体混合物が、式 I およびIIの単量体および
   スチレン、ビニルナフタレンまたはビニルトルエンより
   成る群からの化合物、およびメタクリル酸、アクリル酸
   またはクロトン酸の化合物のうちの一種のほかに、全混
   合物を基準として９０重量％までのジメチルホルムアミ
   ドをも含む特許請求の範囲第８項記載の方法。 １５）単量体混合物が、式 I およびIIの単量体および
   スチレン、ビニルナフタレンまたはビニルトルエンより
   成る群からの化合物、およびメタクリル酸、アクリル酸
   またはクロトン酸の化合物のうちの一種のほかに、全混
   合物を基準として９０重量％までの、２％までの強度の
   水性乳化剤溶液をも含む特許請求の範囲第８項記載の方
   法。 １６）特許請求の範囲第１項記載の分散重合体に抗体、
   抗原、またはハプテンを結合して成る生物活性分散重合
   体。 １７）特許請求の範囲第１６項記載の生物活性分散重合
   体の抗原、抗体またはハプテンの診断検出のための使用
   。 １８）特許請求の範囲第１６項記載の生物活性分散重合
   体のネフロ計測定および濁度測定手順への、および粒子
   計数手順への使用。 １９）特許請求の範囲第１項記載の分散重合体およびそ
   れに結合した抗体、抗原またはハプテンを含む診断助剤
   。