CN110637232B - 测定试剂用胶乳粒子、致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定试剂 - Google Patents

测定试剂用胶乳粒子、致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及测定试剂用胶乳粒子，所述测定试剂用胶乳粒子的粒径的变异系数是10％以下、平均粒径是250～1000nm，所述胶乳粒子包含20重量％以上的折射率1.60以上的化合物，将所述胶乳粒子分散在超纯水中得到的固形成分浓度1重量％的分散液加入主体内径10.8mm的圆筒状10mL量筒中静置10天时的上清液深度为5mm以内。利用所述粒子，即使在测定被检物质的浓度稀薄的测定样品的情况，也能进行高灵敏度的测定。

Description

测定试剂用胶乳粒子、致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定 试剂
技术领域
本发明涉及一种即使在对被检物质的浓度稀薄的测定样品进行测定的情况下也能够实现高灵敏度的测定的测定试剂用胶乳粒子。另外，本发明还涉及使用了测定试剂用胶乳粒子的致敏胶乳粒子及免疫比浊法用测定试剂。
背景技术
在以临床检查为首的各种领域中，作为将测定试剂中的微量的被检物质定量的方法，广泛使用利用了抗原抗体反应的免疫学的测定法。其中，将胶乳粒子作为抗原或抗体的载体来使用的胶乳免疫比浊法操作简便，并且测定所需的时间短。因此，采用胶乳免疫比浊法作为测定方法的微量被检物质的种类在进一步增加。
对于基于胶乳免疫比浊法的测定样品中的抗原或抗体等被检物质的定量，可以通过在光学上检测因负载有抗原或抗体的胶乳粒子(以下也称作“致敏胶乳粒子”)的凝聚而产生的吸光度的变化来进行。该吸光度的变化是基于来自于因致敏胶乳粒子的凝聚而形成的凝聚块的表观粒径的变化而产生的。
以往，对于在胶乳免疫比浊法中作为载体来使用的胶乳粒子而言，由于抗原或抗体的致敏(固定化)容易、比较廉价、并且聚合反应也容易控制，因此一直使用着以聚苯乙烯作为主成分的聚苯乙烯系胶乳粒子(专利文献1等)。但是，在将聚苯乙烯系胶乳粒子作为胶乳免疫比浊法中的载体来使用的情况下，如果测定样品中的被检物质的浓度稀薄，则所形成的凝聚块的数目就会变少，另外，与被检物质的浓度相对于胶乳粒子数处于适当的范围时的情况相比，凝聚块的表观粒径也变小，因此，存在无法获得充分的灵敏度的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2003-005031号
专利文献2：日本特开2008-215816号
专利文献3：日本特开2001-296299号
专利文献4：国际公开第2012-133771号
发明概述
发明要解决的问题
作为提高灵敏度的方法，主要有两种。(1)第一是增大胶乳粒子的粒径。当粒径大时，吸光系数变大，因此即使为稀薄浓度，也变得容易检出凝集变化的差异。(2)第二是提高胶乳粒子的折射率，结果是提高了吸光系数。这是因为如果为相同粒径，则对折射率较高的胶乳粒子一方而言，其吸光系数较高，因此即使在较稀薄的环境中也能够维持检测灵敏度。
但是，对于(1)，如果胶乳粒子的粒径增得太大，则胶乳粒子在测定中沉降或在保存中沉到保存容器的底部，从而存在测定误差增大、显著损害存储稳定性的问题。
为了改善这一点，在专利文献2中提出了使用具有单孔中空结构的胶乳粒子的方法，尽管解决了沉降的问题，但是来自单孔中空结构的吸光系数低下，降低了检测的灵敏度，因此不能实现实质地提高灵敏度。对于(2)，例如，在专利文献3和4中提出了通过使用由高折射率材料构成的胶乳粒子来提高灵敏度的方法。但是，高折射率的材料通常比重大、粒子重量重，因此仅当粒径小于300nm时才能作为试剂实用化，在提高灵敏度方面存在限制。
本发明的目的是提供测定试剂用胶乳粒子，所述测定试剂用胶乳粒子即使在对被检物质的浓度稀薄的测定样品进行测定的情况下也能够实现高灵敏度的测定。
用于解决问题的方法
本发明者们深入研究的结果是发现了，通过降低含有折射率为1.6以上的化合物的胶乳粒子的比重，粒子沉降得到抑制。基于该见解，通过使用作为现有试剂不能实用化的大粒径范围的粒子，使吸光度大大提高，获得了即使在对被检物质的浓度稀薄的测定样品进行测定的情况下，也能实现高灵敏度的测定的测定试剂用胶乳粒子，从而完成了本发明。
本发明涉及以下内容。
[1]测定试剂用胶乳粒子，所述测定试剂用胶乳粒子的粒径的变异系数是10％以下、平均粒径是250～1000nm，所述胶乳粒子包含20重量％以上的折射率1.60以上的化合物，将所述胶乳粒子分散在超纯水中得到的固形成分浓度1重量％的分散液加入主体内径10.8mm的圆筒状10mL量筒中静置10天时的上清液深度为5mm以内。
[2]根据[1]所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述折射率1.60以上的化合物包含具有选自由芴骨架、二萘并噻吩骨架、萘骨架、蒽骨架、菲骨架、咔唑骨架组成的组中的至少1种骨架的化合物。
[3]根据[2]所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述折射率1.60以上的化合物是聚合性化合物。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述折射率1.60以上的化合物是聚合性化合物的聚合体。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述胶乳粒子包含10重量％以上的具有选自由苯基骨架、萘骨架、芴骨架、二萘并噻吩骨架、蒽骨架、菲骨架及咔唑骨架组成的组中的至少1种骨架的多官能聚合性化合物。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述胶乳粒子中的干燥粉体的比重低于1.17g/cm3。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，所述胶乳粒子中的吸光度低于下式(1)所示值且所低的程度不超过5％：
式(1)：吸光度＝3.28×粒径(μm)-0.28
[8]致敏胶乳粒子，其为在[1]～[7]中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子上负载有与被检物质特异性结合的物质。
[9]免疫比浊法用测定试剂，其中，[8]所述的致敏胶乳粒子分散在缓冲液中。
发明效果
根据本发明可以提供即使在对被检物质的浓度稀薄的测定样品，也能够实现高灵敏度的测定的测定试剂用胶乳粒子。本发明的测定试剂用胶乳粒子通过相对于现有的胶乳粒子降低比重而抑制了沉降，能够实现使用更大粒径的粒子，由此能够提高稀薄浓度范围中的被检物质的测定灵敏度。
附图简述
图1是表示吸光度的意义的图。
具体实施方式
以下例举实施方式对本发明进行说明，但本发明不限于以下的实施方式。
[测定试剂用胶乳粒子]
本发明涉及测定试剂用胶乳粒子，所述测定试剂用胶乳粒子的粒径变异系数(CV值)为10％以下、平均粒径为250～1000nm，包含20重量％以上的折射率1.60以上的化合物，将测定试剂用胶乳粒子分散在纯水中得到的胶乳粒子浓度1.0重量％的分散液加入主体内径10.8mm的圆筒状10mL量筒中于室温下静置10天时的上清液深度为5mm以内。另外，“上清液深度为5mm以内”是指上清液深度为0mm～5mm，其记载的是测定试剂用胶乳粒子在实用范围的沉降度的下限值。另外，“上清液”是指浊度在以原始值为100时变为了低于5％的状态，例如，能够通过使用分光光度计(日立制U-3900)测定利用移液管收集的上清液而确认。“超纯水”是指电阻值18.2MΩ·cm、TOC值5ppb以下的水。“超纯水”能够通过例如自来水直接连接型超纯水装置Milli-Q Integral MT仪器分析型(默克公司制)得到。
[粒子]
[聚合物胶乳]
作为本发明的试剂测定用胶乳粒子的一个形式，可以例举至少包含聚合性化合物的聚合体(以下也记载为“聚合体”)和折射率1.60以上的化合物(以下也记载为“高折射率化合物”)的胶乳粒子。
[聚合性化合物的聚合体]
本发明的试剂测定用胶乳粒子中包含的聚合体是一种或二种以上的聚合性化合物的聚合体，能够通过对包含上述聚合性化合物的组合物实施光照射或加热等聚合处理而获得。
聚合性化合物为1个分子中包含1个以上的聚合性官能团的化合物，可以是1个分子中包含1个聚合性官能团的单官能聚合性化合物，也可以是1个分子中包含2个以上的聚合性官能团的多官能聚合性化合物。另外，聚合性化合物可以是单体，也可以是低聚物或预聚物等多聚体。
上述聚合性化合物可以是一种单独的，也可以是二种以上以任意比例的组合。另外，在使用二种以上的聚合性化合物的情况，对二种以上的聚合性化合物的组合而言，可以是二种以上的单官能聚合性化合物的组合、二种以上的多官能聚合性化合物的组合、一种以上的单官能聚合性化合物与一种以上的多官能聚合性化合物的组合中的任一组合。
这些聚合体的分子量例如是80以上且50000以下，并无特别的限制。另外，本发明及本说明书中的分子量是指通过凝胶渗透色谱(GPC)用聚苯乙烯换算而测定的重均分子量。后述重均分子量是通过下述测定而测定的值。
GPC装置：GPC系统(岛津制作所公司制)
柱：K-804L(Shodex公司制)
洗脱液：四氢呋喃(THF)
[聚合性官能团]
聚合性官能团可以是自由基聚合性官能团、离子聚合性官能团、配位聚合性官能团，其中自由基聚合性官能团是优选的。从聚合反应的反应性观点来看，可例举：含乙烯型不饱和键的基团、环氧基、氧杂环丁烷基、羟甲基等聚合性基团，其中含乙烯型不饱和键的基团是更优选的。作为含乙烯型不饱和键的基团，可例举：(甲基)丙烯酰氧基、(甲基)丙烯酰基、乙烯基、苯乙烯基、烯丙基，其中(甲基)丙烯酰基、乙烯基、苯乙烯基是更优选的。另外，本发明及本说明书中使用的记载为“(甲基)丙烯酰基”是指丙烯酰基和甲基丙烯酰基中的至少一种的意思。“(甲基)丙烯酰氧基”、“(甲基)丙烯酸酯”、“(甲基)丙烯酰基”等也是同样的情况。关于多官能聚合性化合物，化合物中包含的聚合性基团的数量是1个分子中2个以上。
作为具有上述含乙烯型不饱和键的基团的单官能聚合性化合物的具体例子，没有特别的限制，可以例举例如：作为乙烯基化合物，苯乙烯、α-甲基苯乙烯、氯苯乙烯等苯乙烯系单体；1-乙烯基萘、2-乙烯基萘等萘系化合物；2-乙烯基蒽、9-乙烯基蒽等蒽基化合物；3-乙烯基菲、9-乙烯基菲等菲化合物；6-乙烯基二萘并噻吩、6-乙烯基醚二萘并噻吩等二萘并噻吩系化合物；9-乙烯基咔唑等咔唑化合物；甲基乙烯基醚、乙基乙烯基醚、丙基乙烯基醚等乙烯基醚化合物；乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、硬脂酸乙烯酯等酸乙烯酯化合物；氯乙烯、氟乙烯等含卤素的单体；作为(甲基)丙烯酰基化合物，(甲基)丙烯酸苄酯等芳香族(甲基)丙烯酸酯化合物；2-(1-萘基)(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸菲基(フエナンチル)酯、6-(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩、6-(甲基)丙烯酰氧基乙基二萘并噻吩等多环芳香族(甲基)丙烯酸酯化合物；(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸鲸蜡酯、(甲基)丙烯酸硬脂醇酯、(甲基)丙烯酸环己酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯等(甲基)丙烯酸烷基酯化合物；(甲基)丙烯酸2-羟乙酯、(甲基)丙烯酸甘油酯、聚氧乙烯(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯等含有氧原子的(甲基)丙烯酸酯化合物；(甲基)丙烯腈等含有腈的单体；(甲基)丙烯酸三氟甲酯、(甲基)丙烯酸五氟乙酯等含卤素的(甲基)丙烯酸酯化合物；作为α-烯烃化合物，二异丁烯、异丁烯、LINEALEN(リニアレン)、乙烯、丙烯等烯烃化合物；作为共轭二烯化合物，异戊二烯、丁二烯等。
作为具有上述含乙烯型不饱和键的基团的多官能聚合性化合物的具体例子，没有特别的限制，可例举例如：作为乙烯基化合物，二乙烯基苯、2，12-二乙烯基二萘并噻吩、3，11-二乙烯基二萘并噻吩、5，9-二乙烯基二萘并噻吩、2，12-二乙烯基氧基甲基二萘并噻吩、3，11-二乙烯基氧基二萘并噻吩、1，4-二乙烯基氧基丁烷、二乙烯基砜等的乙烯基系单体；作为(甲基)丙烯酰基化合物，2，12-二(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩、3，11-二(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩、四羟甲基甲烷四(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷三(甲基)丙烯酸酯、四羟甲基甲烷二(甲基)丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇六(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、三(甲基)丙烯酸甘油酯、二(甲基)丙烯酸甘油酯、(聚)乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、(聚)丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、(聚)丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1，4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、9，9-二(4-(甲基)丙烯酰氧基苯基)芴、9，9-二(4-(甲基)丙烯酰氧基甲氧基苯基)芴、9，9-二(4-(2-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基)苯基)芴；作为烯丙基化合物，三烯丙基(异)氰脲酸酯、偏苯三酸三烯丙酯、邻苯二甲酸二烯丙酯、二烯丙基丙烯酰胺、二烯丙基醚、9，9’-二(4-烯丙基氧基苯基)芴；作为聚硅氧烷化合物，四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、异丙基三甲氧基硅烷、异丁基三甲氧基硅烷、环己基三甲氧基硅烷、正己基三甲氧基硅烷、正辛基三乙氧基硅烷、正癸基三甲氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、二甲基二乙氧基硅烷、二异丙基二甲氧基硅烷、三甲氧基甲硅烷基苯乙烯、γ-(甲基)丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷、1，3-二乙烯基四甲基二硅氧烷、甲基苯基二甲氧基硅烷、二苯基二甲氧基硅烷等硅烷醇盐(Silane alkoxide)化合物；乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷、二甲氧基甲基乙烯基硅烷、二甲氧基乙基乙烯基硅烷、二乙氧基甲基乙烯基硅烷、二乙氧基乙基乙烯基硅烷、乙基甲基二乙烯基硅烷、甲基乙烯基二甲氧基硅烷、乙基乙烯基二甲氧基硅烷、甲基乙烯基二乙氧基硅烷、乙基乙烯基二乙氧基硅烷、对苯乙烯基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、3-甲基丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯氧基丙基三乙氧基硅烷、3-丙烯氧基丙基三甲氧基硅烷等含聚合性双键的硅烷烷氧化合物；十甲基环五硅氧烷等环状硅氧烷；单末端硅油、两末端硅油、侧链型硅油等改性(反应性)硅油；(甲基)丙烯酸、马来酸、无水马来酸等的含羧基的单体等。
这些当中，从不使折射率低下出发，可例举：苯乙烯、二乙烯基苯等芳香族乙烯基化合物；乙烯基萘、乙烯基蒽、乙烯基菲、乙烯基二萘并噻吩、乙烯基咔唑等多环芳香族乙烯基化合物；(甲基)丙烯酸苄酯、二(甲基)丙烯酸芴、(甲基)丙烯酸萘、(甲基)丙烯酸菲等具有芳香族或多环芳香族骨架的(甲基)丙烯酸酯。
在上述芳香族乙烯基化合物及多环芳香族乙烯基化合物中，作为芳香族环的取代基，可以例举：烷基、羟基、羧基、卤素基(例如氟基、氯基、溴基、碘基)等。作为上述烷基，可例举例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基-正丁基、2-甲基-正丁基、3-甲基-正丁基、1，1-二甲基-正丙基、1，2-二甲基-正丙基、2，2-二甲基-正丙基、1-乙基-正丙基、正己基、1-甲基-正戊基、2-甲基-正戊基、3-甲基-正戊基、4-甲基-正戊基、1，1-二甲基-正丁基、1，2-二甲基-正丁基、1，3-二甲基-正丁基、2，2-二甲基-正丁基、2，3-二甲基-正丁基、3，3-二甲基-正丁基、1-乙基-正丁基、2-乙基-正丁基、1，1，2-三甲基-正丙基、1，2，2-三甲基-正丙基、1-乙基-1-甲基-正丙基和1-乙基-2-甲基-正丙基等。另外，作为上述烷基也可以使用环状烷基、例如作为碳原子数为1～10的环状烷基，可以例举环丙基、环丁基、1-甲基-环丙基、2-甲基-环丙基、环戊基、1-甲基-环丁基、2-甲基-环丁基、3-甲基-环丁基、1，2-二甲基-环丙基、2，3-二甲基-环丙基、1-乙基-环丙基、2-乙基-环丙基、环己基、1-甲基-环戊基、2-甲基-环戊基、3-甲基-环戊基、1-乙基-环丁基、2-乙基-环丁基、3-乙基-环丁基、1，2-二甲基-环丁基、1，3-二甲基-环丁基、2，2-二甲基-环丁基、2，3-二甲基-环丁基、2，4-二甲基-环丁基、3，3-二甲基-环丁基、1-正丙基-环丙基、2-正丙基-环丙基、1-异丙基-环丙基、2-异丙基-环丙基、1，2，2-三甲基-环丙基、1，2，3-三甲基-环丙基、2，2，3-三甲基-环丙基、1-乙基-2-甲基-环丙基、2-乙基-1-甲基-环丙基、2-乙基-2-甲基-环丙基和2-乙基-3-甲基-环丙基等。
[折射率1.60以上的化合物]
本发明的试剂测定用胶乳粒子包含高折射率化合物(折射率1.60以上的化合物)。作为高折射率化合物，没有特别的限制，但优选为具有选自由芴骨架、二萘并噻吩骨架、萘骨架、蒽骨架、菲骨架、芘骨架、咔唑骨架组成的组中的至少1种骨架的化合物。作为优选的骨架的组合，可例举：芴骨架、二萘并噻吩骨架、萘骨架。
作为高折射率化合物的具体例子，可例举：芴、二萘并噻吩、萘、蒽、菲、咔唑等。其中，芴、二萘并噻吩、萘是优选的。
在高折射率化合物是具有聚合性官能团的聚合性化合物的情况，可以形成基于单一聚合的聚合体，也可以形成与其他聚合性化合物共聚合而成的聚合体。前述聚合性化合物作为其具体例，可例举：9，9-二(4-(甲基)丙烯酰氧基苯基)芴、9，9-二(4-(甲基)丙烯酰氧基甲氧基苯基)芴、9，9-二(4-(2-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基)苯基)芴、6-乙烯基二萘并噻吩、6-乙烯基醚二萘并噻吩、2，12-二乙烯基二萘并噻吩、3，11-二乙烯基二萘并噻吩、5，9-二乙烯基二萘并噻吩、2，12-二乙烯基氧基甲基二萘并噻吩、3，11-二乙烯基氧基二萘并噻吩、2，12-二(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩、3，11-二(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩、1-乙烯基萘、2-乙烯基萘、二乙烯基萘、萘基甲基丙烯酸酯等萘基化合物；2-乙烯基蒽、9-乙烯基蒽等蒽基化合物；乙烯基菲；乙烯基芘、正乙烯基咔唑。其中，具有选自由芴骨架、二萘并噻吩骨架、萘骨架组成的组中的至少一个骨架的化合物是优选的。
[高折射率化合物含有量]
高折射率化合物在试剂测定用胶乳中含有20重量％以上是优选的。当低于20重量％时，如后述那样，不能补偿试剂测定用胶乳的源自中空化的吸光度降低，存在灵敏度降低的情况。更优选为30重量％以上、进一步优选为50重量％以上。另外，对上限没有特别的限制，为96重量％以下。
[多孔中空结构]
本发明的试剂测定用胶乳粒子具有多孔中空结构，通过具有多孔中空结构，相对于不是多孔中空结构的胶乳粒子而言比重更轻。
多孔是指，当观察粒子截面时具有2个以上的中空结构，更优选具有5个以上、最优选为具有10个以上的中空结构。另外，中空结构可以是独立孔，也可以是联孔。具有多孔中空结构的粒子能够抑制沉降，提高试剂的重现性，并且与单孔结构相比，更抑制粒子的折射率降低，从而能够进行高灵敏度的测定。上述多孔中空结构的孔的直径为100nm以下是优选的，更优选为50nm以下，进一步优选为10nm以下。
作为孔的形态，可例举在胶乳粒子的表面上形成的凹凸形状，除此以外，还有形成胶乳粒子的聚合物链之间的空隙的形态、一起具有前者和后者的形态。
作为确认试剂测定用胶乳粒子的多孔中空结构的方法，可例举使用SEM(扫描型电子显微镜)和TEM(透射电子显微镜)的观察方法。在孔较小而难以观察的情况，可以例如通过上述记载的测定干燥粉体的比重来确认多孔中空结构。另外，在联孔的情况，由于粒子的比表面积变大，可以通过例如使用Quantachrome Instruments公司制“NOVA4200e”等测定BET比表面积来确认多孔中空结构。在这种情况，BET比表面积也变得比理论值6/ρD(ρ：密度、D：粒径)要大。优选为1.5倍以上，更优选为2倍以上，进一步优选为5倍以上。
作为其他确认多孔中空结构的方法，可例举利用由多孔中空结构所致表面积大这一试剂测定用胶乳粒子特征的方法。具体而言，在首先将具有多孔中空结构的胶乳粒子浸渍在给定的金属染料中后，测量通过烧制该胶乳粒子获得的残留金属重量。另外，对于具有与上述胶乳粒子同样的平均粒径等但不为多孔结构的胶乳粒子，也同样地测量残留金属重量。根据由此获得的各胶乳粒子的残留金属重量的差，能够确认多孔中空结构的存在。
另外，可例举在对试剂测定用胶乳粒子的多孔中空结构部分进行染色后，进行观察胶乳粒子的截面的方法。具体地，可以将试剂测定用胶乳粒子浸渍在给定的染料中，对多孔中空结构的孔部分染色后，包埋于环氧树脂中，并且用截面抛光机(Cross sectionpolisher)(JEOL社制IB-19520CCP)制作粒子截面，通过配备有高灵敏度YAG反射电子检测器的场发射扫描电镜FE-SEM(S-4800、株式会社日立High technology公司制)进行观察。
通常，当小粒径的胶乳粒子沉降或凝集在装有溶剂的容器的底部时，胶乳粒子彼此紧密填充，因此无论怎么搅拌溶剂，都难以使胶乳粒子再分散。但是，当由于聚合物链之间的空隙在胶乳粒子中形成多孔中空结构的情况下，由于胶乳粒子成为毛线球(毛糸球)状，因此胶乳粒子彼此缓慢地填充在一起。因此，即使当具有多孔中空结构的胶乳粒子沉降或凝集在装有溶剂的容器的底部时，也可以通过搅拌溶剂容易地使胶乳粒子再分散。
[交联材料]
为了使本发明的试剂测定用胶乳粒子易于维持多孔结构，优选其包含交联材料。作为上述交联材料，优选多官能聚合性化合物。
对上述多官能聚合性化合物没有特别的限制，可以使用上述的那些化合物，但是优选具有芳香族骨架或多环芳香族骨架的那些化合物，因为不会降低折射率。其中，更优选具有选自由苯基骨架、萘骨架、芴骨架、二萘并噻吩骨架、蒽骨架、菲骨架、芘骨架、咔唑骨架组成的组中的至少一种骨架的化合物。
作为上述多官能聚合性化合物，可以例举二乙烯基苯、二乙烯基萘、9，9-二(4-(甲基)丙烯酰氧基苯基)芴、9，9-二(4-(甲基)丙烯酰氧基甲氧基苯基)芴、9，9-二(4-(2-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基)苯基)芴、2，12-二乙烯基二萘并噻吩、3，11-二乙烯基二萘并噻吩、5，9-二乙烯基二萘并噻吩、2，12-二乙烯基氧基甲基二萘并噻吩、3，11-二乙烯基氧基二萘并噻吩、2，12-二(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩、3，11-二(甲基)丙烯酰氧基甲基二萘并噻吩等。
上述胶乳粒子优选含有基于多官能聚合性化合物的单独聚合体或者与其他聚合性单体的共聚合体。在为上述与其他聚合性单体的共聚合体的情况，从更容易维持多孔结构的观点出发，多官能聚合性化合物优选为5重量％以上，更优选为10重量％以上。
[制造方法]
对本发明的试剂测定用胶乳粒子的制造方法没有特别限制，可以使用乳液聚合法、微乳液聚合法(miniemulsion polymerization)、悬浮聚合法、微悬浮聚合法、无皂聚合法、种子法、液中干燥法、转相乳化法和它们的组合。
更具体地，作为含有高折射率化合物为20重量％以上的优选的方法，可例示以下方法：
(1)[乳化、悬浮聚合法]包括将聚合性化合物、高折射率化合物、聚合引发剂、能够溶解聚合性化合物、高折射率化合物这两者的疏水性溶剂混合，制备聚合性化合物溶液的步骤；将前述聚合性化合物溶液添加至溶解了表面活性剂、分散稳定剂的水溶液中之后，通过乳化、转相乳化、悬浊等形成液滴的步骤；通过加热等将聚合性化合物聚合的步骤；蒸馏出疏水性溶剂的步骤；通过过滤、分级等使粒径整齐的步骤的方法；
(2)[液中干燥法]包括将聚合体和高折射率化合物溶解在能够溶解这两者的疏水性溶剂中，制备疏水性溶液的步骤；将前述疏水性溶液在溶解了表面活性剂、分散稳定剂的水溶液中形成液滴的步骤；蒸馏出疏水性溶剂的步骤；通过过滤、分级等使粒径整齐的步骤的方法；
(3)[种子膨润法]包括在溶解了表面活性剂和/或分散稳定剂的水中分散由作为模板的单官能聚合性单体的聚合体组成的粒子(以下也记载为“种子粒子”)的步骤；添加在疏水性溶剂中溶解了高折射率化合物的疏水性溶液的步骤，其中，所述疏水性溶剂能够将种子粒子和高折射率化合物这两方增溶溶解；疏水性溶剂和高折射率化合物一起被吸收至前述粒子内的步骤；蒸馏出疏水性溶剂的步骤的方法；以及
(4)[种子膨润聚合法]包括在溶解有表面活性剂和/或分散稳定剂的水中分散种子粒子的步骤；添加疏水性溶液的步骤，所述疏水性溶液是在能够溶解种子粒子和高折射率化合物这两者的疏水性溶剂中溶解了高折射率化合物、聚合性化合物、聚合引发剂的疏水性溶液；使疏水性溶剂和高折射率化合物、聚合性化合物、聚合引发剂一起吸收至种子粒子内的步骤；通过加热等将聚合性化合物聚合的步骤：蒸馏出疏水性溶剂的步骤的方法。
由于通过使用粒径整齐的粒子作为种子粒子，使所获得的试剂测定用胶乳粒子的粒径整齐，能够使高折射率化合物的含量均匀，优选使用(3)、(4)的方法。进一步地，由于易于轻松地形成多孔结构，因此更优选使用(4)的方法。
[疏水性溶剂]
作为在前述(1)(2)(3)(4)的制备法中使用的疏水性溶剂，只要是能够溶解种子粒子或聚合性化合物、以及高折射率化合物的疏水性溶剂即可，并没有特别的限制，但溶解性参数(SP值)为10以下、由于随后要蒸馏出疏水性溶剂的原因，优选其沸点低于水。
具体地，可例举：乙酸乙酯(SP值：9.1、沸点：77.1℃)、苯(SP值：9.2、沸点：80.1℃)、二异丙醚(SP值：6.9、沸点：69℃)、氯仿(SP值：9.1、沸点：61.2℃)等。这些可以单独使用或两种以上组合使用。其中，优选乙酸乙酯。
SP值意指使用由冲津俊直在“粘合”，高分子刊行会，40卷8号(1996)p342-350中记载的冲津提供的各种原子团的ΔF、Δv值，根据下式(A)算出的溶解性参数δ。另外，在混合物、共聚合体的情况，SP值意指由下式(B)算出的溶解性参数δmix。
δ＝∑ΔF/∑Δv (A)
δmix＝Φ1δ1+Φ2δ2+……Φnδn (B)
式中，ΔF、Δv分别表示冲津提供的各种原子团的ΔF、摩尔容积Δv。Φ表示容积分数或摩尔分数，其中Φ1+Φ2+……Φn＝1。
对上述疏水性溶剂没有特别的限制，除了上述以外，还可例举例如：十二烷、癸烷、异十二烷、壬烷、正己醚、辛烷、异辛烷、环辛烷、二苯醚、己烷、丙基苯、邻二氯苯、乙苯、对二甲苯、甲苯、二乙醚、乙酸丁酯、四氯化碳、二氯甲烷、环己烷、庚烷等。上述疏水性溶剂使粒子膨润，发挥体积增大剂的作用。可以是不参与聚合，在聚合后通过液中干燥法等除去。在这种情况下，优选为沸点为100℃以下的环己烷。另外，在不除去而原样留在粒子内的情况，优选为在水中溶解性低、比重小的癸烷或庚烷等。
[种子粒子]
作为构成前述种子粒子的聚合物，只要是单官能聚合性化合物的聚合体即可，没有特别的限制，作为单官能聚合性化合物，可以使用前述的化合物。从尽可能维持胶乳粒子的折射率的观点出发，作为前述单官能聚合性化合物优选为由苯乙烯、1-乙烯基萘和(甲基)丙烯酸苄酯中的1种或2种以上组成的聚合体。
作为种子粒子的制造方法，能够使用乳液聚合、微乳液聚合、悬浮聚合、微悬浮聚合、无皂聚合、分散聚合等公知方法。其中，优选使用粒径控制性优异的无皂聚合。
作为无皂聚合中使用的聚合性引发剂，可以使用水溶性的过硫酸化物、过氧化物和偶氮化合物。具体而言，可例示：过硫酸钾、过硫酸铵、2，2′-偶氮二[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]、2，2′-偶氮二(2-甲基丙脒)、2，2′-偶氮二[N-(2-羧乙基)-2-甲基丙脒]、2，2′-偶氮二[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]、4，4′-偶氮二(4-氰基戊酸)、异丙苯氢过氧化物、过氧化氢叔丁基。
另外，对种子粒子的分子量而言，与上述“聚合性化合物的聚合体”条目下记载的同样地优选例如为80以上且50000以下。
作为种子粒子的粒径，优选为作为目标的测定试剂胶乳粒子粒径的10％～93％。当大于93％时，其无法含有必要量的高折射率化合物或多官能聚合性化合物，当小于10％时，其无法吸收特定量的高折射率化合物或多官能聚合性化合物，可能无法获得所要的粒径。
对制备上述种子粒子的方法没有特别的限定，能够使用公知的方法，但不使用乳化剂(表面活性剂)的无皂乳液聚合法是优选的。作为该乳液聚合法中使用的聚合引发剂，可例举：过硫酸钾、过硫酸铵等，优选为过硫酸钾。在本发明中，能够通过向反应容器中装入离子交换水、例如单体、聚合引发剂，一边搅拌一边将反应容器内置换为氮气后，于65℃～80℃进行反应12～42小时而制造。获得的粒子具有低CV值、优异的分散稳定性。
[种子聚合的引发剂]
作为在前述(1)及(4)的制造方法中使用的聚合引发剂，只要是能够在前述疏水性溶剂中溶解的非水溶性引发剂即可，没有特别的限定。具体地，可例举：过氧化苯甲酰、过氧化异丙苯新癸酸酯、过氧化六氢对苯二甲酸二叔丁酯、过氧新戊酸叔丁酯、1，1，3，3-四甲基丁基过氧化2-乙基己酸酯、过氧化异丙基碳酸叔丁酯、过氧化二碳酸二-2-乙基己基酯、二-α-异丙苯基过氧化物、过氧化苯甲酸叔丁酯、叔丁基-α-异丙苯基过氧化物、二叔丁基过氧化物、2，5-二甲基-2，5-二(叔丁基过氧基)己烷、2，5-二甲基-2，5-二(叔丁基过氧化)己炔-3、4，4-二叔丁基过氧戊酸正丁酯、1，1-二(叔丁基过氧)环己烷、过氧化新癸酸叔丁酯、过氧化二乙基乙酸叔丁酯、双(3，5，5-三甲基己酰基)过氧化物、叔丁基过氧化-3，5，5-三甲基己酸酯、叔丁基过氧化2-乙基己基碳酸酯、叔丁基过氧化新庚酸酯、2，2-二叔丁基过氧化丁烷、双(叔丁基二氧基异丙基)苯、二(4-叔丁基环己基)过氧化二碳酸酯、过氧化二苯甲酰、月桂酰过氧化物、甲乙酮过氧化物等过氧化物、2，2′-偶氮双(异丁腈)、2，2′-偶氮双(4-甲氧基-2，4-二甲基戊腈)、2，2′-偶氮双(2，4-二甲基戊腈)，2，2′-偶氮二(异丁酸甲酯)、2，2′-偶氮二(2-甲基丁腈)、1，1′-偶氮二(环己烷-1-腈)、2，2′-偶氮双(2-甲基丙酸)二甲基等偶氮化合物，优选为过氧化苯甲酰。
[测定试剂用胶乳粒子的平均粒径等]
本发明的测定试剂用胶乳粒子的平均粒径根据胶乳免疫比浊法的具体方法或所用的测定仪器的规格等适当地选择即可，然而优选的下限为0.25μm(250nm)、优选的上限是1μm(1000nm)。
如果平均粒径为0.25μm以下，则有时存在由凝聚造成的光学的变化量过小从而得不到测定所必要的灵敏度的情况。如果平均粒径超过1μm，则测定试剂中的被检物质为高浓度时由致敏胶乳粒子的凝聚造成的光学的变化量会超过光学测定仪器所能够测定的范围，因而会存在得不到与被检物质的量相对应的光学的变化量的情况。需要说明的是，“粒径”是使用贝克曼库尔特公司生产的粒度分布测量装置“LS 13 320”测定的体积统计值的平均粒径的值。较优选的下限是0.3μm(300nm)、较优选的上限是0.8μm(800nm)。进一步更优选的下限是0.35μm(350nm)、进一步更优选的上限是0.6μm(600nm)。
对本发明的测定试剂用胶乳粒子的粒径的变异系数(CV值)没有特别的限定，只要根据胶乳免疫比浊法的具体方法或所使用的测定仪器的规格等适当地选择即可，但优选为10％以下。如果CV值超过10％，则存在致敏胶乳粒子在制备时的制造重现性降低，测定试剂的性能(测定重现性)降低的情况。需要说明的是，上述粒径的变异系数可以对于从透射电子显微镜(TEM)图像获得的500个粒子通过以下(1)计算出。
式(1)：粒径的变异系数(CV值)＝粒径的标准偏差/平均粒径
在胶乳粒子中，干燥粉体的比重优选低于1.17g/cm3。对下限没有特别的限制，为1.01g/cm3左右。比重较优选为1.05～1.15g/cm3。另外，“比重”是指使用真比重计(例如，岛津制作所制AccupicII1340)测定的值。
在胶乳粒子中，吸光度优选低于下式(1)所示值且所低程度不超过5％。
式(1)：吸光度＝3.28×粒径(μm)-0.28
另外，“低于且所低程度不超过5％”是指，如图1所示，以粒径为横轴、吸光度为纵轴，将式(1)用实线L1、低于L15％的界线用虚线L2表示的情况时，排除L2以下的斜线区域X。
[致敏胶乳粒子/免疫比浊法用测定试剂]
可以以本发明的测定试剂用胶乳粒子作为载体，使其负载与被检物质特异性结合的物质，从而制造致敏胶乳粒子。在本发明的测定试剂用胶乳粒子上负载有与被检物质特异性结合的物质的致敏胶乳粒子也是本发明之一。致敏胶乳粒子优选分散在缓冲液中。
作为上述与被检物质特异性结合的物质，只要是免疫血清学的测定试剂(在免疫学的凝聚反应及凝聚抑制反应中所使用的试剂)、作为生化学测定法通常所用的生理活性物质即可，并没有特别限定。其中，优选为能够利用于抗原抗体反应中的物质。
作为本发明的能够用于抗原抗体反应中的物质，可列举例如：蛋白质、核酸、核蛋白质、雌激素等激素、脂质等抗原或抗体。作为上述抗原，可列举例如各种抗原、受体、酶等。更具体来说，可列举例如：β2微球蛋白、C反应性蛋白(CRP)、人纤维蛋白原、铁蛋白、类风湿因子(RA)、α-甲胎蛋白(AFP)、支原体抗原、HBs抗原等。作为上述抗体，可列举例如针对各种毒素或病原菌等的抗体。更具体来说，可列举例如：抗链球菌溶血素O抗体、抗雌激素抗体、β2微球蛋白抗体、梅毒螺旋体抗体、针对梅毒脂质抗原的抗体、抗HBs抗体、抗HBc抗体、抗Hbe抗体、抗PSA抗体、抗CRP抗体等。
另外，作为用于制作致敏胶乳粒子而负载于测定试剂用胶乳粒子上的抗体，除了免疫球蛋白分子本身以外，例如也可以是像F(ab’)2这样的片段。另外，上述抗体也可使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任一种。上述抗体的取得方法也可以使用通常所用的方法。在本说明书中，在使用“抗原抗体反应”、“抗原”、“抗体”的用语的情况下，除了通常的意味以外，有时还包括能够通过特异性的结合反应而使致敏胶乳粒子凝聚的上述的概念/形态中的任一种，而并非解释为限定性的。
作为使本发明的测定试剂用胶乳粒子负载与被检物质特异性结合的物质来制造致敏胶乳粒子的方法，没有特别限定，可以使用以往公知的利用物理性和/或化学性结合来进行负载的方法。本发明的致敏胶乳粒子中的与被检物质特异性结合的物质的负载量，根据所用的与被检物质特异性结合的物质的种类而不同，可以通过实验适当地设定最佳的量。
需要说明的是，在本说明书中“负载”、“致敏”、“固定化”的用语具有通常的意味，以相同意义来使用。
将利用此种方法得到的本发明的致敏胶乳粒子根据需要利用牛血清白蛋白等实施被覆(封闭)处理，分散于适当的缓冲液中而用作致敏胶乳粒子分散液。致敏胶乳粒子分散液能够作为免疫比浊法用测定试剂来使用。另外，将本发明的致敏胶乳粒子分散于缓冲液中的免疫比浊法用测定试剂也是本发明之一。本发明的免疫比浊法用测定试剂可以与在测定中所用的稀释液(缓冲液)、标准物质等组合，从而作为测定试剂盒来使用。
上述稀释液用于对测定样品等进行稀释。作为上述稀释液，只要为pH5.0～9.0的缓冲液即可，可以使用任何缓冲液。具体来说，可列举例如：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、硼酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Good’s缓冲液等。
为了提高测定灵敏度或促进抗原抗体反应，本发明的免疫比浊法用测定试剂或稀释液可以含有各种增敏剂。作为上述增敏剂，可列举例如：甲基纤维素、乙基纤维素等烷基化多糖类，支链淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮等。
为了抑制因存在于测定样品中的除了被检物质以外的物质所引起的非特异性的凝聚反应、或提高测定试剂的稳定性，本发明的免疫比浊法用测定试剂或稀释液中可以含有白蛋白(牛血清白蛋白、卵白蛋白)、酪蛋白、明胶等蛋白质或其分解物、氨基酸或表面活性剂等。
如果使用本发明的免疫比浊法用测定试剂，则通过光学地测定利用测定样品中的被检物质同负载于致敏胶乳粒子上的与被检物质特异性结合的物质的反应而导致的致敏胶乳粒子的凝聚程度，从而可以测定出测定样品中的被检物质的量。在上述光学地测定中，可以使用能够检测散射光强度、透过光强度、吸光度等的光学仪器、或具备多种这些检测方法的光学仪器等。代表性地，只要是临床检查中广泛使用的生化学自动分析仪，就可以使用任一种。
作为上述光学地测定凝聚程度的方法，可以使用以往公知的方法，可列举例如：将凝聚的形成以浊度的增加的形式进行检测的比浊法、将凝聚的形成以粒度分布或平均粒径的改变的形式进行检测的方法、使用积分球测定由凝聚的形成所造成的向前散射光的变化，并对与透过光强度的比进行比较的积分球浊度法等。另外，作为测定方法，可列举例如：在不同的时间点获得至少2个测定值，并基于这些时间点之间的测定值的增加量(增加速度)而求出凝聚的程度的速度试验(Rate Assay)；在某个时间点(通常是被视为反应的终点的时间点)获得1个测定值，并基于该测定值而求出凝聚的程度的终点试验(End PointAssay)等。其中，从测定的简便性、迅速性的方面考虑，优选借助比浊法的终点试验。本说明书中在使用“免疫比浊”、“免疫比浊法”的用语的情况下，包括上述的概念/形态中的任一种，而并非解释为限定性的。
[其他的实施方式]
在用于实施上述发明的实施方式的栏中，作为试剂测定用胶乳粒子的一个实施方式，以至少包含聚合性化合物的聚合体和折射率1.60以上的化合物的胶乳粒子为中心进行了说明。但是，本发明并不限于这些实施方式，例如，可以存在上述聚合体为与上述高折射率化合物相同的组成的情况。具体地，在本发明中，在种子膨润法或种子膨润聚合法中，包括种子粒子(聚合性化合物的聚合体)与种子粒子内包含的膨润单体(折射率1.60以上的化合物)为同样的组成的情况。
以下通过实施例、比较例对本发明进行详细说明，但本发明不受它们的限定。
[实施例1]
关于本发明的测定试剂用胶乳粒子，首先通过无皂乳液聚合法制备了种子粒子。向反应容器中加入离子交换水1200mL、作为单体的1-乙烯基萘120mL并搅拌，其后，将反应容器内置换为氮气。在反应容器中的温度达到70℃之后，滴加13mL的3％(w/v)过硫酸钾水溶液。从3％(w/v)过硫酸钾水溶液滴加起24小时后，终止反应并过滤，得到聚1-乙烯基萘系种子粒子悬浊液。
使用上述通过无皂乳液聚合法得到的种子粒子，应用种子膨润聚合制备了本发明的测定试剂用胶乳粒子。将1-乙烯基萘8.0g、过氧化苯甲酰0.08g溶解于乙酸乙酯10g中，常温搅拌6小时，得到溶液。
向上述种子粒子悬浊液20g中混合上述溶液，于常温搅拌24小时，使上述溶液内包于种子粒子中。其后，于70℃加热搅拌10小时，实施了1-乙烯基萘的聚合之后，于90℃加热搅拌10小时，使乙酸乙酯进行液中干燥，得到1-乙烯基萘的复合粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.398μm，粒径的CV值是5.3％。
另外，胶乳粒子的粒径是使用贝克曼库尔特公司生产的粒度分布测量装置“LS 13320”测定的体积统计值的平均粒径的值、CV值是根据常规方法将胶乳粒子载于胶棉膜上，通过透射电子显微镜拍摄粒子图像，通过测定了图像上观察到的500个以上粒子的方法求得的。
[实施例2]
与实施例1同样地得到了种子粒子。使1-乙烯基萘8.0g、二乙烯基苯1.0g、过氧化苯甲酰0.09g溶解于乙酸乙酯10g中，于常温搅拌6小时，成为溶液后，与上述种子粒子悬浊液10g混合，与实施例1同样地通过种子膨润聚合而得到胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.411μm、粒径的CV值是4.5％。
[实施例3]
与实施例1同样地得到了种子粒子。使6-乙烯基二萘并噻吩2.0g、二乙烯基苯3.0g、过氧化苯甲酰0.05g溶解于乙酸乙酯10g中，于常温搅拌6小时，成为溶液后，与上述种子粒子悬浊液50g混合，与实施例1同样地通过进行种子膨润聚合而得到胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.420μm、粒径的CV值是6.0％。
[实施例4]
除了使用苯乙烯作为单体之外，其余操作与实施例1同样地得到了种子粒子。使9，9-二(4-(2-(甲基)丙烯酰氧基乙氧基)苯基)芴(大阪Gas Chemicals制EA-0200)5.0g、过氧化苯甲酰0.05g溶解于乙酸乙酯10g中，于常温搅拌6小时，成为溶液后，与上述种子粒子悬浊液50g混合，与实施例1同样地通过进行种子膨润聚合而得到胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.436μm、粒径的CV值是6.1％。
[实施例5]
与实施例1同样地得到了种子粒子。使6-乙烯基二萘并噻吩9.0g、过氧化苯甲酰0.09g溶解于乙酸乙酯10g中，于常温搅拌6小时，成为溶液后，与上述种子粒子悬浊液10g混合，与实施例1同样地通过进行种子膨润聚合而得到胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.463μm、粒径的CV值是7.2％。
[实施例6]
除了进行粒径调整之外，其余与实施例2同样地得到胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.301μm、粒径的CV值是3.6％。
[实施例7]
除了进行粒径调整之外，其余与实施例2同样地得到胶乳粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.600μm、粒径的CV值是4.3％。
[比较例1]
使用无皂乳液聚合来制备。向反应容器中加入离子交换水1200mL、作为单体的1-乙烯基萘120mL并搅拌，其后，将反应容器内置换为氮气。在反应容器中的温度达到70℃之后，滴加13mL的3％(w/v)过硫酸钾水溶液。从3％(w/v)过硫酸钾水溶液滴加起24小时后，终止反应并过滤，得到聚1-乙烯基萘系胶乳粒子悬浊液。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.404μm、粒径的CV值是4.9％。
本比较例与专利文献3、4中记载的胶乳粒子相当。
[比较例2]
除了使用甲基丙烯酸甲酯作为单体之外，其余操作与实施例1同样地得到种子粒子。得到的胶乳粒子的平均粒径是0.410μm、粒径的CV值是3.9％。
本比较例与专利文献2中记载的胶乳粒子相当。
[评价1]测定试剂用胶乳粒子的比重测定
将实施例1～4及比较例1～2中得到的各测定试剂用胶乳粒子于100℃加热干燥3小时后用乳钵粉碎，对得到的干燥粉体使用真比重计(岛津制作所制AccupicII1340)测定比重，进行比较评价。结果示于表1中。
[评价2]测定试剂用胶乳粒子的吸光度测定
将实施例1～4及比较例1～2中得到的各测定试剂用胶乳粒子调整为浓度0.01重量％，使用分光光度计(日立制U-3900)测定了波长580nm的吸光度。已知对于聚苯乙烯粒子在波长580nm的吸光度，一般地能通过下式(2)算出(专利文献1与此相当)。
式(2)：吸光度＝2.72×粒径(μm)-0.22
另外，在高折射率材料1-乙烯基萘与苯乙烯的组成比是20：80的情况，已知与下式(1)的直线一致(专利文献3、4与此相当)。
式(1)：吸光度＝3.28×粒径(μm)-0.28
本发明以得到高灵敏度(高吸光度)的粒子为目的，因此以式(2)为基准进行了评价，将高+20％以上的情况评价为○○、将+20～-5％的情况评价为○、将-5％以下的情况评价为×。结果示于表1、表2中。
[评价3]测定试剂用胶乳粒子的沉降度测定
将实施例1～4及比较例1～2中得到的各测定试剂用胶乳粒子分散到超纯水(水质：电阻值18.2MΩ·cm、TOC值5ppb以下)得到的胶乳粒子浓度1.0重量％的分散液加入圆筒状的10mL量筒(柴田科学社制、商品名“带有通用的磨砂玻璃平塞的有塞量筒A型026580-10A”/高190mm、主体外径13.1mm、主体内径10.8mm、材质为玻璃)，室温下静置10天后，测定上清液的深度(沉降度)，进行了比较评价。
评价(×：6以上；Δ：5；○：3～4；○○：2；○○○：0～1)
结果示于表1、表2中。
[表1]
[表2]
根据表1和表2确认了相对于比较例1的粒子而言，实施例1的粒子的比重为比重降低与沉降度的改善，实现了作为实用范围的3mm以下。此外，由于多孔中空结构，不降低粒子的折射率而实现了高灵敏度(高吸光度)。在实施例2中，确认了由添加交联剂带来的比重降低的效果提高。在比较例2的粒子中，虽然观察到比重降低和沉降度的改善，但由于该粒子为单孔中空结构，因此折射率大幅降低，仅能得到比通常的苯乙烯粒子更低的灵敏度(吸光度)。
如上所述，本发明的测定试剂用胶乳粒子通过使用高折射率的材料而提高测定灵敏度，且通过具有多孔中空结构由此降低比重并抑制了粒子的沉降，可以确认，即使在测定被检物质的浓度稀薄的测定样品的情况，也能进行高灵敏度的测定。

Claims (10)

1.测定试剂用胶乳粒子，所述测定试剂用胶乳粒子的粒径的变异系数是10％以下、平均粒径是250～1000nm，所述胶乳粒子包含20重量％以上的折射率1.60以上的化合物，将所述胶乳粒子分散在超纯水中得到的固形成分浓度1重量％的分散液加入主体内径10.8mm的圆筒状10mL量筒中静置10天时的上清液深度为5mm以内，其中所述胶乳粒子具有多孔结构。
2.根据权利要求1所述的测定试剂用胶乳粒子，其中所述胶乳粒子具有多孔中空结构。
3.根据权利要求1所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述折射率1.60以上的化合物包含具有选自由芴骨架、二萘并噻吩骨架、萘骨架、蒽骨架、菲骨架、咔唑骨架组成的组中的至少1种骨架的化合物。
4.根据权利要求3所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述折射率1.60以上的化合物是聚合性化合物。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述折射率1.60以上的化合物是聚合性化合物的聚合体。
6.根据权利要求1～4中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述胶乳粒子包含10重量％以上的具有选自由苯基骨架、萘骨架、芴骨架、二萘并噻吩骨架、蒽骨架、菲骨架及咔唑骨架组成的组中的至少1种骨架的多官能聚合性化合物。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，其中，所述胶乳粒子中的干燥粉体的比重低于1.17g/cm3。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子，所述胶乳粒子中的吸光度低于下式(1)所示值且所低的程度不超过5％：
式(1)：吸光度＝3.28×粒径μm-0.28。
9.致敏胶乳粒子，其中，在权利要求1～8中任一项所述的测定试剂用胶乳粒子上负载有与被检物质特异性结合的物质。
10.免疫比浊法用测定试剂，其中，权利要求9所述的致敏胶乳粒子分散在缓冲液中。
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