WO2012133771A1 - 測定試薬用ラテックス粒子、感作ラテックス粒子及び免疫比濁法用測定試薬 - Google Patents

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measurement
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北原　慎一郎
由紀 高橋
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積水メディカル株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a latex particle for a measurement reagent that enables highly sensitive measurement even when measuring a measurement sample with a low concentration of a test substance.
  • an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction is widely used as a method for quantifying a trace amount of a test substance in a measurement sample.
  • the latex immunoturbidimetric method using latex particles as an antigen or antibody carrier is easy to operate and requires a short time for measurement. Then, the kind of the trace amount test substance which employ
  • Quantification of test substances such as antigens or antibodies in a measurement sample by latex immunoturbidimetry is a change in absorbance caused by aggregation of latex particles carrying antigens or antibodies (hereinafter also referred to as “sensitized latex particles”). Is detected optically. This change in absorbance is based on a change in the apparent particle diameter derived from the aggregate formed by the aggregation of the sensitized latex particles.
  • latex particles used as a carrier in latex immunoturbidimetry are easily sensitized (immobilized) with an antigen or antibody, are relatively inexpensive, and are easy to control the polymerization reaction.
  • Polystyrene latex particles as the main component have been used (Patent Document 1, etc.).
  • Patent Document 1 Patent Document 1
  • concentration of the test substance in the measurement sample is dilute, the number of aggregates formed is reduced. Since the apparent particle size is smaller than that in the case where the concentration of the test substance with respect to the number of latex particles is within an appropriate range, there is a problem that sufficient sensitivity cannot be obtained.
  • the particle size of the polystyrene latex particles is increased so that the apparent particle size of the formed agglomerates is increased. It has been tried. However, if the particle size of the latex particles is too large, the optical measurement instrument used with a lower concentration of sensitized latex particles in the reaction solution due to the relationship with the upper limit of the measurable absorbance of the optical measurement instrument used. Need to be adjusted to meet If the concentration of the sensitized latex particles in the reaction solution is lowered, the probability that the sensitized latex particles and the test substance meet within a certain period of time will decrease, and the expected measurement sensitivity may not be improved. did.
  • the particle size of latex particles as a carrier is increased, the particles are easily settled, and the storage stability is lowered when the measurement reagent containing the sensitized latex particles is stored in a solution state.
  • the method of increasing the particle size of polystyrene latex particles is expected to improve the measurement sensitivity at a certain size, but if the particle size is increased beyond a certain size, the measurement sensitivity may be lowered.
  • the storage stability of the measurement reagent is problematic.
  • Patent Document 2 discloses a method for improving measurement sensitivity without increasing the particle diameter by increasing the refractive index of latex particles.
  • the latex particles described in Patent Document 2 are used, there is a problem that the expected measurement sensitivity cannot be obtained.
  • An object of the present invention is to provide latex particles for a measurement reagent that enables highly sensitive measurement even when measuring a measurement sample with a low concentration of a test substance.
  • the present invention relates to a monomer mixture containing the following polymerizable monomers (a) to (c) and a surfactant in an aqueous medium containing 7.5 to 25% by weight of C 1-4 alcohol. It is latex particles for a measuring reagent made of a copolymer obtained by copolymerization without being used.
  • A Polymerizable monomer having a phenyl group
  • b Polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate
  • c Polymerizable monomer having a naphthyl group
  • the present invention is described in detail below.
  • the present inventors examined the reason why the expected measurement sensitivity could not be obtained even when the latex immunoturbidimetric method was performed with the sensitized latex particles prepared using the latex particles described in Patent Document 2. As a result, it has been found that the surfactant contained in the latex particles is the cause.
  • a surfactant is used as an emulsifier in order to produce latex particles having a high refractive index with a uniform particle diameter. This surfactant remains in the latex particles. As a result, the surfactant interferes with the sensitization (immobilization) of the antigen or antibody to the latex particle surface, and the amount of the antigen or antibody adsorbed on the latex particle is reduced. It is considered that the measurement sensitivity is not as high as expected.
  • the present inventors have used latex particles made of a copolymer obtained by copolymerizing a monomer mixture containing a specific polymerizable monomer without using a surfactant, Even when the particle size is about the same as that of conventional polystyrene latex particles, latex particles for measurement reagents that enable highly sensitive measurement even when measuring a measurement sample with a low concentration of the test substance should be obtained. As a result, the present invention has been completed.
  • the latex particle for measuring reagent of the present invention comprises a copolymer obtained by copolymerizing a monomer mixture containing the following polymerizable monomers (a) to (c) without using a surfactant. .
  • Latex particles for measuring reagent which are made of a copolymer having segments derived from the following polymerizable monomers (a) to (c) and do not contain a surfactant are also one aspect of the present invention.
  • c Polymerizable monomer having a naphthyl group
  • the (a) polymerizable monomer having a phenyl group is not particularly limited, and examples thereof include styrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, 4-vinylbenzoic acid, divinylbenzene, and vinyltoluene. Etc. These polymerizable monomers may be used alone or in combination of two or more. Of these, styrene is preferable.
  • the minimum with the preferable compounding quantity of the said (a) polymerizable monomer which has a phenyl group in the said monomer mixture is 40 mol%, and a preferable upper limit is 94.9 mol%.
  • a preferable upper limit is 94.9 mol%.
  • the blending amount of the polymerizable monomer having the phenyl group (a) is less than 40 mol%, the particle size distribution may be broadened, and when it exceeds 94.9 mol%, c)
  • the blending amount of the polymerizable monomer having a naphthyl group may be small and the sensitivity may not be high.
  • the more preferable lower limit of the amount of the polymerizable monomer (a) having a phenyl group is 50 mol%, and the more preferable upper limit is 89.9 mol%.
  • the polymerizable monomer (b) having a phenyl group and a sulfonate is not particularly limited as long as it is a monomer capable of containing a sulfonic acid group on the surface of the carrier particles after polymerization.
  • styrene examples thereof include sulfonate, divinylbenzene sulfonate, o-methylstyrene sulfonate, and p-methylstyrene sulfonate.
  • the salt in this case is not particularly limited, and examples thereof include sodium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt and the like. These polymerizable monomers may be used alone or in combination of two or more. Of these, styrene sulfonate is preferable, and sodium styrene sulfonate is more preferable.
  • the preferable lower limit of the amount of the polymerizable monomer having (b) phenyl group and sulfonate in the monomer mixture is 0.01 mol%, and the preferable upper limit is 5 mol%.
  • the blending amount of the polymerizable monomer having the (b) phenyl group and the sulfonate is less than 0.01 mol%, the particle diameter may be too large. Distribution may be too wide.
  • the more preferable lower limit of the amount of the polymerizable monomer having the phenyl group and the sulfonate (b) is 0.05 mol%, and the more preferable upper limit is 3 mol%.
  • the (c) polymerizable monomer having a naphthyl group is not particularly limited, and examples thereof include 1-vinylnaphthalene, 2-vinylnaphthalene, ⁇ -naphthyl (meth) acrylate, ⁇ -naphthyl (meth) acrylate, and the like. Is mentioned. These polymerizable monomers may be used alone or in combination of two or more. Of these, 1-vinylnaphthalene is preferable.
  • the minimum with the preferable compounding quantity of the said (c) polymerizable monomer which has a naphthyl group in the said monomer mixture is 5 mol%, and a preferable upper limit is 59.9 mol%.
  • a preferable upper limit is 59.9 mol%.
  • the blending amount of the polymerizable monomer having (c) naphthyl group is less than 5 mol%, the sensitivity may not be high, and when it exceeds 59.9 mol%, particles may not be formed at the time of polymerization. The particle size distribution may become wide.
  • the more preferable lower limit of the blending amount of the polymerizable monomer having the (c) naphthyl group is 10 mol%, and the more preferable upper limit is 49.9 mol%.
  • the monomer mixture may further contain a polymerizable unsaturated monomer.
  • the polymerizable unsaturated monomer is not particularly limited as long as it can be used for ordinary radical polymerization.
  • (meth) acrylic acid means acrylic acid or methacrylic acid.
  • the monomer mixture further contains the polymerizable unsaturated monomer, (a) a polymerizable monomer having a phenyl group, (b) a polymerizable having a phenyl group and a sulfonate. It is necessary to set the blending amount so as not to impair the preferable blending amount of the monomer and (c) the polymerizable monomer having a naphthyl group.
  • the upper limit with the preferable compounding quantity of the said polymerizable unsaturated monomer is 20 mol%.
  • the blending amount of the polymerizable unsaturated monomer exceeds 20 mol%, the sensitivity may not be high.
  • the upper limit with the more preferable compounding quantity of the said polymerizable unsaturated monomer is 5 mol%.
  • the preferable lower limit of the compounding amount of the polymerizable unsaturated monomer is not particularly limited, and varies depending on the properties to be controlled, such as the hardness, elasticity, water resistance, etc. of the latex particles, and can be appropriately set through experiments. .
  • the latex particles for measuring reagent of the present invention can be obtained by copolymerizing the monomer mixture.
  • a surfactant for example, an alkali metal salt of alkylbenzene sulfonic acid
  • the surfactant remains in the resulting latex particles, and the surfactant interferes with the sensitization (immobilization) of the antigen or antibody to the latex particle surface, resulting in latex particles.
  • the amount of antigen or antibody adsorbed becomes insufficient, and high measurement sensitivity cannot be obtained.
  • the copolymerization method a conventionally known method can be used except that it is carried out without using a surfactant in an aqueous medium.
  • the above monomer is contained in a reaction vessel charged with an aqueous medium as a solvent. Examples thereof include a method of adding a body mixture and a polymerization initiator and heating the mixture with stirring in a nitrogen atmosphere.
  • the aqueous medium is a mixed solvent containing water and a monohydric alcohol having 1 to 4 carbon atoms (hereinafter also referred to as “C 1-4 alcohol”), and the C 1-4 alcohol is added to 7.5 to 25. Contains by weight.
  • the C 1-4 alcohol include linear alcohols such as methanol and ethanol, and branched chain alcohols such as isopropyl alcohol and t-butyl alcohol. Of these, ethanol is preferred.
  • the concentration of C 1-4 alcohol in the aqueous medium ranges from 7.5 to 25% by weight. When the concentration of C 1-4 alcohol is higher than 25% by volume, the particle size distribution becomes wide and the particle size varies.
  • the concentration of C 1-4 alcohol is lower than 7.5% by volume, the particle diameter does not expand, but high measurement sensitivity cannot be obtained when used as latex particles for measurement reagents.
  • a known radical initiator can be used as the polymerization initiator.
  • persulfates such as potassium persulfate, sodium persulfate, ammonium persulfate, 2,2′-azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis (4-methoxy-2,4- Dimethylvaleronitrile), 2,2'-azobis-2,4-dimethylvaleronitrile, and other azo compounds, benzoyl peroxide, di-t-butyl peroxide, lauroyl peroxide, t-butylperoxy-2-ethyl Examples thereof include organic peroxides such as hexanoate.
  • the blending amount of the polymerization initiator is not particularly limited, but is usually 0.01 to 1% by weight based on the total amount of the polymerizable monomer.
  • the polymerization temperature in the copolymerization is preferably 50 to 100 ° C, more preferably 60 to 85 ° C.
  • the polymerization time is usually 5 to 50 hours, although it depends on the composition and concentration of the polymerizable monomer and the conditions such as the polymerization initiator.
  • the latex particles for measuring reagent of the present invention produced by such a method are obtained in a state suspended in water or an aqueous solvent.
  • the concentration of the latex particles for measurement reagent in the suspension is not particularly limited, but it is usually preferably 1 to 20% by weight. If it is less than 1% by weight, it needs to be concentrated during the preparation of the sensitized latex particles, and if it exceeds 20% by weight, it may be agglomerated.
  • the average particle size of the latex particles for measurement reagent of the present invention may be appropriately selected depending on the specific method of latex immunoturbidimetry and the specifications of the measuring instrument used, but the preferred lower limit is 0.01 ⁇ m and the preferred upper limit is 1. 0.0 ⁇ m. If the average particle size is less than 0.01 ⁇ m, the amount of optical change due to aggregation is too small to obtain the sensitivity required for measurement, or it takes a long time for centrifugation during preparation of sensitized latex particles. Therefore, the manufacturing cost may increase.
  • the average particle diameter exceeds 1.0 ⁇ m, the amount of optical change due to the aggregation of the sensitized latex particles exceeds the measurable area of the optical measuring instrument when the test substance in the measurement sample has a high concentration. An optical change amount corresponding to the amount of the test substance may not be obtained.
  • the more preferable lower limit of the average particle diameter is 0.05 ⁇ m, the more preferable upper limit is 0.7 ⁇ m, the still more preferable lower limit is 0.1 ⁇ m, and the still more preferable upper limit is 0.4 ⁇ m.
  • the coefficient of variation (CV value) of the particle diameter of the latex particles for measuring reagent of the present invention is preferably 10% or less. When the coefficient of variation (CV value) exceeds 10%, the production reproducibility at the time of preparation of the sensitized latex particles may decrease, and the performance (measurement reproducibility) of the measurement reagent may decrease.
  • the coefficient of variation (CV value) is more preferably 5% or less, still more preferably 3% or less.
  • the coefficient of variation of the particle diameter is calculated by the following formula (1).
  • Coefficient of variation of particle diameter (CV value) standard deviation of particle diameter / average particle diameter As described above, the spread of the particle diameter distribution is the C 1 ⁇ in the aqueous solvent used in the copolymerization reaction.
  • Latex particles for measurement reagent having a coefficient can be appropriately selected and used.
  • Sensitized latex particles can be produced by using a latex particle for measurement reagent of the present invention as a carrier and supporting a substance that specifically binds to a test substance. Sensitized latex particles in which the latex particles for measurement reagent of the present invention carry a substance that specifically binds to the test substance are also one aspect of the present invention.
  • Substances that specifically bind to the test substance include immunoserologic measurement reagents (used in immunological agglutination and agglutination inhibition reactions) and physiologically active substances commonly used as biochemical measurement methods. If there is no particular limitation. Among these, substances that can be used for antigen-antibody reaction are preferable.
  • Examples of substances that can be used for the antigen-antibody reaction in the present invention include proteins, nucleic acids, nucleoproteins, hormones such as estrogens, and antigens or antibodies such as lipids.
  • Examples of the antigen include various antigens, receptors, enzymes and the like. More specifically, examples include ⁇ 2 microglobulin, C-reactive protein (CRP), human fibrinogen, ferritin, rheumatoid factor (RA), ⁇ -fetoprotein (AFP), mycoplasma antigen, HBs antigen and the like.
  • Examples of the antibody include antibodies against various toxins and pathogenic bacteria.
  • anti-streptridine O antibody anti-estrogen antibody, ⁇ 2 microglobulin antibody, syphilis treponema antibody, antibody against syphilis lipid antigen, anti-HBs antibody, anti-HBc antibody, anti-Hbe antibody, anti-PSA antibody, anti-PSA antibody
  • examples include CRP antibodies.
  • the antibody carried on the measurement reagent latex particles for preparing the sensitized latex particles may be, for example, a fragment such as F (ab ′) 2 in addition to the immunoglobulin molecule itself.
  • the antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a commonly used method can be used.
  • the terms “antigen-antibody reaction”, “antigen”, “antibody” are used, in addition to the usual meaning, the above-mentioned concept / form capable of aggregating sensitized latex particles by a specific binding reaction Any of these may be included, and should not be interpreted in a limited way.
  • the method for producing a sensitized latex particle by supporting a substance that specifically binds to a test substance on the latex particle for measurement reagent of the present invention is not particularly limited, and conventionally known physical and / or chemical bonds. Can be used.
  • the amount of the substance that specifically binds to the test substance in the sensitized latex particles of the present invention varies depending on the type of substance that specifically binds to the test substance to be used, and an optimal amount is appropriately set experimentally. be able to.
  • the terms “support”, “sensitization”, and “immobilization” have ordinary meanings and are used synonymously.
  • the sensitized latex particles of the present invention obtained by such a method are coated (blocking) with bovine serum albumin or the like, if necessary, and dispersed in an appropriate buffer to be used as a sensitized latex particle dispersion.
  • the sensitized latex particle dispersion can be used as a measurement reagent for immunoturbidimetry.
  • a measurement reagent for immunoturbidimetry in which the sensitized latex particles of the present invention are dispersed in a buffer is also one aspect of the present invention.
  • the measurement reagent for immunoturbidimetry of the present invention can be used as a measurement reagent kit in combination with a diluent (buffer solution), a standard substance and the like used for measurement.
  • the diluent is used for diluting a measurement sample or the like.
  • any buffer solution having a pH of 5.0 to 9.0 can be used. Specific examples include phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, borate buffer, citrate buffer, and Good's buffer.
  • the immunoturbidimetric measurement reagent or diluent of the present invention may contain various sensitizers for improving measurement sensitivity and promoting antigen-antibody reaction.
  • the sensitizer include alkylated polysaccharides such as methylcellulose and ethylcellulose, pullulan, and polyvinylpyrrolidone.
  • the immunoturbidimetric measurement reagent or diluent of the present invention is used.
  • Proteins such as albumin (bovine serum albumin, egg albumin), casein, gelatin and the like, degradation products thereof, amino acids or surfactants may be contained.
  • the sensitized latex particle produced by the reaction between the test substance in the measurement sample and the substance that specifically binds to the test substance supported on the sensitized latex particle By optically measuring the degree of aggregation, the amount of the test substance in the measurement sample can be measured.
  • an optical apparatus that can detect scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, or the like, or an optical apparatus that includes a plurality of these detection methods can be used.
  • any biochemical automatic analyzer widely used in clinical tests can be used.
  • a conventionally known method for example, a turbidimetric method in which the formation of aggregates is regarded as an increase in turbidity, and the formation of aggregates as a change in particle size distribution or average particle size.
  • a turbidimetric method in which the formation of aggregates is regarded as an increase in turbidity, and the formation of aggregates as a change in particle size distribution or average particle size.
  • an integrating sphere turbidity method in which a change in forward scattered light due to the formation of aggregates is measured using an integrating sphere, and the ratio to the transmitted light intensity is compared.
  • a measurement method for example, a speed test (rate assay) in which at least two measurement values are obtained at different time points, and the degree of aggregation is obtained based on the increment (increase rate) of the measurement values between these time points
  • a speed test rate assay
  • Examples include an end point test (end point assay) in which one measurement value is obtained at a certain time point (usually considered as the end point of the reaction), and the degree of aggregation is determined based on this measurement value.
  • the end point test by the turbidimetric method is preferable from the viewpoint of simplicity of measurement and rapidity.
  • the terms “immunoturbidity” and “immunoturbidimetry” are intended to include any of the above concepts and forms and should not be interpreted in a limited manner.
  • the latex particle for measurement reagents which enables a highly sensitive measurement can be provided.
  • the latex particles for measuring reagent of the present invention improve the measurement sensitivity of the test substance in the dilute concentration range without decreasing the protein adsorption amount while maintaining the same particle size as the conventional polystyrene latex particles. Can be made. Further, when the latex particles for measurement reagent of the present invention are used, it is possible to obtain a highly sensitive measurement reagent without lowering the storage stability of the measurement reagent due to particle sedimentation.
  • FIG. 5 is a sensitivity curve (calibration curve) obtained by measuring a CRP antigen standard solution using latex particles for measurement reagent obtained in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 5.
  • FIG. (A) is the figure which displayed the measured whole concentration range
  • (b) is the figure which expanded and displayed the sensitivity curve about the concentration range below 0.6 mg / dL.
  • Example 1 In a glass reaction vessel (capacity 1 L) equipped with a stirrer, a reflux condenser, a temperature detector, a nitrogen inlet tube and a jacket, 400 g of ultrapure water, 100 g of ethanol, 19 g of styrene monomer, 25 g of 1-vinylnaphthalene, styrene sulfonic acid After 0.01 g of sodium and 0.15 g of potassium persulfate were added and the inside of the container was replaced with nitrogen gas, polymerization was carried out for 24 hours while stirring at 70 ° C. at a rate of 160 rpm. After completion of the polymerization, the solution was filtered with a paper filter paper, and latex particles were taken out.
  • the obtained latex particles had an average particle size of 0.351 ⁇ m, and the CV value of the particle size was 3.8%.
  • the particle diameter and CV value of the latex particles are determined by measuring the particle diameter of 100 or more particles observed on the image by placing the latex particles on a collodion film according to a conventional method, taking a particle image with a transmission electron microscope. It was determined by the measurement method.
  • Example 2 Instead of “400 g of ultrapure water, 100 g of ethanol, 19 g of styrene monomer, 25 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, 0.15 g of potassium persulfate”, 450 g of ultrapure water, 50 g of ethanol, 35 g of styrene monomer, Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 20 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, and 0.18 g of potassium persulfate were used. The average particle diameter of the obtained latex particles was 0.355 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 2.2%.
  • Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 18 g of 1-vinylnaphthalene, 0.30 g of potassium persulfate, and 0.06 g of sodium dodecylbenzenesulfonate (surfactant) were used.
  • the average particle diameter of the obtained latex particles was 0.433 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 15.0%.
  • the latex particles of this comparative example correspond to the latex particles described in Patent Document 2.
  • Evaluation 1 Evaluation of protein adsorption amount of latex particles for measurement reagent Latex having a final concentration of 0.4% by weight using the latex particles for measurement reagent obtained in Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 2 Mix in particles (4 mg as solid amount), 0.8 mg / mL BSA, 20 mmol / L phosphate buffer (pH 7.4), and use a wave broacher (50 rpm) in a low temperature chamber at 4 ° C. While shaking for 3 hours, BSA was adsorbed on the latex particles.
  • the latex particles for measurement reagent of Comparative Example 1 have significantly lower BSA adsorption than the latex particles of Examples 1, 2 and Comparative Example 2.
  • the latex particles for measurement reagent of Examples 1 and 2 had the same amount of BSA adsorption as the latex particles for measurement reagent of Comparative Example 2.
  • the latex particles for measurement reagent of the present invention contain a large amount of antibodies and the like useful for the construction of a measurement reagent for immunoturbidimetric method compared to the latex particles for measurement reagent of Comparative Example 1 produced using a surfactant. It was confirmed that it can be adsorbed on the surface.
  • Measurement condition A Equipment: Hitachi 7170 type automatic analyzer Use wavelength: 570nm / 800nm
  • Photometric point 18-34 (end point assay)
  • Measurement temperature 37 ° C
  • Measurement sample (0 to 36 mg / dL CRP standard solution): 2 uL CRP concentration of each CRP standard solution: 0.2, 0.3, 0.6, 6, 18, 36 mg / dL
  • First reagent Nanopia (registered trademark) CRP buffer 100 ⁇ L
  • Second reagent 100 ⁇ L
  • the measurement sample and the first reagent were mixed and stirred, and then the second reagent was further added and mixed and stirred. Then, it implemented by the end point assay which measures the turbidity after progress for a fixed time.
  • the measurement reagent using the sensitized latex particles prepared from the latex particles for measurement reagent of Comparative Example 1 has substantial sensitivity at CRP 0.6 mg / dL or less. In addition, even at 6 mg / mL or more, the sensitivity difference between the concentrations was not sufficient.
  • the measurement reagent using the sensitized latex particles prepared from the latex particles for measurement reagent of Comparative Example 2 (not containing a polymerizable monomer having a naphthyl group) has a sensitivity of 6 mg / dL compared to Comparative Example 1.
  • Example 3 Instead of “400 g of ultrapure water, 100 g of ethanol, 19 g of styrene monomer, 25 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, 0.15 g of potassium persulfate”, 375 g of ultrapure water, 125 g of ethanol, 35 g of styrene monomer, Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 20 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, and 0.18 g of potassium persulfate were used. The average particle diameter of the obtained latex particles was 0.361 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 7.8%.
  • Example 4 Instead of “400 g of ultrapure water, 100 g of ethanol, 19 g of styrene monomer, 25 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, 0.15 g of potassium persulfate”, 400 g of ultrapure water, 100 g of ethanol, 35 g of styrene monomer, Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 20 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, and 0.18 g of potassium persulfate were used. The average particle diameter of the obtained latex particles was 0.359 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 4.1%.
  • Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 35 g of styrene monomer, 20 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, and 0.18 g of potassium persulfate were used.
  • the average particle diameter of the obtained latex particles was 0.345 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 3.1%.
  • Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 20 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, and 0.18 g of potassium persulfate were used.
  • the average particle diameter of the obtained latex particles was 0.401 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 17.1%.
  • Latex particles for measurement reagents were obtained in the same manner as in Example 1 except that 20 g of 1-vinylnaphthalene, 0.01 g of sodium styrenesulfonate, and 0.18 g of potassium persulfate were used.
  • the average particle diameter of the obtained latex particles was 0.343 ⁇ m, and the CV value of the particle diameter was 2.8%.
  • the measurement sensitivity was lower than that of the measurement reagent using the latex particles of the example, and it was found that the measurement sensitivity was not sufficient.
  • Comparative Examples 1, 3 and 4 were similarly low compared to the measurement reagent using the latex particles of the Examples, and it was found that the measurement sensitivity was not sufficient (from FIG. 2 and Table 2). ).
  • the amount of BSA adsorption was almost the same in each Example and each Comparative Example except for Comparative Example 1 in which a surfactant was used during copolymerization (from Table 1 above).
  • latex particles for measurement reagent capable of highly sensitive measurement can be produced even with a measurement sample having a low concentration of the test substance.
  • the latex particles for measurement reagent of the present invention have the same particle size as conventional polystyrene latex particles, and do not reduce the amount of protein adsorbed, and the measurement sensitivity of a test substance in a dilute concentration range is low. It was confirmed that it can be improved.
  • the particle size distribution of the latex particles for measuring reagent of the present invention converges to 10% or less in terms of CV, and since there is little variation in particle size, the production reproducibility during preparation of sensitized latex particles is stable, As a result, it was confirmed that the performance (measurement reproducibility) of the measurement reagent can be stabilized.

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Abstract

本発明は、被検物質の濃度が希薄な測定試料を測定する場合であっても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子を提供することを目的とする。 本発明は、下記（ａ）～（ｃ）の重合性単量体を含有する単量体混合物を、Ｃ１－４アルコールを７．５～２５重量％含有する水性媒体中で界面活性剤を用いずに共重合してなる共重合体からなる測定試薬用ラテックス粒子である。 （ａ）フェニル基を有する重合性単量体 （ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体 （ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体

Description

測定試薬用ラテックス粒子、感作ラテックス粒子及び免疫比濁法用測定試薬
本発明は、被検物質の濃度が希薄な測定試料を測定する場合であっても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子に関する。
臨床検査をはじめとする種々の分野において、測定試料中の微量な被検物質を定量する方法として、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定法が広く使用されている。なかでもラテックス粒子を抗原又は抗体の担体として用いたラテックス免疫比濁法は、操作が簡便で、かつ、測定に要する時間が短い。そこで、測定方法としてラテックス免疫比濁法を採用する微量被検物質の種類が更に増加している。
ラテックス免疫比濁法による測定試料中の抗原又は抗体等の被検物質の定量は、抗原又は抗体を担持したラテックス粒子（以下、「感作ラテックス粒子」ともいう。）の凝集により生ずる吸光度の変化を光学的に検出することにより行われる。この吸光度の変化は、感作ラテックス粒子の凝集によって形成される凝集塊に由来する見かけの粒子径の変化に基づくものである。
従来、ラテックス免疫比濁法において担体として用いられるラテックス粒子には、抗原又は抗体の感作（固定化）が容易であり、比較的安価で、かつ、重合反応も制御しやすいことから、ポリスチレンを主成分とするポリスチレン系ラテックス粒子が用いられてきた（特許文献１等）。しかし、ポリスチレン系ラテックス粒子をラテックス免疫比濁法における担体として用いた場合、測定試料中の被検物質の濃度が希薄であると、形成される凝集塊の数が少なくなり、また、凝集塊の見かけの粒子径もラテックス粒子数に対する被検物質の濃度が適当な範囲である場合に比べ小さくなることから、充分な感度が得られないという問題があった。
そこで、被検物質の濃度が希薄な場合において低下する測定感度を向上させることを目的として、形成される凝集塊の見かけの粒子径が大きくなるように、ポリスチレン系ラテックス粒子の粒子径を大きくすることが試みられている。
しかしながら、ラテックス粒子の粒子径を大きくしすぎると、使用する光学的測定機器の測定可能な吸光度上限との関係から、反応液中における感作ラテックス粒子の濃度を低くして使用する光学的測定機器に適合するように調整する必要が生じる。反応液中の感作ラテックス粒子の濃度を低くすると、一定時間内に感作ラテックス粒子と被検物質とが出会う確率が低下してしまい、期待した測定感度の向上が得られないことがしばしば発生した。また、担体となるラテックス粒子の粒子径を大きくすると沈降しやすくなり、感作ラテックス粒子を含む測定試薬を溶液状態で保存する場合に保存安定性が低下してしまう。
このようにポリスチレン系ラテックス粒子の粒子径を大きくする方法では、一定の大きさまでは測定感度の向上が見込めるものの、一定の大きさを超えて粒子径を大きくすると、かえって測定感度の低下を招いたり、測定試薬の保存安定性に問題が生じたりするという問題があった。
これに対して特許文献２では、ラテックス粒子の屈折率を高めることで粒子径を大きくせずに、測定感度の向上を図る方法が開示されている。しかしながら、特許文献２に記載されたラテックス粒子を用いても、実際には期待する測定感度が得られないという問題があった。
国際公開ＷＯ２００３／００５０３１号パンフレット 特開２００１－２９６２９９号公報
本発明は、被検物質の濃度が希薄な測定試料を測定する場合であっても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子を提供することを目的とする。
本発明は、下記（ａ）～（ｃ）の重合性単量体を含有する単量体混合物を、Ｃ１－４アルコールを７．５～２５重量％含有する水性媒体中で界面活性剤を用いずに共重合してなる共重合体からなる測定試薬用ラテックス粒子である。
（ａ）フェニル基を有する重合性単量体
（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体
（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体
以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、特許文献２に記載されたラテックス粒子を用いて調製した感作ラテックス粒子によりラテックス免疫比濁法を行っても期待した測定感度が得られない理由について検討を行った。その結果、ラテックス粒子中に含まれる界面活性剤が原因であることを見出した。特許文献２に記載された方法では、屈折率の高いラテックス粒子を粒子径の揃った状態で製造するために、乳化剤として界面活性剤を使用している。この界面活性剤がラテックス粒子中に残存し、その結果、界面活性剤が抗原又は抗体のラテックス粒子表面への感作（固定化）を妨害して、ラテックス粒子の抗原又は抗体の吸着量が不充分となり、期待するほどには高い測定感度が得られないのだと考えられる。
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の重合性単量体を含有する単量体混合物を、界面活性剤を用いずに共重合してなる共重合体からなるラテックス粒子を用いれば、従来のポリスチレン系ラテックス粒子と同程度の粒子径であっても、被検物質の濃度が希薄な測定試料を測定する場合においても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子は、下記（ａ）～（ｃ）の重合性単量体を含有する単量体混合物を、界面活性剤を用いずに共重合してなる共重合体からなる。
下記（ａ）～（ｃ）の重合性単量体に由来するセグメントを有する共重合体からなり、かつ、界面活性剤を含有しない測定試薬用ラテックス粒子もまた、本発明の１つである。
（ａ）フェニル基を有する重合性単量体
（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体
（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体
上記（ａ）フェニル基を有する重合性単量体としては特に限定されず、例えば、スチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン等が挙げられる。これらの重合性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、スチレンが好ましい。
上記単量体混合物における上記（ａ）フェニル基を有する重合性単量体の配合量の好ましい下限は４０モル％、好ましい上限は９４．９モル％である。上記（ａ）フェニル基を有する重合性単量体の配合量が４０モル％未満であると粒子径分布が広くなることがあり、９４．９モル％を超えると、上記単量体混合物における（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体の配合量が少なくなり高感度とならないことがある。上記（ａ）フェニル基を有する重合性単量体の配合量のより好ましい下限は５０モル％、より好ましい上限は８９．９モル％である。
上記（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体としては、重合後の担体粒子表面にスルホン酸基を含有せしめることができる単量体であれば特に限定されず、例えば、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩等が挙げられる。
この場合の塩としても、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
これらの重合性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、スチレンスルホン酸塩が好ましく、スチレンスルホン酸ナトリウムがより好ましい。
上記単量体混合物における上記（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体の配合量の好ましい下限は０．０１モル％、好ましい上限は５モル％である。上記（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体の配合量が０．０１モル％未満であると、粒子径が大きくなりすぎることがあり、５モル％を超えると、粒子径分布が広くなりすぎることがある。上記（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体の配合量のより好ましい下限は０．０５モル％、より好ましい上限は３モル％である。
上記（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体としては特に限定されず、例えば、１－ビニルナフタレン、２－ビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α－ナフチル、（メタ）アクリル酸β－ナフチル等が挙げられる。これらの重合性単量体は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。なかでも、１－ビニルナフタレンが好ましい。
上記単量体混合物における上記（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体の配合量の好ましい下限は５モル％、好ましい上限は５９．９モル％である。上記（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体の配合量が５モル％未満であると、高感度とならないことがあり、５９．９モル％を超えると、重合時に粒子にならなかったり、粒子径分布が広くなったりすることがある。上記（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体の配合量のより好ましい下限は１０モル％、より好ましい上限は４９．９モル％である。
上記単量体混合物は、更に、重合性不飽和単量体を含有してもよい。
上記重合性不飽和単量体としては、通常のラジカル重合に使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸アミド、ハロゲン化ビニル、ビニルエステル、（メタ）アクロレイン、マレイン酸誘導体、フマル酸誘導体等が挙げられる。
なお、本明細書において（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味する。
上記単量体混合物に、更に上記重合性不飽和単量体を含有させる場合には、上記（ａ）フェニル基を有する重合性単量体、（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び、（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体の好ましい配合量を損ねることがないように、その配合量を設定する必要がある。
上記単量体混合物が上記重合性不飽和単量体を含有する場合、上記重合性不飽和単量体の配合量の好ましい上限は２０モル％である。上記重合性不飽和単量体の配合量が２０モル％を超えると、高感度とならないことがある。上記重合性不飽和単量体の配合量のより好ましい上限は５モル％である。
上記重合性不飽和単量体の配合量の好ましい下限は特に限定されず、ラテックス粒子の硬さ、弾性、耐水性等、制御したい性質により異なり、実験を通じる等して適宜設定することができる。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子は、上記単量体混合物を共重合することにより得られる。ここで、共重合の際に、乳化剤として広く使用されている界面活性剤（例えば、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩等）を使用しないことが極めて重要である。界面活性剤を用いた場合には、得られるラテックス粒子中に界面活性剤が残存し、該界面活性剤が抗原又は抗体のラテックス粒子表面への感作（固定化）を妨害して、ラテックス粒子の抗原又は抗体の吸着量が不充分となり、高い測定感度が得られなくなる。
上記共重合の方法としては、水性媒体中で界面活性剤を用いずに行うこと以外は従来公知の方法を用いることができ、例えば、溶媒として水性媒体が仕込まれた反応容器内に上記単量体混合物及び重合開始剤を添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら加熱する方法等が挙げられる。
上記水性媒体は、水と炭素数１～４の一価アルコール（以下、「Ｃ１－４アルコール」ともいう。）とを含有する混合溶媒であり、Ｃ１－４アルコールを７．５～２５重量％含有する。Ｃ１－４アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール等の直鎖アルコール、イソプロピルアルコール、ｔ－ブチルアルコール等の分岐鎖アルコールを挙げることができる。なかでもエタノールが好適である。
水性媒体中におけるＣ１－４アルコールの濃度は、７．５～２５重量％の範囲である。Ｃ１－４アルコールの濃度が２５容量％よりも高いと粒子径分布が広くなり粒子径がばらつく。一方、Ｃ１－４アルコールの濃度が７．５容量％よりも低いと粒子径の広がりは生じないものの測定試薬用ラテックス粒子として使用したときに高い測定感度を得ることができない。上記濃度範囲で使用することにより粒子径分布の広がりを制御して粒子径のばらつきが少なく、かつ、抗原又は抗体の吸着量が充分で、高い測定感度が得られる、すぐれた測定試薬用ラテックス粒子を製造することができる。
上記重合開始剤としては、公知のラジカル開始剤を用いることができる。具体的には例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、２，２’－アゾビスイソブチロニトリル、２，２’－アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル）、２，２’－アゾビス－２，４－ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物や、ベンゾイルパーオキサイド、ジ－ｔ－ブチルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、ｔ－ブチルパーオキシ－２－エチルヘキサノエート等の有機過酸化物等が挙げられる。なかでも、過硫酸塩が好ましく、過硫酸カリウムがより好ましい。
上記重合開始剤の配合量は特に限定されないが、通常は重合性単量体量の全量に対して０．０１～１重量％を配合する。
上記共重合における重合温度としては５０～１００℃が好ましく、より好ましくは６０～８５℃である。また、重合時間としては、重合性単量体の組成、濃度、及び、重合開始剤等の条件にもよるが、通常５～５０時間である。
このような方法にて製造した本発明の測定試薬用ラテックス粒子は、水又は水系溶媒に懸濁した状態で得られる。該懸濁液中の測定試薬用ラテックス粒子の濃度としては特に限定されないが、通常は１～２０重量％であることが好ましい。１重量％未満であると、感作ラテックス粒子の調製時に濃縮する必要があり、２０重量％を超えると、凝集してしまうことがある。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子の平均粒子径は、ラテックス免疫比濁法の具体的な方法や用いる測定機器の仕様等によって適宜選択すればよいが、好ましい下限は０．０１μｍ、好ましい上限は１．０μｍである。平均粒子径が０．０１μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さすぎて測定に必要な感度が得られなかったり、感作ラテックス粒子の調製時の遠心分離の際等に長時間を要して製造コストが高くなったりすることがある。平均粒子径が１．０μｍを超えると、測定試料中の被検物質が高濃度であるときに感作ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が光学的測定機器の測定可能領域を超えてしまい、被検物質の量に応じた光学的変化量が得られないことがある。平均粒子径のより好ましい下限は０．０５μｍ、より好ましい上限は０．７μｍ、更に好ましい下限は０．１μｍ、更に好ましい上限は０．４μｍである。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子の粒子径の変動係数（ＣＶ値）は、１０％以下であることが好ましい。変動係数（ＣＶ値）が１０％を超えると、感作ラテックス粒子の調製時の製造再現性が低下し、測定試薬の性能（測定再現性）が低下することがある。変動係数（ＣＶ値）は、５％以下であることがより好ましく、３％以下であることが更に好ましい。なお、上記粒子径の変動係数は、下記式（１）により算出される。
　　式（１）：粒子径の変動係数（ＣＶ値）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径
上記したように、粒子径分布の広がりは、共重合反応を行う際の水性溶媒中のＣ１－４アルコールの濃度によって一定範囲に収束させることができる。当業者であれば、被検物質の特性（物性や測定試料中での濃度等）、ラテックス粒子に感作させる抗原や抗体の特性、製造ロット間における再現性等を考慮して、好適な変動係数を有する測定試薬用ラテックス粒子を適宜選択し、使用することができる。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子を担体として、被検物質と特異的に結合する物質を担持させて、感作ラテックス粒子を製造することができる。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子に、被検物質と特異的に結合する物質を担持させた感作ラテックス粒子もまた、本発明の１つである。
上記被検物質と特異的に結合する物質としては、免疫血清学的測定試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質であれば特に限定されない。なかでも、抗原抗体反応に利用できる物質が好適である。
本発明における抗原抗体反応に利用できる物質としては、例えば、タンパク質、核酸、核タンパク質、エストロゲン等のホルモン、脂質等の抗原又は抗体が挙げられる。
上記抗原としては、例えば、各種抗原、レセプター、酵素等が挙げられる。より具体的には、例えば、β２マイクログロブリン、Ｃ－反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、リウマチ因子（ＲＡ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、マイコプラズマ抗原、ＨＢｓ抗原等が挙げられる。
上記抗体としては、例えば、各種の毒素や病原菌等に対する抗体が挙げられる。より具体的には、例えば、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗エストロゲン抗体、β２マイクログロブリン抗体、梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗Ｈｂｅ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＣＲＰ抗体等が挙げられる。
なお、感作ラテックス粒子を作製するため測定試薬用ラテックス粒子に担持させる抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ’）２のような断片であってもよい。また、上記抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。
上記抗体の取得方法も通常使用される方法を用いることができる。
本明細書において「抗原抗体反応」、「抗原」、「抗体」の語を用いる場合、通常の意味に加え、特異的な結合反応により感作ラテックス粒子を凝集させることができる上記の概念・形態のいずれをも含む場合があり、限定的に解釈してはならない。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子に被検物質と特異的に結合する物質を担持させて、感作ラテックス粒子を製造する方法としては特に限定されず、従来公知の物理的及び／又は化学的結合により担持させる方法を用いることができる。
本発明の感作ラテックス粒子における被検物質と特異的に結合する物質の担持量は、用いられる被検物質と特異的に結合する物質の種類により異なり、実験的に最適な量を適宜設定することができる。
なお、本明細書において「担持」、「感作」、「固定化」の語は、通常の意味を有し、同義に使用している。
このような方法により得られた本発明の感作ラテックス粒子は、必要に応じてウシ血清アルブミン等で被覆（ブロッキング）処理を施し、適当な緩衝液に分散して感作ラテックス粒子分散液として用いる。感作ラテックス粒子分散液は、免疫比濁法用測定試薬として用いることができる。
本発明の感作ラテックス粒子が緩衝液中に分散している免疫比濁法用測定試薬もまた、本発明の１つである。
本発明の免疫比濁法用測定試薬は、測定に用いる希釈液（緩衝液）や標準物質等を組み合わせて、測定試薬キットとして用いることができる。
上記希釈液は、測定試料等を希釈するのに用いられる。
上記希釈液としては、ｐＨ５．０～９．０の緩衝液であればどのようなものでも用いることができる。具体的には、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
本発明の免疫比濁法用測定試薬や希釈液は、測定感度の向上や抗原抗体反応の促進のために、種々の増感剤を含有してもよい。
上記増感剤としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類や、プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
本発明の免疫比濁法用測定試薬や希釈液は、測定試料中に存在する被検物質以外の物質により起こる非特異的凝集反応を抑制するためや、測定試薬の安定性を高めるために、アルブミン（牛血清アルブミン、卵性アルブミン）、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質やその分解物、アミノ酸又は界面活性剤等を含有してもよい。
本発明の免疫比濁法用測定試薬を用いれば、測定試料中の被検物質と感作ラテックス粒子に担持された被検物質に特異的に結合する物質との反応により生じる感作ラテックス粒子の凝集の度合いを光学的に測定することにより、測定試料中の被検物質の量を測定することができる。
上記光学的測定には、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、又は、これらの検出方法を複数備えた光学機器等を用いることができる。代表的には、臨床検査で広く使用されている生化学自動分析機であればいずれも使用することができる。
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては従来公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒子径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
また、測定法としては、例えば、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得て、これらの時点間における測定値の増加分（増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）や、ある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）等が挙げられる。なかでも、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による終点試験が好適である。
本明細書において「免疫比濁」、「免疫比濁法」の語を用いる場合、上記の概念・形態のいずれも含むものとし、限定的に解釈してはならない。
本発明によれば、被検物質の濃度が希薄な測定試料であっても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子を提供することができる。
本発明の測定試薬用ラテックス粒子は、従来のポリスチレン系ラテックス粒子に対して、粒子径は同程度のまま、タンパク質の吸着量を低下させることなく、希薄濃度域における被検物質の測定感度を向上させることができる。また、本発明の測定試薬用ラテックス粒子を用いれば、粒子沈降による測定試薬の保存安定性の低下がなく、高感度な測定試薬を得ることが可能になる。
実施例１、２及び比較例１、２で得られた測定試薬用ラテックス粒子を用いてＣＲＰ抗原標準液を測定した感度曲線（検量線）である。 実施例１～５、比較例１～５で得られた測定試薬用ラテックス粒子を用いてＣＲＰ抗原標準液を測定した感度曲線（検量線）である。（ａ）は、測定した全濃度範囲を表示し、（ｂ）は０．６ｍｇ／ｄＬ以下の濃度範囲について感度曲線を拡大して表示した図である。
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
（実施例１）
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量１Ｌ）に、超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃で１６０ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を行った。
重合終了後、上記溶液をペーパーろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、精製された測定試薬用ラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の平均粒子径０．３５１μｍ、粒子径のＣＶ値は３．８％であった。
なお、ラテックス粒子の粒子径及びＣＶ値は、ラテックス粒子を常法に従ってコロジオン膜状に載せ、透過型電子顕微鏡により粒子画像を撮影し、画像上で観察された１００個以上の粒子の粒子径を計測する方法により求めた。
（実施例２）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水４５０ｇ、エタノール５０ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．３５５μｍ、粒子径のＣＶ値は２．２％であった。
（比較例１）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水２００ｇ、エタノール２００ｇ、スチレンモノマー１２ｇ、１－ビニルナフタレン１８ｇ、過硫酸カリウム０．３０ｇ、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（界面活性剤）０．０６ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．４３３μｍ、粒子径のＣＶ値は１５．０％であった。
本比較例のラテックス粒子は、特許文献２に記載のラテックス粒子に相当する。
（比較例２）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水５００ｇ、スチレンモノマー４５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．４０５μｍ、粒子径のＣＶ値は３．３％であった。
本比較例のラテックス粒子は、特許文献１に記載のラテックス粒子に相当する。
（評価１）
（１）測定試薬用ラテックス粒子のタンパク質吸着量の評価
実施例１、２及び比較例１、２で得られた各測定試薬用ラテックス粒子を用いて、最終濃度が、０．４重量％のラテックス粒子（固形量として４ｍｇ）、０．８ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）となるように混合し、４℃の低温室にて、ウエイブローター（５０ｒｐｍ）を使用しながら３時間振盪させ、ラテックス粒子にＢＳＡを吸着させた。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分、１５℃）を行い、上清を分取し、Ａ／Ｇテストワコー（和光純薬工業社製）測定キットを用いて、上清中のタンパク濃度を測定した。陰性対照（ラテックス粒子未添加）のタンパク濃度から各上清中のタンパク濃度を差し引くことで、ラテックス粒子に吸着したタンパク結合量（ラテックス粒子単位面積当たりのＢＳＡ結合量）を算出した。
結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
表１より、比較例１の測定試薬用ラテックス粒子では、実施例１、２及び比較例２のラテックス粒子に比べて、ＢＳＡ吸着量が著しく低いことが判る。一方、実施例１、２の測定試薬用ラテックス粒子は、比較例２の測定試薬用ラテックス粒子と同程度のＢＳＡ吸着量であった。
以上より、本発明の測定試薬用ラテックス粒子が、界面活性剤を用いて製造した比較例１の測定試薬用ラテックス粒子に比べて、免疫比濁法用測定試薬の構築に有用な抗体等を多量に吸着可能であることが確認された。
（２）感作ラテックス粒子を用いた測定試薬の測定感度の評価
実施例１、２及び比較例１、２で得られた測定試薬用ラテックス粒子を遠心分離で精製した後、抗ＣＲＰ抗体を感作して感作ラテックス粒子を製造した。
得られた感作ラテックス粒子を、０．１％ＢＳＡを含む緩衝液で３回遠心洗浄しブロッキング処理した。次いで、感作ラテックス粒子の濃度を緩衝液で０．０２５重量％に調整し、感作ラテックス粒子を含む測定試薬（第２試薬）を作製した。
得られた測定試薬を用いてＣＲＰ抗原標準液を測定し感度曲線（検量線）を作成した。
得られた感度曲線を図１に示した。
測定条件を以下に示す。
（測定条件Ａ）
　装置：日立７１７０型自動分析装置
　使用波長：５７０ｎｍ／８００ｎｍ
　測光ポイント：１８－３４（エンドポイントアッセイ）
　測定温度：３７℃
　測定試料（０～３６ｍｇ／ｄＬのＣＲＰ標準液）：２ｕＬ
　各ＣＲＰ標準液のＣＲＰ濃度：０．２、０．３、０．６、６、１８、３６ｍｇ／ｄＬ
　第１試薬：ナノピア（登録商標）ＣＲＰ緩衝液１００μＬ
　第２試薬：１００μＬ
測定は、測定試料、第１試薬を混合撹拌した後、更に第２試薬を添加し混合攪拌した。その後、一定時間経過後の濁度を計測するエンドポイントアッセイにて実施した。
図１より、比較例１の測定試薬用ラテックス粒子（共重合時に界面活性剤を使用）より調製した感作ラテックス粒子を用いた測定試薬では、ＣＲＰ０．６ｍｇ／ｄＬ以下で実質的な感度が得られず、また６ｍｇ／ｍＬ以上においても各濃度間の感度差が充分ではなかった。
一方、比較例２の測定試薬用ラテックス粒子（ナフチル基を有する重合性単量体を含有しない）より調製した感作ラテックス粒子を用いた測定試薬では、６ｍｇ／ｄＬの感度が比較例１に対し顕著に向上したが、０．６ｍｇ／ｄＬ以下では比較例１との感度差はわずかであった。
これらに対し、実施例１及び２の測定試薬用ラテックス粒子より調製した感作ラテックス粒子を用いた測定試薬では、いずれのＣＲＰ濃度でも比較例１、２に対して感度が顕著に向上した。特に比較例１及び２で実質的な感度が得られなかった０．６ｍｇ／ｄＬ以下での感度向上が明確であった。以上より、実施例１、２では、比較例２に対してタンパク質の吸着量は同程度であっても、感度向上できることが確認された。
（実施例３）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水３７５ｇ、エタノール１２５ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．３６１μｍ、粒子径のＣＶ値は７．８％であった。
（実施例４）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．３５９μｍ、粒子径のＣＶ値は４．１％であった。
（実施例５）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水４６２．５ｇ、エタノール３７．５ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．３４５μｍ、粒子径のＣＶ値は３．１％であった。
（比較例３）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水２５０ｇ、エタノール２５０ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．４０１μｍ、粒子径のＣＶ値は１７．１％であった。
（比較例４）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水３５０ｇ、エタノール１５０ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．３６８μｍ、粒子径のＣＶ値は１３．０％であった。
（比較例５）
「超純水４００ｇ、エタノール１００ｇ、スチレンモノマー１９ｇ、１－ビニルナフタレン２５ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１５ｇ」に代えて、超純水４７５ｇ、エタノール２５ｇ、スチレンモノマー３５ｇ、１－ビニルナフタレン２０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．０１ｇ、過硫酸カリウム０．１８ｇとしたこと以外は実施例１と同様にして測定試薬用ラテックス粒子を得た。
得られたラテックス粒子の平均粒子径は０．３４３μｍ、粒子径のＣＶ値は２．８％であった。
（評価２）
（１）測定試薬用ラテックス粒子のタンパク質吸着量の評価
実施例３～５、比較例３～５で得られた各測定試薬用ラテックス粒子を用いて、上記「（評価１）」における「（１）測定試薬用ラテックス粒子のタンパク質吸着量の評価」に記載と同様の操作、方法によりラテックス粒子に吸着したタンパク結合量（ラテックス粒子単位面積当たりのＢＳＡ結合量）を算出した。
結果を表１に示した。
（２）感作ラテックス粒子を用いた測定試薬の測定感度の評価
実施例３～５、比較例３～５で得られた測定試薬用ラテックス粒子を用い、上記「（評価１）」における「（２）感作ラテックス粒子を用いた測定試薬の測定感度の評価」に記載と同様の操作、方法により、実施例３～５、比較例３～５で得られた測定試薬用ラテックス粒子をそれぞれ含む測定試薬を作製した。
得られた測定試薬それぞれを用いてＣＲＰ抗原標準液を上記測定条件Ａにより測定し感度曲線（検量線）を作成した。
得られた感度曲線を図２、測定された吸光度を表２に示した。
なお、図２、表２は、上記した実施例１、２、比較例１、２を用いた場合の結果も含め一覧に整理した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表１より、比較例１及び３（エタノール濃度５０％）、比較例４（同３０％）で製造したラテックス粒子では、実施例１及び４（同２０％）、実施例２（同１０％）、実施例３（同２５％）、実施例５（同７．５％）及び比較例５（同５％）で製造したラテックス粒子に比べて、ＣＶ値が１０％を超えた。以上より、エタノール濃度が本発明の好適濃度範囲より高濃度になるとＣＶ値が変動し、得られた測定試薬用ラテックス粒子の粒径の変動幅が大きくなることがわかった。また、比較例２（同０％）、比較例５（同５％）で製造したラテックス粒子では、ＣＶ値は実施例のラテックス粒子と同程度であるものの（以上、表１より）、測定試薬における測定感度は、実施例のラテックス粒子を使用した測定試薬と比較して低く、充分なものではないことがわかった。測定感度については、比較例１、３及び４も同様に、実施例のラテックス粒子を使用した測定試薬と比較して低く、充分なものではないことがわかった（以上、図２及び表２より）。
なお、ＢＳＡ吸着量は、共重合の際に界面活性剤を用いる比較例１を除き、各実施例、各比較例でほぼ同様であった（以上、表１より）。
表１より、実施例３～５の測定試薬用ラテックス粒子と比較例３～５の測定試薬用ラテックス粒子間でＢＳＡ吸着量は同程度であることが確認された。
以上のように本発明によれば、被検物質の濃度が希薄な測定試料であっても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子を製造することができることが確認された。
また、本発明の測定試薬用ラテックス粒子は、従来のポリスチレン系ラテックス粒子に対して、粒子径は同程度のまま、タンパク質の吸着量を低下させることなく、希薄濃度域における被検物質の測定感度を向上させることができることが確認された。
また、本発明の測定試薬用ラテックス粒子の粒子径の分布はＣＶ値で１０％以下に収束しており、粒子径のばらつきが少ないため感作ラテックス粒子の調製時の製造再現性が安定し、結果として測定試薬の性能（測定再現性）も安定させうることが確認された。
本発明によれば、被検物質の濃度が希薄な測定試料を測定する場合であっても高感度な測定を可能にする測定試薬用ラテックス粒子を提供することができる。

Claims (11)

  1. 下記（ａ）～（ｃ）の重合性単量体を含有する単量体混合物を、Ｃ１－４アルコールを７．５～２５重量％含有する水性媒体中で界面活性剤を用いずに共重合してなる共重合体からなることを特徴とする測定試薬用ラテックス粒子。
    （ａ）フェニル基を有する重合性単量体
    （ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体
    （ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体
  2. Ｃ１－４アルコールが、エタノールであることを特徴とする請求項１記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  3. 単量体混合物は、更に重合性不飽和単量体を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  4. 下記（ａ）～（ｃ）の重合性単量体に由来するセグメントを有する共重合体からなり、かつ、界面活性剤を含有しないことを特徴とする測定試薬用ラテックス粒子。
    （ａ）フェニル基を有する重合性単量体
    （ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体
    （ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体
  5. （ａ）～（ｃ）の重合性単量体に由来するセグメントを有する共重合体は、Ｃ１－４アルコールを７．５～２５重量％含有する水性媒体中で単量体混合物を共重合してなる共重合体であることを特徴とする請求項４記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  6. Ｃ１－４アルコールが、エタノールであることを特徴とする請求項５記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  7. 単量体混合物は、重合性不飽和単量体を含有することを特徴とする請求項５又は６記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  8. （ａ）フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、（ｂ）フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸塩、かつ、（ｃ）ナフチル基を有する重合性単量体が１－ビニルナフタレンであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  9. 平均粒子径が０．０１～１．０μｍであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の測定試薬用ラテックス粒子。
  10. 請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９記載の測定試薬用ラテックス粒子に、被検物質と特異的に結合する物質を担持させたことを特徴とする感作ラテックス粒子。
  11. 請求項１０記載の感作ラテックス粒子が緩衝液中に分散していることを特徴とする免疫比濁法用測定試薬。
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