ES2592163T3 - Partícula de látex para reactivo de medición, partícula de látex sensibilizada y reactivo de medición para inmunonefelometría - Google Patents

Partícula de látex para reactivo de medición, partícula de látex sensibilizada y reactivo de medición para inmunonefelometría Download PDF

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Abstract

Una partícula de látex para un reactivo de medición, que comprende un copolímero obtenido por copolimerización de una mezcla de monómeros que comprende los siguientes monómeros polimerizables (a) a (c): (a) un monómero polimerizable que tiene un grupo fenilo; (b) un monómero polimerizable que tiene un grupo fenilo y un sulfonato; y (c) un monómero polimerizable que tiene un grupo naftilo; en un medio acuoso que contiene 7,5 a 25 % en peso de alcohol C1-4 sin utilizar cualquier tensioactivo distinto de dicho monómero polimerizable (b).

Description

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cantidad de proteína que se va a adsorber. Además, cuando se usa la partícula de látex para un reactivo de medición de la presente invención, se puede obtener un reactivo de medición altamente sensible libre de la degradación de la estabilidad de almacenamiento del reactivo de medición a través de la precipitación de las partículas.
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Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra curvas de sensibilidad (curvas analíticas) obtenidas mediante la medición de una solución estándar de antígeno CRP mediante el uso de partículas de látex de un reactivo de medición producido en los
10 Ejemplos 1 y 2 y en los Ejemplos Comparativos 1 y 2. La figura 2 ilustra curvas de sensibilidad (curvas analíticas) obtenidos mediante la medición de una solución estándar de antígeno CRP mediante el uso de partículas de látex para un reactivo de medición producido en los Ejemplos 1 a 5 y los Ejemplos Comparativos 1 a 5, donde la Figura 2(a) ilustra la totalidad de la región de la concentración medida y la Figura 2(b) ilustra de forma ampliada las curvas de sensibilidad en una región de
15 concentración de 0,6 mg/dl o menos.
Descripción de las realizaciones
La presente invención se describirá a continuación con más detalle con referencia a los ejemplos, pero cabe 20 destacar que la presente invención no está limitada a estos ejemplos.
(Ejemplo 1)
Un recipiente de reacción de vidrio (con un volumen de 1 l) equipado con un agitador, un condensador de reflujo, un
25 detector de temperatura, un tubo de introducción de nitrógeno y una camisa se cargó con 400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de una monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato potásico, y, después de sustituir el interior del recipiente por un gas de nitrógeno, se realizó la polimerización durante 24 horas con agitación a 70 ºC y a una velocidad de 160 rpm.
30 Una vez completada la polimerización, la solución resultante se sometió a un tratamiento de filtración con un filtro de papel, sacando de este modo las partículas de látex. Después de ello, las partículas de látex se sometieron a un tratamiento de diálisis con una membrana de diálisis durante 48 horas, y, por lo tanto, se obtuvieron partículas de látex refinado para un reactivo de medición. Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,351 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 3,8 %.
35 De forma accidental, el tamaño de partícula y el valor de CV de las partículas de látex se obtuvieron por el método siguiente: las partículas de látex se colocaron en una membrana de colodión mediante un método habitual, una imagen de las partículas se capturó mediante el uso de un microscopio electrónico de transmisión, y se midieron tamaños de partículas de 100 o más partículas observadas en la imagen.
40 (Ejemplo 2)
Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron 450 g de agua ultrapura, 50 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1-vinilnaftaleno,
45 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,355 µm y un valor de 50 CV del tamaño de partícula de 2,2 %.
(Ejemplo comparativo 1)
Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto
55 que se usaron 200 g de agua ultrapura, 200 g de etanol, 12 g de un monómero de estireno, 18 g de 1-vinilnaftaleno, 0,30 g de persulfato de potasio y 0,06 g de dodecilbencenosulfonato de sodio (un tensioactivo) en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio.
60 Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,433 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 15,0 %.
Las partículas de látex de este ejemplo comparativo corresponden a las partículas de látex descritas en la literatura de patentes 2.
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A partir de la Tabla 1 se entiende que la cantidad de BSA adsorbida es extremadamente pequeña en el uso de las partículas de látex para un reactivo de medición del Ejemplo Comparativo 1, en comparación con la alcanzada en el uso de las partículas de látex de los Ejemplos 1 y 2 y el Ejemplo Comparativo 2. Por otra parte, las partículas de látex para un reactivo de medición de los Ejemplos 1 y 2 mostraron la cantidad de BSA adsorbida equivalente a la de
5 las partículas de látex para un reactivo de medición del ejemplo comparativo 2.
Basándose en estos resultados, se confirmó que las partículas de látex para un reactivo de medición de la presente invención pueden adsorber una gran cantidad de anticuerpo o similar útiles para construir un reactivo de medición para el método inmunoturbidimétrico en comparación con las partículas de látex para un reactivo de medición del
10 Ejemplo comparativo 1 producido mediante el uso de un agente tensioactivo.
(2) Evaluación de la sensibilidad de medición del reactivo de medición utilizando partículas de látex recubiertas
Después de que las partículas de látex para un reactivo de medición producido en cada uno de los Ejemplos 1 y 2 y 15 los Ejemplos Comparativos 1 y 2 se refinaran mediante centrifugación, un anticuerpo anti-CRP se recubrió sobre partículas de látex.
Las partículas de látex recubiertas con el anticuerpo obtenidas de este modo se sometieron a tres lavados centrífugos con una solución tampón que contiene 0,1 % de BSA y después se sometieron a un tratamiento de
20 bloqueo. Posteriormente, la concentración de las partículas de látex recubiertas de anticuerpo se ajustó a 0,025 % en peso con una solución tampón, con lo que se produjo un reactivo de medición (segundo reactivo) que contenía las partículas de látex recubiertas de anticuerpo.
Los reactivos de medición obtenidos de este modo se utilizaron para la medición de una solución estándar de 25 antígeno CRP, obteniendo de este modo las curvas de sensibilidad (curvas analíticas).
Las curvas de sensibilidad obtenidas se muestran en la Figura 1.
Las condiciones de la medición fueron las siguientes:
30 (Condiciones de medición A) Aparato: Autoanalizador Hitachi 7170 Longitud de onda: 570 nm/800 nm Punto fotométrico: 18 -34 (ensayo de punto final) Temperatura de medición: 37 ºC
35 Muestra de medición (soluciones estándar de PCR de 0-36 mg/dL): 2 µl Concentraciones de PCR en las respectivas soluciones estándar de CRP: 0,2, 0,3, 0,6, 6, 18, 36 mg/dl Primer reactivo: Nanopia (marca registrada) Solución tampón para CRP 100 µl Segundo reactivo: 100 µl
40 La medición se realizó mediante un ensayo de punto final como sigue: Una muestra de medición y el primer reactivo se mezclaron y se agitaron, se añadió el segundo reactivo adicional a la misma, y la solución resultante se mezcló y se agitó. Después de un cierto período de tiempo, se midió la turbidez.
Haciendo referencia a la figura 1, el reactivo de medición con las partículas de látex recubiertas de anticuerpo
45 preparadas a partir de las partículas de látex para un reactivo de medición del ejemplo comparativo 1 (utilizando un agente tensioactivo en la copolimerización) no pudo alcanzar la sensibilidad sustancial a una concentración de CRP de 0,6 mg/dl o menos y tampoco pudo alcanzar suficientes diferencias de sensibilidad entre las concentraciones respectivas cuando la concentración de CRP fue de 6 mg/ml o más.
50 Por otra parte, el reactivo de medición con las partículas de látex recubiertas de anticuerpo preparadas a partir de las partículas de látex para un reactivo de medición del ejemplo comparativo 2 (que no contiene un monómero polimerizable que tiene un grupo naftilo) mostró una sensibilidad notablemente mejorada a una concentración de 6 mg/dl en comparación con la del Ejemplo comparativo 1, pero pudo alcanzar una sensibilidad solo ligeramente mejorada a una concentración de 0,6 mg/dl o menos en comparación con la del Ejemplo comparativo 1.
55 Por el contrario, los reactivos de medición utilizando las partículas de látex recubiertas de anticuerpo preparadas a partir de las partículas de látex para un reactivo de medición de los Ejemplos 1 y 2 mostraron ambos una sensibilidad notablemente mejorada en cualquier concentración de CRP en comparación con las de los Ejemplos Comparativos 1 y 2. En particular, la sensibilidad se mejoró claramente a una concentración de 0,6 mg/dl o menos
60 donde no se pudo observar una sensibilidad sustancial por los de los ejemplos comparativos 1 y 2. Así pues, se confirmó que la sensibilidad puede mejorarse en los Ejemplos 1 y 2, aunque la cantidad de proteína adsorbida sea equivalente a la alcanzada en el Ejemplo Comparativo 2.
(Ejemplo 3)
Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron 375 g de agua ultrapura, 125 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1-vinilnaftaleno,
5 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,361 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 7,8 %.
(Ejemplo 4)
Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto
15 que se usaron 400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio”.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,359 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 4,1 %.
(Ejemplo 5)
25 Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron 462,5 g de agua ultrapura, 37,5 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio”.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,345 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 3,1 %.
(Ejemplo comparativo 3)
35 Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron 250 g de agua ultrapura, 250 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,401 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 17,1 %.
45 (Ejemplo comparativo 4)
Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron 350 g de agua ultrapura, 150 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio”.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,368 µm y un valor de CV del tamaño de partícula de 13,0 %.
55 (Ejemplo comparativo 5)
Las partículas de látex para un reactivo de medición se obtuvieron de la misma manera que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron 475 g de agua ultrapura, 25 g de etanol, 35 g de un monómero de estireno, 20 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,18 g de persulfato de potasio en lugar de "400 g de agua ultrapura, 100 g de etanol, 19 g de un monómero de estireno, 25 g de 1-vinilnaftaleno, 0,01 g de sulfonato de estireno de sodio y 0,15 g de persulfato de potasio”.
Las partículas de látex obtenidas de este modo tenían un tamaño promedio de partícula de 0,343 µm y un valor de 65 CV del tamaño de partícula de 2,8 %.
(Evaluación 2)
(1) Evaluación de la cantidad de adsorción de proteínas de las partículas de látex para el reactivo de medición
5 Las partículas de látex de un reactivo de medición producido en cada uno de los Ejemplos 3 a 5 y los Ejemplos Comparativos 3 a 5 se utilizaron para el cálculo de la cantidad de unión de la proteína adsorbida en las partículas de látex (una cantidad de unión a BSA de por unidad de superficie de las partículas de látex) a través de la misma operación y por el mismo método que se ha descrito anteriormente en el punto "(1) Evaluación de la cantidad de adsorción de proteínas de partículas de látex para el reactivo de medición" de la "Evaluación 1”.
10 Los resultados se muestran en la Tabla 1.
(2) Evaluación de la sensibilidad del reactivo de medición utilizando partículas de látex
15 Las partículas de látex de un reactivo de medición producido en cada uno de los Ejemplos 3 a 5 y los Ejemplos Comparativos 3 a 5 se utilizaron para la fabricación de un reactivo de medición que contiene las partículas de látex para un reactivo de medición de cada uno de los ejemplos 3 a 5 y los ejemplos Comparativos 3 a 5 a través de la misma operación y por el mismo método que se ha descrito anteriormente en el punto "(2) Evaluación de la sensibilidad de la medición del reactivo de medición utilizando partículas de látex" de la "Evaluación 1”.
20 Los reactivos de medición obtenidos de este modo se utilizaron para la medición de una solución estándar de antígeno CRP en las condiciones A de medición mencionadas anteriormente para obtener las curvas de sensibilidad (curvas analíticas).
25 Las curvas de sensibilidad obtenidas se muestran en la Figura 2 y LAS absorbancias medidas se muestran en la Tabla 2.
Accidentalmente, los resultados obtenidos en los Ejemplos 1 y 2 y los Ejemplos Comparativos 1 y 2 descritos anteriormente también se muestran en la Figura 2 y en la Tabla 2.
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