JP6188577B2 - 粒子凝集測定用ラテックス粒子 - Google Patents
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Description
[1]フェニル基を有する重合性単量体、及び、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を成分とし、かつ非イオン性界面活性剤を水性媒体に対する重量%濃度で、0.005〜0.02%とした反応系で乳化重合したラテックスであって、平均粒子径が0.005〜1.0μmであることを特徴とする粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[2]非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー又はポリオキシアルキレンアルキルエーテル類である、上記[1]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[3]ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、下記式(I)に示す構造を有し、重量平均分子量が1000〜15000であり、かつEO(エチレンオキサイド、以下同様)含有率が5〜90%である、上記[2]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
HO(C2H4O)a−(C3H6O)b−(C2H4O)cH (I)
(式中、a,b,cは任意の整数を表し、a+b+cが17〜300単位となることを限度として、a+cは2〜270単位の平均重合度のオキシエチレンとなるよう決定され、かつbは15〜40単位の平均重合度のオキシプロピレンとなるよう決定される。)
[4]ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、(1)〜(4)よりなる群より選ばれるものである、上記[3]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
(1)重量平均分子量1333、EO含有率10%、
(2)重量平均分子量2222、EO含有率10%、
(3)重量平均分子量8000、EO含有率85%、
(4)重量平均分子量13333、EO含有率85%。
[5]ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、下記式(II)に示す構造を有し、HLB値が、5.0〜19.3の範囲にある、上記[2]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
R1O(AO)n−H (II)
(式中、R1は、炭素数8〜22の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基を示し、AOはオキシアルキレン基を示し、Aは炭素数2〜4のアルキル基を示す。nはAOが示すオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、nは2〜15の整数である。)
[6]ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、(1)〜(3)よりなる群より選ばれるものである、上記[2]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
(1)ポリオキシエチレントリデシルエーテル(HLB10.5)、
(2)ポリオキシエチレンラウリルエーテル(HLB9.5)、
(3)ポリオキシエチレン2-エチルヘキシルエーテル(HLB14.6)。
[7]フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムであることを特徴とする上記[2]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
[8]上記[1]〜[7]のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
[9]抗原または抗体を物理吸着により担持する上記[1]〜[7]のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
また、一段階での重合反応によりラテックス粒子を作製できるため、非常に簡便な方法でラテックス粒子を得ることができ、かつ抗原や抗体の感作も物理吸着で行うよう設計されているため、容易に高感度な粒子凝集測定試薬を製造することが可能である。
(式中、a,b,cは任意の整数を表し、a+b+cが17〜300単位となることを限度として、a+cは2〜270単位の平均重合度のオキシエチレンとなるよう決定され、かつbは15〜40単位の平均重合度のオキシプロピレンとなるよう決定される。)
なお、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーの成分としての表記は数種類存在し、各表記間で相互に同一性、類似性を確認できるが、同一名称の市販品であっても各表記間での数値が完全に一致しない場合がある。これらは重合性高分子に特有のものであり当業者は当然に理解しうる。
「エパン(登録商標)」の名称で第一工業製薬社より販売されている非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられる。
エパン410:重量平均分子量1333、EO含有率10%、
エパン710:重量平均分子量2222、EO含有率10%、
エパン485:重量平均分子量8000、EO含有率85%、
エパン785:重量平均分子量13333、EO含有率85%、
エパン750:重量平均分子量4000、EO含有率50%、
エパン420:重量平均分子量1500、EO含有率20%、
エパン450:重量平均分子量2400、EO含有率50%、
エパン610:重量平均分子量2000、EO含有率10%、
エパン680:重量平均分子量8800、EO含有率80%、
エパン740:重量平均分子量3300、EO含有率40%、
エパン720:重量平均分子量2500、EO含有率20%、
これらのうち、エパン410、エパン710、エパン485、エパン785を使用することが本発明には好ましい。
プルロニックL−42:PPG分子量1,200、EO含有率20%
プルロニックL−43:PPG分子量1,200、EO含有率30%
プルロニックL−44:PPG分子量1,200、EO含有率40%
プルロニックL−61:PPG分子量1,750、EO含有率10%
プルロニックL−62:PPG分子量1,750、EO含有率20%
プルロニックL−64:PPG分子量1,750、EO含有率40%
プルロニックP−65:PPG分子量1,750、EO含有率50%
プルロニックF−68:PPG分子量1,750、EO含有率80%
R1O(AO)n−H (II)
(式中、R1は、炭素数8〜22の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基を示し、AOはオキシアルキレン基を示す。nはAOが示すオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、nは2〜15の整数である。)
ポリオキシエチレン2-エチルヘキシルエーテル(ニューコール1008:日本乳化剤社製など)、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル(ノイゲンXL:ポリオキシアルキレン部分はポリオキシ短鎖アルキレンとポリオキシエチレンの重合体よりなる。第一工業製薬社製など)、ポリオキシエチレンイソデシルエーテル(ノイゲンSD:第一工業製薬社製など)、ポリオキシエチレンラウリルエーテル(DKSNL:第一工業製薬社製など)、ポリオキシエチレントリデシルエーテル(ノイゲンTDS:第一工業製薬社製など)、ポリオキシアルキレントリデシルエーテル(ノイゲンTDX:ポリオキシアルキレン部分はポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンの重合体よりなる。第一工業製薬社製など)、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル(ノイゲンLF:第一工業製薬社製など)、ポリオキシエチレンセチルエーテル(ニューコール1606:日本乳化剤社製など)、ポリオキシエチレンオレイルエーテル(ニューコール1204:日本乳化剤社製など)、などが挙げられる。
これらのうち、ノイゲンTDS−50(ポリオキシエチレントリデシルエーテル。HLB10.5)、DKS NL40(ポリオキシエチレンラウリルエーテル。HLB9.5)、ニューコール1008(ポリオキシエチレン2-エチルヘキシルエーテル。HLB14.6)を使用することが本発明には好ましい。
HLB値=20x親水部の式量の総和/分子量 (III)
本発明においてHLB値は、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類の構造を特定する上で有用な情報である。例えば、ノイゲンTDS−50(ポリオキシエチレントリデシルエーテル。HLB10.5)であれば、HLB値=ポリオキシエチレンの式量の総和/(トリデシルエーテル部分の分子量+ポリオキシエチレンの式量の総和)より、10.5=(44n)/(199+44n)を代入することで、ポリオキシエチレン付加モル数nを、約5と見積もることができる。
粒子径の変動係数(CV値)=粒子径の標準偏差/平均粒子径
ラテックス粒子の粒径測定
ラテックス粒子を常法に従ってコロジオン膜状に載せ、透過型電子顕微鏡により粒子画像を撮影し、画像上の粒子径(100個以上)を計測することにより平均粒子径及び標準偏差を求めた。
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器(容量2L)に、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:分子量1333、EO含有率10%、第一工業製薬社製)0.10gを超純水1000gに溶解させた溶液、及びスチレンモノマー150g、スチレンスルホン酸ナトリウム0.80g、過硫酸カリウム0.72gを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、70℃、210rpmの速度で攪拌しながら24時間重合を実施した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて48時間透析処理を行い、精製されたラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.114μm(CV10.4%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン710:分子量2222、EO含有率10%、第一工業製薬社製)0.10gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.116μm(CV9.6%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン485:分子量8000、EO含有率85%、第一工業製薬社製)0.10gに変更したこと、及びスチレンスルホン酸ナトリウム0.80gを2.00gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.093μm(CV9.5%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン785:分子量13333、EO含有率85%、第一工業製薬社製)0.10gに変更したこと、及びスチレンスルホン酸ナトリウム0.80gを2.00gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.108μm(CV6.6%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gを0.05gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.110μm(CV10.9%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gを0.20gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.104μm(CV11.2%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシアルキレンアルキルエーテル類であるポリオキシエチレントリデシルエーテル(ノイゲンTDS−50:第一工業製薬社製、HLB10.5)0.10gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.101μm(CV10.2%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシアルキレンアルキルエーテル類であるポリオキシエチレンラウリルエーテル(DKSNL−40:第一工業製薬社製、HLB9.5)0.10gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.102μm(CV10.5%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシエチレン2-エチルヘキシルエーテル(ニューコール1008:日本乳化剤社製、HLB14.6)0.10gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.107μm(CV11.1%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)を用いなかったこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.099μm(CV11.1%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gを1.00gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.105μm(CV9.8%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン710:第一工業製薬社製)1.00gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.107μm(CV8.6%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gを0.04gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.102μm(CV9.9%)であった。
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー(エパン410:第一工業製薬社製)0.10gを0.30gに変更したこと以外は実施例1と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、0.101μm(CV10.8%)であった。
用いた試薬及び材料は以下の通りである。
<試薬及び材料>
・抗Dダイマー抗体
・抗体感作ラテックス調製用緩衝液:20mM Tris-HCl(pH8.0)を用いた。
・ブロッキング用緩衝液:2%BSAを含む20mM Tris-HCl(pH8.0)を用いた。
・検体希釈用緩衝液:0.15%BSAを含む30mM Tris-HCl(pH8.5)を用いた。
実施例1〜6、比較例1〜3で得られたラテックス粒子を遠心分離で精製した後、5%(w/v)となるよう抗体感作ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈ラテックス液を調製した。
一方、抗Dダイマー抗体を濃度1mg/mLとなるよう抗体感作ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈抗体溶液を調製した。
上記希釈ラテックス液1容を攪拌しながら上記希釈抗体溶液1容を添加・混合し、更に攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液2容を追加添加し、攪拌を続けた。その後、これを回収し、緩衝液を用いて0.5%(w/v)に調整して、抗体感作ラテックス分散液とした。該抗体感作ラテックス分散液を用い、Dダイマー抗原標準液にて検量線を作成した。
装置:日立 7170型自動分析装置
使用波長:570/800nm、測定温度:37℃
被検査物質(0〜58μg/mLのDダイマー標準液):12μL
第1試薬(0.15%BSAを含む30mM Tris-HCl(pH8.5)):100μL
第2試薬(抗体感作ラテックス(0.5%(w/v))分散液):100μL
測光ポイント:18−34
実施例1〜6および比較例1〜3のラテックス粒子に抗Dダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス(0.5%(w/v))分散液を用いて、上記測定方法に従い測定し、検量線を作成した(図1)。実施例1〜6のラテックス粒子を用いた場合は高感度の測定が可能であった。一方、比較例1〜3のラテックス粒子を用いた場合は、実施例1に比較して低い感度しか得られなかった。
実施例1〜6および比較例1〜3のラテックス粒子に抗Dダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス粒子(0.5%(w/v))分散液とDダイマー乖離検体(2種)を用いて、上記測定方法に従い測定し、その値を測定例1によって求めた検量線からそれぞれ濃度換算を行った。ここで、Dダイマー乖離検体とは、従来のDダイマー免疫比濁測定系で非特異的凝集反応が観察された検体をいう。その結果を図2及び図3に示す。実施例1〜6のラテックス粒子を用いた場合は、非イオン性界面活性剤を用いなかった比較例1に対して、乖離検体の非特異的凝集反応を高度に抑制することが認められた。また、比較例2〜3のラテックス粒子を用いた場合は、実施例1〜6よりも高度に乖離検体の非特異的凝集反応を抑制することが認められたが、感度が大幅に低下していることから、抗体がラテックス粒子表面に十分に吸着(感作)しなかったと考えられる。
用いた試薬及び材料は以下の通りである。
<試薬及び材料>
適用例1に同じ。
実施例7〜9、比較例4〜5で得られたラテックス粒子を用いた以外は、適用例1と同様の操作にて抗体感作ラテックス分散液を調整した。
該抗体感作ラテックス分散液を用い、Dダイマー抗原標準液にて検量線を作成した。
装置:日立 7170型自動分析装置
使用波長:570/800nm、測定温度:37℃
被検査物質(0〜58μg/mLのDダイマー標準液):12μL
第1試薬(0.15%BSAを含む30mM Tris−HCl(pH8.5)):100μL
第2試薬(抗体感作ラテックス(0.5%(w/v))分散液):100μL
測光ポイント:18−34
実施例7〜9および比較例4〜5のラテックス粒子に抗Dダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス(0.5%(w/v))分散液を用いて、上記測定方法に従い測定し、検量線を作成した(図4)。実施例7〜9のラテックス粒子を用いた場合は高感度の測定が可能であった。一方、比較例4〜5のラテックス粒子を用いた場合は、実施例7〜9に比較して低い感度しか得られなかった。
実施例7〜9および比較例4〜5のラテックス粒子に抗Dダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス粒子(0.5%(w/v))分散液と、適用例1と同じDダイマー乖離検体(2種)を用いて、上記測定方法に従い測定し、その値を測定例3によって求めた検量線からそれぞれ濃度換算を行った。その結果を図5及び図6に示す。実施例7〜9のラテックス粒子を用いた場合は、非イオン性界面活性剤を用いる濃度が低い比較例4に対して、乖離検体の非特異的凝集反応を高度に抑制することが認められた。また、比較例5のラテックス粒子を用いた場合は、実施例7〜9よりも乖離検体の非特異的凝集反応を抑制することが認められたが、感度が大幅に低下していることから、抗体がラテックス粒子表面に十分に吸着(感作)しなかったと考えられる。
Claims (8)
- フェニル基を有する重合性単量体、及び、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を成分とし、かつ非イオン性界面活性剤を水性媒体に対する重量%濃度で、0.005〜0.02%とした反応系で乳化重合したラテックスであって、
平均粒子径が0.005〜1.0μmであり、
上記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー又はポリオキシアルキレンアルキルエーテル類である粒子凝集測定用ラテックス粒子。 - 上記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、下記式(I)に示す構造を有し、重量平均分子量が1000〜15000であり、かつEO含有率が5〜90%である請求項1に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
HO(C2H4O)a−(C3H6O)b−(C2H4O)cH (I)
(式中、a,b,cは任意の整数を表し、a+b+cが17〜300単位となることを限度として、a+cは2〜270単位の平均重合度のオキシエチレンとなるよう決定され、かつbは15〜40単位の平均重合度のオキシプロピレンとなるよう決定される。) - 上記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、(1)〜(4)よりなる群より選ばれるものである請求項2に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
(1)重量平均分子量1333、EO含有率10%、
(2)重量平均分子量2222、EO含有率10%、
(3)重量平均分子量8000、EO含有率85%、
(4)重量平均分子量13333、EO含有率85%。 - 上記ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、下記式(II)に示す構造を有し、HLB値が、5.0〜19.3の範囲にある請求項1に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
R1O(AO)n−H (II)
(式中、R1は、炭素数8〜22の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基を示し、AOはオキシアルキレン基を示し、Aは炭素数2〜4のアルキル基を示す。nはAOが示すオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、nは2〜15の整数である。) - 上記ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、(1)〜(3)よりなる群より選ばれるものである請求項1に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
(1)ポリオキシエチレントリデシルエーテル(HLB10.5)、
(2)ポリオキシエチレンラウリルエーテル(HLB9.5)、
(3)ポリオキシエチレン2-エチルヘキシルエーテル(HLB14.6)。 - 上記フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムである請求項1に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
- 上記請求項1〜6のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
- 抗原または抗体を物理吸着により担持する上記請求項1〜6のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる、粒子凝集測定試薬。
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