KR101835918B1 - Psa의 측정 방법 및 그의 시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 평균 입경이 상이한 담체를 사용하지 않고, 1단계의 반응으로, 간편하고 고정밀도로 PSA를 측정하는 방법 및 그의 시약을 제공한다. 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽에 반응하는 항PSA 모노클로날 항체로서, 서로 에피토프를 다르게 하는 2종의 항PSA 모노클로날 항체에서, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 동일 평균 입경의 불용성 담체를 감작하고, 응집 촉진제의 공존하에 시료와 접촉시키는 PSA의 측정 방법 및 이것에 사용하는 시약을 제공한다.

Description

PSA의 측정 방법 및 그의 시약 {PSA ASSAY METHOD AND REAGENT THEREFOR}
본 발명은 면역 응집 반응에 의해 유리형의 항원과, 유리형의 항원과 검체 중 공존 물질로 복합체를 형성하고 있는 복합체형의 항원 둘 다를 등몰의 반응성으로 측정하는 항원의 측정 방법 및 시약에 관한 것이다. 특히 전립선 특이 항원을 측정하기 위한 방법 및 그것에 사용하는 시약에 관한 것이다.
전립선암은 남성에게서 볼 수 있는 악성 질환으로, 미국이나 유럽에서 환자수가 많고, 최근 일본에서도 환자수가 급격하게 증가하고 있다. 전립선암은 증식이 더딘 종양이라는 점, 방사선 요법이나 항 남성 호르몬 요법이 효과를 발휘하기 쉽다는 특징이 있다는 점에서, 조기 발견이 중요한 과제이다.
전립선 특이 항원(Prostate Specific Antigen, 이하, 간단히 "PSA"라고도 함)은, 전립선 표피 세포로부터 분비되는 세린 프로테아제의 일종으로, 분자량 33,000 내지 34,000달톤의 당단백이다. 이 PSA는, 전립선에 질환이 있으면 혈액 중 농도가 정상인보다도 높아지기 때문에, 전립선 질환(특히 전립선암)의 조기 발견에 유용하다고 알려져 있다. PSA에는 혈중에서 프로테아제 억제제와 결합하는 복합체형과, 비결합된 유리형 PSA(이하, "fPSA"라고도 함)가 있지만, 혈중 PSA의 대부분은 복합체형이고, 전립선 특이 항원-α1-안티키모트립신 복합체(이하, "PSA-ACT"라고도 함)나, 전립선 특이 항원-α2-매크로글로불린 복합체 등이 존재하고 있다. 이 중, 면역학적 측정 방법으로 측정할 수 있는 것은 fPSA와 PSA-ACT의 2종이다.
면역학적 측정 방법으로는 라텍스 등을 사용한 응집 반응에 의한 측정 방법(소위 면역 응집 반응 측정법)이 사용되고 있다. 그러나, 항PSA 모노클로날 항체의 fPSA에 대한 반응성과 PSA-ACT에 대한 반응성이 상이하기 때문에, 총PSA량을 제대로 측정할 수 없다는 문제가 있었다.
이러한 문제를 해결하는 종래 기술로서, 예를 들어 특허문헌 1에서는, (1) 측정 대상 물질이 유리 상태이거나, 거기에 대응하는 결합 분자와 결합한 복합체여도 결합 가능한 제1 모노클로날 항체를 감작(感作)한 제1 불용성 담체 입자를 포함하는 제1 입자 현탁액, (2) 상기 측정 대상 물질이 유리 상태이거나, 거기에 대응하는 결합 분자와 결합한 복합체여도 결합 가능하며, 추가로 상기 제1 모노클로날 항체와 경합하지 않는 제2 모노클로날 항체를 감작한 제2 불용성 담체 입자를 포함하는 제2 입자 현탁액, 및 (3) 상기 측정 대상 물질이 유리 상태에서는 인식되지 않지만 상기 측정 대상 물질이 그것에 대응하는 결합 분자와 결합한 복합체를 인식하는 제3 모노클로날 항체를 감작한 제3 불용성 담체 입자를 포함하는 제3 입자 현탁액을 포함하는 면역 응집 측정용 시약 및 그것을 사용하는 방법이 제안되어 있다.
또한, 특허문헌 2에서는, 유리형의 항원과 복합체형의 항원 둘 다에 반응성을 갖고, 각각 인식 부위가 상이한 3종의 모노클로날 항체 중 적어도 1종을, 입경이 상이한 2종 이상의 담체 중 입경이 작은 쪽의 담체에 감작하고, 나머지 모노클로날 항체를 입경이 큰 쪽의 담체에 감작함으로써 유리형의 항원과 복합체형의 항원의 반응성을 조정하는 측정 시약 및 그것을 사용하는 측정 방법이 제안되어 있다.
또한, 특허문헌 3에서는, 측정 대상 물질이 유리체 및 복합체에서 존재하는 검체와, 측정 대상 물질에 대한 모노클로날 항체 1을 고정화한 라텍스 1을 반응시켜 반응체 1을 얻는 공정 (1), 및 항체 1과 측정 대상 물질에 대한 인식 부위가 상이한 모노클로날 항체 2를 고정화한 라텍스 2와, 반응체 1을 반응시켜 반응체 2를 얻는 공정 (2)를 포함하는, 즉 2단계로 반응시키는 면역 측정 방법이 제안되어 있다.
또한, 특허문헌 4에서는, 전립선 특이 항원의 유리체와 결합체의 양자와 반응성을 갖는 모노클로날 항체 1이 고정화된 라텍스 1과, 항체 1과는 전립선 특이 항원에 대한 인식 부위가 상이한, 전립선 특이 항원의 유리체와 결합체의 양자와 반응성을 갖는 모노클로날 항체 2가 고정화된, 라텍스 1과는 평균 입경이 상이한 라텍스 2를 포함하는, 전립선 특이 항원 측정용의 면역학적 측정용 시약 및 그것을 사용하는 측정 방법이 제안되어 있다.
일본 특허 공개 제2001-108681호 공보 WO 2006/068206 팸플릿 일본 특허 공개 제2007-163319호 공보 일본 특허 제4241301호 공보
그러나, 상기 특허문헌 1에 기재된 방법은, 평균 입경 0.78㎛의 폴리스티렌 라텍스에 항PSA 모노클로날 항체를 감작하여 fPSA 및 PSA-ACT를 상이한 비율로 혼합한 시료의 측정 결과가 나타내고 있는 바와 같이, PSA-ACT의 혼합 비율이 증가함에 따라 상대 측정값의 저하가 인정되고 있다. 즉, PSA-ACT뿐인 경우에는 유리의 PSA에 대한 상대 측정값이 81.43％로, 등몰 반응성은 얻어지지 않고 있다. 또한, 특허문헌 2에 기재된 방법에서는 입경이 상이한 라텍스를 조합할 필요가 있고, 특허문헌 3에 기재된 방법에서는 제1 모노클로날 항체를 반응시킨 후에 제2 모노클로날 항체를 반응시킨다는 2단계의 반응을 일으킬 필요가 있었다. 또한, 특허문헌 4에 기재된 방법도 입경이 상이한 라텍스를 조합할 필요가 있다. 또한, 특허문헌 4에는 동일한 평균 입경(0.22㎛)의 라텍스를 사용한 비교예가 나타나 있지만, 응집 촉진제를 사용한 것이 아니며, 등몰 반응성도 얻어지지 않고 있다.
따라서, 보다 간편하고 정확하게 PSA의 총량(면역학적 측정 방법으로 측정 가능한 fPSA와 PSA-ACT의 합)을 측정하는 방법의 개발이 요망되고 있었다.
즉, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 평균 입경이 상이한 담체를 사용하지 않고 1단계의 반응으로 간편하고 고정밀도로 PSA를 측정하는 방법 및 그의 시약을 제공하는 것이다. 또한, 특별히 언급이 없는 한 PSA의 측정이란, PSA의 총량을 측정하는 것을 의미한다.
과제를 해결하기 위한 수단으로서의 본 발명은 다음의 것을 포함한다.
(1) 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽에 반응하는 항PSA 모노클로날 항체로서, 서로 에피토프를 다르게 하는 2종의 항PSA 모노클로날 항체로, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 동일 평균 입경의 불용성 담체를 감작하고, 응집 촉진제의 공존하에서 시료와 접촉시키는 PSA의 측정 방법.
(2) 상기 (1)에 있어서, 응집 촉진제가 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)으로부터 선택되는 1종 이상인 측정 방법.
(3) 상기 (1)에 있어서, 불용성 담체가 합성 고분자를 포함하는 라텍스, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체의 재질로 이루어지는 입자로부터 선택되는 1종 이상인 측정 방법.
(4) 상기 (1)에 있어서, 응집 촉진제의 농도가 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽과 등몰 반응성을 나타내도록 조정되어 있는 측정 방법.
(5) 상기 (2)에 있어서, 다당류가 덱스트란, 풀루란, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스의 알킬화 다당류로부터 선택되는 1종 이상인 측정 방법.
(6) 상기 (3)에 있어서, 합성 고분자가 폴리스티렌, 스티렌-술폰산 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산 에스테르 공중합체, 아세트산비닐-아크릴산 에스테르 공중합체로부터 선택되는 1종 이상인 측정 방법.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 2종의 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd)와, 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT에 대한 해리상수(cKd)의 비(fKd/cKd)가 모두 0.1보다 크고 2.0 이하이며, 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd값)가 10nM 이하인 측정 방법.
(8) 적어도 다음의 1) 및 2)를 포함하는 PSA 측정용 시약.
1) 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽에 반응하는 항PSA 모노클로날 항체로서, 서로 에피토프를 다르게 하는 2종의 항PSA 모노클로날 항체를, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 동일 평균 입경의 불용성 담체에 각각 감작시킨 항체 감작 담체
2) 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)으로부터 선택되는 1종 이상의 응집 촉진제
(9) 상기 (1)에 있어서,
2종의 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd)와, 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT에 대한 해리상수(cKd)의 비(fKd/cKd)가 모두 0.1보다 크고 2.0 이하이며, 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd값)가 10nM 이하이고,
상기 응집 촉진제가 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하여,
당해 응집 촉진제의 첨가량을 조정함으로써,
유리형 PSA와, 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT가 둘 다 등몰 반응성을 나타내도록 조정하는, PSA의 측정 방법.
본 발명의 측정 방법은 평균 입경이 상이한 담체를 사용할 필요가 없고, 측정도 1단계의 반응으로 일으킬 수 있어, 간편하고 고정밀도로 PSA를 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면, 특수한 장치를 필요로 하지 않고, 범용의 자동 분석 장치를 이용하여 고정밀도의 측정을 할 수 있다.
(측정 대상 물질)
본 발명은 전립선 특이 항원(PSA)을 측정 대상 물질로 하는 것이다. 면역학적 측정 방법으로 측정할 수 있는 PSA는, 혈장 중에서는 유리형(fPSA)과, fPSA와 α1-안티키모트립신의 복합체형(PSA-ACT)이다.
대상 시료로는, 상기 PSA를 함유하는 시료이면 특별히 제한은 되지 않지만, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 등이 바람직하다.
(항PSA 모노클로날 항체)
PSA에 대한 모노클로날 항체로는, fPSA와 PSA-ACT의 양자와 반응성을 갖는 것으로, 서로 에피토프를 다르게 하는 적어도 2종을 사용한다. 또한, 2종의 항체의 에피토프가 상이한 것은, 항원인 PSA 및 이들의 항체를 사용하여 통상의 샌드위치 면역 측정이 가능한지의 여부에 따라 확인할 수 있다.
(항체의 선택)
항체는 다음과 같이 하여 선택한다.
항체는, 우선 ELISA법 등에 의해 PSA-ACT와 fPSA의 반응성이 높은, 즉 역가가 높은 항체를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 담체는 충분한 측정 감도가 얻어지는 것을 선택하는 것이 바람직하다. 이어서, 선택된 역가가 높은 항체로부터, 2종의 항체를 적당히 선택하여 각각 담체에 감작하고, PSA-ACT와 fPSA를 시료로서 측정했을 때 양쪽 시료와의 반응성의 차가 작으며, 충분한 측정 감도가 얻어지는 항체의 조합을 선택한다.
또한, 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd)와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT에 대한 해리상수(cKd)의 비(fKd/cKd)는 0.1보다 큰 것이 바람직하고, 0.2보다 큰 것이 보다 바람직하다. 또한, fKd/cKd의 상한은 2.0 이하가 바람직하고, 1.5 이하가 보다 바람직하다. 또한 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd값)가 10nM 이하가 바람직하고, 6nM 이하가 보다 바람직하다.
모노클로날 항체는, 파파인 등으로 부분 분해하여 얻어지는 Fab 프래그먼트, 펩신 등으로 부분 분해하여 얻어지는 F(ab')2 및/또는 F(ab')2를 환원 처리하여 얻어지는 Fab' 등을 포함할 수도 있다.
(불용성 담체)
본 발명에서 사용하는 항체를 감작하는 불용성 담체는 특별히 한정되지 않지만, 합성 고분자를 포함하는 라텍스, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체의 재질로 이루어지는 입자로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기 합성 고분자로는 폴리스티렌, 스티렌-술폰산 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산 에스테르 공중합체, 아세트산비닐-아크릴산 에스테르 공중합체로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.
또한, 이들 입자 중, 솝프리(soap-free) 유화 중합에 의해 얻어지는 폴리스티렌 라텍스가 특히 바람직하다. 이 폴리스티렌 라텍스의 제작 방법으로는, 예를 들어 국제 공개 팸플릿 WO2003/005031에 기재된 방법 등을 사용할 수 있다. 즉, 용매로서의 물이 투입된 반응 용기 내에 소정량의 스티렌 단량체, 과황산칼륨 등으로 대표되는 중합 개시제, 스티렌술폰산나트륨 등으로 대표되는 중합 안정제를 넣고, 필요에 따라 라우릴황산나트륨 등의 유화제를 첨가하여, 질소 분위기하에서 교반하면서 가열하여 중합하는 방법 등이다.
(불용성 담체의 입경)
이 불용성 담체의 입경으로는, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하, 바람직하게는 0.22㎛ 초과 0.40㎛ 이하, 보다 바람직하게는 0.23㎛ 이상 0.40㎛ 이하, 더욱 바람직하게는 0.23㎛ 이상 0.34㎛ 이하인 것이다. 평균 입경이 0.20㎛ 이하인 경우 및 평균 입경이 0.40㎛ 초과인 경우에는, 등몰 반응성이 얻어지기 어려워지기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 본 명세서에 있어서 불용성 담체의 평균 입경(㎛)은, 후술하는 실시예에 기재된 투과형 전자 현미경을 사용한 화상 해석에 의해 얻은 평균 입경의 소수점 3째자리를 반올림한 수치를 말한다(화상 해석에서는 소수점 4자리째까지 산출 가능함).
또한, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 본 발명의 평균 입경의 범위 내에 있어서는, 예를 들어 로트가 상이한 2종의 입자를 사용하는 경우 등에 있어서, 2종의 입자의 평균 입경이 이하의 관계에 있을 때는 동일한 평균 입경이라고 간주한다.
"한쪽 입자(입자 A)의 평균 입경±SD를 M±N, 다른쪽 입자(입자B)의 평균 입경±SD를 P±Q로 하고, M>P 및 N 및 Q가 각각 0.02㎛ 이하인 2종의 입자에 있어서, M-N≤P+Q이다."
예를 들어, 입자 A: 0.22±0.02, 입자 B: 0.21±0.02의 경우, M-N은 0.20, P+Q는 0.23이고, 상기한 관계를 만족하므로, 입자 A와 입자 B는 동일한 평균 입경이라 간주할 수 있다.
또한 예를 들어, 입자 A: 0.40±0.02, 입자 B: 0.37±0.02의 경우, M-N은 0.38, P+Q는 0.39이고, 상기한 관계를 만족하므로, 입자 A와 입자 B는 동일한 평균 입경이라 간주할 수 있다.
또한, 상기와 같은 동일한 평균 입경이라 간주할 수 있는 입자를 적당한 비율로 혼화하여 얻어지는 입자는 본 발명에 포함된다.
본 발명에서는 동일한 평균 입경의 담체를 사용하는 것이지만, 재질이 상이한 2종 이상의 담체의 사용을 배제하는 것은 아니다. 또한, 주반응을 상기 평균 입경의 담체를 사용하여 등몰 반응성을 얻고 있는 한, 상이한 평균 입경의 담체의 사용을 배제하는 것은 아니다.
(항체의 감작 방법)
불용성 담체에 항체를 감작하는 방법은 일반적으로 사용되고 있는 물리적 흡착법을 채용할 수 있지만, 화학 결합법이나 면역적 결합 등도 채용할 수 있다. 또한 통상은, 후술하는 실시예와 같이, 서로 에피토프를 다르게 하는 2종의 모노클로날 항체를, 각각 개별적으로 감작한 담체를 적당한 비율로 혼화하여 사용하는데, 각 모노클로날 항체를 적당한 비율로 혼화한 후에 동일한 담체 상에 감작하는 형태를 배제하는 것은 아니다.
(응집 촉진제)
응집 촉진제로는, 항원 항체 반응에 의한, 항체를 감작한 불용성 담체의 응집을 촉진시키는 작용을 갖는 것이면 좋고, 공지된 것을 사용할 수 있으며, 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)(이하, "MPC 중합체"라고도 함) 등을 들 수 있다. 또한, 다당류로는 덱스트란, 풀루란, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 등의 알킬화 다당류로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다. 또한, 폴리-γ-글루탐산염의 염으로는 나트륨, 칼륨, 리튬 등의 알칼리 금속, 마그네슘, 칼슘, 바륨 등의 알칼리 토금속 및 암모늄염이 예시된다.
이들 중 폴리에틸렌글리콜 및 폴리비닐피롤리돈이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 또한, 복수의 응집 촉진제를 조합하여 사용할 수도 있다.
상기한 응집 촉진제로서 예시한 것으로는, 분자량이 상이한 것이 시판되고 있으며, 수용성 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있다. 폴리에틸렌글리콜에서는, 예를 들어 수 평균 분자량이 3,000 내지 1,000,000인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 5,000 내지 100,000, 특히 바람직하게는 5,000 내지 50,000인 것이다. 상기 3,000 내지 1,000,000 범위의 것이면, 측정 감도가 양호해진다. 또한, 폴리비닐피롤리돈에서는 예를 들어 중량 평균 분자량 25,000 내지 1,200,000, 바람직하게는 40,000 내지 360,000인 것을 이용할 수 있고, 폴리-γ-글루탐산염에서는 예를 들어 중량 평균 분자량 200,000 내지 6,000,000인 것을 이용할 수 있다. MPC 중합체에서는 예를 들어 분자량 5,000 내지 5,000,000 범위의 것을 이용할 수 있고, 500,000 내지 2,000,000인 것이 바람직하다.
응집 촉진제의 농도는, 사용하는 담체의 평균 입경이나 사용하는 응집 촉진제의 종류를 고려하여, 등몰 반응성이 얻어지는 농도가 되도록 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 시료와 접촉시킬 때, 최종 농도로 0.1 내지 5중량％가 되도록 하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 2중량％, 특히 바람직하게는 0.2 내지 0.6중량％이다. 상기 0.1 내지 5중량％의 범위이면, 측정 감도가 양호해진다.
(그 밖의 첨가제)
상기 항PSA 모노클로날 항체와 PSA가 반응하는 것을 방해하지 않는 범위에서, 당류(글루코오스, 수크로오스 등), 무기염(염화나트륨 등), 계면활성제(모노스테아르산폴리옥시에틸렌소르비탄 등), 방부제(아지드화나트륨 등) 및/또는 비특이 반응 방지제 등(정상 동물 유래의 IgG 항체 등)을 시약에 함유시킬 수도 있다.
그 경우, 시약 중 당류의 함유량은 0.1 내지 10중량％ 정도, 무기염의 함유량은 0.01 내지 5중량％ 정도, 계면활성제의 함유량은 0.02 내지 5중량％ 정도, 방부제의 함유량은 0.001 내지 0.1중량％ 정도, 비특이 반응 방지제의 함유량은 0.001 내지 5중량％ 정도가 바람직하다.
(완충액)
본 발명에 있어서의 항원 항체 반응은 완충액 내에서 행해진다. 완충액의 종류, 농도 및 pH는, 상기 항원 항체 반응이 일어나는 조건이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 인산 완충액, 트리스 염산 완충액, 탄산 완충액, 글리신 완충액, 굿(good) 완충액 등을 사용할 수 있다. 완충제의 농도는 3mM 내지 500mM 정도로 사용되고, 바람직하게는 5mM 내지 100mM, 더욱 바람직하게는 5mM 내지 50mM이다. 또한, 완충액의 pH는 중성 영역으로부터 염기성 영역이 바람직하며, 통상 6.5 내지 9.5의 범위에서 사용된다.
(응집 시그널의 측정 방법)
응집 시그널의 측정은, 응집 반응 측정에 사용되는 통상의 측정 방법이면 어느 것일 수도 있고, 흡광도, 입자수, 입자 크기 측정, 산란광 측정 등을 들 수 있다.
예를 들어, PSA의 측정은 다음과 같이 행해진다.
fPSA 및 PSA-ACT의 양쪽에 반응하는 적어도 2종의 항체를 라텍스 등의 담체에 감작하고, fPSA 및/또는 PSA-ACT를 포함하는 시료와 반응시키면 응집한다. 따라서, 그 응집의 정도를 측정하고, PSA 농도 기지의 표준액을 사용한 경우 응집의 정도와 비교함으로써, 시료 중 총PSA 농도를 정량할 수 있다. 예를 들어, 범용의 생화학 자동 분석 장치를 이용하여, 응집의 정도를 흡광도의 변화량으로서 검출하는 방법이 바람직하고, 이 경우 통상 500 내지 900nm의 파장에 있어서의 흡광도 변화량을 정량으로 사용하는 것이 바람직하다.
(등몰 반응성)
본 발명의 측정 방법을 사용하면, fPSA 및 PSA-ACT에 대하여 등몰 반응성이 얻어지기 때문에, 높은 정밀도로 PSA를 정량할 수 있다.
또한, fPSA 및 PSA-ACT의 등몰 반응이란, 시료로서 fPSA만을 포함하는 시료를 측정했을 때의 시그널과, 동몰의 PSA-ACT만을 포함하는 시료를 측정했을 때의 시그널이 거의 1:1인 반응을 의미한다.
구체적으로는, 예를 들어 fPSA 및 PSA-ACT의 양쪽 항원이 나타내는 등몰당 응집 시그널의 비(PSA-ACT/fPSA비, 이하 간단히 c/f비라고도 함)를 구하고, 상기 c/f비가 85 내지 115％, 가장 바람직하게는 90 내지 110％일 때에 등몰 반응하고 있다고 간주된다.
(시약의 제조 방법)
본 발명의 PSA 측정 시약의 제조는, 이하와 같이 하여 행한다.
PSA-ACT 및 fPSA의 양쪽 항원에 반응하여, 인식 부위가 상이한 2종의 항체를 감작한 담체를 준비하고, 미리 2종의 항체를 각각 감작한 동일한 평균 입경의 담체(평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하)의 혼합 비율을 소정의 범위로 설정하고, 응집 촉진제의 농도를 양쪽 항원과 항체가 등몰 반응성을 나타내도록 조정함으로써 제조할 수 있다. 또한, 상기 혼합 비율은 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:5 내지 5:1, 더욱 바람직하게는 1:2 내지 2:1이다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 설명하는데, 본 발명이 이에 따라 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
(모노클로날 항체의 제작)
1. 면역
(1) 면역원
면역원으로서 인간 정액 유래 정제 PSA(SCIPAC사 제조, Code No.P117-7, 정제도 96％)를 사용하였다. 정제 PSA는 20mM PBS(pH 7.2)로 투석 후에 사용하였다.
(2) 면역 방법
상기 PSA 용액과 CFA(완전 프로인트 아쥬반트: 집코(GIBCO)사 제조)를 1:1로 혼화 유화하고, 6주령의 암컷 Balb/C 마우스의 배부 피하에 25μgPSA/마리가 되도록 투여하였다. 2주일 간격으로 추가 면역을 3회 행하고, 추가로 세포 융합 3일 전에 PSA 용액(25μgPSA/마리)을 마우스의 복강 내에 투여하였다.
2. 세포 융합
상기한 PSA를 면역한 후 마우스의 비장을 적출하고, 비장 세포를 취출하였다. 이 비장 세포와 마우스 골수종 세포 SP2/O-Ag14를 6:1의 비율로 혼합하고, 50％ 폴리에틸렌글리콜 1540(와코 쥰야꾸 고교사 제조) 존재하에서 세포 융합시켰다. 융합 세포는 비장 세포로서 2.5×106개가 되도록 HAT 배지에 현탁하고, 96 구멍 배양 플레이트(코닝(CORNING)사 제조)에 0.2mL씩 분주하였다. 이를 5％ CO2 인큐베이터 중에서 37℃에서 2주간 배양하였다.
3. 스크리닝
융합 세포를 분주한 배양 플레이트의 각 웰의 배양 상청을 사용하고, 다음에 나타내는 ELISA법으로 fPSA 및 PSA-ACT의 양자와 반응하는 웰을 선택하였다.
(1) 재료: 항원
1) PSA: SCIPAC, Code No.P117-7
2) PSA-ACT: SCIPAC, Code No.P192-3
(2) 방법
1) 염소 항 마우스 IgG(Fc) 항체(잭슨사 제조) 5μg/mL를 ELISA용 플레이트(Nunc)에 코팅하고(50μL/웰), 4℃에서 하룻밤 정치하였다.
2) 세정액(0.05％ 트윈20-PBS)으로 3회 세정 후(400μL/웰), 블로킹액(0.05％ 트윈20-PBS)을 각 웰에 200μL가 되도록 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
3) 블로킹액을 제거한 후, 융합 세포를 분주한 플레이트의 각 웰의 배양 상청을 ELISA용 플레이트의 각 웰에 50μL씩 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
4) 세정액(0.05％ 트윈20-PBS)으로 3회 세정 후, 0.05％ 트윈20-PBS로 5ng/mL로 희석한 fPSA 또는 PSA-ACT를 각 웰에 50μL씩 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다.
5) 세정액으로 3회 세정한 후, HRP-토끼 항 인간 PSA 항체(x500)를 각 웰에 50μL씩 분주하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 또한, HRP-토끼 항 인간 PSA 항체는, 토끼 항 인간 PSA 항체(다코(DAKO)사) 및 퍼옥시다아제(도요보사 제조)를 사용하여, 과요오드산법으로 제작하였다.
6) 3회 세정 후, OPD 발색액을 각 웰에 50μL씩 분주하고, 실온에서 10분간 정치하였다.
7) 정지액(1.5N 황산)을 각 웰에 50μL씩 분주하고, 반응을 정지한 후, 플레이트 리더를 사용하여 파장 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
4. 클로닝
상기 스크리닝에 의해 fPSA와 PSA-ACT의 양자에 반응한 웰의 세포주를 한계 희석법에 의해 클론화를 행하여, 하이브리도마를 수립하였다. 이 결과, 수립한 하이브리도마는 28종 얻어졌다.
5. 모노클로날 항체의 제조
미리 2주일 전에 프리스탄 0.5mL를 복강 내에 주사한 8주령의 암컷 Balb/C 마우스에, 상기 클로닝에 의해 얻어진 각 하이브리도마를 세포수 0.5×106개의 양으로 복강 내에 투여하였다. 2주일 후 복수를 채취하여, 단백질 A 칼럼(아머샴사 제조)으로 IgG 분획을 정제하였다. 이 결과 28종의 각 모노클로날 항체의 정제 분획이 얻어졌다.
(모노클로날 항체의 조합의 예비 검토)
상기에서 얻어진 28종의 모노클로날 항체에 대하여, 각 항체를 라텍스에 감작하여 라텍스 응집의 검토를 이하와 같이 행하였다. 시그널이 큰 2종의 항체, #91 항체, #51 항체 및 그러한 라텍스와의 조합을 얻었다.
1. 항체의 선택
(1) 20mM Tris-HCl(pH 8.5)로 희석한 1％의 0.3㎛ 라텍스 용액과 28종의 모노클로날 항체 용액(0.5Abs)을 1용기:1용기로 혼합하고, 4℃에서 2시간 교반하였다.
(2) 0.4％ BSA를 포함하는 20mM Tris-HCl(pH 8.5)을 2용기 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반하였다.
(3) 원심 분리로 상청을 제거하여, 5mM MOPS(pH 7.0)로 현탁하고, 파장 600nm에서 2Abs로 조정하였다.
(4) 28종으로부터 선택된 2종의 MoAb-Lx(항체 감작 라텍스)를 1용기:1용기로 혼합하여 시약 2로 한다(전체 조합에 대하여 마찬가지로 제조하여 검토함).
(5) 시약 1(0.1％ BSA, 0.5M NaCl 및 0.3％ 폴리비닐피롤리돈 K-90(PVP K-90)을 포함하는 30mM HEPES 완충액(pH 7.0))과 상기 시약 2를 사용하여, 26ng/mL의 fPSA 및 PSA-ACT를 히타치 7170형 자동 분석 장치로 측정하였다.
(6) 응집하는 모노클로날 항체의 조합으로부터, 에피토프가 상이하다고 여겨지는 2개의 항체 그룹이 얻어졌다.
i) #63217, #63251, #63279
ii) #63214, #63291
상기 그룹 i)과 그룹 ii)의 항체의 조합으로 응집이 가능하였다.
상기 항체 중, 식별 번호 #63251, #63279, #63291 각각의 항체를 생산하는 하이브리도마 3주는, 수탁 번호 FERM BP-11453, 동 FERM BP-11454, FERM BP-11455로서, 도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타에 기탁되어 있다. 또한, 이들의 하이브리도마로부터 얻어지는 모노클로날 항체를 각각 #51 항체, #79 항체 및 #91 항체와 식별 번호의 말미 2자리수로 기재하는 경우가 있다.
(입경이 상이한 라텍스의 제조)
1) 0.2㎛ 이하
교반기, 환류용 냉각기, 온도계, 질소 도입관 및 가열용 유욕 등을 설치한 유리제 반응 용기(2L)에 물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 1.2g, 스티렌술폰산나트륨 0.2g을 첨가하고, 약 200rpm으로 교반하면서 반응 용기 내를 충분히 질소 치환하였다. 그 후, 70℃로 승온하고, 약 18시간 중합한 후, 반응 용액을 여과지(아드반텍 No.2)로 여과하고, 라텍스 입자를 얻었다. 얻어진 라텍스 입자의 평균 입경은 투과형 전자 현미경을 사용하여 라텍스 입자를 촬영하고, 무작위로 선택한 3시야에 대하여, 각각 100개 이상의 입자를 화상 해석함으로써, 시야마다 "평균 입경(±SD)"을 구하고, 그들의 값을 추가로 평균함으로써, 최종적인 "평균 입경(±SD)"을 산출하였다. 그 결과, 평균 입경은 0.19㎛(±0.01㎛)였다.
2-1) 0.23㎛
물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 2.4g, 스티렌술폰산나트륨 0.1g으로 변경한 것 이외에는 상기 1)과 마찬가지의 조작을 행하여, 라텍스 입자를 얻었다. 그 결과, 평균 입경은 0.23㎛(±0.01㎛)였다.
2-2) 0.25㎛
물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 0.9g, 스티렌술폰산나트륨 0.2g으로 변경한 것 이외에는 상기 1)과 마찬가지의 조작을 행하여, 라텍스 입자를 얻었다. 그 결과, 평균 입경은 0.25㎛(±0.01㎛)였다.
2-3) 0.29㎛
물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 1.3g, 스티렌술폰산나트륨 0.1g으로 변경한 것 이외에는 상기 1)과 마찬가지의 조작을 행하여, 라텍스 입자를 얻었다. 그 결과, 평균 입경은 0.29㎛(±0.01㎛)였다.
2-4) 0.34㎛
물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 1.3g, 스티렌술폰산나트륨 0.08g으로 변경한 것 이외에는 상기 1)과 마찬가지의 조작을 행하여, 라텍스 입자를 얻었다. 그 결과, 평균 입경은 0.34㎛(±0.01㎛)였다.
2-5) 0.40㎛
물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 1.3g, 스티렌술폰산나트륨 0.03g으로 변경한 것 이외에는 상기 1)과 마찬가지의 조작을 행하여, 라텍스 입자를 얻었다. 그 결과, 평균 입경은 0.40㎛(±0.01㎛)였다.
3) 0.4㎛ 초과
물 1200g, 스티렌 단량체 200g, 과황산칼륨 1.2g, 스티렌술폰산나트륨 0.01g으로 변경한 것 이외에는 상기 1)과 마찬가지의 조작을 행하여, 라텍스 입자를 얻었다. 그 결과, 평균 입경은 0.42㎛(±0.01㎛)였다.
(항체 감작 라텍스의 제조)
상기에서 얻어진 2종의 모노클로날 항체(#91, #51)를 다음에 나타내는 재료, 방법에 의해 담체에 감작시켰다.
1. 재료
(1) 항PSA 모노클로날 항체
#63291(#91)
#63251(#51)
(상기 모노클로날 항체는 모두 PBS 용액임)
(2) 라텍스
상기 방법으로 얻어진 평균 입경 0.19 내지 42㎛의 폴리스티렌 라텍스
2. 항체 감작 라텍스액의 제조
(1) #91 항체-라텍스 복합체(#91Lx) 함유액의 제조 방법
1) 라텍스, #91 항체를 각각 20mM 글리신 완충액(pH 9)으로 희석하고, 1％ 라텍스액, 0.4mg/mL의 #91 항체액을 제조하였다. 이들을 1:1(1용기+1용기)로 혼합하고, 약 1시간 교반하였다.
2) 상기 혼합액 2용기에 블로킹액(10％ BSA)을 0.1용기 첨가하고, 약 1시간 교반하였다.
3) 원심 분리로 상청을 제거하고, 5mM MOPS 완충액(pH 7.0) 용액으로 현탁하고, 3Abs/mL(600nm)가 되도록 희석하여 #91 항체 감작 라텍스(#91Lx)액을 얻었다.
(2) #51 항체-라텍스 복합체(#51Lx) 함유액의 제조 방법
1) 라텍스, 항체를 각각 20mM 트리스 완충액(pH 8)으로 희석하고, 1％ 라텍스액, 0.4mg/mL의 #51 항체액을 제조하였다. 이들을 1:1(1용기+1용기)로 혼합하고, 약 1시간 교반하였다.
2) 상기 혼합액 2용기에 블로킹액(10％ BSA)을 0.1용기 첨가하고, 약 1시간 교반하였다.
3) 원심 분리로 상청을 제거하고, 5mM MOPS 완충액(pH 7.0) 용액으로 현탁하고, 파장 600nm에 있어서의 흡광도가 3Abs/mL가 되도록 희석하여 #51 항체 감작 라텍스(#51Lx)액을 얻었다.
〔시험예 1〕
(라텍스의 평균 입경 변동시 c/f비의 확인)
동일한 농도(5ng/mL)의 fPSA와 PSA-ACT를 측정 시료로 하고, 하기의 PSA 측정 시약, 하기의 측정 조건, 측정 시료를 사용하여 fPSA와 PSA-ACT에 대한 반응성을 확인하였다. fPSA 및 PSA-ACT의 양쪽 항원에 대한 반응성의 비PSA-ACT/fPSA(c/f비)를 구하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
(1) PSA 측정 시약
제1 시약(완충액)
0.5M KCl,
0.1％ BSA(플로리언트),
0.3％ PVP K-90
을 포함하는 30mM HEPES 완충액(pH 7.0)
제2 시약(항체 감작 라텍스액)
항PSA 마우스 모노클로날 항체 감작 라텍스 입자(2종의 항체 감작 라텍스 입자의 혼합비, #91Lx 함유액:#51Lx 함유액=1:1)를 포함하는 5mM MOPS 완충액(pH 7.0).
또한, 본 검토에서는 모두 동일한 평균 입경(0.19 내지 0.42㎛)의 라텍스 입자에 #91 항체 및 #51 항체를 각각 감작한 항체 함유액의 조합을 사용하였다.
(2) 측정 조건
측정 장치: 히타치 7170형 자동 분석 장치(H-7170)
측정 파라미터:
분석법; 2포인트 엔드(측정 포인트 19-34)
액량 (μL); 14.4/90/90
측정 파장(nm); 570(주)/800(부)
캘리브레이션; 스플라인
또한, 캘리브레이션에는 나노피어(등록상표) PSA PSA 캘리브레이터(PSA 농도: 0, 4.2, 10 및 29ng/mL, 세끼스이 메디컬 가부시끼가이샤 제품을 사용함)
(3) 측정 시료
fPSA, PSA-ACT(모두 피츠제럴드사 제조)를 1％ BSA 및 0.1％ NaN3을 포함하는 PBS(pH 7.4)로 용해시켜 시료로 하였다.
Figure 112013095633532-pct00001
표 1에 나타낸 결과에 따르면, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 범위에서는, c/f비가 85％ 이상으로 100％에 가까운 값을 나타내어, 등몰 반응성이 얻어지는 것을 알 수 있다.
평균 입경이 0.20㎛ 이하인 경우 및 평균 입경이 0.40㎛를 초과하는 경우에는 c/f비가 80％를 하회하고, 등몰 반응성이 얻어지지 않았다.
〔시험예 2〕
(응집 촉진제의 첨가에 의한 c/f비의 조정)
동일한 농도(35ng/mL)의 fPSA와 PSA-ACT를 측정 시료로 하고, 하기의 PSA 측정 시약을 사용하여 시험예 1과 동일한 측정 조건으로 fPSA와 PSA-ACT에 대한 반응성을 확인하고, 양쪽 항원에 대한 반응성의 비PSA-ACT/fPSA(c/f비)를 구하였다. 이들의 결과를 하기 표 2 내지 4에 나타냈다.
(1) PSA 측정 시약
제1 시약(완충액)
0.5M KCl,
0.1％ BSA(플로리언트),
0 내지 0.8％ 응집 촉진제〔표 2 내지 4 중에 나타낸 PEG(폴리에틸렌글리콜, 수치는 수 평균 분자량), PVP(폴리비닐피롤리돈; PVP K-30의 분자량은 4만, PVP K-90의 분자량은 36만, 모두 와코 쥰야꾸 고교사 제조), MPC 중합체(분자량 100만), 풀루란 PI-20(분자량 약 20만, 하야시바라 쇼지사 제조) 및 PGA-Na(폴리-γ-글루탐산나트륨, 수치는 수 평균 분자량)을 사용함〕를 포함하는 30mM HEPES 완충액(pH 7.0)
(응집 촉진제 무첨가의 경우를 비교예로 함)
제2 시약(항체 감작 라텍스액)
항PSA 마우스 모노클로날 항체 감작 라텍스 입자(2종의 항체 감작 라텍스 입자의 혼합비, #91Lx 함유액:#51Lx 함유액=1:1)를 포함하는 5mM MOPS 완충액(pH 7.0). 또한, 본 검토에서는 모두 동일한 평균 입경 0.29㎛의 라텍스에 감작한 항체 함유액을 사용하였다.
Figure 112013095633532-pct00002
Figure 112013095633532-pct00003
Figure 112013095633532-pct00004
표 2 내지 표 4에 나타낸 결과에 따르면, 응집 촉진제의 첨가 및 상기 첨가량의 증가에 따라, c/f비는 약 82％ 내지 100％에 가깝고, 응집 촉진제의 첨가량을 적절히 조정함으로써, 1단계 반응에서 c/f비가 85％ 이상으로 등몰 반응성이 얻어지는(c/f비가 100％ 부근으로 개선되는 효과가 있음) 것이 명확해졌다. 또한, "1단계 반응"이란, 2종의 항PSA 모노클로날 항체를 1회 첨가하여 반응시키는 것을 의미하는 것이다.
〔시험예 3〕
(상이한 항체의 조합에서의 반응성 확인)
모노클로날 항체 #51과 #91의 조합 대신에 #79와 #91, #14와 #51, #91과 #17, #14와 #17의 각 조합을 사용하여, 응집 촉진제로서 0.6％ MPC 중합체를 사용한 하기 측정 시약을 사용하여 c/f비를 구하였다. 또한, 그 이외에는 시험예 1과 마찬가지로 하였다. 동일한 농도(각 35ng/mL)의 fPSA, PSA-ACT를 샘플로 하였다.
(1) PSA 측정 시약
제1 시약(완충액)
0.5M KCl,
0.1％ BSA(플로리언트),
0.6％ MPC 중합체
를 포함하는 30mM HEPES 완충액(pH 7.0)
이들의 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
Figure 112013095633532-pct00005
이 결과로부터, c/f비는 89.0％ 내지 101.9％로 어느 것의 조합을 사용한 경우도 등몰 반응성이 얻어지는 것이 확인되었다.
(검토에 사용한 모노클로날 항체의 Kd값)
상기 검토에 사용한 모노클로날 항체의 fPSA 및 PSA-ACT에 대한 Kd값은, 하기 표 6에 나타낸 바와 같다. 표 6으로부터, 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd)와, 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT에 대한 해리상수(cKd)의 비(fKd/cKd)가 0.1보다 크고 2.0 이하이며, 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd값)가 10nM 이하인 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
Figure 112013095633532-pct00006
또한, 상기 시험예 3-3의 #91 항체 대신에 #16 항체(fKd=1.33nM, cKd=23.18nM, fKd/cKd=0.057)를 사용한 경우에는 c/f비(％)=52.4가 되고, 등몰 반응성은 얻어지지 않았다.
또한, 상기 표 6의 Kd값은, 이하의 실험 조건에 의해 구하였다.
1. 비아코어(Biacore; 등록상표) 기기 및 전용 시약류 일식(비아코어사 제조: 현 지이 헬스케어(GE Healthcare)사 제조, 다음의 (i) 내지 (viii)은 비아코어사 제조 당시의 제품 및 카탈로그 No.인데, 현재는 지이 헬스케어사에서 입수 가능함)
(i) 비아코어(등록상표) T100: 비아코어사 제조 JJ-1037-02
(ii) 시리즈 S 센서 칩 CM5: 비아코어사 제조 BR-1005-30
(iii) 아민 커플링 키트: 비아코어사 제조 BR-1000-50
(iv) 아세테이트 5.0: 비아코어사 제조 BR-1003-51
(v) α-마우스 면역 글로불린: 비아코어사 제조 BR-1005-14
(vi) 글리신 1.5: 비아코어사 제조 BR-1003-54
(vii) 글리신 2.0: 비아코어사 제조 BR-1003-55
(viii) HBS-EP+10×(러닝 버퍼): 비아코어사 제조 BR-1006-69(사용시, NaOH에 의해 pH 8.5로 제조한 후, 정제수로 10배 희석하여 사용함)
2. 시험 방법
(i)α-마우스 면역 글로불린을 고정화한 센서 칩 CM5를 비아코어 기기에 세팅한다.
(ii) 러닝 버퍼(HBS-EP)에 항PSA 항체를 각각 1.0μg/mL가 되도록 희석하고, 유속 30μL/분으로 60초간 첨가
(iii) 러닝 버퍼(HBS-EP)에 PSA 항원(fPSA 또는 PSA-ACT)을 5.0μg/mL가 되도록 희석하고, 유속 30μL/분으로 120초간 첨가
(iv) 러닝 버퍼(HBS-EP)로 프리 러닝하고, 해리 120초(유속 30μL/분)
(v) 재생액(글리신 1.5와 글리신 2.0을 1:1로 혼합하고, 글리신 1.75를 제조)으로 센서 칩을 재생
본 발명의 측정 방법 및 그의 시약은, 범용의 자동 분석 장치를 이용하여, 간편하고 고정밀도로 PSA를 측정할 수 있으므로, 전립선 질환, 특히 전립선암의 조기 발견에 유용하다.
〔기탁 생물 재료에 대한 언급〕
(1) FERM BP-11453(#51 항체 생산 하이브리도마 #63251)
가 당해 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타
일본 이바라기껭 쯔쿠바시 히가시 1쪼메 1반치 1주오 다이6(우편번호 305-8566)
나 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 일자
2010년 2월 19일
다 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11453
(2) FERM BP-11454(#79 항체 생산 하이브리도마 #63279)
가 당해 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타
일본 이바라기껭 쯔쿠바시 히가시 1쪼메 1반치 1주오 다이6(우편번호 305-8566)
나 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 일자
2010년 2월 19일
다 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11454
(3) FERM BP-11455(#91 항체 생산 하이브리도마 #63291)
가 당해 생물 재료를 기탁한 기탁 기관의 명칭 및 주소
도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타
일본 이바라기껭 쯔쿠바시 히가시 1쪼메 1반치 1주오 다이6(우편번호 305-8566)
나 가의 기탁 기관에 생물 재료를 기탁한 일자
2010년 2월 19일
다 가의 기탁 기관이 기탁에 대하여 부여한 수탁 번호
FERM BP-11455
도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타 FERMBP-11453 20100219 도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타 FERMBP-11454 20100219 도꾸리쯔 교세이 호징 산교 기쥬쯔 소고 겡뀨쇼 토쿄 세부쯔 기따꾸 센타 FERMBP-11455 20100219

Claims (14)

  1. 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽에 반응하는 항PSA 모노클로날 항체로서, 서로 에피토프를 다르게 하는 2종의 항PSA 모노클로날 항체로, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 동일 평균 입경의 불용성 담체를 감작하고, 응집 촉진제의 공존하에 1단계 반응으로 시료와 접촉시키며, 상기 2종의 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd)와, 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT에 대한 해리상수(cKd)의 비(fKd/cKd)가 모두 0.1보다 크고 2.0 이하인 것을 특징으로 하는 PSA의 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 응집 촉진제가 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)으로부터 선택되는 1종 이상인 PSA의 측정 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 불용성 담체가 합성 고분자를 포함하는 라텍스, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체의 재질로 이루어지는 입자로부터 선택되는 1종 이상인 PSA의 측정 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 응집 촉진제의 농도가 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽과 등몰 반응성을 나타내도록 조정되어 있는 PSA의 측정 방법.
  5. 제2항에 있어서, 다당류가 덱스트란, 풀루란 및 알킬화 다당류로부터 선택되는 1종 이상인 PSA의 측정 방법.
  6. 제5항에 있어서, 알킬화 다당류가 메틸셀룰로오스 및/또는 에틸셀룰로오스를 포함하는 PSA의 측정 방법.
  7. 제3항에 있어서, 합성 고분자가 폴리스티렌, 스티렌-술폰산 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산 에스테르 공중합체, 및 아세트산비닐-아크릴산 에스테르 공중합체로부터 선택되는 1종 이상인 PSA의 측정 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2종의 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd값)가 10nM 이하인 PSA의 측정 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2종의 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd값)가 10nM 이하이고, 응집 촉진제가 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)으로부터 선택되는 1종 이상이고, 응집 촉진제의 양이 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽과 등몰 반응성을 나타내도록 조정되어 있는 PSA의 측정 방법.
  10. 적어도 다음의 1) 및 2)를 포함하는 PSA 측정용 시약.
    1) 유리형 PSA 및 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT의 양쪽에 반응하는 항PSA 모노클로날 항체로서, 서로 에피토프를 다르게 하는 2종의 항PSA 모노클로날 항체를, 평균 입경이 0.20㎛ 초과 0.40㎛ 이하인 동일 평균 입경의 불용성 담체에 각각 감작시킨 항체 감작 담체이며, 상기 2종의 항PSA 모노클로날 항체의 유리형 PSA에 대한 해리상수(fKd)와, 유리형 PSA와 α1-안티키모트립신의 복합체인 PSA-ACT에 대한 해리상수(cKd)의 비(fKd/cKd)가 모두 0.1보다 크고 2.0 이하인 항체 감작 담체
    2) 폴리에틸렌글리콜, 다당류, 폴리비닐피롤리돈, 폴리염화비닐, 폴리-γ-글루탐산염 및 폴리(2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린)으로부터 선택되는 1종 이상의 응집 촉진제
  11. 제10항에 있어서, 불용성 담체가 합성 고분자를 포함하는 라텍스, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체의 재질로 이루어지는 입자로부터 선택되는 1종 이상인 PSA 측정용 시약.
  12. 제11항에 있어서, 합성 고분자가 폴리스티렌, 스티렌-술폰산 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산 에스테르 공중합체, 및 아세트산비닐-아크릴산 에스테르 공중합체로부터 선택되는 1종 이상인 PSA 측정용 시약.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 다당류가 덱스트란, 풀루란 및 알킬화 다당류로부터 선택되는 1종 이상인 PSA 측정용 시약.
  14. 제13항에 있어서, 알킬화 다당류가 메틸셀룰로오스 및/또는 에틸셀룰로오스를 포함하는 PSA 측정용 시약.
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