CN104335048B - 凝集测定用胶乳粒子 - Google Patents

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Abstract

提供了一种凝集测定用胶乳粒子和一种使用所述粒子的凝集测定用试剂，所述胶乳粒子能够实现高灵敏度测定，同时抑制非特异性反应并且可以容易地制备诊断剂。一种凝集测定用胶乳粒子，所述胶乳粒子包含以下单体作为成分：具有苯基的可聚合单体，具有苯基和磺酸盐基的可聚合单体，以及具有通式(1)(CH2＝CRl‑COO(CH2CH20)n‑R2…(1)，其中R1表示氢原子或甲基；R2表示氢原子或甲基；并且n为1<n<20)表示的可聚合单体，其中粒子表面上的具有式(1)的可聚合单体的密度(即官能团的密度)是0.05至0.5μmol/m2。

Description

凝集测定用胶乳粒子
技术领域
本发明涉及几乎不引发非特异性反应的用于高灵敏凝集测定的胶乳粒子以及利用该胶乳粒子的凝集测定用试剂。
背景技术
在临床检查领域中，已经广泛地进行利用抗原-抗体反应的免疫测定以确定样品中的微量物质。在这些中，在实验室中已经广泛地使用利用携带抗体的胶乳粒子(在下文中也被称为敏化胶乳粒子)的胶乳免疫浊度测定，因为可以通过短时间的简单操作实现胶乳免疫浊度测定。在胶乳免疫浊度测定中，通过由免疫复合物形成期间敏化胶乳粒子的凝集导致的吸光度变化的光学检测确定样品中抗原或抗体的量。这种吸光度变化基于由敏化胶乳粒子的凝集导致的粒径的明显变化。
如在专利文献1中描述的，主要由聚苯乙烯组成的聚苯乙烯胶乳粒子已经用于胶乳免疫浊度测定，这是因为可与其靶标物质特异性反应的抗原或抗体的固定(敏化)容易、较低的成本、以及容易控制这些粒子的聚合反应。不考虑这种优势，即抗原或抗体的物理吸附(敏化)，聚苯乙烯胶乳粒子还可以吸附样品中的非靶标蛋白。这种非靶标蛋白的吸附可能会引起通常所说的非特异性反应，即并非由特异性抗原-抗体反应引起的敏化胶乳粒子的凝集反应。应该抑制非特异性反应。
根据专利文献1，将用抗原或抗体敏化的胶乳粒子用牛血清白蛋白(BSA)封闭以抑制非特异性反应。不幸的是，这种封闭仍然是不足的，并且产生高背景值。因此，这种措施对于能够实现高灵敏测量的试剂的制备来说具有严重的困难。
专利文献2公开了用于诊断剂的载体粒子的制备。通过在水溶性自由基聚合引发剂的存在下在水中使苯乙烯、由式(CH2＝CR3-COO(CH2CH2O)X(CH(CH3)CH2O)y(CH2CH2O)ZR4，其中R3表示H或CH3；R4表示H或CH3；x、y、和z各自表示0或100以下的整数，并且满足关系1≤x+y+z≤100)表示的化合物、和苯乙烯磺酸盐共聚来制备所述粒子。专利文献2公开了仅使用由在其中x、y、和z中的至少一个是20以上的式表示的化合物，并且未提出使用任何其他化合物。此外，在聚合物粒子的制备中使用高含量的由该式表示的化合物；因此，所得到的聚合物粒子几乎不将抗原或抗体物理吸附至其表面上并且不能起用于诊断剂的载体粒子的作用。
专利文献3公开了抑制非特异性吸附的胶乳粒子，其通过将具有不同链长度的聚乙二醇和抗体或抗原经由共价键共同固定至粒子表面上以防止脱附而制备。不幸的是，胶乳粒子应当具有大量的用于将抗体和聚乙二醇链结合至粒子表面上的官能团，并且应当通过涉及抗体的共价结合、随后的聚乙二醇的共价结合的复杂方法制备。
相关技术
专利文献1：日本专利号3708942
专利文献2：日本已审查的专利申请公开号58-34486
专利文献3：WO2010/082681
发明概述
为了解决常规胶乳免疫浊度测定中的问题而已经做出的本发明的目标是提供，几乎不引发非特异性反应并且可以容易地制备诊断剂的用于高灵敏凝集测定的胶乳粒子，以及包含胶乳粒子的凝集测定用试剂。
专利文献2说明了仅以重量计使用的单体，并且未提出或描述结合至胶乳粒子表面的乙二醇(含乙二醇的)单体的最佳量(密度)和丙二醇(含丙二醇的)单体的最佳量(密度)。由于这种原因，应该在对能够充分抑制非特异性反应的合成条件的检查中根据单体的分子量通过试错法确定单体的最佳量。专利文献3除了制备胶乳粒子的步骤之外还需要结合乙二醇(含乙二醇的)单体的步骤，结果是复杂的两步操作，其包括胶乳粒子制备期间对用于结合乙二醇的官能团的控制以及官能团与乙二醇结合的控制。
解决问题的方案
为了解决问题已经进行了广泛研究的本发明的发明人已经根据本发明通过简单操作在胶乳粒子合成的同时制备了凝集测定用胶乳粒子。本发明的特征如下。
方面[1]。一种凝集测定用胶乳粒子，所述凝集测定用胶乳粒子包含：具有苯基的可聚合单体，具有苯基和磺酸盐的可聚合单体，以及由式(1)表示的可聚合单体，其中粒子表面上的由式(1)表示的可聚合单体中的官能团的密度是0.05至0.5μmol/m2：
CH2＝CR1-COO(CH2CH2O)n-R2...(1)
其中R1表示氢原子或甲基；R2表示氢原子或甲基；并且n为1≤n<20。
方面[2]。根据方面[1]所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述具有苯基的可聚合单体是选自由下列各项组成的组中的至少一种：苯乙烯、邻甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、和4-乙烯基苯甲酸。
方面[3]。根据方面[1]或[2]所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述具有苯基和磺酸盐的可聚合单体是选自由下列各项组成的组中的至少一种：苯乙烯磺酸盐、二乙烯基苯磺酸盐、邻甲基苯乙烯磺酸盐、和对甲基苯乙烯磺酸盐。
方面[4]。根据方面[1]所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述具有苯基的可聚合单体是苯乙烯，并且所述具有苯基和磺酸盐的可聚合单体是苯乙烯磺酸钠。
方面[5]。根据方面[1]所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述胶乳粒子通过物理吸附携带抗原或抗体。
方面[6]。一种凝集测定用试剂，所述凝集测定用试剂包含根据方面[1]至[5]中任一项所述的凝集测定用胶乳粒子。
发明效果
根据本发明的凝集测定用胶乳粒子和凝集测定用试剂仅引起靶标特异性凝集反应，而不吸附引起非特异性凝集反应的非靶标蛋白，并且因此可以生产比传统诊断剂更灵敏的诊断剂。胶乳粒子可以通过单步聚合反应制备，并且被设计为利用抗原或抗体通过其物理吸附而敏化。由于这种原因，也可以在诊断剂的制备中通过明显简单的方法制备高灵敏粒子。
附图简述
图1是通过在实施例和比较例中使用被抗D-二聚体抗体敏化的凝集测定用胶乳粒子测量标准D-二聚体抗原产生的校准曲线。
图2是显示根据实施例和比较例的利用被抗D-二聚体抗体敏化的凝集测定用胶乳粒子确定的D-二聚体差异性样品1和2中D-二聚体的浓度的图表，所述浓度利用图1中的校准曲线换算。
实施方案描述
为了解决问题已经进行了广泛研究的本发明的发明人提供了一种凝集测定用胶乳粒子，其包含具有苯基的可聚合单体，具有苯基和磺酸盐的可聚合单体，以及具有末端羟基或甲基的聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯(在下文中被称为“PEG单体”)，其中粒子表面上的PEG单体中的官能团的密度是0.05至0.5μmol/m2。
现在将更详细地描述本发明。根据本发明的凝集测定用胶乳粒子含有任何具有苯基的可聚合单体。其实例包括苯乙烯、邻甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、和4-乙烯基苯甲酸。这些可以单独或组合使用。在这些中，优选的是苯乙烯。
具有苯基和磺酸盐的可聚合单体可以是任何在聚合后使得磺酸基能够存在于粒子表面上的单体。此类单体的实例包括苯乙烯磺酸盐、二乙烯基苯磺酸盐、邻甲基苯乙烯磺酸盐、和对甲基苯乙烯磺酸盐。在这里，可以使用任何磺酸盐。其实例包括钠盐、钾盐、锂盐、和铵盐。这些盐可以单独或组合使用。在这些中，优选的是苯乙烯磺酸盐，并且更优选的是苯乙烯磺酸钠。
PEG单体可以是任何由式(1)表示的单体：
CH2＝CR1-COO(CH2CH2O)n-R2...(1)
其中R1表示氢原子或甲基；R2表示氢原子或甲基；并且n为1≤n<20。
其实例包括Blemmer(注册商标，以下同样适用)PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer PE-350(R1＝甲基，R2＝H，n＝8，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer AE-90(R1＝H，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer AE-200(R1＝H，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer AE-400(R1＝H，R2＝H，n＝10，可从NOFCORPORATION获得)，Blemmer PME-100(R1＝甲基，R2＝甲基，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer PME-200(R1＝甲基，R2＝甲基，n＝4，可从NOF CORPORATION获得)，BlemmerPME-400(R1＝甲基，R2＝甲基，n＝9，可从NOF CORPORATION获得)，Blemmer AME-400(R1＝H，R2＝甲基，n＝9，可从NOF CORPORATION获得)，LIGHT ACRYLATE MTG-A(R1＝H，R2＝甲基，n＝3，可从Kyoeisha Chemical Co.,Ltd.获得)，LIGHT ACRYLATE 130A(R1＝H，R2＝甲基，n＝9，可从Kyoeisha Chemical Co.,Ltd.获得)。
在含有具有苯基的可聚合单体、具有苯基和磺酸盐的可聚合单体、和PEG单体的水性介质中，通过无皂乳液聚合制备根据本发明的胶乳粒子。可以通过任何已知的无皂乳液聚合方法进行这种聚合。例如，在反应容器中，将具有苯基的可聚合单体、具有苯基和磺酸盐的可聚合单体、PEG单体、和聚合引发剂加入至作为介质的水中，并且在氮气氛下搅拌的情况下将反应混合物加热。
聚合温度优选为50至100℃，更优选60至85℃。聚合时间取决于条件，如可聚合单体的组成及其含量、以及聚合引发剂，并且通常为5至50小时。
优选的水性介质是单独的水(去离子水)或者水和水可溶混溶剂的混合溶剂。混合溶剂的实例包括水和醇，如乙醇的混合溶剂。在这些中，优选的是单独的水。
可以使用已知的自由基引发剂作为聚合引发剂。其实例包括过硫酸盐，如过硫酸钾、过硫酸钠、和过硫酸铵；偶氮化合物，如2,2'-偶氮二异丁腈、2,2'-偶氮双(4-甲氧基-2,4-二甲基戊腈)、和2,2'-偶氮双-2,4-二甲基戊腈；以及有机过氧化物，如过氧化苯甲酰、过氧化二叔丁基、过氧化月桂酰、和叔丁基过氧基-2-乙基己酸酯。在这些中，优选的是过硫酸盐，更优选的是过硫酸钾。可以以任何含量使用聚合引发剂。相对于可聚合单体，聚合引发剂的优选的含量在0.01至5重量％的范围内。
取决于根据本发明的凝集测定用胶乳粒子的用途，还可以在聚合期间加入可以与上述单体共聚的可聚合不饱和单体。这种可聚合不饱和单体可以是任何通常用于自由基聚合的单体。其实例包括(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯衍生物、(甲基)丙烯腈、(甲基)丙烯酰胺、卤化乙烯基化合物、乙烯基酯、(甲基)丙烯醛、马来酸衍生物、和富马酸衍生物。在整个说明书中，术语(甲基)丙烯酸表示丙烯酸或甲基丙烯酸。苯乙烯衍生物表示除在本发明中使用的具有苯基的可聚合单体以及具有苯基和磺酸盐的可聚合单体外的苯乙烯衍生物。
在本发明中，可以在聚合中以任何量使用PEG单体，以使得粒子表面上的PEG单体中的官能团的密度为0.05至0.5μmol/m2。粒子表面上较高密度的官能团不是优选的，无论其抑制非特异性反应的效果有多高，因为这种较高的密度明显地降低灵敏度。粒子表面上明显低密度的官能团不是优选的，因为这种低密度降低了通过PEG单体抑制非特异性反应的效果，并且在抑制非特异性反应的效果方面所得到的胶乳粒子不优于不含PEG单体的胶乳粒子。本发明的发明人已经发现，重要的是将PEG单体的官能团的密度控制为0.05至0.5μmol/m2以在不降低灵敏度的情况下抑制非特异性反应，并且已经完成了本发明。
根据下列表达式计算PEG单体的官能团的密度：
官能团的密度(μmol/m2)＝(胶乳粒子的制备中使用的PEG单体的摩尔量)/(制备的胶乳粒子的总表面积)
可以通过下列步骤计算官能团的密度：
使r表示制备的胶乳粒子的平均粒径(nm)，
Y表示胶乳粒子的制备中使用的PEG单体的摩尔量(μmol)，或者
Y＝(制备中使用的PEG单体的重量(g))/(制备中使用的PEG单体的平均分子量)，
V表示胶乳粒子的总体积(cm3)，
S表示胶乳粒子的总表面积(cm2)，
x表示胶乳粒子的总数量，
Z表示官能团的密度(μmol/m2)，并且
K表示在聚合反应中使用的具有苯基的可聚合单体、具有苯基和磺酸盐的可聚合单体、聚合引发剂、和PEG单体的总重量(g)，
如下计算V和S：
V＝4/3π(r/2×10-7)3×x，并且
S＝4π(r/2×10-7)2×x
以使S＝6V/(r×10-7)；
则，
Z＝Y/(S×10-4)
＝Y×r×10-3/6V；
其中聚合的聚苯乙烯的比重是1.06g/cm3，
V＝K/1.06，并且
Z＝1.766×10-4×Y×r/K。
根据本发明的用于凝集测定的胶乳粒子的平均粒径适宜为0.05至1.0μm。归因于明显少的量的由胶乳粒子的凝集导致的光学变化，小于0.05μm的平均粒径不能获得测量所需的灵敏度，并且增加试剂制备期间的用于离心的时间而增加试剂成本。在胶乳粒子的平均粒径大于1.0μm并且靶标物质的浓度高的情况下，由胶乳粒子的凝集导致的光学变化超过可测量的范围，并且被测量的光学变化的量不与靶标物质的量对应。平均粒径取决于使用凝集测定用胶乳粒子的测量中所使用的方法和装置。平均粒径优选为0.05至0.7μm，更优选0.05至0.4μm。
胶乳粒子的直径的变异系数(CV值)优选为20％以下。大于20％的变异系数可能会导致试剂制备期间生产批次之间的低再现性，并且因此降低测定用试剂的再现性。变异系数更优选为15％以下。根据下列方程式确定粒径的变异系数：
粒径的变异系数(CV值)＝(粒子直径的标准差)/(平均粒径)
可以由胶乳粒子制备中使用的PEG单体的摩尔量控制官能团的密度，其表示根据本发明的凝集测定用胶乳粒子的表面上的PEG单体的密度。即，以胶乳粒子制备中使用的PEG单体的摩尔量而非重量计，规定每单位面积胶乳粒子表面上的官能团的量。可以通过简单操作由具有不同分子量的任何PEG单体确定官能团的密度，只要PEG单体可以由式(1)表示即可：
CH2＝CR1-COO(CH2CH2O)n-R2...(1)
其中R1表示氢原子或甲基；R2表示氢原子或甲基；并且n为1≤n<20。
以在其中胶乳粒子悬浮在水或水性溶剂中的状态得到根据本发明的凝集测定用胶乳粒子。可以以任何含量使用该粒子。含量通常为1至20重量％。在小于1重量％的含量下，应当在其制备期间将试剂浓缩。在大于20重量％的含量下，粒子凝集。
本发明的另一个方面是携带通过物理吸附特异性结合至靶标物质的物质的凝集测定用胶乳粒子。特异性结合至靶标物质的物质可以是任何用于免疫血清试验的试剂(在免疫凝集反应和凝集抑制反应中使用的试剂)或通常在生物化学测定中使用的任何生理学活性物质。在这些中，在抗原-抗体反应中使用的物质是适合的。
在抗原-抗体反应中使用的物质的实例包括抗原或抗体，如蛋白质、核酸、核蛋白、雌激素、和脂质。抗原的实例包括各种抗原、受体、和酶，如β2-微球蛋白、C-反应蛋白(CRP)、胰岛素、人纤蛋白酶原、铁蛋白、类风湿因子(RA)、α-胎蛋白(AFP)、支原体抗原、和HBs抗原。抗体的实例包括各种针对毒素和病菌的抗体，如抗链酶素O抗体(anti-streptolisynOantibody)、抗雌激素抗体、抗β2-微球蛋白抗体、抗梅毒密螺旋体抗体、针对梅毒脂质抗原的抗体、抗HBs抗体、抗HBc抗体、抗HBe抗体、抗PSA抗体、抗CRP抗体、抗胰岛素抗体、和抗D-二聚体抗体。抗体可以是免疫球蛋白分子本身或其片段，如F(ab’)2。要使用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
可以通过任何已知方法将与靶标物质特异性反应的物质携带在(敏化至)胶乳粒子上，只要是通过物理吸附进行固定或敏化即可。
可以任选地将携带在胶乳粒子上的物质用牛血清白蛋白封闭并且分散在适当的缓冲液中以制备敏化胶乳粒子的分散液。可以使用敏化胶乳粒子的分散液、缓冲液、和要在测量中使用的标准物质作为凝集测定用试剂的试剂盒。
可以将与靶标物质特异性反应的物质以任何量携带在胶乳粒子上。量取决于与靶标物质特异性反应的物质的类型。
对于包含携带抗原或抗体的胶乳粒子的测定用试剂的使用来说，试剂可以含有多种敏化剂以增强用于测定的灵敏度并且促进抗原-抗体反应。敏化剂的实例包括烷基化多糖，如甲基纤维素和乙基纤维素；支链淀粉；和聚乙烯吡咯烷酮。
根据本发明的胶乳粒子可以高度抑制非特异性反应。此外，胶乳粒子可以含有蛋白质，如白蛋白(牛血清白蛋白、卵清蛋白)、酪蛋白、和明胶，以及它们的分解产物，氨基酸，或表面活性剂，以抑制由样品中存在的其他物质引起的非特异性反应或者增强试剂的稳定性。
可以用适当的稀释液稀释靶标物质。稀释液可以是任何pH为5.0至9.0的缓冲液。其实例包括磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液(tris buffers)、硼酸盐缓冲液、和柠檬酸盐缓冲液。
包含携带抗原或抗体的根据本发明的胶乳粒子的测定用试剂可以通过光学测量胶乳粒子凝集的程度来测定样品中靶标物质的反应量，所述胶乳粒子凝集由样品中的靶标物质与可与胶乳粒子上携带的靶标物质反应性的物质的特异性反应引起。可以用任何标准生物化学自动分析仪，如可以检测散射光的强度、透射光的强度、和吸光度的光学检测器或者以组合方式设置有这些检测器的任何光学装置，进行光学测量。
可以通过任何已知方法光学确定凝集的程度。其实例包括：随着浊度增加而检测凝集的浊度测定，随着粒径分布或平均粒径的变化而检测凝集的方法，和检测积分球浊度的方法，其中用积分球测量由凝集导致的前向散射光(forward-scattered light)的变化并且之后与透射光的强度比较。
测量凝集程度变化的方法的实例还包括：倍率测定(rate assay)，其中从在不同时间的测量得到至少两个值，并且基于这两个在不同时间测量的值之间的增加(增加的倍率)来确定凝集的程度；以及终点测定，其中从在一个时间(通常被认为是反应终点的时间)的测量得到一个值，并且由所得到的值确定凝集的程度。在这些中，根据浊度测定的终点测定是适合的，因为操作简单且快速。
实施例
现在将通过实施例的方式更详细地描述本发明。实施例中制备的凝集测定用胶乳的粒径各自测量如下。
凝集测定用胶乳的粒径的测量：
通过常规方法将凝集测定用胶乳粒子放在胶棉膜上。用透射电子显微镜对粒子的图像拍照，并且测量图像上的粒子直径(100个以上粒子的)以确定平均粒径和标准差。
[实施例1]
将超纯水(1000g)、苯乙烯单体(135g)、Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)、苯乙烯磺酸钠(1.2g)、和过硫酸钾(0.7g)置于设置有搅拌器、回流冷却器、温度检测器、氮入口管、和套管的玻璃反应器(体积：2L)中。在将容器用氮气清扫后，将混合溶液在210rpm的搅拌下在70℃聚合24小时。
在停止聚合后，通过滤纸过滤溶液以萃取胶乳粒子。通过透析膜将胶乳粒子透析48小时以精制胶乳粒子。胶乳粒子具有0.109μm的粒径(CV：8.4％)和0.192μmol/m2的PEG密度。
[实施例2]
除了用Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)(0.39g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.108μm的粒径(CV：11.7％)和0.191μmol/m2的PEG密度。
[实施例3]
除了用Blemmer PE-350(R1＝甲基，R2＝H，n＝8，可从NOF CORPORATION获得)(0.60g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.106μm的粒径(CV：9.8％)和0.187μmol/m2的PEG密度。
[实施例4]
除了用Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)(0.12g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.101μm的粒径(CV：10.5％)和0.054μmol/m2的PEG密度。
[实施例5]
除了用Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)(0.98g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.105μm的粒径(CV：10.1％)和0.464μmol/m2的PEG密度。
[比较例1]
除了不使用Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.107μm的粒径(CV：10.3％)。因为未使用PEG单体，PEG密度为0。
[比较例2]
除了用Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)(0.03g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.104μm的粒径(CV：9.5％)和0.018μmol/m2的PEG密度。
[比较例3]
除了用Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)(1.59g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.106μm的粒径(CV：11.3％)和0.749μmol/m2的PEG密度。
[比较例4]
除了用Blemmer PE-200(R1＝甲基，R2＝H，n＝4至5，可从NOF CORPORATION获得)(4.05g)代替Blemmer PE-90(R1＝甲基，R2＝H，n＝2，可从NOF CORPORATION获得)(0.24g)之外，与在实施例1中一样制备胶乳粒子。胶乳粒子具有0.106μm的粒径(CV：9.3％)和1.891μmol/m2的PEG密度。
[应用]
用实施例和比较例中制备的胶乳粒子评价D-二聚体试剂。使用下列试剂和材料。
<试剂和材料>
·抗D-二聚体抗体
·用于制备携带抗体的胶乳粒子的缓冲液：使用20mM Tris-HCl(pH：8.0)。
·用于封闭的缓冲液：使用在20mM Tris-HCl(pH：8.0)中的2％BSA。
·用于稀释样品的缓冲液：使用在30mM Tris-HCl(pH：8.5)中的0.15％BSA。
<用于测量D-二聚体的试剂的制备>
在将实施例1至5和比较例1至4中制备的胶乳粒子各自通过离心精制后，利用用于制备携带抗体的胶乳粒子的缓冲液将胶乳粒子各自稀释至5％(w/v)以制备稀释的胶乳溶液。
利用用于制备携带抗体的胶乳粒子的缓冲液将抗D-二聚体抗体稀释至1mg/mL以制备稀释的抗体溶液。
在搅拌稀释的胶乳溶液的同时将稀释的抗体溶液(1体积)加入至稀释的胶乳溶液(1体积)。进一步搅拌混合溶液。另外加入用于封闭的缓冲液(2体积)，并且连续搅拌混合溶液。将溶液回收，并且用缓冲液调节至0.5％(w/v)以制备经抗体敏化的胶乳粒子的分散液。用经抗体敏化的胶乳粒子的分散液测量D-二聚体抗原标准溶液以产生校准曲线。
装置：Hitachi 7170自动分析仪
波长：570/800nm
运行温度：37℃
靶标物质(0至58μg/mL D-二聚体标准溶液)：12μL
第一试剂(含有0.15重量％牛血清白蛋白的Tris缓冲液)：100μL
第二试剂(0.5％经抗体敏化的胶乳粒子的分散液)：100μL
用于测量的点：18-34
[测量1]
根据上述方法利用实施例1至5和比较例1至4中的被抗D-二聚体抗体敏化的经抗体敏化的胶乳粒子(0.5％(w/v))进行测量，以做出校准曲线(图1)。图1明显地显示实施例1至5中的经抗体敏化的胶乳粒子实现了相对高灵敏的测定。图1还显示比较例1至4中的经抗体敏化的胶乳粒子具有比实施例2中的经抗体敏化的胶乳粒子的灵敏度低的灵敏度。
[测量2]
根据上述方法对实施例1至5和比较例1至4中的被抗D-二聚体抗体敏化的诊断剂粒子(0.5％(w/v))和两个D-二聚体差异性样品进行测量，并且利用测量1中做出的校准曲线将观察到的值换算为D-二聚体的浓度。在这里，D-二聚体差异性样品是在其中在由D-二聚体的常规免疫浊度测定测量的系统中观察到非特异性凝集反应的样品。结果在图2中示出。图2明显地显示，与比较例1中的不含PEG单体的胶乳粒子相比，实施例1至5中的经抗体敏化的胶乳粒子更明显地抑制D-二聚体差异性样品中的非特异性凝集反应。图2还显示，与实施例1至5中的经抗体敏化的胶乳粒子相比，比较例2至4中的经抗体敏化的胶乳粒子同样明显地或更明显地抑制D-二聚体差异性样品中的非特异性凝集反应，然而如在测量1中所示，灵敏度明显降低，尤其是在比较例3和4的测量中得到负值。比较例中的不足的灵敏度的原因很可能是因为胶乳粒子的表面不充分地吸附抗体(或不充分地被抗体敏化)。
工业适用性
根据本发明的凝集测定用胶乳粒子连同凝集测定用试剂可以仅引起靶标特异性凝集反应而不吸附样品中的引起非特异性凝集反应的非靶标蛋白质。因此，根据本发明的凝集测定用胶乳粒子和凝集测定用试剂可以提供比常规诊断剂更灵敏的诊断剂。根据本发明的凝集测定用胶乳粒子和凝集测定用试剂可以用作用于免疫血清学试验的试剂(在免疫学凝集反应和凝集抑制反应中使用的试剂)和用于测试通常在生物化学测定中使用的生理学活性物质的试剂。

Claims (13)

1.一种凝集测定用胶乳粒子，所述凝集测定用胶乳粒子在含有下列各项的水性介质中通过无皂乳液聚合制备：
具有苯基的可聚合单体，
具有苯基和磺酸盐的可聚合单体，以及
由式(1)表示的可聚合单体：
CH2＝CR1-COO(CH2CH2O)n-R2...(1)
其中R1表示氢原子或甲基；R2表示氢原子或甲基；并且n为1≤n<20，
其中在所述粒子的表面上的衍生自所述由式(1)表示的可聚合单体的官能团的密度是0.05至0.5μmol/m2。
2.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述具有苯基的可聚合单体是选自由下列各项组成的组中的至少一种：苯乙烯、邻甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、对氯苯乙烯、和4-乙烯基苯甲酸。
3.根据权利要求1或2所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述具有苯基和磺酸盐的可聚合单体是选自由下列各项组成的组中的至少一种：苯乙烯磺酸盐、二乙烯基苯磺酸盐、邻甲基苯乙烯磺酸盐、和对甲基苯乙烯磺酸盐。
4.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述具有苯基的可聚合单体是苯乙烯，并且所述具有苯基和磺酸盐的可聚合单体是苯乙烯磺酸钠。
5.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中在聚合期间，加入与上述单体可共聚的可聚合不饱和单体。
6.根据权利要求5所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述可聚合不饱和单体包括(甲基)丙烯酸、(甲基)丙烯酸酯、苯乙烯衍生物、(甲基)丙烯腈、(甲基)丙烯酰胺、卤化乙烯基化合物、乙烯基酯、(甲基)丙烯醛、马来酸衍生物和富马酸衍生物。
7.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述凝集测定用胶乳粒子的平均粒径为0.05至1.0μm。
8.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述凝集测定用胶乳粒子的直径的变异系数为20％以下。
9.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述胶乳粒子通过物理吸附携带抗原或抗体。
10.根据权利要求9所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述抗原包括β2-微球蛋白、C-反应蛋白、胰岛素、人纤蛋白酶原、铁蛋白、类风湿因子、α-胎蛋白、支原体抗原和HBs抗原，并且所述抗体包括抗链酶素O抗体、抗雌激素抗体、抗β2-微球蛋白抗体、抗梅毒密螺旋体抗体、针对梅毒脂质抗原的抗体、抗HBs抗体、抗HBc抗体、抗HBe抗体、抗PSA抗体、抗CRP抗体、抗胰岛素抗体和抗D-二聚体抗体。
11.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述凝集测定用胶乳粒子还包含蛋白质及其分解产物或表面活性剂。
12.根据权利要求1所述的凝集测定用胶乳粒子，其中所述凝集测定用胶乳粒子还包含氨基酸。
13.一种凝集测定用试剂，所述凝集测定用试剂包含根据权利要求1至12中任一项所述的凝集测定用胶乳粒子。
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