CN105424936B - Psa测定方法及其试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过一步反应简便和高精度的PSA测定方法，其中不使用具有不同平均粒度的载体。还提供了用于其的试剂。所述PSA测定方法包括：用两种类型的识别不同表位的抗PSA单克隆抗体固定化不溶性载体，所述载体具有大于0.20μm但等于或小于0.40μm的相同的平均粒度，所述两种类型的抗PSA单克隆抗体是与游离PSA和PSA‑ACT二者均反应的抗PSA单克隆抗体，所述PSA‑ACT是PSA与α1‑抗胰凝乳蛋白酶的复合物；和使该载体在存在凝集促进剂的条件下与样品接触。

Description

PSA测定方法及其试剂
本申请是国际申请号PCT/JP2012/058056，国际申请日为2012年3月28日，中国申请号为201280014696.2，发明名称为“PSA测定方法及其试剂”的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗原测定方法以及试剂，其使得能够通过免疫凝集测量游离抗原和样品中游离抗原与共存物质的复合物，以获得等摩尔反应。特别地，本发明涉及前列腺特异性抗原的测定方法，及其试剂。
背景技术
前列腺癌是见于男性的一种恶性疾病。在美国和欧洲，大量患者受到前列腺癌的折磨。近年来，在日本，患前列腺癌的患者的数量迅速增加。由于前列腺癌发展缓慢，可以有效地通过放射疗法或抗雄性激素疗法治疗，因此重要的是在早期阶段发现前列腺癌。
前列腺特异性抗原(以下可称作“PSA”)是由前列腺上皮细胞分泌的糖蛋白(丝氨酸蛋白酶)，分子量为33,000-34,000Da。由于患前列腺疾病的人与健康人相比表现出血液中PSA水平的增加，所以PSA对于前列腺疾病(特别是前列腺癌)的早期检测是有用的。PSA分为与血液中蛋白酶抑制剂相结合的复合物类型的PSA和游离PSA(以下可称为“fPSA”)。血液中的大部分PSA是复合物类型的PSA，以PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(以下可称为“PSA-ACT”)、PSA与α2-巨球蛋白的复合物等的形式存在。fPSA和PSA-ACT可以通过免疫测定法进行测量。
利用乳胶等的基于凝集反应的测定(免疫凝集测定)被用作免疫测定。然而，由于抗PSA单克隆抗体与fPSA和PSA-ACT具有不同的反应性，所以可能难以准确测量PSA总水平。
为了解决上述问题，PTL 1提出了一种免疫凝集测定试剂及使用其进行的测定，其中免疫凝集测定试剂包括：(1)包括其上固定化了第一单克隆抗体的第一不溶载体颗粒的第一颗粒悬浮液，所述第一单克隆抗体能够结合游离测量目标物质和游离测量目标物质与相应结合分子的复合物，(2) 包括其上固定化了第二单克隆抗体的第二不溶载体颗粒的第二颗粒悬浮液，所述第二单克隆抗体能够结合游离测量目标物质和游离测量目标物质与相应结合分子的复合物，但不与第一单克隆抗体竞争，以及(3)包括其上固定化了第三单克隆抗体的第三不溶载体颗粒的第三颗粒悬浮液，所述第三单克隆抗体不识别游离测量目标物质，但识别游离测量目标物质与相应结合分子的复合物。
PTL 2提出了一种测定试剂及使用其进行的测定，其中所述测定试剂如下调节与游离抗原和复合物类型的抗原的反应性：使用在两种或更多种类型的粒度不同的载体中具有较小粒度并且其上固定化了至少一种单克隆抗体的载体，所述至少一种单克隆抗体是三种与游离抗原和复合物类型的抗原具有反应性但识别位点不同的单克隆抗体中的单克隆抗体；并且使用其上固定化了其余的单克隆抗体的所述两种或更多种载体中具有较大粒度的载体。
PTL 3提出了一种两步反应的免疫测定法，包括(1)使包括游离测量目标物质和复合物类型的测量目标物质的样品与其上固定有针对测量目标物质的单克隆抗体1的乳胶1接触，获得反应产物1，以及(2)使反应产物1与其上固定有与单克隆抗体1识别位点不同的单克隆抗体2的乳胶2接触，获得反应产物2。
PTL 4提出了一种前列腺特异性抗原免疫测定试剂及使用其进行的测定，其中免疫测定试剂包括其上固定有与游离PSA和PSA复合物有反应性的单克隆抗体1的乳胶1，以及其上固定有与游离PSA和PSA复合物有反应性的单克隆抗体2的乳胶2，单克隆抗体2与单克隆抗体1的识别位点不同，并且乳胶2与乳胶1的平均粒度不同。
引证文件列表
专利文献
PTL 1：JP-A-2001-108681
PTL 2：WO2006/068206
PTL 3：JP-A-2007-163319
PTL 4：日本专利No.4241301
发明概述
技术问题
然而，当使用PTL 1公开的方法时，当PSA-ACT的混合比增加的时候，观察到相对测定值下降(参见将具有0.78μm的平均粒度且其上固定化了抗PSA的单克隆抗体的聚苯乙烯乳胶、fPSA和PSA-ACT以不同比例混合时的测定结果)。特别地，当仅使用PSA-ACT时，游离PSA的相对测定值为81.43％且没有获得等摩尔反应。PTL 2公开的方法的问题是需要联合使用不同粒度的乳胶，PTL 3公开的方法的问题是需要实施两步反应，其中在第一单克隆抗体反应后使第二单克隆抗体反应。PTL 4公开的方法也有需要联合使用不同粒度的乳胶的问题。PTL 4公开了比较例，其中使用了具有相同平均粒度(0.22μm)的乳胶。但是，没有使用凝集促进剂，且没有获得等摩尔反应。
鉴于上述情况，期望开发能够更容易并更准确测定PSA总水平(即能通过免疫测定测量的fPSA和PSA-ACT的总和)的方法。
特别地，本发明的目的是提供通过一步反应且不使用具有不同平均粒度的载体来容易并准确地测量PSA的测定方法，以及使用的试剂。请注意本文中使用的表述“PSA的测量”或“PSA的测定”指PSA总水平的测量或测定，除非另有说明。
问题的解决方案
实现上述目的的本发明的几个方面包括下述方面。
(1)一种PSA测定方法，所述测定方法包括：使用其上固定化了两种类型的抗PSA单克隆抗体的不溶载体，使该不溶载体在存在凝集促进剂的条件下与样品接触，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体能够与游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)二者均反应且识别不同的表位，而且所述不溶载体具有大于0.20μm且等于或小于0.40μm的相同的平均粒度。
(2)根据(1)的PSA测定方法，其中所述凝集促进剂是选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸和聚(2-甲基丙烯酰基氧基 乙基磷酸胆碱)的一种或多种凝集促进剂。
(3)根据(1)的PSA测定方法，其中所述不溶载体是选自包含衍生于以下的物质的颗粒的一种或多种类型的不溶载体：合成聚合物的乳胶颗粒、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷、和/或磁性体。
(4)根据(1)的PSA测定方法，其中调节所述凝集促进剂的浓度以获得对于游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的等摩尔反应。
(5)根据(2)的PSA测定方法，其中所述多糖是选自右旋糖酐、普鲁兰、和包括甲基纤维素和乙基纤维素的烷基化多糖的一种或多种多糖。
(6)根据(3)的PSA测定方法，其中所述合成聚合物是选自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一种或多种合成聚合物。
(7)根据(1)至(6)任一项的PSA测定方法，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的解离常数(cKd)的比值(fKd/cKd)为大于0.1且等于或小于2.0，并且对游离PSA的解离常数(fKd)为10nM或更小。
(8)包含至少1)和2)的PSA测定试剂：
1)通过使用其上固定化了两种类型的抗PSA单克隆抗体的不溶载体制备的抗体固定化(antibody-immobilized)载体，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体能够与游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)二者均反应且识别不同的表位，而且所述不溶载体具有大于0.20μm且等于或小于0.40μm的相同的平均粒度；
2)选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、和聚(2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱)的一种或多种凝集促进剂。
(9)根据(1)的PSA测定方法，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的解离常数(cKd)的比值(fKd/cKd)为大于0.1且等于或小于2.0，并且对游离PSA的解离常数(fKd)为10nM或更小，所述凝集促进剂是选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、 和聚(2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱)的一种或多种凝集促进剂，并且调节所述凝集促进剂的量以获得对游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的等摩尔反应。
发明的有益效果
根据本发明的所述方面的测定方法可以通过一步反应且不使用具有不同平均粒度的载体而容易并准确地测量PSA。因此，能够使用通用的自动分析仪进行高精度的测定，而无需特殊设备。
具体实施方案
(测量目标物质)
本发明的实施方案的目标为前列腺特异性抗原(PSA)(即测量目标物质)。可以通过免疫测定测量的血浆中的PSA包括游离PSA(fPSA)和游离PSA(fPSA)与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)。
目标样品没有特别限制，只要该样品包括PSA，但优选为血液、血清、血浆等。
(抗PSA单克隆抗体)
使用能与fPSA和PSA-ACT二者均反应且识别不同表位的至少两种类型的抗PSA单克隆抗体作为针对PSA的单克隆抗体。所述两种类型的抗PSA单克隆抗体之间表位的不同可以通过证实是否能使用PSA(抗原)和这些抗体进行常规的夹心免疫测定来确定。
(抗体的选择)
抗体的选择如下所述。
理想的是选择在ELISA等中与PSA-ACT和fPSA有高反应性(即高效价)的抗体。理想地是选择能确保足够测量灵敏度的载体。在载体上固定化从所挑选的具有高效价的抗体中任意选择的两种抗体，选择抗体的组合使得与PSA-ACT和fPSA的反应性显示小的差异并获得足够的测量灵敏度。
优选抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的解离常数(cKd)的比值(fKd/cKd)为大于0.1，更优选大于0.2。比值(fKd/cKd)的上限优选为2.0或更小，更优选为1.5或更小。对游离PSA的解离常数(fKd)优选为10nM或更小，更优选为6nM或更小。
单克隆抗体可以包括，例如，由木瓜蛋白酶等部分水解获得的Fab片段，由胃蛋白酶等部分水解获得的F(ab’)2片段，和/或F(ab’)2片段经还原获得的Fab’片段。
(不溶载体)
其上固定化了抗体的不溶载体没有特别限制，但优选选自包含衍生于以下的物质的颗粒：合成聚合物的乳胶颗粒、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷、和/或磁性体。合成聚合物优选是选自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一种或多种合成聚合物。
特别优选使用通过无皂乳液聚合获得的聚苯乙烯乳胶颗粒。聚苯乙烯乳胶可以例如用WO2003/005031中公开的方法生产。特别地，在包含水作为溶剂的反应容器中装入特定量的苯乙烯单体、引发剂(如过硫酸钾)、和聚合稳定剂(如苯乙烯磺酸钠)。在任选地加入乳化剂(如，十二烷基硫酸钠)后，将混合物在氮气气氛中加热并搅拌，进行聚合。
(不溶载体的粒度)
不溶载体的平均粒度为大于0.20μm且等于或小于0.40μm，优选大于0.22μm且等于或小于0.40μm，更优选为等于或大于0.23μm且等于或小于0.40μm，更优选为等于或大于0.23且等于或小于0.34μm。如果不溶载体的平均粒度为0.20μm或更小，或者超过0.40μm，则可能难以获得等摩尔反应。应注意，本文中与不溶载体一起使用的术语“平均粒度(μm)”指使用透射式电子显微镜(参见实施例)进行图像分析并四舍五入至小数点后两位数字获得的值。应注意，通过图像分析可以将平均粒度计算到小 数点后四位数字。
在平均粒度大于0.20μm且等于或小于0.40μm的情况下，当颗粒A的平均粒度(±SD)为M±N，颗粒B的平均粒度(±SD)为P±Q，M＞P，且N和Q为0.02μm或更小时，如果这两种类型的颗粒(例如在不同批次中制备的)满足“M-N≤P+Q”的关系，则认为这两种类型的颗粒具有相同的平均粒度。
例如，当颗粒A的平均粒度为0.22±0.02μm，且颗粒B的平均粒度为0.21±0.02μm时，M-N为0.20，P+Q为0.23(即满足上述关系)。因此，认为颗粒A和颗粒B具有相同的平均粒度。
当颗粒A的平均粒度为0.40±0.02μm，且颗粒B的平均粒度为0.37±0.02μm时，M-N为0.38，P+Q为0.39(即满足上述关系)。因此，认为颗粒A和颗粒B具有相同的平均粒度。
如上所述被认为具有相同的平均粒度并以任意比例混合的颗粒的混合物在本发明的范围内。
根据本发明的实施方案，两种或更多种载体具有相同的平均尺寸，但不排除由不同材料制成的载体的组合。也不排除具有不同平均粒度的载体的组合，只要其中的载体具有在上述范围内的平均粒度并用于主要反应中以获得等摩尔反应。
(抗体的固定化)
不溶载体可以通过常用的物理吸附法，和化学结合法，免疫结合法等在其上固定化抗体。其上分别固定化了识别不同表位的两种类型的单克隆抗体的载体通常以适当的比例混合(参见实施例)，但是可以将所述两种类型的单克隆抗体事先以适当的比例混合以固定化在载体上。
(凝集促进剂)
凝集促进剂没有特别限制，只要所述凝集促进剂促进其上固定化了抗体的不溶载体经由抗原抗体反应发生的凝集。凝集促进剂的实例包括聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、聚(2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱)(以下可称为“MPC聚合物”)等。多糖优选是选自 右旋糖酐、普鲁兰、和烷基化多糖(包括甲基纤维素和乙基纤维素)的一种或多种多糖。聚-γ-谷氨酸可以是碱金属盐(如钠盐、钾盐、或锂盐)，碱土金属盐(如镁盐、钙盐、或钡盐)，或铵盐。
其中，优选聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮，更优选聚乙二醇。应注意可以组合使用多个凝集促进剂。
市场上可以买到不同分子量的产品作为凝集促进剂，可以在考虑水溶性等的情况下进行适当的选择。例如，聚乙二醇的数均分子量优选为3,000-1,000,000，更优选为5,000-100,000，特别优选为5,000-50,000。当聚乙二醇的数均分子量为3,000-1,000,000时，可以获得极好的测量灵敏度。聚乙烯吡咯烷酮可以具有例如25,000-1,200,000的重均分子量，优选40,000-360,000。聚-γ-谷氨酸可以具有例如200,000-6,000,000的重均分子量。MPC聚合物可以具有例如5,000-5,000,000的分子量，优选500,000-2,000,000。
在考虑载体的平均粒度和凝集促进剂的类型的情况下，优选适当地设定凝集促进剂的浓度以获得等摩尔反应。例如，当凝集促进剂与样品相接触时，优选调节凝集促进剂的浓度以使凝集促进剂的终浓度为0.1-5wt％，更优选为0.2-2wt％，特别优选为0.2-0.6wt％。当凝集促进剂的终浓度为0.1-5wt％时，可以获得极好的测量灵敏度。
(添加剂)
可以向试剂中加入多糖(如葡萄糖和蔗糖)、无机盐(如氯化钠)、表面活性剂(如聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬脂酸酯)、防腐剂(如叠氮化钠)、和/或非特异性反应抑制剂(如来自于正常动物的IgG抗体)，只要其不妨碍抗PSA单克隆抗体和PSA之间的反应。
试剂中多糖的含量优选为大约0.1至大约10wt％，试剂中无机盐的含量优选为大约0.01至大约5wt％，试剂中表面活性剂的含量优选为大约0.02至大约5wt％，试剂中防腐剂的含量优选为大约0.001至大约0.1wt％，试剂中非特异性反应抑制剂的含量优选为大约0.001至大约5wt％。
(缓冲液)
根据本发明实施方案的抗原-抗体反应在缓冲液中进行。缓冲液的类型、浓度和pH没有特别限制，只要能发生抗原-抗体反应。缓冲液的实例包括磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good’s缓冲液等。缓冲液的浓度为大约3至大约500mM，优选为5-100mM，更优选为5-50mM。优选缓冲液具有中性至碱性的pH(通常为6.5-9.5)。
(凝集信号测定方法)
可以使用用于测定凝集反应的任何方法测定凝集信号。例如，可以通过测量吸光度、颗粒计数、颗粒大小、散射光等测定凝集信号。
例如，如下所述测定PSA。
特别地，当用能与fPSA和PSA-ACT二者反应的至少两种类型的抗体固定化在载体(如乳胶)上并随后与包括fPSA和/或PSA-ACT的样品反应时，发生凝集反应。样品中的PSA总水平可以通过测定凝集程度，并将所测定的凝集程度与使用具有已知PSA水平的标准溶液时的凝集程度相比较来确定。例如，优选使用通用的生物化学自动分析仪，通过吸光度的变化来测定凝集程度。在这种情况下，优选使用500-900nm波长的吸光度的变化来测定凝集程度。
(等摩尔反应)
由于可以使用根据本发明实施方案的测定获得对fPSA和PSA-ACT的等摩尔反应，所以可以高精度地定量测定PSA。
本文使用的表述“对fPSA和PSA-ACT的等摩尔反应”指测定仅包括fPSA的样品获得的信号与测定仅包括PSA-ACT(与fPSA等摩尔)的样品获得的信号的比值为大约1∶1。
例如，计算每等摩尔的fPSA和PSA-ACT的凝集信号的比值(PSA-ACT/fPSA)(以下可称为“c/f比值”)，当c/f比值为85-115％(更优选90-110％)时则视为获得等摩尔反应。
(生产试剂的方法)
如下所述生产根据本发明实施方案的PSA测定试剂。
特别地，可以如下生产PSA测定试剂：提供其上已经固定化了能与PSA-ACT和fPSA二者反应且识别位点不同的两种类型的抗体的载体，将其上已经固定化了两种类型的抗体且具有相同平均粒度(大于0.20μm且等于或小于0.40μm)的载体的混合比设定在特定范围内，并调节凝集促进剂的浓度使得获得对PSA-ACT和fPSA的等摩尔反应。混合比为1∶10至10∶1，优选为1∶5至5∶1，更优选为1∶2至2∶1。
下面进一步通过实施例描述本发明。应当注意本发明不限于下述实施例。
实施例
(单克隆抗体的制备)
1.免疫
(1)免疫原
使用来源于人精液的纯化的PSA(SCIPAC Ltd.，编号P117-7，纯度：96％)作为免疫原。纯化的PSA用20mM PBS(pH：7.2)渗析后使用。
(2)免疫方法
将上述PSA溶液和完全弗氏佐剂(CFA)(GIBCO)以1∶1的比例混合并乳化，对6周龄的雌性Balb/C小鼠的背部以25μg PSA/小鼠的量进行皮下施用。以2周的间隔进行另外的三次免疫，在细胞融合前3天将PSA溶液(25μg PSA/小鼠)进行腹膜内施用。
2.细胞融合
从用PSA免疫的每只小鼠中摘除脾脏，收集脾细胞。将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/O-Ag14以6∶1的比例混合，在存在50％聚乙二醇1540(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)的条件下融合。将融合细胞悬浮于HAT培养基中，使得脾细胞的数量为2.5×106，并使其以0.2ml/孔的量分散于96孔培养板(CORNING Inc.)上。在5％CO2培养箱中在37℃培养融合细胞2周。
3.筛选
将分散有融合细胞的培养板的每个孔中的培养上清液进行ELISA(见 下文)以选择与fPSA和PSA-ACT二者均反应的孔。
(1)材料：抗原
1)PSA：SCIPAC，编号P117-7
2)PSA-ACT：SCIPAC，编号P192-3
(2)方法
1)将ELISA板(Nunc)用山羊抗鼠IgG(Fc)抗体(Jackson Inc.)(5μg/ml)包被(50μl/孔)，于4℃放置过夜。
2)在将ELISA板用洗涤液(0.05％Tween 20-PBS)洗涤三次(400μl/孔)后，将封闭试剂(0.05％Tween 20-PBS)以200μl/孔的量分散于每孔中，将ELISA在室温放置1小时。
3)除去封闭试剂后，将分散有融合细胞的培养板的每个孔中的培养上清液以50μl/孔的量分散于ELISA板的每个孔中，将ELISA板在室温放置1小时。
4)将ELISA板用洗涤液(0.05％Tween 20-PBS)洗涤3次后，将用0.05％Tween 20-PBS稀释至5ng/ml的fPSA或PSA-ACT以50μl/孔的量分散于每个孔中，将ELISA板在室温放置1小时。
5)将ELISA板用洗涤液洗涤3次后，将HRP--兔抗人PSA抗体(×500)以50μl/孔的量分散于每个孔中，将ELISA板在室温放置1小时。应注意使用兔抗人PSA抗体(DAKO)和过氧化物酶(Toyobo Co.，Ltd.)通过过碘酸法制备HRP--兔抗人PSA抗体。
6)将ELISA板洗涤3次后，将OPD显色剂以50μl/孔的量分散于每个孔中，将ELISA板在室温放置10分钟。
7)将终止液(1.5N硫酸)以50μl/孔的量分散于每个孔中以终止反应，用平板读数器(plate leader)测定492nm波长下的吸光度。
4.克隆
将上述筛选过程中与fPSA和PSA-ACT二者均反应的孔中的细胞系通过有限稀释法进行克隆以建立杂交瘤。由此获得28种建立的杂交瘤。
5.单克隆抗体的制备
将通过克隆获得的杂交瘤(0.5×106细胞)对2周前已进行0.5ml降植烷腹膜内施用的8周龄的雌性Balb/C小鼠进行腹膜内施用。2周后收集腹 膜液，用蛋白A柱(Amershamplc)纯化IgG级分。由此获得28种单克隆抗体的纯化级分。
(对单克隆抗体组合的初步考虑)
将28种类型的单克隆抗体中的每一种固定化在乳胶上，如下所述观察乳胶的凝集。两种抗体(#91抗体和#51抗体)表现出大信号，选择其与乳胶的组合。
1.抗体的选择
(1)将用20mM Tris-HCl(pH：8.5)稀释的1％乳胶(0.3μm)溶液与每种单克隆抗体溶液(0.5Abs)按1∶1(v/v)的比例混合，在4℃搅拌混合物2小时。
(2)加入包括0.4％BSA(2vol)的20mM Tris-HCl(pH：8.5)后，在4℃搅拌混合物1小时。
(3)离心去除上清液，悬于5mM MOPS(pH：7.0)中，使得600nm的吸光度为2Abs。
(4)选择两种MoAb-Lx(抗体固定化的乳胶)，按1∶1(v/v)的比例混合以获得试剂2(用所有的组合制备试剂2)。
(5)利用试剂1(包括0.1％BSA、0.5MNaCl、0.3％聚乙烯吡咯烷酮K-90(PVP K-90)的30mM HEPES缓冲液(pH：7.0))和试剂2，使用Hitachi 7170自动分析仪测定26ng/ml的fPSA和PSA-ACT。
(6)从表现出凝集反应的单克隆的抗体组合中获得被认为识别不同表位的两组抗体。
i)#63217、#63251、和#63279
ii)#63214和#63291
使用i)和ii)组的抗体组合观察到凝集反应。
产生抗体#63251、#63279、和#63291的杂交瘤保藏于国际专利生物保藏机构(IPOD)，独立行政法人产业技术综合研究所，保藏号为FERM BP-11453、FERM BP-11454、和FERM BP-11455。从这些杂交瘤获得的单克隆抗体可称为“#51抗体”、“#79抗体”、和“#91抗体”，分别对应于识别号码的最后两位数字。
(不同粒度的乳胶的产生)
1)0.2μm或更小
在配备有搅拌器、回流冷凝器、温度计、氮入口管、加热油浴等的玻璃反应容器(21)中加入1200g水、200g苯乙烯单体、1.2g过硫酸钾、和0.2g苯乙烯磺酸钠，在搅拌下(大约200rpm)将反应容器中的气氛充分置换为氮气。将单体在70℃聚合约18小时后，通过滤纸(ADVANTEC No.
2)过滤反应溶液，获得乳胶颗粒。用透射式电子显微镜对乳胶颗粒进行照相，任意选择3个视野，对每个视野内的100个或更多个乳胶颗粒进行图像分析以确定每个视野的乳胶颗粒的平均粒度(±SD)，并取每个视野的乳胶颗粒平均粒度(±SD)的平均值，从而确定乳胶颗粒的平均粒度(±SD)。由此确定的平均粒度为0.19μm(±0.01μm)。
2-1)0.23μm
用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯乙烯单体、2.4g过硫酸钾、和0.1g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为0.23μm(±0.01μm)。
2-2)0.25μm
用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯乙烯单体、0.9g过硫酸钾、和0.2g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为0.25μm(±0.01μm)。
2-3)0.29μm
用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯乙烯单体、1.3g过硫酸钾、和0.1g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为0.29μm(±0.01μm)。
2-4)0.34μm
用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯乙烯单体、1.3g过硫酸钾、和0.08g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为0.34μm(±0.01μm)。
2-5)0.40μm
用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯乙烯单体、1.3g过硫酸钾、和0.03g苯乙烯磺酸钠。由此获得的 乳胶颗粒的平均粒度为0.40μm(±0.01μm)。
3)大于0.4μm
用与第1)节相同的方式获得乳胶颗粒，不同之处在于使用1200g水、200g苯乙烯单体、1.2g过硫酸钾、和0.01g苯乙烯磺酸钠。由此获得的乳胶颗粒的平均粒度为0.42μm(±0.01μm)。
(抗体固定化乳胶的制备)
将如前所述获得的两种单克隆抗体(#91和#51)，利用下述材料和方法固定化在载体上。
1.材料
(1)抗PSA单克隆抗体
#63291(#91)
#63251(#51)
(将这些单克隆抗体溶解于PBS中。)
(2)乳胶
如前所述获得的聚苯乙烯乳胶(平均粒度：0.19-42μm)
2.抗体固定化乳胶液的制备
(1)含#91抗体-乳胶复合物(#91Lx)液体的制备
1)将乳胶和#91抗体分别用20mM甘氨酸缓冲液(pH：9)稀释，制备1％乳胶液和#91抗体液(0.4mg/ml)。混合乳胶液和#91抗体液(1∶1，v/v)，并将混合物搅拌约1小时。
2)向混合物中加入封闭试剂(10％BSA)(0.1∶2，v/v)，并将混合物搅拌约1小时。
3)离心除去上清液，悬于5mM MOPS缓冲液(pH：7.0)中并稀释，以使600nm波长下的吸光度为3Abs/ml，获得#91抗体固定化的乳胶(#91Lx)液。
(2)含#51抗体-乳胶复合物(#51Lx)液体的制备
1)将乳胶和#51抗体分别用20mM甘氨酸缓冲液(pH：8)稀释，制备1％乳胶液和#51抗体液(0.4mg/ml)。混合乳胶液和#51抗体液(1∶1，v/v)，并将混合物搅拌约1小时。
2)向混合物中加入封闭试剂(10％BSA)(0.1∶2，v/v)，并将混合物搅拌约1小时。
3)离心除去上清液，悬于5mM MOPS缓冲液(pH：7.0)中并稀释，以使600nm波长下的吸光度为3Abs/ml，获得#51抗体固定化的乳胶(#51Lx)液。
[测试例1]
(由于乳胶平均粒度改变导致的c/f比值改变的测定)
使用fPSA和PSA-ACT(浓度：5ng/ml)作为测量样品，使用下述PSA测定试剂和测量条件确定与fPSA和PSA-ACT的反应性。确定与PSA-ACT的反应性和与fPSA的反应性的比值“PSA-ACT/fPSA”(c/f比值)。结果显示于表1中。
(1)PSA测定试剂
第一试剂(缓冲液)
包括0.5M KCl、0.1％BSA(Proliant)、和0.3％PVP K-90的30mM HEPES缓冲液(pH：7.0)
第二试剂(抗体固定化乳胶液)
包括小鼠抗PSA单克隆抗体固定化(两种抗体固定化颗粒的混合比，含#91Lx液体∶含#51Lx液体＝1∶1)的乳胶颗粒的5mM MOPS缓冲液(pH：7.0)。
本实施例中使用的含抗体液体的每种组合分别用具有相同平均粒度(0.19-0.42μm)并且其上固定化了#91抗体或#51抗体的乳胶颗粒制备。
(2)测量条件
测量系统：Hitachi 7170自动分析仪(H-7170)
测量参数：
分析方法：2-终点法(测量点：19至34)
液量(μl)：14.4/90/90
测量波长(nm)：570(主)/800(副)
校准：样条
用Nanopia(注册商标)PSA校准器(PSA浓度：0、4.2，10、和29ng/ml， SekisuiMedical Co.，Ltd.)进行校准。
(3)测量样品
将fPSA和PSA-ACT(Fitzgerald)溶解于包括1％BSA和0.1％NaN3的PBS(pH：7.4)中来制备测量样品。
[表1]
根据表1显示的结果，证明当平均粒度大于0.20μm并等于或小于0.40μm时c/f比值为85％或更高(接近于100％)且获得了等摩尔反应。
当平均粒度为0.20μm或更小，或超过0.40μm时，c/f比值小于80％且没有获得等摩尔反应。
[测试例2]
(通过加入凝集促进剂调节c/f比值)
使用fPSA和PSA-ACT(浓度：35ng/ml)作为测量样品。在与测试例1中所使用的相同的测量条件下，使用下述PSA测量试剂测定与fPSA和PSA-ACT的反应性，并测定与PSA-ACT的反应性和与fPSA的反应性的比值“PSA-ACT/fPSA”(c/f比值)。结果显示于表2至4。
(1)PSA测定试剂
第一试剂(缓冲液)
包括0.5M KCl、0.1％BSA(Proliant)、和0-0.8％凝集促进剂(PEG(聚乙二醇)(数值为数均分子量)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)(PVP K-30的分子量：40,000，PVP K-90的分子量：360,000，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)、MPC聚合物(分子量：1,000,000)、普鲁兰PI-20(分子量：大约200,000，Hayashibara Co.，Ltd.)、或PGA-Na(聚-γ-谷氨酸钠)(数值为数均分子量)(参 见表2至4))的30mM HEPES缓冲液(pH：7.0)。
(比较例中不加入凝集促进剂。)
第二试剂(抗体固定化乳胶液)
包括小鼠抗PSA单克隆抗体固定化的乳胶颗粒(两种抗体固定化颗粒的混合比，含#91Lx液体∶含#51Lx液体＝1∶1)的5mM MOPS缓冲液(pH：7.0)。
本实施例中含抗体的液体是使用具有相同平均粒度(0.29μm)并且其上固定化了#91抗体或#51抗体的乳胶来制备。
[表2]
[表3]
[表4]
根据表2至4显示的结果，证明由于加入凝集促进剂以及凝集促进剂的量的增加，使得c/f比值从大约82％接近100％，通过适当调节凝集促进剂的量通过一步反应获得了等摩尔反应(c/f比值：85％或更高)(表现出c/f比值增加至大约100％的效果)。应注意，术语“一步反应”指同时加入两种类型的抗PSA单克隆抗体并使其反应。
[测试例3]
(使用不同抗体组合的反应性的测定)
使用单克隆抗体#79和#91、#14和#51、#91和#17、或#14和#17的组合代替单克隆抗体#51和#91的组合，并且使用下述包括0.6％MPC聚合物作为凝集促进剂的测量试剂来测定c/f比值。其它条件与测试例1中使用的那些相同。使用fPSA和PSA-ACT(浓度：35ng/ml)作为样品。
(1)PSA测定试剂
第一试剂(缓冲液)
包括0.5M KCl、0.1％BSA(Proliant)、和0.6％MPC聚合物的30mM HEPES缓冲液(pH：7.0)
结果显示在表5中。
[表5]
根据表5显示的结果，证明通过使用上述组合的任何一种，获得了等摩尔反应(c/f比值：89.0-101.9％)。
(测试例中使用的单克隆抗体的Kd值)
表6显示了测试例中使用的单克隆抗体对fPSA和PSA-ACT的Kd值。如表6所示，证明抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)和对游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的比值(fKd/cKd)优选为大于0.1和等于或小于2.0，对游离PSA的解离常数(fKd)为10nM或更小。
[表6]
当使用#16抗体(fKd＝1.33nM，cKd＝23.18nM，fKd/cKd＝0.057)代替测试例3-3中的#91抗体时，c/f比值为52.4％，没有获得等摩尔反应。
表6中的Kd值在下述实验条件下测定。
1.Biacore(注册商标)系统和专用试剂(GE Healthcare(前身为Biacore)，
(i)-(viii)表示Biacore的产品名和目录编号(现在可从GE Healthcare获得))
(i)Biacore(注册商标)T100：JJ-1037-02(Biacore)
(ii)S系列传感器芯片CM5：BR-1005-30(Biacore)
(iii)胺偶联试剂盒：BR-1000-50(Biacore)
(iv)乙酸盐5.0：BR-1003-51(Biacore)
(v)α-小鼠免疫球蛋白：BR-1005-14(Biacore)
(vi)甘氨酸1.5：BR-1003-54(Biacore)
(vii)甘氨酸2.0：BR-1003-55(Biacore)
(viii)HBS-EP+10×(电泳缓冲液)：BR-1006-69(Biacore)(用NaOH调节至pH 8.5，使用前用纯水稀释10倍)
2.测定方法
(i)将其上固定有α-小鼠免疫球蛋白的传感器芯片CM5放置于Biacore系统中。
(ii)将抗PSA抗体分别用电泳缓冲液(HBS-EP)稀释至1.0μg/ml，以30μl/min的流速加入达60秒。
(iii)将PSA抗原(fPSA或PSA-ACT)用电泳缓冲液(HBS-EP)稀释至5.0μg/ml，以30μl/min的流速加入达120秒。
(iv)使用电泳缓冲液(HBS-EP)进行自由电泳操作以进行解离达120秒(流速：30μl/min)。
(v)使用再生剂(将甘氨酸1.5和甘氨酸2.0以1∶1的比例混合制备的甘氨酸1.75)再生传感器芯片。
工业实用性
根据本发明实施方案的测定方法和试剂可以使用通用的自动分析仪容易并准确地测定PSA，且对于前列腺疾病(特别是前列腺癌)的早期检测是有用的。
[关于保藏的微生物]
(1)FERM BP-11453(产生#51-抗体的杂交瘤#63251)
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPOD)
(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)
Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本
ii)在i)的保藏机构保藏生物材料的日期。
2010年2月19日
iii)由i)的保藏机构指定的保藏号。
FERM BP-11453
(2)FERM BP-11454(产生#79-抗体的杂交瘤#63279)
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPOD)
(International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)
Tsukuba Central 6，1-1-1Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本
ii)在i)的保藏机构保藏生物材料的日期。
2010年2月19日
iii)由i)的保藏机构指定的保藏号。
FERM BP-11454
(3)FERM BP-11455(产生#91-抗体的杂交瘤#63291)
i)保藏生物材料的保藏机构的名称和地址
独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPOD)
( International Patent Organism Depositary，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology)
Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566，日本
ii)在i)的保藏机构保藏生物材料的日期。
2010年2月19日
iii)由i)的保藏机构指定的保藏号。
FERM BP-11455

Claims (10)

1.其上固定化了两种类型的抗PSA单克隆抗体的不溶载体在制备用于PSA测定的试剂中的应用，其中所述不溶载体用于在存在凝集促进剂的条件下与样品接触，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体能够在一步反应中与游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)二者反应且识别不同的表位，而且所述不溶载体具有大于0.20μm且等于或小于0.40μm的相同的平均粒度，所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的解离常数(cKd)的比值(fKd/cKd)为大于0.1且等于或小于2.0，其中所述凝集促进剂是选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸和聚(2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱)的一种或多种凝集促进剂。
2.根据权利要求1的应用，其中所述不溶载体是选自以下的一种或多种类型的不溶载体：合成聚合物的乳胶颗粒、二氧化硅颗粒、炭黑颗粒、金属化合物颗粒、金属颗粒、陶瓷颗粒、和磁性体颗粒。
3.根据权利要求2的应用，其中所述金属化合物颗粒是氧化铝颗粒。
4.根据权利要求1的应用，其中调节所述凝集促进剂的浓度以获得对于游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的等摩尔反应。
5.根据权利要求1的应用，其中所述多糖是选自右旋糖酐、普鲁兰、和烷基化多糖的一种或多种多糖。
6.根据权利要求5的应用，其中所述烷基化多糖包括甲基纤维素和乙基纤维素。
7.根据权利要求2的应用，其中所述合成聚合物是选自聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、和乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物的一种或多种合成聚合物。
8.根据权利要求1-7任一项的应用，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)为10nM或更小。
9.包含至少1)和2)的PSA测定试剂：
1)第二试剂，其包含通过使用两种类型的抗PSA单克隆抗体固定化不溶载体制备的抗体固定化载体，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体能够与游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)二者反应且识别不同的表位，而且所述不溶载体具有大于0.20μm且等于或小于0.40μm的相同的平均粒度；
2)第一试剂，其包含选自聚乙二醇、多糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚氯乙烯、聚-γ-谷氨酸、和聚(2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酸胆碱)的一种或多种凝集促进剂，
和其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)与对游离PSA和α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的解离常数(cKd)的比值(fKd/cKd)为大于0.1且等于或小于2.0。
10.根据权利要求1的应用，其中所述两种类型的抗PSA单克隆抗体对游离PSA的解离常数(fKd)为10nM或更小，并且调节所述凝集促进剂的量以获得对游离PSA和游离PSA与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)的等摩尔反应。
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