JP3422846B2 - 消化管疾患のスクリーニング方法及びそのキット - Google Patents
消化管疾患のスクリーニング方法及びそのキットInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、消化管疾患を高精度
に検出する方法及びその為の抗体などに関し、特に、モ
ノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体を用いた消化管疾
患の検出方法などに関する。
に検出する方法及びその為の抗体などに関し、特に、モ
ノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体を用いた消化管疾
患の検出方法などに関する。
【０００２】
【従来の技術】出願人は、既に、大腸癌のスクリーニン
グ方法及びそのキットに関して出願しており（特願平５
−１９４０８９号）、糞便中のラクトフェリンやミエロ
ペルオキシダーゼを測定対象として大腸癌や大腸ポリー
プを確実に検出する方法を提案している。そして、この
発明では、ポリクローン抗ヒトラクトフェリン抗体を用
いて、ＥＬＩＳＡ法によって糞便中のラクトフェリン濃
度を測定している。
グ方法及びそのキットに関して出願しており（特願平５
−１９４０８９号）、糞便中のラクトフェリンやミエロ
ペルオキシダーゼを測定対象として大腸癌や大腸ポリー
プを確実に検出する方法を提案している。そして、この
発明では、ポリクローン抗ヒトラクトフェリン抗体を用
いて、ＥＬＩＳＡ法によって糞便中のラクトフェリン濃
度を測定している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題及び検討事項】しかしな
がら、ゲル濾過法によって分子量ごとに区分された糞便
試料について、それぞれのラクトフェリン濃度を計測す
ると、図１のような結果が得られ、この結果をどう評価
するかが問題となる。すなわち、図１によれば、各種消
化管疾患の患者の糞便試料には、分子量８０，０００弱
のラクトフェリンとは別に、その半分程度の分子量のラ
クトフェリンの存在が顕著に認められる。そこで、本発
明者は、分子量が半分程度のラクトフェリンの存在が一
体何を意味するのかを、以下の通りに鋭意検討した。
がら、ゲル濾過法によって分子量ごとに区分された糞便
試料について、それぞれのラクトフェリン濃度を計測す
ると、図１のような結果が得られ、この結果をどう評価
するかが問題となる。すなわち、図１によれば、各種消
化管疾患の患者の糞便試料には、分子量８０，０００弱
のラクトフェリンとは別に、その半分程度の分子量のラ
クトフェリンの存在が顕著に認められる。そこで、本発
明者は、分子量が半分程度のラクトフェリンの存在が一
体何を意味するのかを、以下の通りに鋭意検討した。
【０００４】先ず、白血球から抽出されたラクトフェリ
ンについて、上記と同じゲル濾過法を用いて濾過パター
ンを調べてみた。その結果は、図２に示す通りであり、
好中球由来ラクトフェリンには、分子量が半分程度のラ
クトフェリンの存在が、図１ほどは認められないことが
確認される。従って、図２と図１のゲル濾過パターンの
関係を検討する必要がある。そこで次に、糞便中ラクト
フェリンについて、そのｐＨを変えた場合にどのような
変化が認められるかを検討した。すなわち、ラクトフェ
リンの含まれていない健常人の糞便の液を作り、そこに
精製したラクトフェリンを加えてｐＨを６，４，２に変
え、それぞれをゲル濾過法によって調べてみた。その結
果は図３の通りであり、酸性度が強まるに従って、分子
量が半分程度のラクトフェリンの存在が顕著となること
が明らかとなった。
ンについて、上記と同じゲル濾過法を用いて濾過パター
ンを調べてみた。その結果は、図２に示す通りであり、
好中球由来ラクトフェリンには、分子量が半分程度のラ
クトフェリンの存在が、図１ほどは認められないことが
確認される。従って、図２と図１のゲル濾過パターンの
関係を検討する必要がある。そこで次に、糞便中ラクト
フェリンについて、そのｐＨを変えた場合にどのような
変化が認められるかを検討した。すなわち、ラクトフェ
リンの含まれていない健常人の糞便の液を作り、そこに
精製したラクトフェリンを加えてｐＨを６，４，２に変
え、それぞれをゲル濾過法によって調べてみた。その結
果は図３の通りであり、酸性度が強まるに従って、分子
量が半分程度のラクトフェリンの存在が顕著となること
が明らかとなった。
【０００５】また、胃の消化酵素であるペプシンによっ
てラクトフェリンがどの様に消化されるのかを検討する
ために、健常人の糞便の液を作り、そこに精製したラク
トフェリンを加えてペプシンを作用されたものについ
て、ゲル濾過法によって調べてみた。その結果は、図４
の通りであり、分子量が半分のもののみが顕著に認めら
れることが確認された。以上説明した図３、図４の結果
によれば、酸性度がｐＨ２程度であってペプシンを作用
させたものは、分子量が半分のラクトフェリンの存在が
顕著に認められることが明らかとなった。小腸以降にお
いては、ペプシンが作用したり、酸性度が上がる場所は
存在しないのであるから、図３、図４の結果から、唾液
中のラクトフェリンが胃の中で中途半端に消化されて糞
便中に表れたのではないかとの推測が成り立つ。
てラクトフェリンがどの様に消化されるのかを検討する
ために、健常人の糞便の液を作り、そこに精製したラク
トフェリンを加えてペプシンを作用されたものについ
て、ゲル濾過法によって調べてみた。その結果は、図４
の通りであり、分子量が半分のもののみが顕著に認めら
れることが確認された。以上説明した図３、図４の結果
によれば、酸性度がｐＨ２程度であってペプシンを作用
させたものは、分子量が半分のラクトフェリンの存在が
顕著に認められることが明らかとなった。小腸以降にお
いては、ペプシンが作用したり、酸性度が上がる場所は
存在しないのであるから、図３、図４の結果から、唾液
中のラクトフェリンが胃の中で中途半端に消化されて糞
便中に表れたのではないかとの推測が成り立つ。
【０００６】そこで、唾液中ラクトフェリンの濃度を測
定した。唾液採取にはOraSure(Epitope,Inc.Beaverton,
Oregon) を用い、１．７５倍に希釈された唾液をＴＢＳ
(0.1mol,pH8.0)で１０倍に希釈して、最終的に１７．５
倍希釈の唾液を試料として、ＥＬＩＳＡ法よってラクト
フェリンの測定を行った。その結果によると、健常者２
０名（男性７名、女性１３名）の唾液中ラクトフェリン
濃度は６．５±３．３μｇ／ｍｌ(mean ±SD) 、最大１
０．８、最小２．４μｇ／ｍｌであった。唾液の分泌量
は一日当たり１０００〜１５００ｍｌであるから、上記
唾液中ラクトフェリン濃度から、一日に約１０ｍｇのラ
クトフェリンが消化管に供給されることになる。一方、
特願平５−１９４０８９号において示した通り、健常者
糞便中のラクトフェリン濃度の正常上限は、２．４μｇ
／ｇ便（＝０．５ｍｇ／２００ｇ便）程度であるから、
この値を踏まえて図１の結果を検討すれば、分子量の小
さいラクトフェリンは、唾液中のラクトフェリンが胃で
消化しきれなかったものではないかと更に強く推測され
る。
定した。唾液採取にはOraSure(Epitope,Inc.Beaverton,
Oregon) を用い、１．７５倍に希釈された唾液をＴＢＳ
(0.1mol,pH8.0)で１０倍に希釈して、最終的に１７．５
倍希釈の唾液を試料として、ＥＬＩＳＡ法よってラクト
フェリンの測定を行った。その結果によると、健常者２
０名（男性７名、女性１３名）の唾液中ラクトフェリン
濃度は６．５±３．３μｇ／ｍｌ(mean ±SD) 、最大１
０．８、最小２．４μｇ／ｍｌであった。唾液の分泌量
は一日当たり１０００〜１５００ｍｌであるから、上記
唾液中ラクトフェリン濃度から、一日に約１０ｍｇのラ
クトフェリンが消化管に供給されることになる。一方、
特願平５−１９４０８９号において示した通り、健常者
糞便中のラクトフェリン濃度の正常上限は、２．４μｇ
／ｇ便（＝０．５ｍｇ／２００ｇ便）程度であるから、
この値を踏まえて図１の結果を検討すれば、分子量の小
さいラクトフェリンは、唾液中のラクトフェリンが胃で
消化しきれなかったものではないかと更に強く推測され
る。
【０００７】図５は、胃の消化酵素であるペプシンによ
って各種蛋白がどの程度消化されるかを調べた結果を図
示したものである。つまり、０．０１Ｎ−ＨＣｌに各蛋
白を２５００ｎｇ／ｍｌの割合で溶解させ、ペプシン(S
igma) を終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ添加して２５℃で作
用させた結果を示している。図５より明らかなように、
トランスフェリン、アルブミン、及びヘモグロビンは、
ペプシンによって１０数分で消化されるが、ラクトフェ
リンは、消化されにくいことが確認される。図６は、小
腸の消化酵素であるトリプシンによって各種蛋白がどの
程度消化されるかを調べた結果を図示したものである。
つまり、０．１Ｍ−ＴＢＳに各蛋白を２５００ｎｇ／ｍ
ｌの割合で溶解させ、トリプシン(Sigma) を終濃度１ｍ
ｇ／ｍｌ添加し３７℃で作用させた結果を示している。
図６の通り、ヘモグロビンとアルブミンは消化される
が、ラクトフェリンとトランスフェリンは、殆ど消化さ
れないことが確認される。
って各種蛋白がどの程度消化されるかを調べた結果を図
示したものである。つまり、０．０１Ｎ−ＨＣｌに各蛋
白を２５００ｎｇ／ｍｌの割合で溶解させ、ペプシン(S
igma) を終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌ添加して２５℃で作
用させた結果を示している。図５より明らかなように、
トランスフェリン、アルブミン、及びヘモグロビンは、
ペプシンによって１０数分で消化されるが、ラクトフェ
リンは、消化されにくいことが確認される。図６は、小
腸の消化酵素であるトリプシンによって各種蛋白がどの
程度消化されるかを調べた結果を図示したものである。
つまり、０．１Ｍ−ＴＢＳに各蛋白を２５００ｎｇ／ｍ
ｌの割合で溶解させ、トリプシン(Sigma) を終濃度１ｍ
ｇ／ｍｌ添加し３７℃で作用させた結果を示している。
図６の通り、ヘモグロビンとアルブミンは消化される
が、ラクトフェリンとトランスフェリンは、殆ど消化さ
れないことが確認される。
【０００８】図７は、ｐＨ２にしたラクトフェリンや、
ペプシンに反応させた後のラクトフェリンや、普通サイ
ズのラクトフェリンそれぞれについて、トリプシンを反
応させた場合の消化状態を調べた結果である。いずれの
場合もあまり消化されないことが確認され、この傾向
は、特に、ペプシンに反応させた後のラクトフェリンに
ついて顕著であることが確認される。以上説明した図５
〜図７の結果によれば、胃で中途半端に消化されたラク
トフェリンが糞便中に表れることは十分にあり得ると考
えられる。従って、小腸や大腸の疾患を検出するには、
糞便中のラクトフェリンのうち分子量８０，０００程度
のもののみを測定した方が精度が上がるものと考えられ
る。この発明は、以上の考察に基づいてなされたもので
あって、通常サイズの分子量のラクトフェリンのみを測
定対象にして消化管疾患を確実に検出すること、及び、
酵素免疫法などの免疫学的測定法において有効に機能す
る抗ヒトラクトフェリン抗体を提供することなどを目的
とする。
ペプシンに反応させた後のラクトフェリンや、普通サイ
ズのラクトフェリンそれぞれについて、トリプシンを反
応させた場合の消化状態を調べた結果である。いずれの
場合もあまり消化されないことが確認され、この傾向
は、特に、ペプシンに反応させた後のラクトフェリンに
ついて顕著であることが確認される。以上説明した図５
〜図７の結果によれば、胃で中途半端に消化されたラク
トフェリンが糞便中に表れることは十分にあり得ると考
えられる。従って、小腸や大腸の疾患を検出するには、
糞便中のラクトフェリンのうち分子量８０，０００程度
のもののみを測定した方が精度が上がるものと考えられ
る。この発明は、以上の考察に基づいてなされたもので
あって、通常サイズの分子量のラクトフェリンのみを測
定対象にして消化管疾患を確実に検出すること、及び、
酵素免疫法などの免疫学的測定法において有効に機能す
る抗ヒトラクトフェリン抗体を提供することなどを目的
とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
め、本発明では、糞便中の分子量８０，０００程度のラ
クトフェリンのみを測定対象にして消化管疾患をスクリ
ーニングすることにした。具体的な測定方法は特に限定
されないが、例えば、酵素免疫法やラテックス凝集反応
法などの免疫学的測定法を用いるのが好ましい。この場
合、モノクローン抗体の中で、ｐＨ２程度にさらされた
糞便中のラクトフェリンや、ペプシンを反応させた後の
ラクトフェリンには反応しないが、分子量８０，０００
程度のラクトフェリンには反応するものを選別して用い
れば消化管疾患をより確実に検出することができる。ま
た、ｐＨ２程度にさらされた糞便中のラクトフェリン
や、ペプシンを反応させた後のラクトフェリンには反応
しないが、分子量８０，０００程度のラクトフェリンに
は反応するモノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体と、
酵素標識された抗ヒトラクトフェリン抗体と、前記酵素
測定用の試薬などによってスクリーニング用キットが構
成される。なお、酵素標識される抗ヒトラクトフェリン
抗体には、モノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体やポ
リクローン抗ヒトラクトフェリン抗体が該当する。
め、本発明では、糞便中の分子量８０，０００程度のラ
クトフェリンのみを測定対象にして消化管疾患をスクリ
ーニングすることにした。具体的な測定方法は特に限定
されないが、例えば、酵素免疫法やラテックス凝集反応
法などの免疫学的測定法を用いるのが好ましい。この場
合、モノクローン抗体の中で、ｐＨ２程度にさらされた
糞便中のラクトフェリンや、ペプシンを反応させた後の
ラクトフェリンには反応しないが、分子量８０，０００
程度のラクトフェリンには反応するものを選別して用い
れば消化管疾患をより確実に検出することができる。ま
た、ｐＨ２程度にさらされた糞便中のラクトフェリン
や、ペプシンを反応させた後のラクトフェリンには反応
しないが、分子量８０，０００程度のラクトフェリンに
は反応するモノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体と、
酵素標識された抗ヒトラクトフェリン抗体と、前記酵素
測定用の試薬などによってスクリーニング用キットが構
成される。なお、酵素標識される抗ヒトラクトフェリン
抗体には、モノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体やポ
リクローン抗ヒトラクトフェリン抗体が該当する。
【００１０】以上の構成からなる本発明について、以
下、更に詳細に説明する。ヒトラクトフェリンで免疫し
たマウスの脾臓リンパ球と、マウスの骨髄種細胞とを融
合させてモノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハ
イブリドーマを作ると、このハイブリドーマは、図８に
示す通り、各種の特性を示すモノクローン抗ヒトラクト
フェリン抗体を産生する。そこで、産生されたモノクロ
ーン抗ヒトラクトフェリン抗体のうち、ｐＨ２程度にさ
らされた糞便中のラクトフェリンや、ペプシンに反応さ
せた後のラクトフェリンには反応しないが、通常サイズ
のラクトフェリンには反応するもの選択して、これを本
発明に係るモノクローン抗体（以下、モノクローン抗体
Ｍ２８と称す）とした。なお、図９は、ポリクローン抗
体（ＤＡＫＯ）と、本発明に係るモノクローン抗体Ｍ２
８と、自家製の別のモノクローン抗体（Ｍ２６７）と
が、同一の試料（消化管疾患に係る糞便）に対して、ど
のような特性の差異を示すかを図示したものである。
下、更に詳細に説明する。ヒトラクトフェリンで免疫し
たマウスの脾臓リンパ球と、マウスの骨髄種細胞とを融
合させてモノクローン抗ヒトラクトフェリン抗体産生ハ
イブリドーマを作ると、このハイブリドーマは、図８に
示す通り、各種の特性を示すモノクローン抗ヒトラクト
フェリン抗体を産生する。そこで、産生されたモノクロ
ーン抗ヒトラクトフェリン抗体のうち、ｐＨ２程度にさ
らされた糞便中のラクトフェリンや、ペプシンに反応さ
せた後のラクトフェリンには反応しないが、通常サイズ
のラクトフェリンには反応するもの選択して、これを本
発明に係るモノクローン抗体（以下、モノクローン抗体
Ｍ２８と称す）とした。なお、図９は、ポリクローン抗
体（ＤＡＫＯ）と、本発明に係るモノクローン抗体Ｍ２
８と、自家製の別のモノクローン抗体（Ｍ２６７）と
が、同一の試料（消化管疾患に係る糞便）に対して、ど
のような特性の差異を示すかを図示したものである。
【００１１】図１０は、白血球から抽出されたラクトフ
ェリンに対して、ポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）と、モ
ノクローン抗体Ｍ２８とが、どのような反応特性を示す
かを図示したものであって、両者は、好中球由来ラクト
フェリンに対しては同様に反応することが確認される。
図１１は、健常人の糞便の液を作り、そこに精製したラ
クトフェリンを加えてｐＨを８，６，４，２に変えて、
それぞれに対するモノクローン抗体Ｍ２８の反応性をゲ
ル濾過法で調べた結果を図示したものである。ポリクロ
ーン抗体（ＤＡＫＯ）については、ｐＨ２のラクトフェ
リンにも反応するが、モノクローン抗体Ｍ２８は、酸性
度が強まるにしたがって、ポリクローン抗体とは異なる
反応を示すことが確認される。
ェリンに対して、ポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）と、モ
ノクローン抗体Ｍ２８とが、どのような反応特性を示す
かを図示したものであって、両者は、好中球由来ラクト
フェリンに対しては同様に反応することが確認される。
図１１は、健常人の糞便の液を作り、そこに精製したラ
クトフェリンを加えてｐＨを８，６，４，２に変えて、
それぞれに対するモノクローン抗体Ｍ２８の反応性をゲ
ル濾過法で調べた結果を図示したものである。ポリクロ
ーン抗体（ＤＡＫＯ）については、ｐＨ２のラクトフェ
リンにも反応するが、モノクローン抗体Ｍ２８は、酸性
度が強まるにしたがって、ポリクローン抗体とは異なる
反応を示すことが確認される。
【００１２】図１２は、ペプシンを反応された後の半サ
イズのラクトフェリンに対するモノクローン抗体Ｍ２８
とポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）の反応性の差異を図示
したものである。図１３は、大腸癌（ａ）、腫瘍性大腸
炎（ｂ）、胃潰瘍（ｃ）患者の糞便試料に対するモノク
ローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）の反
応性の差異を図示したものである。モノクローン抗体Ｍ
２８を用いた場合には、普通サイズのラクトフェリンの
存在のみが検出されることが確認される。図１４は、健
常者２３１名についてのラクトフェリン濃度を、ポリク
ローン抗体（ＤＡＫＯ）とモノクローン抗体Ｍ２８とを
用いて測定した結果を図示したものである。ポリクロー
ン抗体（ＤＡＫＯ）を用いた場合にはカットオフ値が１
１４ｎｇ／ｍｌになるのに対して、モノクローン抗体Ｍ
２８を用いた場合にはカットオフ値が半分以下の４５ｎ
ｇ／ｍｌとなっており、モノクローン抗体Ｍ２８を用い
た方が検出精度が高まると考えられる。
イズのラクトフェリンに対するモノクローン抗体Ｍ２８
とポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）の反応性の差異を図示
したものである。図１３は、大腸癌（ａ）、腫瘍性大腸
炎（ｂ）、胃潰瘍（ｃ）患者の糞便試料に対するモノク
ローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）の反
応性の差異を図示したものである。モノクローン抗体Ｍ
２８を用いた場合には、普通サイズのラクトフェリンの
存在のみが検出されることが確認される。図１４は、健
常者２３１名についてのラクトフェリン濃度を、ポリク
ローン抗体（ＤＡＫＯ）とモノクローン抗体Ｍ２８とを
用いて測定した結果を図示したものである。ポリクロー
ン抗体（ＤＡＫＯ）を用いた場合にはカットオフ値が１
１４ｎｇ／ｍｌになるのに対して、モノクローン抗体Ｍ
２８を用いた場合にはカットオフ値が半分以下の４５ｎ
ｇ／ｍｌとなっており、モノクローン抗体Ｍ２８を用い
た方が検出精度が高まると考えられる。
【００１３】
【実施例】図１５〜図１８は、各種消化管疾患に対し
て、それぞれポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）とモノクロ
ーン抗体Ｍ２８とを用いた場合のラクトフェリン濃度の
測定結果（μｇ／ｇ便）を図示したものである。図示の
ごとく、測定結果には明らかな相関関係が認められ、し
かも、モノクローン抗体Ｍ２８を用いた方が、検出精度
が上がることが確認される。なお、モノクローン抗体Ｍ
２８を用いた場合のカットオフ値は約１μｇ／ｇ便であ
り、ポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）を用いた場合のカッ
トオフ値は約２．４μｇ／ｇ便である。図１５〜図１８
におけるラクトフェリン濃度の測定は、特願平５−１９
４０８９号の場合と同様のＥＬＩＳＡ法によっている。
以下、モノクローン抗体Ｍ２８を用いたラクトフェリン
の測定について説明しておく。
て、それぞれポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）とモノクロ
ーン抗体Ｍ２８とを用いた場合のラクトフェリン濃度の
測定結果（μｇ／ｇ便）を図示したものである。図示の
ごとく、測定結果には明らかな相関関係が認められ、し
かも、モノクローン抗体Ｍ２８を用いた方が、検出精度
が上がることが確認される。なお、モノクローン抗体Ｍ
２８を用いた場合のカットオフ値は約１μｇ／ｇ便であ
り、ポリクローン抗体（ＤＡＫＯ）を用いた場合のカッ
トオフ値は約２．４μｇ／ｇ便である。図１５〜図１８
におけるラクトフェリン濃度の測定は、特願平５−１９
４０８９号の場合と同様のＥＬＩＳＡ法によっている。
以下、モノクローン抗体Ｍ２８を用いたラクトフェリン
の測定について説明しておく。
【００１４】マイクロプレート（SUMILON, Japan）の各
wellに、抗ヒトラクトフェリン抗体（モノクローン抗体
Ｍ２８）５μg/mlを含む0.1 Ｍ Tris 緩衝液を100 μl
づつ分注し、一夜４℃で放置して物理吸着させて表面に
固相化する。別途、過ヨウ素酸法により、アルカリホス
ファターゼ（Beehringer-Mannheim,FRG ）を抗ヒトラク
トフェリン抗体に酵素標識して調製する。各wellに100
μl の１％ＢＳＡ（Beehringer-Mannheim,FRG ）を含む
Tris緩衝液（0.1mol/l ｐＨ8.0 ）を分注し、次いで、
５０μl の糞便試料を加え、混和した後、３７℃で１時
間反応させる。次にTween20 を０．０５％含む脱イオン
水で３回洗浄する。その後、アルカリホスファターゼ標
識抗ヒトラクトフェリン抗体溶液（１％ＢＳＡを含むト
リス緩衝液）を各wellに100 μl づつ加え混和した後、
３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。
wellに、抗ヒトラクトフェリン抗体（モノクローン抗体
Ｍ２８）５μg/mlを含む0.1 Ｍ Tris 緩衝液を100 μl
づつ分注し、一夜４℃で放置して物理吸着させて表面に
固相化する。別途、過ヨウ素酸法により、アルカリホス
ファターゼ（Beehringer-Mannheim,FRG ）を抗ヒトラク
トフェリン抗体に酵素標識して調製する。各wellに100
μl の１％ＢＳＡ（Beehringer-Mannheim,FRG ）を含む
Tris緩衝液（0.1mol/l ｐＨ8.0 ）を分注し、次いで、
５０μl の糞便試料を加え、混和した後、３７℃で１時
間反応させる。次にTween20 を０．０５％含む脱イオン
水で３回洗浄する。その後、アルカリホスファターゼ標
識抗ヒトラクトフェリン抗体溶液（１％ＢＳＡを含むト
リス緩衝液）を各wellに100 μl づつ加え混和した後、
３７℃で１時間反応させ、先と同様に３回洗浄する。
【００１５】さらにKind-King 法の基質緩衝液100 μl
を各wellに加え、３７℃で３０分間反応させる。ここで
基質緩衝液は、Disodium Phenyl-phosphate(WAKO Junya
ku Japan製)0.215ｇと4-aminoantipyrine(WAKO Junyaku
Japan製）0.09ｇを、炭酸緩衝液（0.05mol/l ｐＨ10.1
5)100 mlに溶解したものである。次いで、100 μl の呈
色液を各wellに加えて呈色させる。ここで呈色液は、20
0ml の脱イオン水に2.6 ｇのホウ酸（WAKO Junyaku Jap
an製）を溶解させた後、0.38 gのPotassium ferricyani
de（WAKO Junyaku Japan製）を溶解したものである。最
後に、各wellの呈色をマイクロプレート用比色計（Sank
o Junyaku Japan 製）を用いて510 ／680nm の波長光で
比色し、検量線から糞便中のラクトフェリン濃度を算出
する。マウスにヒトのラクトフェリンを注射するとマウ
スが抗体を作る。そこで、マウスの脾臓からとったリン
パ球と、マウスの骨髄種とを細胞融合して、ハイブリド
ーマを作る。そして、このハイブリドーマによって目的
とするモノクローン抗体を大量に作るのである。一方、
ポリクローン抗体は、ウサギにヒトのラクトフェリンを
注射して作られる抗体を精製したものである。
を各wellに加え、３７℃で３０分間反応させる。ここで
基質緩衝液は、Disodium Phenyl-phosphate(WAKO Junya
ku Japan製)0.215ｇと4-aminoantipyrine(WAKO Junyaku
Japan製）0.09ｇを、炭酸緩衝液（0.05mol/l ｐＨ10.1
5)100 mlに溶解したものである。次いで、100 μl の呈
色液を各wellに加えて呈色させる。ここで呈色液は、20
0ml の脱イオン水に2.6 ｇのホウ酸（WAKO Junyaku Jap
an製）を溶解させた後、0.38 gのPotassium ferricyani
de（WAKO Junyaku Japan製）を溶解したものである。最
後に、各wellの呈色をマイクロプレート用比色計（Sank
o Junyaku Japan 製）を用いて510 ／680nm の波長光で
比色し、検量線から糞便中のラクトフェリン濃度を算出
する。マウスにヒトのラクトフェリンを注射するとマウ
スが抗体を作る。そこで、マウスの脾臓からとったリン
パ球と、マウスの骨髄種とを細胞融合して、ハイブリド
ーマを作る。そして、このハイブリドーマによって目的
とするモノクローン抗体を大量に作るのである。一方、
ポリクローン抗体は、ウサギにヒトのラクトフェリンを
注射して作られる抗体を精製したものである。
【００１６】
【発明の効果】以上説明したように、この発明に係るス
クリーニング方法は、糞便中の通常サイズの分子量のラ
クトフェリンのみを測定対象にして免疫学的測定法を用
いており、図１５〜図１８に示すとおり、大腸癌、大腸
ポリープ、クローン病、腫瘍性大腸炎などをより確実に
検出することができる。
クリーニング方法は、糞便中の通常サイズの分子量のラ
クトフェリンのみを測定対象にして免疫学的測定法を用
いており、図１５〜図１８に示すとおり、大腸癌、大腸
ポリープ、クローン病、腫瘍性大腸炎などをより確実に
検出することができる。
【図１】大腸癌、腫瘍性大腸炎、胃潰瘍症例での糞便中
ラクトフェリンのゲル濾過画分に対するポリクローン抗
ヒトラクトフェリン抗体の反応性を図示したものであ
る。
ラクトフェリンのゲル濾過画分に対するポリクローン抗
ヒトラクトフェリン抗体の反応性を図示したものであ
る。
【図２】好中球由来ラクトフェリンのゲル濾過パターン
を図示したものである。
を図示したものである。
【図３】糞便中ラクトフェリンのｐＨ２〜ｐＨ６での変
化を示したものである。
化を示したものである。
【図４】ラクトフェリンのペプシン消化による変化を示
したものである。
したものである。
【図５】各種蛋白のペプシンによる消化の状態を示した
ものである。
ものである。
【図６】各種蛋白のトリプシンによる消化の状態を示し
たものである。
たものである。
【図７】ラクトフェリンのトリプシンによる消化を示し
たものである。
たものである。
【図８】糞便中ラクトフェリンのゲルフラクションに対
するモノクローン抗体の反応性を示したものである。
するモノクローン抗体の反応性を示したものである。
【図９】糞便中ラクトフェリンに対するポリクローン抗
体とモノクローン抗体の反応性を示したものである。
体とモノクローン抗体の反応性を示したものである。
【図１０】好中球由来ラクトフェリンの抗ヒトラクトフ
ェリン抗体に対する反応性を示したものである。
ェリン抗体に対する反応性を示したものである。
【図１１】ｐＨ調整便汁中でのラクトフェリンの抗ヒト
ラクトフェリン抗体に対する反応性を示したものであ
る。
ラクトフェリン抗体に対する反応性を示したものであ
る。
【図１２】ペプシン消化ラクトフェリンに対する抗ヒト
ラクトフェリン抗体に対する反応性を示したものであ
る。
ラクトフェリン抗体に対する反応性を示したものであ
る。
【図１３】大腸癌、腫瘍性大腸炎、胃潰瘍症例での糞便
中ラクトフェリンゲル濾過画分に対する抗ヒトラクトフ
ェリン抗体に対する反応性を示したものである。
中ラクトフェリンゲル濾過画分に対する抗ヒトラクトフ
ェリン抗体に対する反応性を示したものである。
【図１４】ラクトフェリン濃度のカットオフ値を、モノ
クローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体とを用いて健常
者群から求めた結果である。
クローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体とを用いて健常
者群から求めた結果である。
【図１５】モノクローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体
とを用いて、大腸癌患者についてラクトフェリン濃度を
求めたものである。
とを用いて、大腸癌患者についてラクトフェリン濃度を
求めたものである。
【図１６】モノクローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体
とを用いて、大腸ポリープ患者についてラクトフェリン
濃度を求めたものである。
とを用いて、大腸ポリープ患者についてラクトフェリン
濃度を求めたものである。
【図１７】モノクローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体
とを用いて、クローン病患者についてラクトフェリン濃
度を求めたものである。
とを用いて、クローン病患者についてラクトフェリン濃
度を求めたものである。
【図１８】モノクローン抗体Ｍ２８とポリクローン抗体
とを用いて、腫瘍性大腸炎患者についてラクトフェリン
濃度を求めたものである。
とを用いて、腫瘍性大腸炎患者についてラクトフェリン
濃度を求めたものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 臨床検査，1993年，ＶＯＬ．37 Ｎ
Ｏ．８，923−926
日本消化器病学会雑誌 臨時増刊,
1993年，ＶＯＬ．90，1893
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯ
ＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ，1985
年，ＶＯＬ．84，135−141
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
G01N 33/577
Claims (3)
- 【請求項１】 ｐＨ２程度にさらされた糞便中のラクト
フェリンや、ペプシンを反応させた後のラクトフェリン
には反応しないが、分子量８０，０００程度のラクトフ
ェリンには反応するモノクローン抗ヒトラクトフェリン
抗体を用いて、糞便中の分子量８０，０００程度のラク
トフェリンのみを測定対象にすることを特徴とする消化
管疾患のスクリーニング方法。 - 【請求項２】 ｐＨ２程度にさらされた糞便中のラクト
フェリンや、ペプシンを反応させた後のラクトフェリン
には反応しないが、分子量８０，０００程度のラクトフ
ェリンには反応するモノクローン抗ヒトラクトフェリン
抗体と、酵素標識された抗ヒトラクトフェリン抗体と、
前記酵素測定用の試薬とを少なくとも備えており、免疫
学的測定法によって糞便中の分子量８０，０００程度の
ラクトフェリン濃度を測定して消化管疾患を検出するこ
とを特徴とするスクリーニング用キット。 - 【請求項３】 免疫学的測定法を用いて消化管疾患を検
出する目的で用いるモノクローン抗ヒトラクトフェリン
抗体であって、ｐＨ２程度にさらされた糞便中のラクト
フェリンや、ペプシンを反応させた後のラクトフェリン
には反応しないが、分子量８０，０００程度のラクトフ
ェリンには反応するモノクローン抗ヒトラクトフェリン
抗体。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17764794A JP3422846B2 (ja) | 1994-07-05 | 1994-07-05 | 消化管疾患のスクリーニング方法及びそのキット |
| US08/339,192 US5552292A (en) | 1993-01-18 | 1994-11-10 | Method of screening for colorectal cancer |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17764794A JP3422846B2 (ja) | 1994-07-05 | 1994-07-05 | 消化管疾患のスクリーニング方法及びそのキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0821834A JPH0821834A (ja) | 1996-01-23 |
| JP3422846B2 true JP3422846B2 (ja) | 2003-06-30 |
Family
ID=16034655
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17764794A Expired - Fee Related JP3422846B2 (ja) | 1993-01-18 | 1994-07-05 | 消化管疾患のスクリーニング方法及びそのキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3422846B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020130803A1 (en) * | 2018-12-21 | 2020-06-25 | N.V. Nutricia | Protein compositions with high isoelectric proteins |
-
1994
- 1994-07-05 JP JP17764794A patent/JP3422846B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ，１９８５年，ＶＯＬ．８４，１３５−１４１ |
| 日本消化器病学会雑誌 臨時増刊，１９９３年，ＶＯＬ．９０，１８９３ |
| 臨床検査，１９９３年，ＶＯＬ．３７ ＮＯ．８，９２３−９２６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0821834A (ja) | 1996-01-23 |
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