BR112013024686B1

BR112013024686B1 - ensaio de psa, e, reagente de ensaio de psa

Info

Publication number: BR112013024686B1
Application number: BR112013024686-3A
Authority: BR
Inventors: Yuki Takahashi; Thomo Shimizu; Yashushi Nakamura; Shinya Nakayama; Shinichiro Kitahara
Original assignee: Sekisui Medical Co., Ltd
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2020-12-29
Also published as: WO2012133482A1; CN105424936A; MX347002B; CN103443628A; BR112013024686A2; US10119963B2; US20140080143A1; AU2012233635A1; JPWO2012133482A1; EP2698633A1; BR112013024686B8; CA2831398A1; CA2831398C; CN105424936B; KR20140015488A; MY165647A; EP2698633B1; MX2013011090A; KR101835918B1; AU2012233635B2

Abstract

ENSAIO DE PSA, E, REAGENTE DE ENSAIO DE PSA. Descreve-se um método para o ensaio simples e altamente preciso de PSA por uma reação em uma etapa não usa veículos tendo diferentes tamanhos médios de partícula. Também é descrito um reagente para o mesmo. O método de ensaio de PSA compreende usar veículos insolúveis, com o mesmo tamanho médio de partícula dentro da faixa maior do que 0,20 (Mi)m, mas de 0,40 (Mi)m ou menor, imobilizando sobre os mesmos dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA e reconhecendo diferentes epítopos, que são anticorpos monoclonais anti-PSA que irão reagir tanto com PSA livre como PSA-ACT, que é um complexo de PSA livre de (Alfa)1-antiquimotripsina e levando os veículos ao contato com uma amostra na presença de um acelerador de aglutinação.

Description

CAMPO TÉCNICO

A invenção refere-se a um ensaio de antígeno e um reagente que tomam possível medir um antígeno livre, e um complexo de antígeno livre e uma substância coexistente em uma amostra, por aglutinação imune de modo que é obtida uma resposta equimolar. Em particular, a invenção refere-se a um ensaio de antígeno específico da próstata e um reagente para o mesmo.

ANTECEDENTES

O câncer da próstata é uma doença maligna que é observada nos homens. Um grande número de pacientes sofre de câncer de próstata nos Estados Unidos e na Europa. Nos últimos anos, o número de pacientes que sofrem de câncer da próstata aumentou rapidamente no Japão. Uma vez que o câncer da próstata cresce lentamente, e pode ser eficazmente tratado por radioterapia ou terapia anti-androgênica, é importante detectar o câncer da próstata em um estágio prematuro.

Antígeno específico da próstata (a seguir pode ser referido como "PSA") é uma glicoproteína (serina protease) que é secretada a partir de células epiteliais da próstata, e tem um peso molecular de 33.000 a 34.000 Da. Uma vez que uma pessoa que sofre de uma doença da próstata mostra um aumento no nível de PSA no sangue, em comparação com uma pessoa saudável, PSA é útil para a detecção prematuro de uma doença prostática (particularmente o câncer da próstata). PSA é classificado em PSA de tipo complexo que se liga a um inibidor da protease no sangue, e PSA livre (a seguir pode ser referido como "fPSA"). A maior parte do PSA no sangue é PSA de tipo complexo, e presente como complexo de PSA e al-antiquimotripsina (a seguir pode ser referido como “PSA-ACT”), complexo de PSA e a2-macroglobulina ou análogos. fPSA e PSA-ACT podem ser medidos por um imunoensaio.Um ensaio baseado em aglutinação (teste de imunoaglutinação) que utiliza um látex ou similar é usado como o imunoensaio. No entanto, uma vez que um anticorpo monoclonal anti-PSA tem reatividade diferente com fPSA e PSA-ACT, pode ser difícil medir com precisão o nível de PSA total.

A fim de resolver o problema acima, um PTL 1 propõe um reagente de ensaio de imunoaglutinação e um ensaio que utiliza o mesmo, em que o reagente de ensaio de imunoaglutinação incluindo (1) uma primeira suspensão de partículas que inclui primeiras partículas de veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos um primeiro anticorpo monoclonal que pode ligar-se a uma substância alvo de medição livre e um complexo de substância alvo de medição livre e a molécula de ligação correspondente (2), uma segunda suspensão de partículas que inclui segundas partículas de veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos um segundo anticorpo monoclonal que pode se ligar à substância alvo de medição livre e um complexo da substância alvo de medição livre e a molécula de ligação correspondente, e não compete com o primeiro anticorpo monoclonal, e (3) uma terceira suspensão de partículas que inclui terceiras partículas de veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos um terceiro anticorpo monoclonal que não reconhece a substância alvo de medição livre, mas reconhece um complexo da substância alvo de medição livre e a molécula de ligação correspondente. PTL 2 propõe um reagente de ensaio e um ensaio que utiliza o mesmo, em que o reagente de ensaio ajustando a reatividade com um antígeno livre e um antígeno de tipo complexo usando veículos tendo um tamanho de partícula menor entre os dois ou mais tipos de veículos que diferem no tamanho das partículas e imobilizando sobre os mesmos pelo menos um anticorpo monoclonal entre três anticorpos monoclonais, que tem reatividade com um antígeno livre e um antígeno de tipo complexo e diferem no sítio de reconhecimento, e usando veículos tendo um tamanho de partícula maior entre os dois ou mais tipos de veículos e imobilizando sobre os mesmos os anticorpos monoclonais restantes. PTL 3 propõe um imunoensaio de reação em duas etapas, que inclui (1) a reação de uma amostra que inclui uma substância alvo de medição livre e uma substância alvo de medição de tipo complexo com um látex 1 sobre 5 o qual um anticorpo monoclonal 1 para uma substância alvo de medição é imobilizado de modo a obter um produto de reação 1, e (2) reagir o produto de reação 1 com um látex 2 sobre o qual um anticorpo monoclonal 2, que difere no sítio de reconhecimento do anticorpo monoclonal 1, é imobilizado de modo a obter um produto de reação 2. PTL 4 propõe um reagente de imunoensaio de antígeno específico da próstata e um ensaio que utiliza o mesmo, em que o reagente de imunoensaio incluindo um látex 1 em que um anticorpo monoclonal 1, que tem reatividade com PSA livre e complexo de PSA, é imobilizado, e um látex 2 sobre o qual um anticorpo monoclonal 2 que tem reatividade com PSA livre e 15 complexo de PSA é imobilizado, o anticorpo monoclonal 2 diferindo no sítio de reconhecimento a partir do anticorpo monoclonal 1, e o látex 2 diferindo em tamanho médio de partícula do látex 1.

LISTA DE CITAÇÀQ

Literatura de patentes PTL 1: JP-A-2001-108681 PTL 2: W02006/068206 PTL 3: JP-A-2007-163319 PTL 4: Patente JP 4241301

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema Técnico

No entanto, quando usando o método descrito em PTL 1, uma redução no valor medido relativo é observada à medida que a razão de mistura de PSA-ACT aumenta (ver os resultados de medição quando um látex de poliestireno com um tamanho médio de partícula de 0,78 μm e imobilizando um anticorpo monoclonal anti -PSA sobre o mesmo, e fPSA e PSA-ACT são misturados em uma razão diferente). Especificamente, quando apenas PSA- ACT é usado, o valor medido relativo ao PS A livre é 81,43% e uma resposta 5 equimolar não é obtida. O método descrito em PTL 2 tem um problema na medida em que é necessário combinar látex que diferem em tamanho de partículas, e o método descrito em PTL 3 tem um problema na medida em que é necessário empregar uma reação em duas etapas em que o segundo anticorpo monoclonal é reagido depois de reagir o primeiro anticorpo monoclonal. O 10 método descrito em PTL 4 também tem um problema na medida em que é necessário combinar látex que diferem em tamanho de partículas. PTL 4 descreve um exemplo comparativo, em que látex tendo um tamanho médio de partícula idêntico (0,22 μm) são usados. No entanto, um acelerador de aglutinação não é usado, e uma resposta equimolar não é obtida.

Levando em conta a situação acima, é desejável o desenvolvimento de um método que pode mais facilmente e precisamente medir o nível de PSA total (isto é, a soma de fPSA e PSA-ACT que pode ser medida por um imunoensaio).

Especificamente, um objeto da invenção consiste em fornecer um 20 ensaio que mede facilmente e precisamente o PSA por uma reação de uma etapa sem usar veículos que diferem em tamanho médio de partícula, e um reagente usado para os mesmos. Note-se que a expressão “medição de PSA" ou "ensaio de PSA" aqui usado refere-se à medição ou ensaio do nível de PSA total, salvo especificado em contrário.

SOLUÇÃO PARA Q PROBLEMA

Vários aspectos da invenção que alcançam o objetivo acima incluem o seguinte. (1) Um ensaio de PSA compreendendo usar veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA, e levando os veículos insolúveis em contato com uma amostra na presença de um acelerador de aglutinação, em que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA podem reagir tanto com o PSA livre como o complexo de PSA livre e 5 αl-antiquimotripsina (PSA-ACT) e reconhecem diferentes epítopos, e os veículos insolúveis têm um tamanho médio de partícula idêntico, que é maior do que 0,20 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm. (2) O ensaio de PSA de acordo com (1), em que o acelerador de aglutinação é um ou mais aceleradores de aglutinação selecionados dentre 10 polietileno glicol, um polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, poli-y-glutamato, e poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina). (3) O ensaio de PSA de acordo com (1), em que os veículos insolúveis são de um ou mais tipos selecionados dentre partículas compreendendo materiais derivados de partículas de látex de polímeros 15 sintéticos, sílica, alumina, negros de fumo, compostos de metal, metais, cerâmicas e/ou substâncias magnéticas. (4) O ensaio de PSA de acordo com (1), em que a concentração do acelerador de aglutinação é ajustada de modo que é obtida uma resposta equimolar ao PSA livre e complexo de PSA livre e αl-antiquimotripsina (PSA- 20 ACT). (5) O ensaio de PSA de acordo com (2), em que o polissacarídeo é um ou mais polissacarídeos selecionados dentre dextrano, pululano, e polissacarídeos alquilados incluindo metil celulose e etil celulose. (6) O ensaio de PSA de acordo com (3), em que o polímero 25 sintético é um ou mais polímeros sintéticos selecionados dentre poliestireno, um copolímero de estireno - ácido sulfônico, um copolímero de estireno - ácido metacrílico, um copolímero de acrilonitrila-butadieno-estireno, um copolímero de cloreto de vinila - acrilato, e um copolímero de acetato de vinila-acrilato. (7) O ensaio de PSA de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA têm uma razão (fKd/cKd) de uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre para uma constante de dissociação (cKd) para complexo de PSA livre e al- 5 antiquimotripsina (PSA-ACT) maior do que 0,1 e igual a ou menor do que 2,0, e tem uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre de 10 nM ou menor. (8) Um reagente de ensaio de PSA compreendendo, pelo menos, 1) e 2) 1) veículos imobilizados por anticorpos preparados usando io veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA, em que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti- PSA podem reagir tanto com o PSA livre como com o complexo de PSA livre e al-antiquimotripsina (PSA-ACT) e reconhecem diferentes epítopos, e os veículos insolúveis têm um tamanho médio de partícula idêntico, que é maior 15 do que 0,20 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm; e/ou 2) um ou mais aceleradores de aglutinação selecionados dentre polietileno glicol, polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, poli- y-glutamato, e poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina). 9) ) O ensaio de PSA de acordo com (1), em que os dois tipos de 20 anticorpos monoclonais anti-PSA têm uma razão (fKd/cKd) de uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre para uma constante de dissociação (cKd) para complexo de PSA livre e α 1-antiquimotripsina (PSA-ACT) maior do que 0,1 e igual a ou menor do que 2,0 e tem uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre de 10 nM ou menor, o acelerador de aglutinação é um ou mais aceleradores de aglutinação selecionados dentre polietileno glicol, um polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, um poli-y-glutamato, e poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina), e a quantidade do acelerador de aglutinação é ajustada de modo que é obtida a resposta equimolar ao PSA livree complexo de PSA livre e αl-antiquimotripsina (PSA-ACT).

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

O ensaio de acordo com o aspecto da presente invenção pode facilmente e precisamente medir PSA por uma reação de uma etapa sem usar 5 veículos que diferem em tamanho médio de partícula. Portanto, é possível implementar medição de alta precisão usando um analisador automático de uso geral sem requerer um dispositivo especial.

DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO (Substância alvo de medição)

As formas de realização da invenção são alvo-dirigidas a antígeno específico da próstata (PSA) (isto é, a substância alvo de medição). PSA no plasma, que pode ser medido por imunoensaio, inclui PSA livre (fPSA) e complexo de PSA livre (fPSA) e αl-antiquimotripsina (PSA-ACT).

A amostra alvo não é particularmente limitada desde que a 15 amostra inclua PSA, mas é preferencialmente sangue, soro, plasma, ou similares.

(Anticorpo monoclonal anti-PSA)

Pelo menos dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA que podem reagir com tanto fPSA como PSA-ACT e reconhecem diferentes 20 epítopos são usados como anticorpos monoclonais para PSA. A diferença no epítopo entre os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA pode ser determinada por confirmação se um imunoensaio tipo sanduíche normal, usando PSA (antígeno) e estes anticorpos é possível ou não.

(Seleção de anticorpos)

Os anticorpos são selecionados como descrito abaixo. E desejável selecionar um anticorpo que tenha uma elevada reatividade (isto é, título elevado), com PSA-ACT e fPSA por ELISA ou similar. E desejável selecionar veículos que asseguram sensibilidade de medição suficiente. Os veículos imobilizam sobre os mesmos dois tipos de anticorpos selecionados arbitrariamente a partir dos anticorpos selecionados para ter um título elevado, e uma combinação de anticorpos são selecionados de modo que a reatividade com PSA-ACT e fPSA mostra pequena diferença 5 sendo alcançada sensibilidade de medição suficiente.

E preferível que os anticorpos monoclonais anti-PSA tenham uma razão (fKd/cKd) da constante de dissociação (fKd) para PSA livre para a constante de dissociação (cKd) para complexo de PSA livre e αl- antiquimotripsina (PSA-ACT) de mais do que 0,1, e mais preferivelmente mais 10 do que 0,2. O limite superior da razão (fKd/cKd) é preferivelmente 2,0 ou menos, e mais preferivelmente 1,5 ou menos. A constante de dissociação (fKd) para PSA livre é, preferivelmente 10 nM ou menor, e mais preferivelmente 6 nM ou menos.

Os anticorpos monoclonais podem incluir, por exemplo, um 15 fragmento Fab obtido por hidrólise parcial por papaína ou similar, um fragmento F(ab’)2 obtido por hidrólise parcial com pepsina ou similar, e/ou um fragmento de Fab’ obtido por redução de um fragmento F(ab’)2.

(Veículos insolúveis)

Os veículos insolúveis, imobilizando anticorpos sobre os mesmos 20 não são particularmente limitados, mas são preferencialmente selecionados dentre partículas compreendendo materiais derivados de partículas de látex de polímeros sintéticos, sílica, alumina, negros de fumo, compostos de metal, metais, cerâmicas e/ou substâncias magnéticas. O polímero sintético é, preferivelmente, um ou mais polímeros sintéticos selecionados dentre 25 poliestireno, um copolímero de estireno - ácido sulfônico, um copolímero de estireno - ácido metacrílico, um copolímero de acrilonitrila-butadieno-estireno, um copolímero de cloreto de vinila - acrilato, e um copolímero de acetato de vinila-acrilato.

É particularmente preferível usar partículas de um látex de poliestireno obtido por polimerização em emulsão livre de sabão. O látex de poliestireno pode ser produzido, por exemplo, pelo método descrito em W02003/005031. Especificamente, um vaso de reação contendo água como 5 solvente é carregado com quantidades específicas de um monômero de estireno, um iniciador (por exemplo, persulfato de potássio), e estabilizador de polimerização (por exemplo, estireno sulfonato de sódio). Depois de, opcionalmente, adicionar emulsionante (por exemplo, lauril sulfato de sódio), a mistura é aquecida com agitação em uma atmosfera de nitrogênio para efetuar a 10 polimerização.

(Tamanho de partículas de veículos insolúveis)

O tamanho médio das partículas dos veículos insolúveis é maior do que 0,20 μm e igual a ou inferior a 0,40 μm, preferivelmente maior do que 0,22 μm e igual a ou inferior a 0,40 μm, mais preferivelmente igual a ou maior 15 do que 0,23 e igual a ou menor do que 0,40 μm, e ainda mais preferivelmente igual a ou maior do que 0,23 e igual a ou menor do que 0,34 μm. Se o tamanho médio das partículas dos veículos insolúveis for 0,20 μm ou menos, ou exceder 0,40 μm, pode ser difícil obter uma resposta equimolar. Note-se que o termo "tamanho médio de partícula (μm)" aqui usado em conexão com os veículos 20 insolúveis refere-se a um valor que é obtido por análise de imagem usando um microscópio eletrônico de transmissão (ver os exemplos) e arredondado para duas casas decimais. Note-se que o tamanho médio das partículas pode ser calculado com quatro casas decimais por análise de imagem.

No caso em que o tamanho médio de partícula é maior do que 0,20 25 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm, considera-se que dois tipos de partículas (por exemplo preparadas em lotes diferentes) tem um tamanho médio de partícula idêntico, quando os tamanhos médios de partícula dos dois tipos de partículas satisfazem à relação “M-N<P+Q” quando o tamanho médio de partícula (±SD) das partículas A é M±N, o tamanho médio de partículas (±SD) das partículas B é P+Q, M>P, e N e Q são 0,2 μm ou menos.

Por exemplo, quando o tamanho médio de partícula das partículas A é 0,22±0,02 μm e o tamanho médio de partícula das partículas B é 0,21±0,02 5 μm, M-N é 0,20 e P+Q é 0,23 (isto é, a relação acima é satisfeita). Portanto, considera-se que as partículas A e as partículas B têm um tamanho médio de partícula idêntico.

Quando o tamanho médio de partícula das partículas A é 0,40+0,02 μm e o tamanho médio de partícula das partículas B é 0,37+0,02 μm, io M-N é 0,38 e P+Q é 0,39 (isto é, a relação acima é satisfeita). Portanto, considera-se que as partículas A e as partículas B têm um tamanho médio de partícula idêntico.

Uma mistura de partículas em que as partículas são consideradas como tendo um tamanho médio de partícula idêntico, como mencionado acima, 15 e são misturadas em uma razão arbitrária está dentro do âmbito da invenção.

De acordo com as formas de realização da invenção, dois ou mais veículos têm um tamanho médio idêntico, mas uma combinação de veículos feitos a partir de diferentes materiais não está excluída. Uma combinação de veículos tendo diferentes tamanhos médios de partícula também não é excluída, 20 desde que o veículo dos mesmos tenha um tamanho médio de partícula dentro da faixa acima e é usado na reação principal para obter uma resposta equimolar.

(Imobilização de anticorpos)

Os veículos insolúveis podem ser imobilizados com os anticorpos sobre os mesmos por um método de adsorção física geralmente usado, e um 25 método de ligação química, um método de imunoligação, ou similar é usado também. Os veículos que têm respectivamente imobilizados sobre os mesmos dois tipos de anticorpos monoclonais, e reconhecem diferentes epítopos, são normalmente misturados em uma razão apropriada (ver os exemplos), mas os dois tipos de anticorpos monoclonais podem ser misturados previamente em uma razão apropriada para serem imobilizados sobre os veículos.

(Acelerador de aglutinação)

O acelerador de aglutinação não é particularmente limitado, desde que o acelerador de aglutinação promova a aglutinação de veículos insolúveis que imobilizam os anticorpos sobre os mesmos por meio de uma reação antígeno-anticorpo. Exemplos do acelerador de aglutinação incluem polietileno glicol, um polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, um poli-y- glutamato, poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina) (a seguir podem ser referidos como "polímero MPC"), e similares. O polissacarídeo é, preferivelmente, um ou mais polissacarídeos selecionados dentre dextrano, pululano, e polissacarídeos alquilados incluindo metil celulose e etil celulose. O poli-y- glutamato pode ser um sal de metal alcalino (por exemplo, sal de sódio, potássio ou lítio), um sal de metal alcalino-terroso (por exemplo, sal de magnésio, cálcio ou bário), ou um sal de amónio.

Dentre estes, polietileno glicol e polivinilpirrolidona são preferíveis, e polietileno glicol é mais preferível. Note-se que uma pluralidade de aceleradores de aglutinação pode ser utilizada em combinação.

Os produtos que diferem em peso molecular estão comercialmente disponíveis como o acelerador de aglutinação, e podem ser adequadamente selecionados levando em conta a solubilidade em água e similares. O peso molecular médio numérico do polietileno glicol é preferivelmente de 3.000 a 1.000.000, por exemplo, mais preferivelmente de 5.000 a 100.000, e especialmente preferivelmente de 5.000 a 50.000. Quando o peso molecular médio numérico do polietileno glicol é 3.000 a 1.000.000, pode ser alcançada uma sensibilidade de medição excelente. Polivinilpirrolidona pode ter um peso molecular médio ponderai de 25.000 a 1.200.000, por exemplo, e preferivelmente de 40.000 a 360.000. O poli-y-glutamato pode ter um peso molecular médio ponderai de 200.000 a 6.000.000, por exemplo. O polímero MPC pode ter um peso molecular de 5.000 a 5.000.000, por exemplo, e preferivelmente de 500.000 a 2.000.000.

É preferível ajustar de modo apropriado a concentração do acelerador de aglutinação de modo que uma resposta equimolar seja obtida levando em conta o tamanho médio das partículas dos veículos e o tipo de acelerador de aglutinação. Por exemplo, a concentração do acelerador de aglutinação é preferivelmente ajustada de modo que a concentração final do acelerador de aglutinação seja 0,1 a 5% em peso, mais preferivelmente 0,2 a 2% em peso, e especialmente preferivelmente 0,2 a 0,6% em peso, quando o acelerador de aglutinação é colocado em contato com a amostra. Quando a concentração final do acelerador de aglutinação é 0,1 a 5% em peso, uma excelente sensibilidade de medição pode ser alcançada.

(Aditivo)

Um sacarídeo (por exemplo, glicose e sacarose), um sal inorgânico (por exemplo, cloreto de sódio), um tensoativo (por exemplo, sorbitano monoestearato de polioxietileno), um conservante (por exemplo, azida de sódio), e/ou um inibidor da reação não específico (por exemplo, um anticorpo IgG derivado de um animal normal) podem ser adicionados ao reagente, desde que a reação entre o anticorpo monoclonal anti-PSA e PSA não seja prejudicada.

O teor do sacarídeo no reagente é preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 10% em peso, o teor de sal inorgânico no reagente é preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 5% em peso, o teor do tensoativo no reagente é preferivelmente de cerca de 0,02 a cerca de 5% em peso, o teor do conservante no reagente é preferivelmente de cerca de 0,001 a cerca de 0,1% em peso, e o teor do inibidor de reação não específico no reagente é preferivelmente de cerca de 0,001 a cerca de 5% em peso.

(Tampão)

A reação antígeno-anticorpo de acordo com as formas de realização da invenção é efetuada em um tampão. O tipo, a concentração e o pH do tampão não são particularmente limitados, desde que ocorra a reação antígeno-anticorpo. Exemplo de tampão inclui um tampão de fosfato, um tampão Tris-HCl, tampão carbonato, um tampão de glicina, tampão de Good, e similares. A concentração do tampão é de cerca de 3 a cerca de 500 mM, preferencialmente de 5 a 100 mM, e mais preferencialmente 5 a 50 mM. É preferível que o tampão tenha um pH em uma região neutra a básica (normalmente 6,5 a 9,5).

(Método de medição do sinal de aglutinação)

O sinal de aglutinação pode ser medido usando um método arbitrário usado para medir a aglutinação. Por exemplo, o sinal de aglutinação pode ser medido através da medição da Absorbância, da contagem de partículas, do tamanho das partículas, da luz dispersa, ou similares.

Por exemplo, o PSA é medida como descrito a seguir.

Especifícamente, a aglutinação ocorre quando, pelo menos, dois tipos de anticorpos que podem reagir com tanto fPSA como PSA-ACT são imobilizados sobre veículos (por exemplo, látex), e, posteriormente, reagem com uma amostra que inclui o fPSA e/ou PSA-ACT. O nível total de PSA na amostra pode ser determinado medindo o grau de aglutinação, e comparando o grau medido de aglutinação com o grau de aglutinação quando usando uma solução padrão com um nível de PSA conhecido. Por exemplo, o grau de aglutinação é preferencialmente detectado como uma mudança na Absorbância, usando um analisador bioquímico automático de fins gerais. Neste caso, é preferível usar uma mudança em Absorbância a um comprimento de onda de 500 a 900 nm para a determinação do grau de aglutinação.

(Resposta equimolar)

Uma vez que uma resposta equimolar ao fPSA e PSA-ACT pode ser obtida usando o ensaio de acordo com as formas de realização da invenção, o PSA pode assim ser quantitativamente determinado com alta precisão.

A expressão "resposta equimolar para fPSA e PSA-ACT" aqui 5 usada significa que a razão de um sinal obtido através da medição de uma amostra que inclui apenas fPSA para um sinal obtido através da medição de uma amostra que inclui apenas PSA-ACT (mol igual com fPSA) é de aproximadamente 1:1.

Por exemplo, a razão (PSA-ACT/fPSA) (a seguir pode ser referida io como "razão c/P) de sinais de aglutinação por mol igual de fPSA e PSA-ACT é calculada, e considera-se que uma resposta equimolar é obtida quando a razão c/f é de 85 a 115% (mais preferivelmente 90 a 110%).

(Método para a produção de reagente)

O reagente de ensaio de PSA de acordo com formas de realização 15 da invenção é produzido como descrito abaixo.

Especificamente, o reagente de ensaio de PSA pode ser produzido através de veículos que tendo imobilizados sobre os mesmos dois tipos de anticorpos que podem reagir tanto com PSA-ACT como com fPSA e diferem em sítio de reconhecimento, ajustando a razão de mistura dos veículos tem do 20 imobilizados sobre os mesmos dois tipos de anticorpos e tem um tamanho médio de partícula idêntico (mais de 0,20 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm), dentro de uma faixa específica, e ajustando a concentração do acelerador de aglutinação de modo que uma resposta equimolar a PSA-ACT e fPSA é obtida. A razão da mistura é 1:10 a 10:1, preferencialmente 1:5 a 5:1, e mais 25 preferivelmente 1:2 a 2:1.

A invenção é ainda descrita abaixo por meio de exemplos. Note-se que a invenção não é limitada aos seguintes exemplos.

Exemplos (Preparação de anticorpos monoclonais) 1. Imunização (1) Imunogênio

PSA purificado derivado de sêmen humano (SCIPAC Ltd., código 5 PI 17-7, grau de purificação: 96%) foi usado como um imunogênio. O PSA purificado foi usado depois de diálise usando 20 mM PBS (pH: 7,2).

(2) Método de imunização

A solução de PSA acima e um adjuvante de Freund completo (CFA) (Gibco) foram misturados e emulsificados em uma razão de 1:1, e io administrados por via subcutânea no dorso de camundongos Balb/C fêmeas de 6 semanas de idade, em uma quantidade de 25 μg PSA/camundongo. Imunização adicional foi realizada três vezes com intervalos de duas semanas, e a solução de PSA (25 μg PSA /camundongo) foi administrada por via intraperitoneal 3 dias antes da fíisão celular.

2. Fusão celular

O baço foi removido de cada um dos camundongos imunizados com PSA para coletar as células do baço. As células do baço e células de mieloma de camundongo SP2/O-Agl4 foram misturadas em uma razão de 6:1, e fusionadas na presença de 50% de polietileno glicol 1540 (Wako Pure 20 Chemical Industries, Ltd.). As células fusionadas foram colocadas em suspensão em meio HAT, de modo que o número de células de baço foi 2,5xl06, e distribuídos em uma placa de cultura de 96 cavidades (Corning Inc.) em uma quantidade de 0,2 ml/cavidade. As células fusionadas foram cultivadas a 37°C durante 2 semanas em incubador a 5% de CO2,.

3. Triagem

O sobrenadante de cultura em cada cavidade da placa de cultura no qual as células fusionadas foram distribuídas foi submetido a ELISA (ver abaixo) para selecionar as cavidades que reagiram com ambos fPSA e PSA- ACT. (1) Material: antígeno 1) PSA: SCIPAC, Código no. Pl 17-7 2) PSA-ACT: SCIPAC, Código no. Pl92-3 (2) Método 1) Uma placa ELISA (Nunc) foi revestida (50 μl/cavidade) com um anticorpo IgG (Fc) anti-camundongo de cabra (Jackson Inc.) (5 μg/ml), e deixado repousar a 4°C durante a noite. 2) Após a lavagem da placa ELISA com uma solução de lavagem io (0,05% de Tween 20-PBS), três vezes (400 μl/cavidade), um reagente de bloqueio (0,05% de Tween 20-PBS) foi distribuído em cada cavidade em uma quantidade de 200 μl/cavidade, e a placa ELISA foi deixada permanecerem temperatura ambiente durante 1 hora. 3) Após a remoção do reagente de bloqueio, o sobrenadante da 15 cultura em cada cavidade da placa de cultura em que as células fusionadas foram distribuídas, foi distribuído em cada cavidade da placa ELISA, em uma quantidade de 50 μl/cavidade, e a placa ELISA foi deixada permanecerem temperatura ambiente durante 1 hora. 4) Após a lavagem da placa ELISA com uma solução de lavagem 20 (0,05% de Tween 20-PBS), três vezes, fPSA ou PSA-ACT diluído com 0,05% Tween 20-PBS a 5 ng/ml foi distribuído em cada cavidade em uma quantidade de 50 μl/cavidade, e a placa ELISA foi deixada permanecerem temperatura ambiente durante 1 hora. 5) Após a lavagem da placa ELISA com uma solução de lavagem 25 três vezes, um anticorpo de PSA anti-humano de HRP-coelho (*500) Foi distribuído em cada cavidade em uma quantidade de 50 μl/cavidade, e a placa ELISA foi deixada permanecer em temperatura ambiente durante 1 hora. Note- se que o anticorpo de PSA anti-humano de HRP- coelho foi preparado por um método de ácido periódico, usando um anticorpo de PSA anti-humano de coelho (DAKO) e peroxidase (Toyobo Co., Ltd.). 6) Depois de lavagem da placa ELISA três vezes, um reagente de cor OPD foi distribuído em cada cavidade em uma quantidade de 50 5 μl/cavidade, e a placa ELISA foi deixada permanecer em temperatura ambiente durante 10 minutos. 7) Uma solução de parada (1,5 N ácido sulfurico) foi distribuída em cada cavidade em uma quantidade de 50 μl/cavidade para terminar a reação, e a Absorbância em um comprimento de onda de 492 nm foi medida usando io uma leitora de placa.

4. Clonagem

As linhagens de células nas cavidades que reagiram com tanto fPSA como PSA-ACT durante a triagem acima foram clonadas pelo método de diluição de limitação para estabelecer hibridomas. 28 tipos de hibridomas 15 estabelecidos foram assim obtidos.

5. Preparação de anticorpos monoclonais

Os hibridomas (células 0,5x106) obtidos por clonagem foram administrados por via intraperitoneal para camundongos Balb/C fêmeas de 8 semanas de idade em que 0,5 ml de pristano foi administrado por via 20 intraperitoneal 2 semanas antes. Fluido abdominal foi coletado quando tinham decorrido duas semanas, e uma fração de IgG foi purificada usando uma coluna de proteína A (Amersham plc). As frações purificadas dos 28 tipos de anticorpos monoclonais foram assim obtidas.

(Consideração preliminar de combinação de anticorpos 25 monoclonais)

Cada um dos 28 tipos de anticorpos monoclonais é imobilizado sobre um látex, e aglutinação do látex foi observada, tal como descrito abaixo. Dois tipos de anticorpos (anticorpo #91 e anticorpo #51) que mostraram um sinal amplo, e combinações dos mesmos com o látex foram selecionados.

1. Seleção de anticorpos (1) Uma solução de látex a 1% (0,3 mM) diluída com 20 mM Tris- HC1 (pH 8,5), e cada solução de anticorpo monoclonal (0,5 Abs) foram misturados em uma razão de 1:1 (v/v), e a mistura foi agitada a 4 °C durante 2 horas. (2) Após a adição de 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), incluindo 0,4% de BSA (2 volumes), a mistura foi agitada a 4°C durante 1 hora. (3) O líquido sobrenadante foi removido por centrifugação e colocado em suspensão em 5 mM MOPS (pH 7,0) de modo que a absorbância a 600 nm foi de 2 Abs. (4) Foram selecionados dois tipos de MoAb-Lx (anticorpo imobilizado em látex), e misturados em uma razão de 1:1 (v/v) para obter um reagente 2 (o reagente 2 foi preparado usando todas as combinações). (5) 26 ng/ml de fPSA e PSA-ACT foram medidos usando um reagente 1 (tampão HEPES 30 mM (pH 7,0), incluindo 0,1% BSA, 0,5 M NaCl, 0,3% de polivinilpirrolidona K-90 (PVP K-90)) e o reagente 2, utilizando um analisador automático Hitachi 7170. (6) Dois grupos de anticorpos que foram considerados para reconhecer diferentes epítopos foram obtidos a partir das combinações de anticorpos monoclonais que mostraram aglutinação. i) #63217, #63251, e #63279 ii) #63214 e #63291

Aglutinação foi observada usando as combinações dos anticorpos de grupos i) e ii).

Os hibridomas que produzem os anticorpos #63251, #63279 e #63291 são depositados junto ao International Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology como números de acesso FERM BP-11453, FERM BP-11454, e FERM BP - 11455. Os anticorpos monoclonais, obtidos a partir desses hibridomas podem ser referidos como “anticorpo #51 ", "anticorpo #79" e "anticorpo # 91", que correspondem, respectivamente, aos primeiros e segundos números finais dos 5 números de identificação. (Produção de látex que diferem no tamanho das partículas) 1) 0,2 μm ou menosUm vaso de reação de vidro (2 L) equipado com um agitador, um condensador de refluxo, um termômetro, um tubo de entrada de nitrogênio, um 10 banho de óleo de aquecimento e similares, foi carregado com 1200 g de água, 200 g de monômero estireno, 1,2 g de persulfato de potássio, e 0,2 g de estireno-sulfonato de sódio, e a atmosfera no interior do vaso de reação foi suficientemente substituída por nitrogênio com agitação (cerca de 200 rpm). Após a polimerização do monômero a 70°C durante cerca de 18 horas, a 15 solução reacional foi filtrada através de papel de filtro (ADVANTEC No. 2) para obter as partículas de látex. O tamanho médio de partícula (± SD) das partículas de látex foi determinado por fotografia das partículas de látex, usando um microscópio eletrônico de transmissão, selecionando aleatoriamente três campos de visão, submetendo 100 ou mais partículas de látex, dentro de 20 cada campo de visão para análise de imagem para determinar o tamanho médio de partícula (± SD) das partículas de látex para cada campo de visão, e tirando a média do tamanho médio de partícula (± SD) das partículas de látex para cada campo de visão. O tamanho médio de partículas assim determinado foi de 0,19 μm(±0,01 μm). 2-1) 0,23 μmPartículas de látex foram obtidas do mesmo modo como na seção 1), exceto que foram usados 1200 g de água, 200 g de um monômero estireno, 2,4 g de persulfato de potássio, e 0,1 g de estireno sulfonato de sódio. O tamanho médio de partícula das partículas de látex assim obtidas foi 0,23 μm (±0,01 μm). 2-2) 0,25 μmPartículas de látex foram obtidas do mesmo modo como na seção 1), exceto que foram usados 1200 g de água, 200 g de um monômero estireno, 0,9 g de persulfato de potássio, e 0,2 g de estireno sulfonato de sódio. O tamanho médio de partícula das partículas de látex assim obtidas foi de 0,25 μm (±0,01 μm). 2-3) 0,29 μmPartículas de látex foram obtidas do mesmo modo como na seção 1), exceto que foram usados 1200 g de água, 200 g de um monômero de estireno, 1,3 g de persulfato de potássio, e 0,1 g de estireno-sulfonato de sódio. O tamanho médio de partícula das partículas de látex foi de 0,29, assim obtidosμm (±0,01 μm). 2-4) 0,34 μmPartículas de látex foram obtidas do mesmo modo como na seção 1), exceto que 1200 g de água, foram usados 200 g de um monômero de estireno, 1,3 g de persulfato de potássio, e 0,08 g de estireno sulfonato de sódio. O tamanho médio de partícula das partículas de látex assim obtidas foi 0,34μm (±0,01 μm). 2-5) 0,40 μmPartículas de látex foram obtidas do mesmo modo como na seção 1), exceto que foram usados 1200 g de água, 200 g de um monômero de estireno, 1,3 g de persulfato de potássio, e 0,03 g de estireno sulfonato de sódio. O tamanho médio de partícula das partículas de látex assim obtidas é de 0,40 μm (±0,01 μm). 3) Mais de 0,4 μmPartículas de látex foram obtidas do mesmo modo como na seção 1), exceto que foram usados 1200 g de água, 200 g de um monômero de estireno, 1,2 g de persulfato de potássio e 0,01 g de estireno sulfonato de sódio. O tamanho médio de partícula das partículas de látex assim obtidas foi de 0,42μm(±0,01 μm).

(Preparação de anticorpos imobilizados em látex)

Dois tipos de anticorpos monoclonais (#91 e #51) obtidos tal como descrito acima são imobilizados em veículos, usando os seguintes materiais e método. 1. Material (1) Anticorpo monoclonal anti-PSA #63291 (#91) #63251 (#51) (Estes anticorpos monoclonais foram dissolvidos em PBS.) (2) Látex 15 Látex de poliestireno (tamanho médio de partícula: 0,19 a 42 μm), obtido como descrito de cima 2. Preparação de líquido contendo anticorpo imobilizado em látex (1) Preparação de líquido contendo complexo anticorpo-látex #91 (#91Lx) 1)0 látex e o anticorpo #91, respectivamente, foram diluídos com um tampão de 20 mM glicina (pH 9) para preparar um líquido de látex a 1% e um líquido de anticorpo #91 (0,4 mg/ml). O líquido de látex e o líquido de anticorpo #91 foram misturados (1:1, v/v), e a mistura foi agitada durante cerca de 1 hora. 2) Um reagente de bloqueio (BSA a 10%) foi adicionado à mistura (0,1:2, v/v), e a mistura foi agitada durante cerca de 1 hora. 3) O líquido sobrenadante foi removido por centrifugação, colocado em suspensão em tampão MOPS 5 mM (pH 7,0), e diluído de modo que a absorbância a um comprimento de onda de 600 nm foi de 3 Abs/ml para obter um líquido de látex imobilizado por anticorpo #91 (#91Lx). (2) Preparação de líquido contendo complexo anticorpo-látex #51 (#51Lx) 1) O látex e o anticorpo #51 foram, respectivamente, diluídos com um tampão Tris 20 mM (pH 8) para preparar um líquido de látex a 1% e um líquido de anticorpo #51 (0,4 mg/ml). O líquido de látex e o líquido de anticorpo # 51 foram misturados (1:1, v/v), e a mistura foi agitada durante cerca de 1 hora. 2) Um reagente de bloqueio (10% BSA) foi adicionada à mistura (0.1:2, v/v), e a mistura foi agitada durante cerca de 1 hora. 3) O líquido sobrenadante foi removido por centrifugação, colocado em suspensão em tampão MOPS 5 mM (pH 7,0), e diluído de modo que a absorbância a um comprimento de onda de 600 nm foi de 3 Abs/ml para se obter um líquido de látex imobilizado por anticorpo #51 (#51Lx).

[Exemplo de Teste 1]

(Determinação de mudança em razão c/f, devido a mudança no tamanho médio das partículas de látex) fPSA e PSA-ACT (concentração: 5 ng/ml) foram usados como amostras de medição, e a reatividade com fPSA e PSA-ACT foi determinada usando os seguintes reagentes de medição e condições de medição de PSA. A razão "PSA-ACT/fPSA" (razão c/f) da reatividade com o PSA-ACT para a reatividade com fPSA foi determinada. Os resultados são apresentados na Tabela 1. (1) Reagente de medição de PSA Primeiro reagente (tampão) Tampão 30 HEPES mM (pH: 7.0) incluindo 0,5 M KC1, 0,1% BSA (Proliant), e 0,3% PVP K-90 Segundo reagente (líquido de látex imobilizado por anticorpo) Tampão MOPS 5 mM (pH 7,0), incluindo partículas de látex imobilizadas por anticorpo monoclonal anti-PSA de camundongo (razão de mistura de dois tipos de partícula imobilizada por anticorpo, líquido contendo#9 ILx: líquido contendo #5 ILx =1:1). Cada combinação dos líquidos contendo anticorpos usados neste exemplo é preparada respectivamente usando partículas de látex tendo um tamanho médio de partícula idêntico (0,19 a 0,42 μm) e imobilizando sobre a mesma o anticorpo #91 ou anticorpo #51. (2) Condições de medição Sistema de medição: analisador automático Hitachi 7170 (H- 7170) Parâmetros de medição: Método de análise: método de final de 2 pontos (pontos de medição: 19 a 34) Quantidade de líquido (μl): 14,4/90/90 Comprimento de onda de medição (nm): 570 (principal)/800 (secundário) Calibração: Estria

A calibração foi realizada usando um calibrador de PSA Nanopia (marca registrada) (concentração de PSA: 0, 4,2, 10, e 29 ng/ml, Sekisui Medical Co., Ltd.). (3) Amostra de medição As amostras de medição foram preparadas dissolvendo fPSA e PSA-ACT (Fitzgerald) em PBS (pH: 7.4) incluindo 1% BSA e 0,1% NaN3. [Tabela 1]

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 1, foiconfirmado que a razão c/f foi de 85% ou mais (próxima de 100%) e uma resposta equimolar foi obtida quando o tamanho médio de partícula foi maior do que 0,20 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm. A razão c/f foi inferior a 80% e uma resposta equimolar não foi obtida quando o tamanho médio de partícula foi 0,20 μm ou menor, ou excedendo 0,40 μm.

[Exemplo de Teste 2] (Ajuste da razão c/f por adição de acelerador de aglutinação)

fPSA e PSA-ACT (concentração: 35 ng/ml) foram usados como amostras de medição. A reatividade com o fPSA e PSA-ACT foi determinada usando os seguintes reagentes de medição de PSA sob as mesmas condições de medição, como as empregadas em Exemplo de Teste 1, e a razão "PSA- ACT/fPSA" (razão c/f), da reatividade com PSA-ACT para a reatividade com fPSA foi determinada. Os resultados são apresentados nas Tabelas 2 a 4.

(1) Reagente de medição de PSA Primeiro reagente (tampão)

Tampão HEPES 30 mM (pH 7,0), incluindo 0,5 M KC1, 0,1% BSA (Proliant), e acelerador de aglutinação a 0 a 0,8% (PEG (polietileno glicol) (o valor numérico é peso molecular médio numérico), PVP (polivinilpirrolidona) (peso molecular de PVP K-30: 40.000, o peso molecular da PVP K-90: 360.000, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), polímero MPC (peso molecular: 1.000.000), Pululano PI-20 (peso molecular: cerca de 200.000, Hayashibara Co., Ltd.), ou PGA-na (poli-glutamato y-sódico) (valor numérico é o peso molecular médio numérico) (ver Tabelas 2 a 4))

(O acelerador de aglutinação não foi adicionado no exemplo comparativo.)

Segundo reagente (líquido de látex imobilizado por anticorpo)

Tampão MOPS 5 mM(pH 7,0), incluindo as partículas de látex imobilizadas por anticorpo monoclonal anti-PSA de camundongo (razão de mistura de dois tipos de partícula imobilizada por anticorpo, líquido contendo #91Lx: contendo líquido #51Lx = 1:1).

O líquido contendo o anticorpo usado neste exemplo é preparado usando látex tendo um tamanho médio de partícula idêntico (0,29μm) e imobilizando sobre o mesmo o anticorpo #91 e o anticorpo#51.[Tabela 2]

[Tabela 3]

[Tabela 4]

De acordo com os resultados apresentados nas Tabelas 2 a 4, foiconfirmado que a relação c/f aproximada a partir de cerca de 82% a 100% devido à adição do acelerador de aglutinação e um aumento na quantidade do acelerador de aglutinação, e uma resposta equimolar (razão c/f: 85% ou mais) 5 foi obtida (mostrando um efeito de aumento da razão c/f até cerca de 100%) por uma reação de uma etapa ajustando apropriadamente a quantidade do acelerador de aglutinação. Note-se que o termo "reação de uma etapa" refere-se à adição e à reação de dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA de uma só vez.

[Exemplo de Teste 3] (Determinação da reatividade usando diferentes combinações de anticorpos)

A razão c/f foi determinada usando uma combinação dos anticorpos monoclonais #79 e #91, #14 e #51, #91 e #17, e #14 e #17 em vez 15 da combinação dos anticorpos monoclonais #51 e #91, e usando o seguinte reagente de medição incluindo um polímero MPC a 0,6% como acelerador de aglutinação. As demais condições eram as mesmas que as utilizadas no Exemplo de Teste 1. fPSA e PSA-ACT (concentração: 35 ng/ml) foram usados como amostras.

(1) Reagente medição de PSA Primeiro reagente (tampão)

Tampão HEPES 30 mM (pH: 7.0) incluindo 0,5 M KC1, 0,1% BSA (Proliant), e 0,6% polímero MPC Os resultados são apresentados na Tabela 5. [Tabela 5]

De acordo com os resultados apresentados na Tabela 5, confirmou- se que uma resposta equimolar foi obtida (razão c/f: 89,0-101,9%) usando qualquer uma das combinações acima.

(Valor de Kd de anticorpos monoclonais usados nos exemplos de ensaio)

A Tabela 6 mostra os valores de Kd dos anticorpos monoclonais usados nos exemplos de ensaio para fPSA e PSA-ACT. Como mostrado na Tabela 6, foi confirmado que é preferível que os anticorpos monoclonais anti- PSA tenham uma razão (fKd/cKd) da constante de dissociação (fKd) para PSA livre para a constante de dissociação (cKd) para o complexo de PSA livre e al- ls antiquimotripsina (PSA-ACT) de mais do que 0,1 e igual a ou menor do que 2,0, e tenham uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre de 10 nM ou menor.[Tabela 6]

A razão c/f foi de 52,4%, e uma resposta equimolar não foi obtida quando usando anticorpo #16 (fKd = 1,33 nM, cKd = 23,18 nM, fKd/cKd = 0,057), em vez do anticorpo #91 do Exemplo de Teste 3-3. O valor de Kd na Tabela 6 foi determinado de acordo com as seguintes condições experimentais. 1. Sistema Biacore (marca registrada) e reagente dedicado (GE Healthcare (antes Biacore) (i) a (viii) indicam o nome do produto e o número de catálogo de Biacore (disponível a partir de GE Healthcare)) (i) Biacore (marca registrada) TI00: JJ-1037-02 (Biacore) (ii) Chip Sensor série S CM5: BR-1005-30 (Biacore) (iii) Kit de copulação de amina: BR-1000-50 (Biacore) (iv) Acetato 5.0: BR-1003-51 (Biacore) (v) a- Imunoglobulinas de camundongo: BR-1005-14 (Biacore) (vi) Glicina 1.5: BR-1003-54 (Biacore) (vii) Glicina 2.0: BR-1003-55 (Biacore) (viii) HBS-EP+ 10x (tampão de ciclo): BR-1006-69 (Biacore) (ajustado a pH 8,5 com NaOH, e diluído com água purificada antes do uso) 2. Método de teste (i) O chip sensor CM5 em que a-imunoglobulina de camundongos é imobilizada é colocado no sistema Biacore. (ii) Os anticorpos anti-PSA são diluídos respectivamente a 1,0 μg/ml com tampão de ciclo (HBS-EP), e adicionados durante 60 segundos a uma taxa de fluxo de 30 μl/min. (iii) O antígeno PSA (f PSA ou PSA-ACT) é diluído a 5,0 μg/ml com tampão de ciclo (HBS-EP), e adicionado durante 120 segundos, com uma taxa de fluxo de 30 μl/min. (iv) Uma operação de ciclo livre é realizada usando o tampão de ciclo (HBS-EP) para efetuar a dissociação durante 120 segundos (taxa de fluxo: 30 μl/min) (v) O chip do sensor foi regenerado usando um regenerador (Glicina 1,75 preparada misturando glicina 1.5 e glicina 2.0 em uma razão de 5 1:1).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

O ensaio e o reagente de acordo com as formas de realização da invenção podem medir facilmente e precisamente PSA usando um analisador automático de uso geral, e são úteis para a detecção prematura de doenças da 10 próstata (particularmente câncer de próstata). [Referência para microorganismo depositado] (1) FERM BP-11453 (Hibridoma #63251 produzindo o anticorpo #51-) i) Nome e endereço da instituição depositária em que os materiais 15 biológicos foram depositados. International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki 305-8566, Japão ii) Data de depósito do material biológico na instituição 20 depositária em i). 19 de fevereiro de 2010 iii) Número de acesso para o depósito designado pela instituição depositária em i). FERM BP-11453 (2) FERM BP-11454 (Hibridoma #63279 produzindo o anticorpo #79) i) Nome e endereço da instituição depositária em que os materiais biológicos foram depositados.

Claims

1. Ensaio de PSA, caracterizado pelo fato de compreender usar veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA, e levar os veículos insolúveis ao contato com uma amostra na presença de um acelerador de aglutinação, em que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA podem reagir com tanto PSA livre como complexo de PSA livre e α1-antiquimotripsina (PSA-ACT) e reconhecem diferentes epítopos em uma reação de uma etapa, e os veículos insolúveis têm um tamanho médio de partícula idêntico, que é maior do que 0,20 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm e os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA têm uma razão (fKd/cKd) de uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre para uma constante de dissociação (cKd) para complexo de PSA livre e α1-antiquimotripsina (PSA-ACT) maior do que 0,1 e igual a ou menor do que 2,0.

2. Ensaio de PSA de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o acelerador de aglutinação é um ou mais aceleradores de aglutinação selecionados dentre polietileno glicol, um polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, um poli-Y-glutamato, e poli(2- metacriloiloxietilfosforilcolina).

3. Ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os veículos insolúveis são de um ou mais tipos selecionados dentre partículas compreendendo materiais derivados de partículas de látex de polímeros sintéticos, sílica, alumina, negros de fumo, compostos de metal, metais, cerâmicas e/ou substâncias magnéticas.

4. Ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a concentração do acelerador de aglutinação é ajustada de modo que é obtida uma resposta equimolar ao PSA livre e complexo de PSA livre e α1-antiquimotripsina (PSA-ACT).

5. Ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é um ou mais polissacarídeos selecionados dentre dextrano, pululano, e polissacarídeos alquilados.

6. Ensaio de PSA de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os polissacarídeos alquilados compreendem metil celulose e/ou etil celulose.

7. Ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o polímero sintético é um ou mais polímeros sintéticos selecionados dentre poliestireno, um copolímero de estireno-ácido sulfônico, um copolímero de estireno-ácido metacrílico, um copolímero de acrilonitrila-butadieno-estireno, um copolímero de cloreto de vinila-acrilato e um copolímero de acetato de vinila-acrilato.

8. Ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA têm uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre de 10 nM ou menor.

9. Ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA têm uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre de 10 nM ou menor; em que o acelerador de aglutinação é um ou mais aceleradores de aglutinação selecionados dentre polietileno glicol, um polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, um poli-Y-glutamato, e poli(2- metacriloiloxietilfosforilcolina); e em que a concentração do acelerador de aglutinação é ajustada de modo que é obtida uma resposta equimolar ao PSA livre e complexo de PSA livre e α1-antiquimotripsina (PSA-ACT).

10. Reagente de ensaio de PSA, caracterizado pelo fato de compreender, pelo menos: 1) veículos imobilizados por anticorpo preparados usando veículos insolúveis imobilizando sobre os mesmos dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA, em que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA podem reagir tanto com PSA livre como complexo de PSA livre e α1- antiquimotripsina (PSA-ACT) e reconhecem diferentes epítopos, e os veículos insolúveis têm uma tamanho médio de partícula idêntico, que é maior do que 0,20 μm e igual a ou menor do que 0,40 μm, e em que os dois tipos de anticorpos monoclonais anti-PSA têm uma razão (fKd/cKd) de uma constante de dissociação (fKd) para PSA livre para uma constante de dissociação (cKd) para complexo de PSA livre e α1-antiquimotripsina (PSA-ACT) maior do que 0,1 e igual a ou menor do que 2,0; e 2) um ou mais aceleradores de aglutinação selecionados dentre polietileno glicol, um polissacarídeo, polivinilpirolidona, cloreto de polivinila, um poli-Y-glutamato, e poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina).

11. Reagente de ensaio de PSA de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os veículos insolúveis são de um ou mais tipos selecionados dentre partículas compreendendo materiais derivados de partículas de látex de polímeros sintéticos, sílica, alumina, negros de fumo, compostos de metal, metais, cerâmicas e/ou substâncias magnéticas.

12. Reagente de ensaio de PSA de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polímero sintético é um ou mais polímeros sintéticos selecionados dentre poliestireno, um copolímero de estireno-ácido sulfônico, um copolímero de estireno-ácido metacrílico, um copolímero de acrilonitrila-butadieno-estireno, um copolímero de cloreto de vinila-acrilato e um copolímero de acetato de vinila-acrilato.

13. Reagente de ensaio de PSA de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo é um ou mais polissacarídeos selecionados dentre dextrano, pululano, e polissacarídeosalquilados.

14. Reagente de ensaio de PSA de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os polissacarídeos alquilados compreendem metil celulose e/ou etil celulose.