CN117074675A - 一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒及测定方法 - Google Patents
一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒及测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及蛋白检测技术领域，且公开了一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒及测定方法，试剂盒包含如下组分：组分A：包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶‑2抗体(2D5)；组分B：标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶‑1抗体(4E2)；组分C：低浓度校准品溶液(浓度39.06ng/mL)和高浓度校准品溶液(浓度1250ng/mL)；各组分均含有乙酰胺和防腐剂。针对所选抗原表位区域的抗体能够相互组合用于广泛型线粒体肌酸激酶的高灵敏度和特异性检测。针对所选抗原表位区域的抗体能够相互补充各自检测的不足，提高检出率，能够随时监测受试者的广泛型线粒体肌酸激酶含量，这对基层医院或者病房尤其重要。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白检测技术领域，具体为一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒及测定方法。
背景技术
肿瘤标志物目前在肿瘤的早期预测与预后监测等方面发挥着越来越突出的作用，因其检测过程对患者创伤较小，已广泛用于临床，可以为癌症早期诊断提供一定的参考价值。
近年来，肿瘤患者血清中线粒体肌酸激酶(mitochondrial creatine kinase,MtCK)过表达现象引起了临床关注。CK是由M、B两种不同亚基组成的二聚体，在实际检验过程中，时常出现CK-MB同工酶活性高于CK活性的现象，当CK-MB同工酶活性高于CK活性的30％或50％以上时，除考虑CK-BB同工酶的存在外还要考虑广泛型线粒体肌酸激酶的干扰。MtCK有广泛型线粒体肌酸激酶(广泛型线粒体肌酸激酶)和肌节线粒体肌酸激酶(sMtCK)2种同工酶。广泛型线粒体肌酸激酶是一种低聚的线粒体CK，存在于细胞线粒体膜上，当线粒体崩解时，线粒体膜的小碎片进入血液，作为巨分子酶的一种，它常常伴随各种肿瘤出现。目前已有广泛型线粒体肌酸激酶在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌患者血清及病理组织中过表达的报道。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种能够提高检出率，且能够随时监测癌症患者血液中广泛型线粒体肌酸激酶含量的试剂盒及检测方法。
(二)技术方案
一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，所述试剂盒包含如下组分：
组分A：包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体；
组分B：标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体；
组分C：低浓度校准品溶液(浓度39.06ng/mL)和高浓度校准品溶液(浓度1250ng/mL)；
各组分均含有乙酰胺和防腐剂。
优选的，所述组分A中的磁性微球为以下任意一种：表面有环氧基、氨基、醛基、磺酰基、羧基、酰胺基、巯基或羟基修饰的磁性微球，工作浓度为1-10mg/mL；所述组分A中广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体的工作浓度为50-100ng/mL。
优选的，所述组分B中发光标志物为以下任意一种：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，工作浓度为100-200ng/mL；所述组分B中广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体的工作浓度为100-500ng/mL。
优选的，所述乙酰胺质量体积百分浓度为0.1-0.5％；所述防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、苯甲酸钠、Proclin系列、山梨酸钾中的任一种或两种以上混合物。
优选的，所述筛选到的抗体：1A2、1B1、2D5、3C6、4E2、5E6、6F6、7G3；所述所选抗原表位区域：1-50aa、51-87aa、90-150aa、120-186aa。
优选的，所述验证数据包括如下：
(1)选取特定的抗体对组合能够实现对广泛型线粒体肌酸激酶的检测；
针对50例待测样本，用化学发光试剂进行检测，比较发光强度差异，选取发光强度大于250000的；
(2)评价2D5、4E2、1A2、7G3抗体表位抗体组配的诊断准确性及漏检率；
抗体配对方案：2D5+4E2、7G3+4E2、1A2+2D5、1A2+7G3；
阳性漏检率＝阳性漏检数/肿瘤患者数×100％；
特异性＝阴性样本数/健康体检样本数×100％；
(3)采用抗体组合方案2D5、4E2检测待测样本，评估试剂盒对临床样本的敏感性；
待测样本：为通过临床诊断及其他商业试剂筛查已经确诊的癌症患者血清、正常人血清；
待测样本的收集：受检者均于早晨空腹抽静脉血3mL，分离血清，置于-20℃冰箱保存；
检测性能评估：敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)。
优选的，所述验证结果包括如下：
(1)2D5+4E2、7G3+4E2、1A2+2D5、1A2+7G3，可用于广泛型线粒体肌酸激酶的检测；
(2)2D5+4E2和7G3+4E2的组合的特异性优于1A2+2D5和1A2+7G3的组合；
(3)本发明的抗体组合方式对临床肿瘤样本的检测具有良好的敏感性。
优选的，所述2D5特异性识别51-87aa，4E2特异性识别90-150aa。
优选的，所述包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体为2D5；所述标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体为4E2。
(三)有益的技术效果
试剂盒包含如下组分：
组分A：包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体；
组分B：标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体；
组分C：低浓度校准品溶液(浓度39.06ng/mL)和高浓度校准品溶液(浓度1250ng/mL)；
各组分均含有乙酰胺和防腐剂。
采用一对抗体组合对广泛型线粒体肌酸激酶进行检测，其中一个抗体特异性识别51-87aa，另一个抗体特异性识别90-150aa。其中一个抗体包被磁球，另一个抗体标记信号生成物。所制备得到的试剂盒用于检测癌症患者血液中广泛型线粒体肌酸激酶含量。
已经证明针对所选抗原表位区域的抗体能够相互组合用于广泛型线粒体肌酸激酶的高灵敏度和特异性检测。针对所选抗原表位区域的抗体能够相互补充各自检测的不足，提高检出率，能够随时监测受试者的广泛型线粒体肌酸激酶含量，这对基层医院或者病房尤其重要。
具体实施方式
实施例1
1广泛型线粒体肌酸激酶单克隆抗体的制备
1.1免疫小鼠
对广泛型线粒体肌酸激酶(SEQ ID NO:1)抗原溶液与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，取6-8周龄SPF级Balb/c小鼠进行皮下多点注射，剂量50μg抗原/只，间隔3周用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射，剂量30μg抗原/只。取尾血进行效价检测，挑选滴度≥1:10000的小鼠进行融合，融合3天前腹腔注射50μg抗原/只。
1.2细胞融合及亚克隆筛选
取免疫小鼠的脾脏，研磨分离获得分散的单个脾细胞，利用聚乙二醇将脾细胞和骨髓瘤细胞混合，培养基终止后离心复溶铺至96孔板中，一周后换液，取上清进行酶免间接法检测，包被抗原为广泛型线粒体肌酸激酶全长抗原，挑选高值阳性孔，进一步通过有限稀释法进行亚克隆，重复3-4次，直至获得能稳定分泌特异性抗体的单克隆细胞株。
1.3阳性细胞株腹水制备
对单克隆细胞株进行扩大培养，注射到提前接种IFA的小鼠体内制备腹水，收集腹水经过水疗法亲和纯化。
1.4效价评估和表位鉴定
对纯化抗体进行梯度稀释，与广泛型线粒体肌酸激酶全长抗原反应，进行效价检测；挑选效价高于105的抗体进行表位鉴定，与偶联牛免疫球蛋白G的四种广泛型线粒体肌酸激酶区段抗原(分别是1-50aa/51-87aa/90-150aa/120-186aa)进行反应。效价和表位鉴定结果如下：
表1：效价评估结果
| 1A2 | 1B1 | 2D5 | 3C6 | 4E2 | 5E6 | 6F6 | 7G3 | |
| 效价 | 2.3x105 | 1.2x105 | 2.5x107 | 2.3x106 | 3.2x105 | 4.0x106 | 1.9x105 | 2.2x105 |
表2：表位鉴定结果
依据各单抗对不同抗原的反应情况来确定单抗表位(“+”表示强反应性)：
| 克隆号 | 1-50aa | 51-87aa | 90-150aa | 120-186aa |
| 1A2 | + | + | ||
| 1B1 | + | |||
| 2D5 | + | |||
| 3C6 | + | |||
| 4E2 | + | |||
| 5E6 | + | |||
| 6F6 | + | + | ||
| 7G3 | + |
1.5发光配对验证
取上述针对不同表位的抗体进行配对组合，采用化学发光免疫夹心法试剂盒检测100份正常人的临床样本，将配对与临床诊断结果对比，进行评价，一致性高于95％为较好配对。
一致性＝(本发明试剂与对照系统诊断均为阴性的样本数+本发明试剂与对照系统诊断均为阳性的样本数)/总样本数，其中阴性和阳性均通过临床进行验证。
2用于检测广泛型线粒体肌酸激酶的检测试剂盒的制备方法
2.1广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体包被的磁性微球悬浮液的制备
采用上述单克隆制备抗体包被磁性微球(80％粒径分布为1-5μm，磁化强度为4000，浓度为100mg/mL，羟基数为95的纳米磁性微球)。
(1)将磁珠置于醋酸缓冲液溶液中，超声搅拌清洗，采用磁分离方法去上清液，重复三次，得到醋酸缓冲液悬浮磁珠。
(2)采用磁珠连接CDC法(磁珠-CDC-抗原/抗体)，将CDC和广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体加入醋酸缓冲液悬浮磁珠中，置于恒温震荡水浴箱中，得到广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体包被的磁性微球反应液；磁性微球与广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体的比例为1mg：5μg至1mg：10μg。
(3)采用磁分离的方法将步骤(2)得到的反应液去上清液，加入磁珠清洗液(0.1M的pH 7.4的PBS缓冲液)搅拌清洗，重复清洗四次；磁珠清洗液加入混匀后，称量0.5％(w/v)的乙酰胺(Roche生产)，自溶混匀。
(4)清洗完毕后，加入磁珠悬浮液悬浮，得到广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体包被的磁性微球悬浮液；其中磁珠悬浮液为0.1M的pH 7.4的PBS缓冲液。
2.2广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体标记的发光标记物ABEI的制备
(1)透析：将广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体碳酸缓冲液装入合适截留量的透析袋中，置于透析液(碳酸缓冲液)中。
(2)在步骤(1)透析好的溶液中加入发光标记物进行反应；温育温度为25-37℃，温育时间为：8-12h。
(3)以G-25凝胶柱纯化步骤(2)得到的反应液，收集峰值出现的溶液，即为广泛型线粒体肌酸激酶-1标记的发光标记物溶液。
(4)在步骤(3)得到的鼠抗人免疫球蛋白G二抗标记的发光标记物溶液中加入乙酰胺保护液，待用。
3试剂盒组成信息
(1)组分A：包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体溶液，其中：
磁性微球为以下任意一种：表面有环氧基、氨基、醛基、磺酰基、羧基、酰胺基、巯基或羟基修饰的磁性微球。
其中磁性微球的工作浓度为：1-10mg/mL，广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体的工作浓度为50-100ng/mL；
(2)组分B：标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体，其中，发光标志物的工作浓度为100-200ng/mL，广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体工作浓度为100-500ng/mL。
发光标记物为以下任意一种：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶。
(3)校准品溶液：低浓度校准品溶液(浓度39.06ng/mL)和高浓度校准品溶液(浓度1250ng/mL)。各组分均含有乙酰胺和防腐剂，乙酰胺质量体积百分浓度为0.1％-0.5％，防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、苯甲酸钠、Proclin系列、山梨酸钾中的任一种或两种以上混合物。
4一种用于检测广泛型线粒体肌酸激酶抗体的化学发光免疫学方法
(1)将待测样本溶液、高点校准品和低点校准品分别加入不同反应杯孔中。
(2)分别向步骤1)中加入制备的广泛型线粒体肌酸激酶抗体2包被的磁性微球、发光标记物标记的广泛型线粒体肌酸激酶抗体1，温育，使发光标记物标记的广泛型线粒体肌酸激酶抗体1与广泛型线粒体肌酸激酶抗体2包被的磁性微球和待测物质结合；其中，温育温度为25-37℃，温育时间为30min。
(3)磁分离，得到发光标记物标记的广泛型线粒体肌酸激酶抗体1与广泛型线粒体肌酸激酶抗体2包被的磁性微球和待测物质的结合物。
(4)向步骤(3)得到的结合物中加入发光激发底物，检测光信号强度；发光激发底物包括但不限于氢氧化钠和过氧化氢。
5特定的抗体对组合能够实现对广泛型线粒体肌酸激酶的检测
将待测样本用化学发光免疫分析仪(深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产)进行检测，分析仪自动换算出相应待检样本中广泛型线粒体肌酸激酶的浓度值。
针对50例待测样本，用化学发光试剂进行检测，比较发光强度差异。发光强度低者不适用于检测，因此选取发光强度大于250000的4对，2D5+4E2、7G3+4E2、1A2+2D5、1A2+7G3，可用于广泛型线粒体肌酸激酶的检测。
数据如下：
6评价2D5、4E2、1A2、7G3抗体表位抗体组配的诊断准确性及漏检率
阳性漏检率＝阳性漏检数/肿瘤患者数×100％
特异性＝阴性样本数/健康体检样本数×100％
有上表可见，2D5+4E2和7G3+4E2的组合的特异性优于1A2+2D5和1A2+7G3的组合。
7采用抗体组合方案2D5、4E2检测待测样本，评估试剂盒对临床样本的敏感性
待测样本：为通过临床诊断及其他商业试剂筛查已经确诊的癌症患者血清、正常人血清。
待测样本的收集：受检者均于早晨空腹抽静脉血3mL。分离血清，置于-20℃冰箱保存。
检测性能评估：
敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)
临床诊断敏感性：
说明本发明的抗体组合方式对临床肿瘤样本的检测具有良好的敏感性。
抗原表位51-87aa序列：
ERSQGRGGGGNRFPAHPHTQHHQQVGKLAEKTQRASC
抗原表位90-150aa序列：
QTHLSLEKTQRSKRSKVRGTWRKVGETKGKQKVGDHEKQRQEITGLQTWVQNGGGGHSTDG
广泛型线粒体肌酸激酶蛋白质序列：SEQ ID NO:1。
GLNSIRETREETHVVSGDLCLPVPVPHPVISPHPSPHFTFSSSTGTRNYGERSQGRGGGGNRFPAHPHTQHHQQVGKLAEKTQRASCEQQTHLSLEKTQRSKRSKVRGTWRKVGETKGKQKVGDHEKQRQEITGLQTWVQNGGGGHSTDGIRINISLVPPRESFLNFVRRAQRWQGSTLLLFLVLRKRPASGCLSQCLPLTLCFLHILLWYLCLFRGFPAAAPGRPKRWLGQAESRGKGQCHPCTPTGTDRVSATEGCGGRVLGSASPRGCCPPLGAEIWAATSPGREGATSPALDARVSGPANYLAGAAHPCPRAPSAVAGGKAGPGGAPPLETAAGASLSSARPPATSSLRLSCSLIGTGSHSGSSLQSDPHFGCSLGPSSGPRSIRLHPPSLFRILSCASAYSRIPPDLKPWLVPSPVCCPPARDSGSWLWPERGLPLGFCSDRNLYELPVNDGGCIPRGNSAGAGGGGGRRWERRCGKESGQQRRAIITKALELEGCAVCRPQWGGGGGQNHKARTFLGTCQDQLWPYEFLHWLPKSLIVKPGTILFAPLHLLPSFPQFLSLGFSPPPSVVLCHGRKELSRSEETELASQRQLELLGKHRLKSLKRLPRFTLFLIPPPPAEQSQTWPTGQLPGNCTRSRRLCPPS。
Claims (9)
1.一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含如下组分：
组分A：包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体；
组分B：标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体；
组分C：低浓度校准品溶液(浓度39.06ng/mL)和高浓度校准品溶液(浓度1250ng/mL)；
各组分均含有乙酰胺和防腐剂。
2.根据权利要求1所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述组分A中的磁性微球为以下任意一种：表面有环氧基、氨基、醛基、磺酰基、羧基、酰胺基、巯基或羟基修饰的磁性微球，工作浓度为1-10mg/mL；所述组分A中广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体的工作浓度为50-100ng/mL。
3.根据权利要求1所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述组分B中发光标志物为以下任意一种：鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶，工作浓度为100-200ng/mL；所述组分B中广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体的工作浓度为100-500ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述乙酰胺质量体积百分浓度为0.1-0.5％；所述防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、苯甲酸钠、Proclin系列、山梨酸钾中的任一种或两种以上混合物。
5.根据权利要求1所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述筛选到的抗体：1A2、1B1、2D5、3C6、4E2、5E6、6F6、7G3；所述所选抗原表位区域选自SEQID NO:1的1-50aa、51-87aa、90-150aa、120-186aa。
6.根据权利要求5所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述验证数据包括如下：
(1)选取特定的抗体对组合能够实现对广泛型线粒体肌酸激酶的检测；
针对50例待测样本，用化学发光试剂进行检测，比较发光强度差异，选取发光强度大于250000的；
(2)评价2D5、4E2、1A2、7G3抗体表位抗体组配的诊断准确性及漏检率；
抗体配对方案：2D5+4E2、7G3+4E2、1A2+2D5、1A2+7G3；
阳性漏检率＝阳性漏检数/肿瘤患者数×100％；
特异性＝阴性样本数/健康体检样本数×100％；
(3)采用抗体组合方案2D5、4E2检测待测样本，评估试剂盒对临床样本的敏感性；
待测样本：为通过临床诊断及其他商业试剂筛查已经确诊的癌症患者血清、正常人血清；
待测样本的收集：受检者均于早晨空腹抽静脉血3mL，分离血清，置于-20℃冰箱保存；
检测性能评估：敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)。
7.根据权利要求6所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述验证结果包括如下：
(1)2D5+4E2、7G3+4E2、1A2+2D5、1A2+7G3，可用于广泛型线粒体肌酸激酶的检测；
(2)2D5+4E2和7G3+4E2的组合的特异性优于1A2+2D5和1A2+7G3的组合；
(3)本发明的抗体组合方式对临床肿瘤样本的检测具有良好的敏感性。
8.根据权利要求7所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述2D5特异性识别SEQ ID NO:1的51-87aa，4E2特异性识别SEQ ID NO:1的90-150aa。
9.根据权利要求1所述的一种检测血液中线粒体肌酸激酶含量的试剂盒，其特征在于：所述包被磁性微球的广泛型线粒体肌酸激酶-2抗体为2D5；所述标志发光标志物的广泛型线粒体肌酸激酶-1抗体为4E2。
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