CN117761329A - 一种幽门螺杆菌抗体i或ii型检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫诊断技术领域，具体公开了一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒及其制备方法。本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒包括：磁性微球试剂、吖啶酯试剂、校准品1和校准品2；所述磁性微球试剂包括：包被有CagA抗原的磁性微球、包被有VacA抗原的磁性微球、包被有Urease抗原的磁性微球；所述吖啶酯试剂包含抗人IgG抗体与吖啶酯；本申请还提供了上述幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的制备方法。本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒结合了高灵敏度的化学发光测定技术和磁性微粒分离技术，具有检测灵敏度高、特异性强、线性范围宽、自动化程度高等优点。
Description
技术领域
本申请涉及免疫诊断技术领域，具体涉及一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性菌，菌体呈螺旋形弯曲状。幽门螺杆菌常生存于胃部及十二指肠的各区域内，它会引起胃黏膜轻微的慢性发炎，甚或导致胃及十二指肠溃疡与胃癌。可致癌的幽门螺杆菌主要含有两种细胞毒素：一种是细胞毒素相关蛋白CagA，一种是空泡细胞毒素VacA。根据是否表达CagA和VacA能够将幽门螺杆菌分为两种类型：I型和II型，I型为致病性较强的产毒菌株(CagA和VacA均表达，或表达其中一种)，II型为毒性较弱的不产毒菌株(CagA和VacA均不表达)。
目前，针对幽门螺杆菌检测的诊断方法从标本采集角度可以分为侵入性和非侵入性两大类。侵入性方法主要指必须通过胃镜取活检标本检查的方法，包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验、荧光PCR(TaqMan探针)等。非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断HP的方法，包括同位素示踪法、免疫学方法(抗原、抗体检测)等。检测方法虽然多种，但能够简单、快速得检测幽门螺杆菌分型的方法却少之又少。相关技术中利用荧光量子点微球制备出一种能够检测幽门螺杆菌分型的检测试纸卡，但是该方法的灵敏度偏低、检测效率低，检测范围窄。因此，本领域急需提供一种在保证检测灵敏度高、特异性强的同时，能够借助分析仪器实现检测过程全自动化的幽门螺杆菌抗体分型检测盒。
发明内容
为了提高幽门螺杆菌抗体分型检测的灵敏度与准确性，同时实现全自动化检测，本申请提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒及其制备方法。
第一方面，本申请提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，采用如下的技术方案：
一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：磁性微球试剂、吖啶酯试剂、校准品1和校准品2；
所述磁性微球试剂包括：包被有CagA抗原的磁性微球、包被有VacA抗原的磁性微球、包被有Urease抗原的磁性微球；
所述吖啶酯试剂包含抗人IgG抗体与吖啶酯。
本申请提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，该检测试剂盒采用了磁微粒均相反应技术和第四代吖啶酯直接化学发光技术，能够全自动定性检测人血清、血浆和全血样本中的多种幽门螺杆菌(HP)IgG抗体。与相关技术中的检测方法相比，本申请提供的试剂盒以磁性微球作为固相载体，由于磁性微球具有较小的体积及较大的表面积，因此反应面积较大，检测的灵敏度更高。此外，本提供的试剂盒中包含配套试剂(吖啶酯试剂与校准品)，并且该检测是由全自动仪器完成，因此检测过程中的人为因素影响较小，批内样本与批间样本检测结果的差异小，检测结果的稳定性与重复性好。
利用本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒对待测样本进行检测时，待测样本中含有的CagA抗体、VacA抗体和Urease抗体分别能够与包被有CagA抗原的磁性微球、包被有VacA抗原的磁性微球、包被有Urease抗原的磁性微球以及吖啶酯复合物进行免疫结合，形成磁珠-待测物质-吖啶酯复合物，通过检测上述复合物的相对发光强度，并与校准品1和校准品2确认的Cutoff(CO)进行比较，判断待测样本中CagA抗体、VacA抗体和Urease抗体的阴阳性，从而判断幽门螺杆菌IgG抗体分型。
本申请中，当CagA抗体、VacA抗体和Urease抗体结果均呈现阴性时，待测样品为幽门螺杆菌阴性；当CagA抗体、VacA抗体结果中至少一种呈现阳性时，则待测样品为I型幽门螺杆菌抗体阳性；当仅Urease抗体结果呈现阳性时，则待测样品为II型幽门螺杆菌抗体阳性；
本申请中，磁性微球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子通过加入适当的表面活性剂和高分子骨架材料制备而成；磁性微球的粒径为2.2μm。高分子骨架材料选自氨基酸聚合物、多糖和其他高温分子聚合物；其中，氨基酸聚合物如蛋白质、肽类和酶类等，多糖如阿拉伯胶、淀粉、右旋糖酐、琼脂糖等，其他高分子聚合物如聚丙烯、聚乙烯、硅酮等。
优选地，所述CagA抗原、VacA抗原与Urease抗原分别与磁性微球的重量比为1：(25-35)。
在一个具体的实施方案中，所述CagA抗原、VacA抗原与Urease抗原分别与磁性微球的重量比为1：30。
本申请中，所述吖啶酯可以为NSP-DMAE-NHS、NSP-DMAE-HEG-NHS、NSP-SA-NHS、Me-DMAE-NHS和NSP-SA中的一种或多种。
优选地，所述吖啶酯选自NSP-DMAE-NHS、NSP-DMAE-HEG-NHS和NSP-SA-NHS。
本申请中，通过实验探究发现，NSP-DMAE-NHS、NSP-DMAE-HEG-NHS和NSP-SA-NHS较其他化学发光标记物(Me-DMAE-NHS和NSP-S)，具有信噪比高，干扰因素少，发光效率高、强度大，易于蛋白交联等优点，因此利用上述吖啶酯标记获得的检测结果的准确度更高。
优选地，所述吖啶酯试剂中，所述吖啶酯与抗人IgG抗体的摩尔比为(10-20)：1。
进一步地，所述校准品2包括CagA抗体、VacA抗体及Urease抗体和蛋白保护液。蛋白保护液在校准品2中的质量浓度为5.5-7％。
本申请中，校准品2主要用于测定仪其内储存主曲线的校正，校准品2中添加有蛋白保护剂，蛋白保护剂能够提供良好的反应环境，使得抗体保持天然构象。本申请将校准品2中蛋白保护剂的浓度控制在上述范围内，能够降低校准品2的极性，为抗体提供长期稳定保存的疏水环境。
在一个具体的实施方案中，所述蛋白保护液在校准品2中的质量浓度为6.1％。
本申请中，所述蛋白保护液包括酪蛋白、海藻糖和防腐剂，所述防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠和抗生素。
进一步地，所述防腐剂为抗生素；所述蛋白保护剂中，所述酪蛋白、海藻糖和抗生素的重量比为1：(4-6)：(0.05-0.2)。
在一个具体的实施方案中，所述酪蛋白、海藻糖和庆大霉素的重量比为1：5：0.1。
进一步地，所述磁性微球试剂、吖啶酯试剂、校准品1中还包括：含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
可选地，所述抗生素为庆大霉素。
第二方面，本申请提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的制备方法；
一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的制备方法，包括制备吖啶酯试剂：向抗人IgG抗体中加入磷酸盐缓冲液，再加入吖啶酯，于20-28℃下反应10-20min；然后加入赖氨酸猝灭液，反应20-30min；用pH为7.2-7.5的10mM PBS透析，获得吖啶酯试剂。
进一步地，所述制备方法还包括制备包被抗原的磁性微球，具体为：将磁性微球与抗原混合，在20-28℃下静置30-100min；然后加入1.5-2.5％蔗糖封闭多余的位点，在20-28℃下反应20-30min，获得包被原的磁性微球。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，该检测试剂盒采用了磁微粒均相反应技术和第四代吖啶酯直接化学发光技术，能够对幽门螺杆菌的I型或II型的分型进行检测，减少了人为与环境因素的影响，检测的灵敏度、精密度与准确性高，为幽门螺杆菌的诊断治疗提供重要的指导意义。
2.本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒以磁性微球作为固相载体，由于磁性微球具有较小的体积及较大的表面积，因此反应面积较大，检测的灵敏度更高。此外，由于本申请试剂盒的检测是由全自动仪器完成，因此检测更加简单、方便、快捷，可以批量化进行，批内样本与批间样本检测结果的差异小，检测结果的稳定性与重复性好。
具体实施方式
本申请提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，上述检测试剂盒包括CagA试剂、CagA校准品、VacA试剂、VacA校准品、Urease试剂、Urease校准品；具体如下：CagA试剂由R1-CagA、R2、R3组成；R1-CagA为包被有CagA抗原的磁性微球和磁性微球保护液；R2为吖啶酯试剂；R3为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
CagA校准品包含校准品1和校准品2-CagA；校准品1为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品2-CagA中含有30AU/mL CagA抗体、1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％防腐剂。
VacA试剂中由R1-VacA、R2、R3组成；R1-VacA为包被有VacA抗原的磁性微球和磁性微球保护液；R2为吖啶酯试剂；R3为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
VacA校准品包含校准品1和校准品2-VacA；校准品1为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品2-VacA中含有30AU/mL VacA抗体、1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％防腐剂。
Urease试剂由R1-Urease、R2、R3组成；R1-Urease为包被有Urease抗原的磁性微球和磁性微球保护液；R2为吖啶酯试剂；R3为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
Urease校准品包含校准品1和校准品2-Urease；校准品1为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品2-Urease中含有30AU/mL Urease抗体、1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％防腐剂。
上述试剂盒中，各试剂的制备方法如下：
(1)R1-CagA、R1-VacA和R1-Urease的制备：将磁性微球分别与CagA抗原、VacA抗原和Urease抗原混合，在20-28℃下静置30-100min；然后加入1.5-2.5％蔗糖封闭多余的位点，在20-28℃下反应20-30min；洗涤后用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行保存，分别获得包被有CagA抗原的磁性微球R1-CagA、包被有VacA抗原的磁性微球R1-VacA、包被有Urease抗原的磁性微球R1-Urease；
(2)吖啶酯试剂：将吖啶酯用DMSO进行溶解，获得浓度为10μg/μL的母液；向抗人IgG抗体中加入pH为8.0的磷酸盐缓冲液，再加入吖啶酯，于20-28℃下反应10-20min；然后加入赖氨酸淬灭液，反应20-30min；用pH为7.2-7.5的10mM PBS透析，获得标记有吖啶酯的抗人IgG抗体，然后用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释，获得吖啶酯试剂；
其中，吖啶酯可以为NSP-DMAE-NHS、NSP-DMAE-HEG-NHS、NSP-SA-NHS、Me-DMAE-NHS和NSP-SA中的一种或多种，吖啶酯与抗人IgG抗体的摩尔比为(10-20)：1。
(3)校准品2-CagA、校准品2-VacA和校准品2-Urease的制备：用蛋白保护液分别稀释细胞毒抗体、空泡毒抗体及尿毒酶抗体，使浓度均为30AU/mL；分别获得校准品2-CagA、校准品2-VacA和校准品2-Urease；
其中，蛋白保护液中含有1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％庆大霉素。
本申请中，与本申请幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒配套使用的化学发光免疫分析仪可以为Wan200+全自动化学发光免疫分析仪(厦门优迈科医学仪器有限公司)，Shine i1910、Shine i2910全自动化学发光免疫分析仪(深圳迎凯生物公司科技有限公司)，H2000、H2100全自动化学发光免疫分析仪(深圳市希莱恒医用电子有限公司)；磁性微球购自北京博尔迈生物技术有限公司；VacA、CagA的抗原和抗体购自菲鹏生物股份有限公司，VacA抗原为菲鹏HP-Ag6，批号为20171216；CagA抗原为菲鹏HP-Ag9，批号为20210304；Urease抗原和抗体购自厦门万科隆生物科技有限公司，Urease抗原的批号为20200816；抗人IgG抗体购自厦门市波生生物技术有限公司；吖啶酯购自赫利森(厦门)生物科技有限公司；血样从南方医科大学获得；酪蛋白购自默克，CAS号为9000-71-9；海藻糖购自默克，CAS号为6138-23-4；庆大霉素购自默克，CAS号为1405-41-0。
本申请的其余原料、试剂、溶剂等也均可通过商购获得。
以下结合实施例、性能检测试验对本申请作进一步详细说明。
实施例1
实施例1提供一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，上述检测试剂盒包括CagA试剂、CagA校准品、VacA试剂、VacA校准品、Urease试剂、Urease校准品；具体如下：CagA试剂由R1-CagA、R2、R3组成；R1-CagA为包被有CagA抗原的磁性微球和包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；R2为吖啶酯试剂，吖啶酯试剂由NSP-SA-NHS标记的抗人IgG抗体(NSP-SA-NHS与抗人IgG抗体的摩尔比为15：1)和包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液组成；R3为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
CagA校准品包含校准品1和校准品2-CagA；校准品1为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品2-CagA中含有30AU/mL细胞毒抗体、1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％防腐剂。
VacA试剂中由R1-VacA、R2、R3组成；R1-VacA为包被有VacA抗原的磁性微球和包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；R2为吖啶酯试剂，吖啶酯试剂由NSP-SA-NHS标记的抗人IgG抗体(NSP-SA-NHS与抗人IgG抗体的摩尔比为15：1)和包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液组成；R3为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
VacA校准品包含校准品1和校准品2-VacA；校准品1为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品2-VacA中含有30AU/mL空泡毒抗体、1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％防腐剂。
Urease试剂由R1-Urease、R2、R3组成；R1-Urease为包被有Urease抗原的磁性微球和1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；R2为吖啶酯试剂，吖啶酯试剂由NSP-SA-NHS标记的抗人IgG抗体(NSP-SA-NHS与抗人IgG抗体的摩尔比为15：1)和1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液组成；R3为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
Urease校准品包含校准品1和校准品2-Urease；校准品1为包含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；校准品2-Urease中含有30AU/mL尿毒酶抗体、1％酪蛋白、5％海藻糖和0.1％防腐剂。
灵敏度
采用灵敏度参考品对幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的灵敏度进行检测。
(1)首先配制灵敏度检测液：将幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体阳性血样用20％NBS稀释100倍，获得Urease抗体灵敏度参考品；然后将Urease抗体灵敏度参考品按照1：3、1：9、1：27的比例稀释，获得不同稀释比例的Urease抗体灵敏度检测液；同法配制CagA抗体灵敏度检测液和VacA抗体灵敏度检测液。
(2)采用实施例1提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒对上述抗体灵敏度检测液进行检测，结果如下表1所示。
表1三种抗体灵敏度稀释液的灵敏度检测结果
注：初检结果(S/CO)＜1.0，即为阴性，初检结果(S/CO)≥1.0，即为阳性。
根据表1的检测结果可知，稀释度为1：3、1：9的参考品检测为阳性，稀释度为1：27的参考品检测为阴性。因此，说明利用本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的对尿素酶Urease抗体、细胞毒CagA抗体和空泡毒VacA抗体进行检测。
阴性及阳性符合率
利用实施例1提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒对以下参考品进行检测，结果如下表2所示。
Urease抗体阳性参考品(P1-P3)：将幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体阳性血样用20％NBS稀释10倍，获得Urease抗体阳性参考品P1；将幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体阳性血样用20％NBS稀释100倍，获得Urease抗体阳性参考品P2；将幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体阳性血样用20％NBS稀释1000倍，获得Urease抗体阳性参考品P3；
CagA抗体阳性参考品(P4-P6)：将细胞毒CagA抗体阳性血样用20％NBS稀释100倍；平行配制3份，获得CagA抗体阳性参考品P4-P6。
VacA抗体阳性参考品(P7-P9)：将空泡毒VacA抗体阳性血样用20％NBS稀释100倍，获得VacA抗体阳性参考品P7；将空泡毒VacA抗体阳性血样用20％NBS稀释500倍，获得VacA抗体阳性参考品P8；将空泡毒VacA抗体阳性血样用20％NBS稀释1000倍，获得VacA抗体阳性参考品P9；
阴性参考品(N1-N3)：将阴性血样用20％NBS稀释100倍；平行配制3份，获得阴性参考品N1-N3。
表2阴性及阳性符合率检测结果
根据表2的检测结果可知，检测3份Urease抗体阳性参考品(P1-P3)，Urease抗体结果全部为阳性；检测3份CagA抗体阳性参考品(P4-P6)，Urease抗体和CagA抗体结果全部为阳性；检测3份VacA抗体阳性参考品(P7-P9)，Urease抗体和VacA抗体结果全部为阳性。因此，说明本申请实施例1提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒能够准确检测判断Urease抗体、CagA抗体及VacA抗体的阴阳性，该试剂盒能够实现幽门螺杆菌抗体I或II型的分型检测。
重复性
利用实施例1提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒对重复性参考品进行检测，重复性检测结果如下表3所示。
(1)配制重复性参考品：将阳性血样用20％NBS稀释100倍，获得重复性参考品，平行制备10份。
上述阳性血样中，幽门螺杆菌尿素酶Urease抗体、细胞毒CagA抗体和细胞毒VacA抗体均呈现阳性。
(2)检测方法：对重复性参考品样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值和标准差SD，并计算变异系数CV，计算公式如下：
CV＝SD/M×100％
式中：CV—变异系数；M—10次测量结果的平均值；SD—10次测量结果的标准差。
表3重复性检测结果
根据上述结果可知，各CagA抗体、VacA抗体和Urease抗体结果均为阳性，并且CV≤10.0％，SD＜0.3。因此，说明本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的重复性好。
批间差按照实施例1的方法制备3个批次的试剂盒，然后利用这3个批号的试剂盒对重复性参考品分别进行重复性测试，并计算变异系数CV与标准差SD。批间差检测结果如表4所示。
表4批间差检测结果
根据表4的检测结果可知，利用3个批次的试剂盒分别进行重复性测试，测得的变异系数CV均≤15.0％，且CagA抗体、VacA抗体和Urease抗体结果均为阳性。因此，说明本申请提供的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒能够准确检测不同分型的幽门螺杆菌抗体，并且各试剂盒的批间差异小。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：磁性微球试剂、吖啶酯试剂、校准品1和校准品2；
所述磁性微球试剂包括：包被有CagA抗原的磁性微球、包被有VacA抗原的磁性微球、包被有Urease抗原的磁性微球；
所述吖啶酯试剂包含抗人IgG抗体与吖啶酯。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯选自NSP-DMAE-NHS、NSP-DMAE-HEG-NHS、NSP-SA-NHS、Me-DMAE-NHS和NSP-SA中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述吖啶酯试剂中，所述吖啶酯与抗人IgG抗体的摩尔比为（10-20）：1。
4.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述校准品2包括CagA抗体、VacA抗体及Urease抗体和蛋白保护液。
5.根据权利要求4所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述蛋白保护液包括酪蛋白、海藻糖和防腐剂；所述防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠和抗生素。
6.根据权利要求5所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为抗生素；所述蛋白保护剂中，所述酪蛋白、海藻糖和抗生素的重量比为1：（4-6）：（0.05-0.2）。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒，其特征在于，所述磁性微球试剂、吖啶酯试剂、校准品1中还包括：含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液。
8.如权利要求1-7中任一项所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括制备吖啶酯试剂：向抗人IgG抗体中加入磷酸盐缓冲液，再加入吖啶酯，于20-28℃下反应10-20min；然后加入赖氨酸猝灭液，反应20-30min；用pH为7.2-7.5的10mMPBS透析，获得吖啶酯试剂。
9.根据权利要求8所述的幽门螺杆菌抗体I或II型检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备包被抗原的磁性微球，具体为：将磁性微球与抗原混合，在20-28℃下静置30-100min；然后加入1.5-2.5%蔗糖封闭多余的位点，在20-28℃下反应20-30min，获得包被原的磁性微球。
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