KR100924625B1 - 측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 측정 시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은, 면역 혈청학적 검사에 있어서 넓은 농도 범위의 생체 시료를 측정할 수가 있고, 장기간 안정적으로 보존할 수가 있는 측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 그것을 사용한 측정 시약을 제공하는 것이다.
본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는, 표면의 술폰산기량이 0.005 내지 0.7 μmol/㎡, 평균 입경이 0.01 내지 1.5 ㎛인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다.
면역 혈청학적 검사, 생체 시료, 안정성, 측정 시약용 담체 입자 라텍스, 측정 시약, 페닐기, 술폰산염, 중합성 단량체, 술폰산기량

Description

측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 측정 시약 {Carrier Particle Latex for Assay Reagent and Assay Reagent}
본 발명은 면역 혈청학적 검사에 있어서 넓은 농도 범위의 생체 시료를 측정할 수가 있고, 장기간 안정적으로 보존할 수가 있는 측정 시약용 담체 입자 라텍스, 및 그것을 사용한 측정 시약에 관한 것이다.
임상 검사의 분야에서는, 생체 시료 (혈액, 뇨 등)를 사용하여 각종 질환의 진단을 행하고 있지만, 이들을 진단하는 방법으로서 각종 측정법이 개발되어 이용되고 있다. 이들 측정법의 대표적 방법으로서, 효소 반응을 이용하는 생화학 측정 방법이나 항원 항체 반응을 이용하는 면역 측정 방법을 들 수 있다. 이러한 진단에 사용하는 시약으로서는, 예를 들면 임신 진단 테스트, 류마티스 인자를 검출하는 RA 테스트, C-반응성 단백질을 검출하는 CRP 테스트, B형 간염 표면 항원 (HBs 항원), 항HBs 항체, β2 미크로글로블린 항체, 마이코플라즈마 항원, 핵산, 핵 단백질, 에스트로겐, 항에스트로겐 항체 등을 위한 것이 개발되어 있다.
이러한 측정법으로서는, 예를 들면 면역비탁법 (TIA법), 라텍스 비탁법 (LIA 법), 효소 면역 측정법 (EIA법), 방사 면역 측정법 (RIA법) 등을 들 수 있고, 목적 에 따라 구별하여 사용되고 있다.
그 중에서도 LIA법은, 담체 입자를 수성 분산액으로 분산시킨 라텍스의 담체 입자에 항원 또는 항체를 감작시켜, 이것을 사용하여 혈청 중의 대응하는 항체 또는 항원과의 반응을 담체 입자의 응집 반응으로서 검출하는 것이고, 그 간편성과 신속성 때문에 많은 종류의 항원 또는 항체의 검출에 응용되고 있다.
최근, 의료 현장에서는 종래 행해져 온 질병의 진단으로부터 질병의 예방으로 방향을 전환시키고 있다. 즉, 질병으로서 발병하기 이전에 혈액 등의 검사를 행함으로써 질병의 경향을 조기에 발견하고, 예방하려 하는 것이다. 이러한 예방 의료로의 응용을 위해서는 LIA법 등에 대해서도 보다 고감도의 측정이 가능한 것이 요구되고 있다. 원래, 항원 항체 반응 등의 면역 혈청학적 검사는 미량 물질의 평가를 행하는 것이었지만, 예방 의료에 사용하기 위한 측정 시약은 종래의 것 보다 더욱 저농도의 질병에 기인하는 미량 단백질 (항원ㆍ항체)을 검출할 수 있는 것이어야 하고, 이 때문에 측정 시약으로서는 현재 사용되어 있는 것 보다 더욱 고감도의 것이 필수가 되고 있다.
이러한 문제점으로부터, 면역 검사에 사용되는 면역 자동 분석 측정 기기에 있어서도, 소량 검체ㆍ소량 시약에 의한 측정을 행하기 위한 기기류의 개량이 진행되고, 이에 따라, 상기 기기류에 사용하기 위한 측정 시약도 보다 고감도인 성능이 요구되고 있다.
이러한 측정 시약의 감도를 올리는 방법으로서는, 예를 들면 사용되는 담체 입자의 입경을 크게함으로써 광학적 변화량을 크게 하고, 피측정 물질을 보다 감도 있게 측정하는 방법이 시도되고 있다. 일본 특허 공고 소 58-50645호 공보에는 스티렌과 이 스티렌에 대하여 10 중량％ 이하의 스티렌 술폰산염을 유화제의 부재하에서 과황산염을 중합 개시제로서 수 중에서 공중합시키고 이어서 알칼리성의 조건하에서 가열하는 것을 특징으로 하는 라텍스의 제조 방법이 개시되어 있고, 스티렌 단량체에 대한 촉매량을 증가함으로써 0.3 내지 0.8 ㎛의 입경의 담체 입자로 이루어지는 라텍스가 얻어진다고 되어 있다. 또한, 일본 특허 공고 평 1-36484호 공보에는 원자가가 2가인 금속의 산화물 또는 수산화물을 함유하는 수용액 중에서 라텍스를 합성하고 진단약을 제조하는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 입경이 큰 담체 입자를 포함하는 라텍스를 사용하는 방법으로서는 피측정 물질이 고농도인 경우에는, 담체 입자의 응집에 의한 광학적 변화량이 측정 가능 영역을 넘어 피측정 물질의 양에 따른 광학적 변화량이 얻어지지 않고, 또한 비특이 응집 반응을 나타내는 확률이 높다는 문제점이 있고, 또한 안정성이 부족하고 장기 보존을 할 수 없다는 하는 문제가 있었다.
이에 대하여, 일본 특허 공개 소 63-65369호 공보에는, 평균 입경이 상이한 2종류 또는 3종류 이상의 담체 입자를 포함하는 라텍스에 각각 항체 또는 항원을 감작하고, 일정한 비율로 혼합한 라텍스 시약을 사용하는 방법이 개시되어 있다. 이것은 입경이 작은 담체 입자를 포함하는 라텍스의 측정 범위의 넓이와, 입경이 큰 담체 입자를 포함하는 라텍스의 저농도 영역에서의 고감도라는 2 개의 특징을 더불어 가진 성능을 실현하고자 하는 것이다.
또한, 일본 특허 공고 소 63-14783호 공보에는 적어도 2 개의 상이한 양의 동일 항원 또는 항체가 부하된 2종의 상이한 입경 범위의 담체 입자를 포함하는 라텍스가 개시되어 있다.
또한, 일본 특허 제2588174호에는, 평균 입경이 상이한 2종류 이상의 입자에 항체또는 항원을 감작하여 혼합한 라텍스 또는 평균 입경이 상이한 2종류 이상의 담체 입자를 혼합한 후, 항체 또는 항원을 감작하여 얻은 라텍스와, 감작한 항체에 대한 항원 또는 감작한 항원에 대한 항체를 수 용매 중에서 반응시켜, 빛을 조사하여 그 흡광도 변화를 측정하여 항원 항체 반응을 측정하는 방법에 있어서, 평균 입경이 0.05 내지 0.3 ㎛의 범위에 있는 담체 입자와 평균 입경이 0.3 내지 1.O ㎛의 범위에 있는 담체 입자를 혼합하는 것, 및 혼합한 입자의 평균 입경의 적어도 2.5 배이고, 또한 0.6 내지 2.4 ㎛의 파장의 빛을 조사하는 것을 특징으로 하는 항원 항체반응을 사용한 측정법이 개시되어 있다.
또한, 일본 특허 공개 평 5-18973호 공보에는, 면역학적 반응에 의해 측정하고자 하는 성분의 양에 따라서, 측정하고자 하는 성분과 반응하는 성분을 불용화한 입경이 O.1 ㎛ 이하의 담체 입자와, 측정하고자 하는 성분과 반응하는 성분, 반응하는 성분을 불용화한 입경이 O.1 ㎛보다도 큰 담체 입자의 1종 이상을 조합하고, 측정하고자 하는 성분을 포함하는 검체와 반응시키는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정 방법 및 이 측정 방법에 사용하는 시약이 개시되어 있다.
그러나, 이러한 평균 입경이 상이한 복수 종류의 담체 입자를 포함하는 라텍스를 사용하는 방법은 라텍스 시약의 제조가 곤란하고, 동일 시약 제조자가, 동일 평균 입경, CV값의 입자를 사용하여 정해진 시약 프로토콜에 따라서 시약 제조를 행하여도 제조할 때 마다 성능이 상이한 시약 밖에 얻어지지 않는다는 문제점이 있었다.
본 발명의 목적은, 면역 혈청학적 검사에 있어서 넓은 농도 범위의 생체 시료를 측정할 수가 있고, 장기간 안정적으로 보존할 수 있는 측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 그것을 사용한 측정 시약을 제공하는 것이다.
제1의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체와의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 O.O05 내지 O.7 μmol/㎡, 평균 입경이 O.01 내지 1.5 ㎛인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다.
제2의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 상이한 2종류 이상의 입자를 포함하는 것인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다. 제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 O.O05 내지 0.7 μmol/㎡인 것이 바람직하다. 제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서는, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 O.OO5 μmol/㎡ 이상 O.12 μmol/㎡ 미만인 담체 입자 (A)와, 표면의 술폰산기량이 0.12 μmol/㎡ 이상 0.7 μmol/㎡ 이하인 담체 입자 (B)를 포함하는 것이 바람직하고, 담체 입자 (A)와 담체 입자 (B)의 함유 비율은, 중량비로 담체 입자 (A)/담체 입자 (B)=1/10 내지 10/1인 것이 바람직하다.
제3의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 상기 담체 입자는 평균 입경이 0.04 내지 0.1 ㎛, 입경의 CV값이 8 내지 20 ％인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다. 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서는, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 0.OO5 내지 O.7 μmol/㎡인 것이 바람직하다.
제1, 제2 또는 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는 유화제를 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 제1, 제2 또는 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서는, 페닐기를 갖는 중합성 단량체가 스티렌이고, 또한 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체가 스티렌 술폰산염인 것이 바람직하다.
제4의 본 발명은, 제1, 제2 또는 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 담체 입자에 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지되어 이루어지는 측정 시약이다.
<발명의 상세한 설명>
이하에 본 발명을 상술한다.
제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체와의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 것이다.
상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체로서는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 스티렌, 디비닐벤젠, 에틸스티렌, α-메틸스티렌, p-메틸스티렌, p-클로로스티렌, 클로로메틸스티렌 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 이용될 수 있고, 2종 이상이 병용될 수 있다. 그 중에서도 스티렌이 바람직하게 사용된다.
상기 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체로서는 중합 후의 담체 입자 표면에 술폰산기를 함유시킬 수 있는 단량체이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 스티렌 술폰산염, 디비닐벤젠 술폰산염, 에틸스티렌 술폰산염, α-메틸 술폰산염 등을 들 수 있다. 또한, 이 경우의 염으로서는 특별히 한정되지 않으며, 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 이용될 수 있고, 2종 이상이 병용될 수 있다. 그 중에서도 스티렌 술폰산염이 바람직하고, 스티렌술폰산나트륨이 보다 바람직하게 사용된다.
상기 담체 입자는, 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 상기 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체를 공중합시킴으로써 얻어진다. 상기 공중합의 방법으로서는 종래 공지된 방법을 사용할 수 있고, 예를 들면 용매로서 물이 넣어진 반응 용기 내에 상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체, 상기 페닐기와 술폰산염을 갖는 중합성 단량체, 중합 개시제 및 필요에 따라서 유화제를 첨가하고, 질소 분위기하에서 교반하는 방법 등을 들 수 있다. 이 경우, 중합 온도로서는 50 내지 100 ℃가 바람직하고, 보다 바람직하게는 60 내지 85 ℃이다. 또한, 중합 시간으로서는 중합성 단량체의 조성, 농도 및 중합 개시제 등의 조건에 따라서도 다르지만, 통상 5 내지 50 시간이다.
상기 중합 개시제로서는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 과황산염류 등을 들 수 있다. 상기 과황산염류로서는, 예를 들면 과황산칼륨, 과황산나트륨, 과황산암모늄 등이 바람직하다. 상기 중합 개시제의 사용량으로서는 특별히 한정되지 않지만, 통상은 중합성 단량체량에 대하여 O.01 내지 1 중량％의 범위이다.
상기 유화제는, 제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 유화제가 포함되면 측정 정밀도를 저해하는 등의 문제점이 있기 때문에, 통상은 사용하지 않는 것이 바람직하지만, 상기 담체 입자 표면의 술폰산기량의 조정에 필요한 경우 등 필요에 따라서 사용한다. 다만, 중합 후의 후처리 공정에 의해 제거하는 것을 고려하면, 페닐기를 갖는 중합성 단량체에 대하여 바람직하게는 1 중량％ 이하, 보다 바람직하게는 0.5 중량％ 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 0.02 중량％ 사용한다.
상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체에 대한 상기 페닐기와 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 배합량으로서는 입자 표면의 술폰산기량이 O.005 내지 0.7 μmol/㎡의 범위가 되도록 하기 위해서 2 중량％ 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 1.5 중량％, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 1.2 중량％이다. 이 비율로 양자를 공중합함으로써 상기 담체 입자 표면의 술폰산기량을 0.OO5 내지 O.7 μmol/㎡로 조정할 수가 있다.
또한, 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 용도에 따라서는, 상기 공중합 시에 중합성 불포화 단량체를 또한 첨가할 수도 있다. 상기 중합성 불포화 단량체로서는 통상의 라디칼 중합에 사용 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 (메트)아크릴산, (메트)아크릴산에스테르, 스티렌 유도체, (메트)아크릴로니트릴, (메트)아크릴산아미드, 할로겐화 비닐, 비닐에스테르, (메트)아크롤레인, 말레산 유도체, 푸마르산 유도체 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, (메트)아크릴산이란 아크릴산 또는 메타크릴산을 의미한다.
상기 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 0.OO5 내지 O.7 μmol/㎡이다. 본 발명자들은 담체 입자 표면의 술폰산기량이 상기 범위에 있는 것에 의해 측정 감도가 비약적으로 향상되고, 측정 대상인 미량 단백질 농도가 저농도 영역에서 고농도 영역까지 광범위에 걸쳐 측정 가능한 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 상기 담체 입자 표면의 술폰산기량이 0.005 ㎛ol/㎡ 미만이면 비특이 응집을 일으키기 쉽고, O.7 μmol/㎡를 초과하면 응집 반응성이 저하되어 감도가 둔해진다. 바람직하게는 0.02 내지 0.5 μmol/㎡이다. 또한, 상기 담체 입자 표면의 술폰산기량은 전기 전도도 적정법 (Journal of Colloid and Interface Sciences. 49 (3) 425, 1974)에 의해 구할 수 있다.
상기 담체 입자의 평균 입경은 0.01 내지 1.5 ㎛이다. 0.01 ㎛ 미만이면 응집에 의한 광학적 변화량이 지나치게 작아 측정에 필요한 감도가 얻어지지 않고, 또한 시약 제조시의 원심 분리 시에 많은 시간이 걸려 시약 비용이 높아진다. 1.5 ㎛을 초과하면 피측정 물질이 고농도일 때 담체 입자의 응집에 의한 광학적 변화량이 측정 가능 영역을 초과하여 피측정 물질의 양에 따른 광학적 변화량이 얻어지지 않는다. 측정 시약용 담체 입자 라텍스를 사용하는 측정 방법, 측정 기기에 따라서 다르지만, 바람직하게는 0.03 내지 0.8 ㎛, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.5 ㎛ 이다.
상기 담체 입자의 입경의 변동 계수 (CV값)는 10 ％ 이하인 것이 바람직하다. 10 ％를 초과하면 시약 제조시의 로트(lots) 재현성이 나쁘고, 측정 시약의 재현성이 저하되는 경우가 있다. 보다 바람직하게는 5 ％ 이하이고, 더욱 바람직하게는 3 ％ 이하이다. 또한 상기 입경의 변동 계수는 하기 화학식에 의해 산출할 수가 있다.
입경의 변동 계수 (CV값)=입경의 표준 편차/평균 입경
제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는, 상기 담체 입자를 물 또는 수계 용매에 현탁시킴으로써 얻어진다. 제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 있어서의 담체 입자 농도로서는 특별히 한정되지 않지만, 통상은 1 내지 20 중량％인 것이 바람직하다. 1 중량％ 미만이면 시약 제조시에 농축할 필요가 있고, 20 중량％를 초과하면 응집되어 버리는 경우가 있다.
제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는 측정 정밀도를 저해하는 등의 문제점이 있기 때문에 유화제를 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 여기서 실질적이란 담체 입자의 제조 시에 유화제를 사용한 경우에, 그 제거 공정을 거친 후에도 흔적 정도로 잔류하는 유화제의 존재는 상관없다는 의미이다.
제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는 담체 입자 표면의 술폰산기량이 상기 범위에 있음으로써 측정 감도가 비약적으로 향상되고, 측정 대상인 미량 단백질 농도가 저농도 영역에서 고농도 영역까지 광범위하게 걸쳐 있는 경우에도 측정이 가능하다. 또한, 장기 안정성이 우수하기 때문에 특히 광학계 측정 장 치에 최적이다. 또한, 종래와 같이 침강 방지를 위해 액 비중을 올리기 위한 당류 등을 첨가할 필요도 없다.
제2의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체와의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 상이한 2종류 이상의 입자를 포함하는 것으로, 유화제를 실질적으로 함유하지 않는 것인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다.
상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체에 대해서는 제1의 본 발명의 경우와 동일하다.
제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서는, 표면의 술폰산기량이 상이한 2종류 이상의 입자를 포함하는 담체 입자를 사용한다. 담체 입자 표면의 술폰산기량이 상이한 2종류 이상의 담체 입자를 사용함으로써 얻어지는 측정 시약용 담체 입자 라텍스는 저농도로부터 고농도까지의 넓은 농도 범위에 걸쳐 고감도, 또한 고정밀도로 항원 항체 반응을 측정할 수 있고, 장기 안정성도 우수한 측정 시약, 특히 분광 광도계, 탁도계, 광 산란 측정 장치 등의 광학적 측정 장치용으로서 바람직한 측정 시약을 얻기에 적합한 것이 된다.
제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자 표면의 술폰산기량은 O.005 내지 O.7 μmol/㎡인 것이 바람직하다. 0.0O5 μmol/㎡ 미만이면 비특이 응집을 일으키기 쉽고, O.7 μmol/㎡를 초과하면 응집 반응성이 저하되어 감도가 둔해지는 경우가 있다. 바람직하게는 O.O2 내지 0.5 μmol/㎡이다.
제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자는, 표면의 술폰산기량이 O.OO5 μmol/㎡ 이상 O.12 ㎛ol/㎡ 미만인 담체 입자 (A)와, 표면의 술폰산기량이 0.12 μmol/㎡ 이상 0.7 μmol/㎡ 이하인 담체 입자 (B)를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 담체 입자 (A)와 담체 입자 (B)를 혼합하여 사용함으로써, 얻어지는 측정 시약용 담체 입자 라텍스는, 또한 저농도로부터 고농도까지의 매우 넓은 농도 범위에 걸쳐 고감도, 또한 고정밀도로 항원 항체 반응을 측정할 수 있고, 장기 안정성도 더욱 향상된다.
상기 담체 입자 (A) 표면의 술폰산기량이 0.005 μmol/㎡ 미만이면 얻어지는 측정 시약용 담체 입자 라텍스나 최종적으로 얻어지는 측정 시약의 장기 안정성이 저하되어 측정 시약이 비특이 응집 반응을 일으키기 쉬워지고, O.12 μmol/㎡ 이상이면 저농도 영역에서의 측정이 곤란해지는 경우가 있다. 또한, 상기 담체 입자 (B) 표면의 술폰산기량이 0.12 μmol/㎡ 미만이면 고농도 영역에서의 측정이 곤란해지는 경우가 있고, O.7 μmol/㎡를 초과하면 최종적으로 얻어지는 측정 시약의 면역 혈청학적 응집 반응성이 저하되고 측정 감도나 측정 정밀도가 불충분해지는 경우가 있다.
상기 담체 입자 (A)와 담체 입자 (B)와의 함유 비율은, 중량비로 담체 입자 (A)/담체 입자 (B)=1/10 내지 10/1인 것이 바람직하다. 이 범위 밖이면, 상술한 우수한 성능을 겸비하는 측정 시약을 얻기에 적합한 측정 시약용 담체 입자 라텍스가 얻어지지 않는 경우가 있다.
제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자의 평균 입경은 0.01 내지 1.5 ㎛인 것이 바람직하다. 0.01 ㎛ 미만이면 응집에 의한 광학적 변화량이 지나치게 작아 측정에 필요한 감도가 얻어지지 않을 경우가 있고, 또한, 시약 제조시의 원심 분리 시에 많은 시간이 걸려 시약 비용이 높아진다. 1.5 ㎛를 초과하면, 피측정 물질이 많을 때 입자의 응집에 의한 광학적 변화량이 측정 가능 영역을 넘어버리고 고농도 영역에서는 피측정 물질의 양에 따른 광학적 변화량이 얻어지지 않는 경우가 있다. 보다 바람직하게는 0.03 내지 0.8 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.5 ㎛이다. 또한, 제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자의 입경의 변동 계수 (CV값)는 10 ％ 이하인 것이 바람직하다. 10 ％를 초과하면 시약 제조시의 로트 재현성이 나쁘고, 측정 시약의 재현성이 저하되는 경우가 있다. 보다 바람직하게는 5 ％ 이하이고, 더욱 바람직하게는 3 ％ 이하이다. 또한 담체 입자 (A)와 담체 입자 (B)의 입자경은 동일 또는 상이할 수 있다.
제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자의 제조 방법 및 제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 제조 방법에 대해서는 제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 경우와 동일하다.
제2의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는, 표면의 술폰산기량이 상이한 2종류 이상의 입자를 포함하는 담체 입자를 사용함으로써, 저농도로부터 고농도까지의 넓은 농도 범위에 걸쳐 고감도, 또한 고정밀도로 항원 항체 반응을 측정할 수 있고, 장기 안정성도 우수한 측정 시약, 특히 분광 광도계, 탁도계, 광 산란 측정 장치 등의 광학적 측정 장치용으로서 바람직한 측정 시약을 얻는데 적합한 것이 된다.
제3의 본 발명은, 페닐기를 갖는 중합성 단량체와, 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체의 공중합체를 포함하는 담체 입자에 의해 구성되는 측정 시약용 담체 입자 라텍스로서, 담체 입자는 평균 입경이 0.04 내지 0.1 ㎛, 입경의 CV값이 8 내지 20 ％이고, 유화제를 실질적으로 함유하지 않는 것인 측정 시약용 담체 입자 라텍스이다.
상기 페닐기를 갖는 중합성 단량체 및 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체에 대해서는 제1의 본 발명의 경우와 동일하다.
제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자는 평균 입경이 0.04 내지 0.1 ㎛, 입경의 CV값이 8 내지 20 ％이다. 이러한 평균 입자 입경 및 입경의 CV값의 폭을 일정한 범위로 조정한 담체 입자를 사용함으로써, 넓은 농도 범위에 걸쳐 항원 항체 반응의 측정이 가능하고, 또한 시약 제조 후의 장기 안정성도 우수하고, 특히 광학적 측정 장치에 적용할 수 있는 면역 혈청학적 검사 시약용으로서 유용한 것이 된다. 평균 입경이 0.04 ㎛ 미만이면 시약 제조에 장시간을 요하고, O.1 ㎛를 초과하면 백 그라운드가 높아지기 때문에 저농도 영역에서의 측정 정밀도가 저하된다. 바람직하게는 0.05 내지 0.095 ㎛이다. 또한, 입경의 CV값이 8 ％ 미만이면 저농도 영역에서 고농도 영역까지 광범위한 측정이 불가능하고, 20 ％를 초과하면 원심 분리 후 및 시약 제조시의 입자 회수가 곤란해진다. 바람직하게는 10 내지 16 ％이다.
제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자 표면의 술폰산기량은 0.005 내지 O.7 μmol/㎡인 것이 바람직하다. 0.O05 μmol/㎡ 미만이면 비특이 응집을 일으키기 쉽고, O.7 μmol/㎡를 초과하면 응집 반응성이 저하되어 감도가 둔해지는 경우가 있다. 바람직하게는 O.02 내지 0.5 μmol/㎡이다.
제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스에 사용하는 담체 입자의 제조 방법 및 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 제조 방법에 대해서는 제1의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 경우와 동일하다.
제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스는, 평균 입경 및 입경의 CV값의 폭을 일정한 범위로 조정한 담체 입자를 사용함으로써, 넓은 농도 범위에 걸쳐 항원 항체 반응을 측정할 수 있고, 또한 시약 제조 후의 장기 안정성도 우수하고, 특히 광학적 측정 장치에 적용할 수 있는 면역 혈청학적 검사 시약용으로서 유용한 것이 된다.
제4의 본 발명은, 제1, 제2 및 제3의 본 발명의 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 담체 입자에 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질이 담지되어 이루어지는 측정 시약이다.
상기 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질로서는, 면역 혈청학적 검사 시약 (면역학적 응집 반응 및 응집 저지 반응에서 사용되는 것), 생화학 측정법으로서 통상 사용되는 생리 활성 물질이면 특별히 한정되지 않지만, 그 중에서도 항원 항체 반응에 사용할 수 있는 것이 바람직하다.
상기 항원 항체 반응에 사용할 수 있는 것으로서는, 예를 들면 단백질, 핵 산, 핵 단백질, 에스트로겐 지질 등의 항원 또는 항체를 들 수 있다. 항원으로서는, 예를 들면 각종 항원, 수용체, 효소 등을 들 수 있고, β2 마이크로글로블린, C-반응성 단백질 (CRP), 인간 피브리노겐, 페리주석, 류마티스 인자 (RA), α-페트프로테인 (AFP), 마이코플라즈마 항원, HBs 항원 등을 들 수 있다. 또한, 항체로서는, 예를 들면 각종의 독소나 병원균 등에 대한 항체를 들 수 있고, 항 스트레프토리진 O 항체, 항 에스트로겐 항체, β2 마이크로글로블린 항체, 매독 트레포네마 항체, 매독 지질 항원에 대한 항체, HBs 항체, HBc 항체, HBe 항체 등을 들 수 있다. 또한 항체로서는 면역 글로블린 분자 자체 이외에 예를 들면, F(ab')2와 같은 단편일 수도 있다.
상기 담체 입자에 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질을 담지시키는 방법으로서는 특별히 한정되지 않으며, 종래 공지된 방법에 의해 물리적 및(또는) 화학적 결합에 의해 담지시킬 수 있다.
상기 담체 입자에 담지되는 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질의 양으로서는 사용되는 피측정 물질과 특이적으로 결합하는 물질의 종류에 따라 다르고, 특별히 한정되지 않는다.
제4의 본 발명의 측정 시약은 측정 감도의 향상이나 항원 항체 반응의 촉진을 위해 각종 증감제를 함유할 수 있다. 상기 증감제로서는, 예를 들면 일본 특허 공개 평 2-173567호 공보에 기재되어 있는 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스 등의 알킬화 다당류, 일본 특허 공개 평 5-180838호 공보에 기재되어 있는 플루란, 폴리 비닐피롤리돈 등을 들 수 있다.
제4의 본 발명의 측정 시약은, 검체 중에 존재하는 다른 물질에 의해 발생하는 비특이적 응집 반응을 억제하기 위해서 또는 시약의 안정성을 높이기 위해서 알부민 (소혈청 알부민, 난성 알부민), 카제인, 젤라틴 등의 단백질이나 그 분해물, 아미노산 또는 계면활성제 등을 함유할 수 있다.
제4의 본 발명의 측정 시약을 사용하는데 있어서는, 적당한 희석액으로 희석할 수 있다. 상기 희석액으로서는 pH 5.0 내지 9.0의 완충액이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있고, 예를 들면 인산 완충액, 글리신 완충액, 트리스 완충액, 붕산 완충액, 시트르산 완충액 등을 들 수 있다.
제4의 본 발명의 측정 시약을 사용하면 검체 중의 피측정 물질과 담체 입자에 담지된 피측정 물질에 특이적으로 결합하는 물질과의 반응에 의해 생기는 담체 입자의 응집의 정도를 광학적으로 측정함으로써 검체 중의 피측정 물질의 반응량을 측정할 수가 있다. 상기 광학적 측정에는, 산란광 강도, 투과광 강도, 흡광도 등을 검출할 수 있는 광학 기기, 특히 일반의 생화학 자동 분석기이면 모두 사용할 수가 있다.
상기 응집의 정도를 광학적으로 측정하는 방법으로서는 종래 공지된 방법이 사용되고, 예를 들면 응집의 형성을 탁도의 증가로 파악하는 비탁법, 응집의 형성을 입도 분포 또는 평균 입경의 변화로서 파악하는 방법, 응집의 형성에 의한 전방산란광의 변화를 적분구를 사용하여 측정하여 투과광 강도와의 비를 비교하는 적분구 탁도법 등을 들 수 있다. 또한, 측정법으로서는, 예를 들면 다른 시점에서 적 어도 2 개의 측정치를 얻어, 이러한 시점 사이에서의 측정치의 증가분 (증가 속도)에 의하여 응집의 정도를 구하는 속도 시험 (속도 측정); 어떤 시점 (통상은 반응의 종점이라고 생각되는 시점)에서 1개의 측정치를 얻고, 이 측정치에 의하여 응집의 정도를 구하는 종점 시험 (종점 측정) 등을 들 수 있다. 그 중에서도 측정의 간편성, 신속성의 점에서 비탁법에 의한 속도 시험이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 면역 혈청학적 검사에 있어서 넓은 농도 범위의 생체 시료를 측정할 수 있고, 장기간 안정적으로 보존할 수 있는 측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 그것을 사용한 측정 시약을 제공할 수 있다.
<발명을 실시하기 위한 최량의 형태>
<실시예>
이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명하지만 본 발명은 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
[담체 입자의 제조]
교반기, 환류용 냉각기, 온도 검출기, 질소 도입관 및 쟈켓을 구비한 유리제 반응 용기 (용량 2 L)에, 증류수 150O g, 스티렌 280 g, 스티렌 술폰산나트륨 0.9 g 및 증류수 10 g에 과황산칼륨 0.5 g을 용해시킨 수용액을 넣고, 용기 내를 질소 가스로 치환한 후, 70 ℃에서 교반하면서 24 시간 중합하였다.
중합 종료 후, 상기 용액을 페이퍼 여과지로 여과 처리하여, 담체 입자를 추출하였다. 얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 하기의 방법에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타냈다.
(담체 입자의 입경의 측정 방법)
투과형 전자 현미경 장치를 사용하여 담체 입자를 촬영하고 이것을 화상 해석함으로써 입경을 측정하였다.
(담체 입자 표면의 술폰산기량의 측정 방법)
담체 입자를 셀로판 튜브 투석막을 사용하여 48 시간, 정제수로 투석하여 잔존 단량체를 제거하였다. 이 입자를 건조 중량으로 10 g이 되도록 4구 유리 용기에 채취 후, 증류수로 150 mL가 되도록 희석하여 교반기칩을 사용하여 교반하였다. 이것을 용액 A라 하였다.
이어서, 전위차 전기 전도도 적정 처리 장치 (AT-310, 교도 덴시 고교사 제조)의 부속 장치 ATB-310 전동 뷰렛에, N/100-수산화 나트륨 (와꼬 쥰야꾸사 제조)을 셋트하고, 또한 도전율 전극을 용액 A에 침지하여, 질소 도입관, 탈기관 및 pH 전극을 설정하였다. 그리고, N/100-수산화나트륨을 적하 (적하량 0.05 ㎖/150 내지 500 초: 측정하는 술폰산량에 의해 조정)하여, 전위차 전기 전도도 적정 처리 장치 (AT-310)를 사용한 전도도의 변화량으로부터 당량점을 측정하고 목적으로 하는 술폰산량을 산출하였다.
[측정 시약의 제조]
얻어진 담체 입자를 사용하여 농도를 5 ％ (w/v)에 조정한 수용액 250 μL를 8 mL 유리관에 넣었다. 여기에 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도: 12 mg/mL) 550 μL를 한번에 첨가하여 37 ℃에서 완만하게 1 시간 교반하여 흡착시켰다. 이어서 1.0 중량％의 소혈청 알부민 (이하, BSA라고도 함)을 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 450 μL를 한번에 첨가하고, 또한 37 ℃에서 1 시간 교반하여 블로킹 처리를 행하였다.
블로킹 처리 후의 현탁액을 8 mL의 원심관에 분취하여, 1500O rpm, 4 ℃에서 30 분간 원심 분리하여, 상청액을 제거하고, 1.0 중량％ BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2 회 행하였다.
이어서, 잉여 항체 처리를 끝낸 입자에 1.0 중량 ％ BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5) 2.5 mL를 첨가하고, 초음파 처리 후, 또한 1.0 중량％ BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종액량이 30 mL가 되도록 하여 측정 시약을 제조하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
1) 측정 감도의 평가
얻어진 측정 시약을 사용하여 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다. 측정에는 1 검체 측정에 대하여 측정 시약을 132 μL, 검체 희석액으로서 1 ％ BSA 함유 글리신 완충액 132 μL, 측정 검체로서 CRP 농도가 0.08 내지 20 mg/dL의 것을 2 μL를 사용하여 각 검체의 흡광도 변화량을 측정하였다. 측정 기기에는, 생화학 자동 분석기 (히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7170형 자동 분석 장치)를 사용하고, 측정 파장은 800 nm, 측광 포인트 2 포인트-엔드(point-end) 21-34 p로 행하였 다. 이 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1에서 얻어진 측정 시약은 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하였다.
2) 시약 안정성의 평가
얻어진 측정 시약을, 온도 4 ℃에서 6 개월 동안 보관하여 상기 방법과 동일하게 하고 CRP 농도가 0.08 내지 20 mg/dL 범위의 검체의 측정 감도의 평가를 행하였다.
결과를 도 2에 나타냈다.
도 2로부터 장기간 보관 후의 측정 시약에서도 제조 직후와 마찬가지로 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하고, 장기간에 걸쳐 성능이 안정적으로 유지된다는 것을 알았다.
<실시예 2 내지 3, 비교예 1 내지 4>
증류수, 스티렌 및 스티렌술폰산나트륨을 표 1에 나타낸 바와 같이 넣는 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 하여 담체 입자를 제조하였다.
얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하여 그 결과를 표 1에 나타냈다.
다음으로 실시예 1과 표면적당의 감작량이 동일하게 되도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하고 각 실시예 및 비교예의 측정 시약을 제조하였다.
얻어진 측정 시약의 측정 감도의 평가를 실시예 1과 동일한 방법에 의해 행하였다. 결과를 도 1에 나타냈다.
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 2, 3에서 제조한 측정 시약으로는 실시예 1과 동일하게 양호한 측정 결과를 나타냈다. 이에 대하여, 비교예 1 내지 4에서 제조한 측정 시약으로는 측정 감도가 낮았다.
또한, 제조한 측정 시약을, 온도 4 ℃에서 6 개월 동안 보관하여 실시예 1과 동일한 방법에 의해 시약 안정성의 평가를 행하였다. 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2로부터, 실시예 2, 3에서 제조한 측정 시약은 실시예 1과 동일하게 장기간 보관 후에도 제조 직후와 같이, 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하고, 장기간에 걸쳐 성능이 안정적으로 유지되는 것을 알았다. 이에 대하여, 비교예 1 내지 4에서 제조한 측정 시약은 장기간 보관 후는 제조 직후와 비교하여 측정 감도가 저하되고 시약 성능이 나빠진다는 것을 알았다.
Figure 112008087555620-pat00001
<실시예 4, 비교예 5>
실시예 3 및 비교예 3에서 제조한 담체 입자로의 항체 감작량을, 표면적당의 감작량이 실시예 3 및 비교예 3의 각각 80 ％가 되도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하여 측정 시약을 제조하고, 이것을 실시예 4 및 비교예 5로 하였다.
얻어진 측정 시약의 측정 감도 평가를 실시예 1과 동일한 방법에 의해 행하여 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 4에서 제조한 측정 시약은, 실시예 1과 동일하게 양호한 측정 결과를 나타냈다. 이에 대하여, 비교예 5에서 제조한 측정 시약은 측정 감도가 낮았다.
또한, 얻어진 측정 시약을 온도 4 ℃에서 6 개월간 보관하여, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 시약 안정성의 평가를 행하였다. 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4로부터, 실시예 4에서 제조한 측정 시약은 제조 직후와 동일하게 측정 검체 농도가 저농도로부터 고농도의 범위까지 고감도 측정이 가능하고, 장기간 에 걸쳐 성능이 안정적으로 유지된다는 것을 알았다. 이에 대하여, 비교예 5에서 제조한 측정 시약은 장기간 보관 후에는 제조 직후와 비교하여, 측정 감도가 저하되고 시약 성능이 나빠진다는 것을 알았다.
<실시예 5 내지 7, 비교예 6 내지 8>
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2 L)에 표 2에 나타낸 조성의 원료를 넣고, 질소 치환한 후 교반하면서 반응 온도를 70 ℃ 내지 71 ℃로 제어하면서 48 시간 공중합하였다. 또한 중합시에 사용하는 촉매로서는 증류수 10 g에 과황산칼륨 0.5 g을 용해시킨 수용액을 사용하였다. 또한 실시예 5, 6 및 비교예 6에서는 비이온계 유화제 (에멀젠(EMULGEN) 804 S, 가오사 제조)를, 실시예 7 및 비교예 7에서는 음이온계 유화제 (네오페렉스(NEOPELEX) F-25, 가오사 제조)를 사용하였다.
얻어진 담체 입자를 취하고 실시예 1과 동일한 방법에 의해 입경 및 표면의 술폰산기량을 측정하였다.
결과를 표 2에 나타냈다.
Figure 112008087555620-pat00002
[측정 시약의 제조]
실시예 5에서 얻어진 담체 입자를 사용하여 5 ％ 농도 수용액을 제조한 후 8 mL 유리관에 250 μL 넣고, 여기에 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도 12 mg/mL: 이하, 항체 용액이라고 함) 55O μL를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 교반 흡착 후, BSA(소혈청 알부민)를 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 450 μL 가하고, 블로킹 처리로서 37 ℃에서 60 분 교반 처리를 행하였다.
이어서, 블로킹 처리품을, 8 ㎖ 원심관에 분취하여 15000 rpm에서 50 분간 원심 분리 처리 후, 상청을 폐기하고 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2 회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 2.5 mL 첨가하고, 초음파 처리 후 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 30 mL로 하여 측정 시약을 제조하였다.
실시예 6, 7 및 비교예 6 내지 8에서 제조한 담체 입자에 대해서는 항체 감작량이 담체 입자 표면적당 동일하도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정한 것 이외에는, 실시예 5와 동일한 방법으로 측정 시약을 제조하였다.
또한 원심 분리 조건에 대해서는 실시예 5 및 비교예 6에서는 15000 rpm에서 50 분간, 실시예 6 및 비교예 7에서는 15000 rpm에서 45 분간, 실시예 7 및 비교예 8에서는 15000 rpm에서 38 분간으로 하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
얻어진 각 측정 시약을 사용하고, 이하의 측정 조건으로써, CRP 농도 0.08 내지 20 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 5 및 도 6에 나타냈다.
측정기종: 히타치 세이사꾸쇼 제조, 7170형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 2 μL
희석액 (R1) 132 μL (희석액 조성 1 ％ BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 132 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트-엔드 21-34 p
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2L)에, 표 3에 나타낸 소정량의 증류수, 스티렌 및 스티렌술폰산나트륨을 넣고, 또한 증류수 10 g에 과황산칼륨 (중합 개시제) 0.5 g을 용해시킨 수용액을 첨가하여, 질소치환한 후, 교반 상태로 반응 온도를 71 내지 73 ℃로 제어하면서 48 시간 공중합하여, 6 종류의 담체 입자 (a) 내지 담체 입자 (f)를 얻었다. 얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하였다. 결과를 표 3에 나타냈다.
Figure 112008087555620-pat00003
<실시예 8>
[측정 시약의 제조]
담체 입자 (a)와 담체 입자 (b)를 고형분 환산의 중량비로 (a)/(b)=1/10이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용하고, 증류수를 첨가하여 고형분을 10 중량％로 조정한 후, 8 ㎖ 유리관에 250 μL 채취하여, 항 인간 CRP 염소 혈청 (단백질 농도: 18 mg/mL, DAKO사 제조: 이하, 항체 용액라고도 함) 170 μL를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 교반하여 흡착시킨 후, BSA (소혈청 알부민)를 포함하는 글리신 완충액 (pH: 8.5) 2080 μL를 첨가하고, 블로킹 처리로서 37 ℃에서 60 분간 교반 처리를 행하였다. 이어서, 블로킹 처리품을 8 ㎖ 원심관에 분취하여, 15000 rpm에서 50 분간 원심 분리 처리한 후, 상청액을 폐기하고, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2 회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5) 2.5 mL를 첨가하여 초음파 처리한 후, 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 5 mL로 측정 시약을 제조하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
얻어진 각 측정 시약을 사용하여, 이하의 측정 조건으로써 CRP 농도 0.08로부터 20 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정한였다.
결과를 도 7에 나타냈다.
측정 기종: 히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7150형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 3 μL
희석액 (R1) 270 μL (조성: 1 중량％ BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 90 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트 30-50 p
<실시예 9>
담체 입자 (a)와 담체 입자 (b)를 고형분 환산의 중량비로 (a)/(b)= 10/1이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<실시예 10>
담체 입자 (c)와 담체 입자 (d)를 고형분 환산의 중량비로 (c)/(d)=1/10이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<실시예 11>
담체 입자 (c)와 담체 입자 (d)를 고형분 환산의 중량비로 (c)/(d)=10/1이 되도록 혼합한 담체 입자를 사용한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
실시예 9 내지 실시예 11에서 얻어진 측정 시약의 성능 (감도)을 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 평가하였다. 그 결과를 도 7에 나타냈다.
<비교예 9>
담체 입자 (a) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<비교예 10>
담체 입자 (d) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하고, 또한 원심 분리 처리의 조건을 15000 rpm에서 38 분간으로 한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<비교예 11>
담체 입자 (e) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
<비교예 12>
담체 입자 (f) 단독을 담체 입자로서 사용하고, 담체 입자의 표면적당의 항체 감작량이 실시예 8의 경우와 동일하게 되도록 BAS 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하고, 또한 원심 분리 처리의 조건을 15000 rpm에서 38 분간으로 한 것 이외에는 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 측정 시약을 제조하였다.
비교예 9 내지 비교예 12에서 얻어진 측정 시약의 성능 (감도)을 실시예 8의 경우와 동일하게 하여 평가하였다. 그 결과를 도 8에 나타냈다.
도 7로부터 분명한 것과 같이, 실시예 8 내지 11에서 제조한 측정 시약은 모두 CRP 농도 0.08 내지 20 mg/dL의 넓은 농도 범위에서 흡광도 변화량이 크고, 우수한 감도를 나타냈다.
이에 대하여, 도 8로부터 분명한 것과 같이, 담체 입자로서 담체 입자 (a), 담체 입자 (e) 및 담체 입자 (f)를 각각 단독으로 사용하여 제조한 비교예 9, 11, 12의 측정 시약은, 모두 CRP 농도 0.08 내지 20 mg/dL의 넓은 농도 범위의 전부에 있어서 흡광도 변화량이 작고, 감도가 떨어져 있었다. 또한, 담체 입자로서 담체 입자 (d)를 단독으로 사용하여 제조한 비교예 10의 측정 시약은, CRP 농도 5 내지 20 mg/dL의 고농도 영역에서의 흡광도 변화량이 작고, 고농도 영역에서의 감도가 떨어졌다.
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2L)에 표 4에 나타낸 조성의 원료를 넣고, 질소 치환한 후 교반하면서 반응 온도를 71 ℃ 내지 73 ℃로 제어하고 48 시간 공중합하여 5 종류의 담체 입자 (g) 내지 담체 입자 (k)를 얻었다. 얻어진 담체 입자의 입경 및 표면의 술폰산기량을 실시예 1과 동일한 방법에 의해 측정하였다. 결과를 표 4에 나타냈다. 또한 중합시에 사용하는 촉매는 증류수 10 g에 과황산칼륨 0.5 g을 용해시킨 수용액을 사용하였다.
Figure 112008087555620-pat00004
[측정 시약의 제조]
담체 입자 (g) 10 ％ (w/v) 농도로 조정한 수용액을 8 mL 유리관에 250 μL넣고, 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도 18 mg/mL: 이하, 항체 용액이라고 함) 170 μL를 첨가하고, 37 ℃에서 1 시간 교반 흡착 후, BSA (소혈청 알부민)을 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 2080 μL를 가하여, 37 ℃에서 60 분 교반하여 블로킹 처리를 행하였다. 다음으로 블로킹 처리품을 8 mL 원심관에 분취하고 18000 rpm에서 60 분간 원심 분리 처리 후, 상청액을 폐기하고 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하여 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 2.5 mL 첨가하고, 초음파 처리 후, 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 5 mL로 하여 측정 시약을 제조하였다.
또한 담체 입자 (h), (i), (j), (k)에 대해서는 담체 입자 표면적당의 항체 감작량이 동일하게 되도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하여 담체 입자 (g)와 동일 방법으로써 측정 시약을 제조하였다. 원심 분리 조건에 대해서는 담체 입자 (h)는 18000 rpm에서 45 분간, 담체 입자 (i) (j)는 15000 rpm에서 30 분간, 담체 입자 (k)는 18000 rpm에서 60 분간으로 하였다.
<실시예 12>
얻어진 담체 입자 (i), (j)를 포함하는 측정 시약을 사용하고 이하의 측정 조건으로 CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 9 및 도 10에 나타냈다.
측정기종: 히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7150형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 3 μL
희석액 (R1) 270 μL (조성: 1 중량％ BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 90 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트 30-50 p
<비교예 13>
얻어진 담체 입자 (k)를 포함하는 측정 시약을 사용하여 실시예 12와 동일한 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 9 및 도 10에 나타냈다.
<실시예 13>
얻어진 담체 입자 (g)를 포함하는 측정 시약과 담체 입자 (i)를 포함하는 측정 시약을 1:10으로 혼합한 혼합 측정 시약을 사용하고, 실시예 12와 동일한 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 9에 나타냈다.
<실시예 14>
얻어진 담체 입자 (h)를 포함하는 측정 시약과 담체 입자 (j)를 포함하는 측정 시약을 1:10으로 혼합한 혼합 측정 시약을 사용하고, 실시예 12와 동일한 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 10에 나타냈다.
<실시예 15 내지 18, 비교예 14 내지 18>
[담체 입자의 제조]
교반기, 냉각 코일, 온도 검출기, 쟈켓 등을 장비한 유리 반응기 (용량 2L)에, 표 5에 나타낸 조성의 원료를 넣고, 또한 증류수 10 g에 과황산칼륨 (개시제) 0.5 g을 용해시킨 수용액을 가하여 질소 치환한 후, 교반 상태로 반응 온도를 71 내지 73 ℃로 제어하면서 48 시간 공중합하여, 담체 입자를 얻었다.
얻어진 담체 입자를 페이퍼 여과지로 여과 처리 후, 담체 입자의 입경을 측정하여 평균 입경 및 CV값을 구하였다. 또한, 입경은 투과형 전자 현미경으로 촬영한 화상을 바탕으로, 화상 해석 장치로 측정하였다. 또한, 실시예 1과 동일한 방법에 의해 표면의 술폰산기량을 측정하였다.
결과를 표 5에 나타냈다.
Figure 112008087555620-pat00005
[측정 시약의 제조]
실시예 15에서 얻어진 담체 입자를 사용하여 10 ％ (w/v) 농도로 조정한 수용액을 8 mL 유리관에 250 ㎛L 넣고, 항 인간 CRP 염소 혈청 (DAKO사 제조, 단백질 농도 18 mg/mL: 이하, 항체 용액라고도 함) 170 μL를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 교반 흡착 후, BSA (소혈청 알부민)를 포함하는 글리신 완충액 (pH 8.5) 2080 μL를 가하여, 37 ℃에서 60 분 교반하여 블로킹 처리를 행하였다. 이어서, 블로킹 처리품을 8 mL 원심관에 분취하여 1800O rpm에서 60 분간 원심 분리 처리 후, 상청액을 폐기하고 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 사용하고 재분산시켜 잉여 항체 처리를 2회 반복하여 행한 후, BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 2.5 mL 첨가하고, 초음파 처리 후, 또한 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 추가하여 최종 액량을 5 mL로 하여, 측정 시약을 제조하였다.
실시예 16 내지 18 및 비교예 14 내지 18에 대해서는 담체 입자의 표면적당의 항체감작량이 동일하도록 BSA 함유 글리신 완충액 (pH 8.5)을 조정하여, 실시예 15와 동일한 방법으로 측정 시약을 제조하였다.
또한 원심 분리 조건에 대해서는 실시예 15 및 비교예 18은 18000 rpm에서 60 분간, 실시예 16, 17 및 비교예 16, 17은 18000 rpm에서 70 분간으로 하였다.
[측정 시약의 성능 평가]
얻어진 측정 시약을 사용하고 이하의 측정 조건으로, CRP 농도 0.5 내지 30 mg/dL까지의 검체 측정시의 흡광도 변화량을 측정하였다.
결과를 도 11 및 도 12에 나타냈다.
측정 기종: 히타치 세이사꾸쇼사 제조, 7150형 자동 분석 장치
시약 액량: 샘플 3 μL
희석액 (R1) 270 μL (조성: 1 중량％ BSA 함유 글리신 완충액)
측정 시약 90 μL
측정 파장: 800 nm
측광 포인트: 2 포인트 30-50 p
<산업상 이용 가능성>
본 발명에 따르면, 면역 혈청학적 검사에 있어서 넓은 농도 범위의 생체 시료를 측정할 수 있고, 장기간 안정적으로 보존할 수 있는 측정 시약용 담체 입자 라텍스 및 그것을 사용한 측정 시약을 제공할 수 있다.
도 1은, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 4에서 제조한 측정 시약을 제조 직후에 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는, 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 내지 4에서 제조한 측정 시약을 안정성 시험 후에 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은, 실시예 4 및 비교예 5에서 제조한 측정 시약을 조정 직후에 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 실시예 4 및 비교예 5에서 제조한 측정 시약을 안정성 시험 후에 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는, 실시예 5 내지 7에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은, 비교예 6 내지 8에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은, 실시예 8 내지 11에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, 비교예 9 내지 12에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는, 실시예 12 (i), 비교예 13 및 실시예 13에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은, 실시예 12 (j), 비교예 13 및 실시예 14에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은, 실시예 15 내지 18에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는, 실시예 14 내지 18에서 제조한 측정 시약을 사용하여 검체 측정을 행한 결과를 나타낸 도면이다.

Claims (5)

  1. 라텍스 비탁법에 이용하기 위한 것이고, 단량체 성분으로서 페닐기를 갖는 중합성 단량체와 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체만으로 구성된 공중합체를 포함하는 담체 입자를 포함하고, 상기 담체 입자는 표면의 술폰산기량이 0.005 내지 0.7 μmol/㎡, 평균 입경이 0.05 내지 0.5 ㎛인 것을 특징으로 하는, 착색 시약을 제외한 측정 시약용 담체 입자 라텍스.
  2. 제1항에 있어서, 유화제를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 측정 시약용 담체 입자 라텍스.
  3. 제1항에 있어서, 페닐기를 갖는 중합성 단량체가 스티렌이고, 또한 페닐기 및 술폰산염을 갖는 중합성 단량체가 스티렌 술폰산염인 것을 특징으로 하는 측정 시약용 담체 입자 라텍스.
  4. 삭제
  5. 제1항에 기재된 측정 시약용 담체 입자 라텍스의 담체 입자에 항원 또는 항체가 담지되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 측정 시약.
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