CN108026287A - 提供有微相分离结构颗粒的聚合物微粒、使用其的用于粒子免疫测定的试剂和粒子免疫测定方法 - Google Patents

Abstract

一种聚合物微粒，其包括具有两个以上链段的嵌段共聚物，其中所述聚合物微粒在其表面上具有微相分离结构，数均粒度为50nm至1000nm，并且变动系数小于20％。所述聚合物微粒通过控制粒子表面的抗原或抗体固定状态来允许高灵敏度测定。

Description

提供有微相分离结构颗粒的聚合物微粒、使用其的用于粒子 免疫测定的试剂和粒子免疫测定方法

技术领域

本发明涉及一种在高度抑制非特异性反应的同时允许高灵敏度测定的用于粒子免疫测定的聚合物微粒，一种含有该聚合物微粒的用于粒子免疫测定的试剂和使用该聚合物微粒的粒子免疫测定。

背景技术

在临床检查领域中，利用抗原-抗体反应的免疫测定被广泛地用作检测样本中非常少量的待检测的物质的方法。其中，作为实用的方法，使用抗原或抗体固定化的聚合物微粒(下文中也称为敏化聚合物微粒)的粒子免疫比浊法是普遍的，这是因为该方法涉及方便的测定操作，需要短的测定时间，并且能够适用于广泛使用的临床检查仪器。通过粒子免疫比浊法对样本中的抗原或抗体进行测定通过检测光学变化来进行，该光学变化来源于与形成抗原和抗体之间的免疫复合物有关的敏化聚合物微粒的凝集。测定样品的这种光学变化基于由敏化聚合物微粒的凝集引起的表观粒度的变化。

粒子免疫比浊法通常采用主要由聚苯乙烯组成的聚苯乙烯聚合物微粒，这是因为与待检测的物质特异性反应的抗原或抗体容易固定，成本相对较低，并且聚合反应易于控制。然而，主要由聚苯乙烯组成的聚合物微粒具有可以通过物理吸附将抗原或抗体简单地固定到粒子表面上的优点，而这些聚合物微粒的问题在于，对于抗原或抗体到粒子表面上的吸附，难以控制粒子表面上的吸附位点等，使得抗原或抗体不能以某些规律被吸附到粒子表面上。

专利文献1描述了如上所述的主要由聚苯乙烯组成的聚苯乙烯聚合物微粒。

专利文献2描述了通过使用水溶性自由基聚合引发剂将作为主要组分的苯乙烯和苯乙烯磺酸盐与具有可聚合官能团的特定表面活性剂在水中共聚而制备成聚合物微粒的诊断试剂用载体粒子。然而，通过该方法制备的聚合物粒子具有覆盖有表面活性剂的表面，这妨碍了抗原或抗体在粒子表面上的物理吸附。因此，含有吸附在粒子上的抗原或抗体的诊断试剂不能产生所需的灵敏度。

专利文献3描述了由苯乙烯与在均聚物中提供1.6以上的折射率的单体的共聚物构成的诊断药物用粒子。然而，粒子的表面具有这两种组分的随机混合状态，并且不能控制抗原或抗体的吸附。

相关技术

专利文献

专利文献1：国际公开号WO2003/005031

专利文献2：日本专利公开号57-038806

专利文献3：日本专利公开号2001-296299

发明概述

技术问题

在这些情况下，需要开发用于抗原或抗体固定的聚合物微粒或者制备能够通过设计聚合物微粒本身来控制抗原或抗体固定状态的聚合物微粒的方法。

如上所述的主要由聚苯乙烯组成的聚苯乙烯聚合物微粒基本上是由单一类型的聚合物组分构成的均匀微粒。即使当这些微粒含有不同类型的组分时，也很难在粒子表面上形成功能性微观区域(例如，疏水性微观区域或亲水性微观区域)。

本发明的目的在于提供通过控制粒子表面的抗原或抗体固定状态来允许高灵敏度测定的用于粒子免疫测定的聚合物微粒，含有该聚合物微粒的粒子免疫测定试剂，和使用该聚合物微粒的粒子免疫测定。

问题的解决方案

本发明人为了达到上述目的进行了深入的研究，从而完成了本发明。

本发明涉及以下内容：

[1]一种聚合物微粒，所述聚合物微粒包括具有两个以上链段的嵌段共聚物，其中所述聚合物微粒在其表面上具有微相分离结构，数均粒度为50nm至1000nm，并且变动系数小于20％。

[2]根据[1]所述的聚合物微粒，其中具有所述微相分离结构的所述表面由具有针对待检测的物质的结合部的结合相和针对所述待检测的物质的非结合相构成。

[3]根据[2]所述的聚合物微粒，其中所述微相分离结构为海岛或层状微相分离结构。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的聚合物微粒，其中所述具有两个以上链段的嵌段共聚物为具有A-B-A结构的三嵌段共聚物。

[5]根据[4]所述的聚合物微粒，其中所述具有A-B-A结构的三嵌段共聚物为苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯(SIS)三嵌段共聚物。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的聚合物微粒，其中所述结合相与所述非结合相的比率(所述结合相/所述非结合相)为10/90至40/60。

[7]一种用于粒子免疫测定的试剂，其包括根据[1]至[6]中任一项所述的聚合物微粒。

[8]一种粒子免疫测定方法，其包括使用根据[7]所述的用于粒子免疫测定的试剂。

附图简述

[图1]图1是根据实施例1的具有微相分离结构的聚合物微粒的表面照片(SEM照片)。

[图2]图2是具有微相分离结构的聚合物微粒的表面照片(SEM照片)和显示其一部分的放大图的示意图。

[图3]图3是根据参考例1的具有微相分离结构的聚合物微粒的表面照片(SEM照片)。

实施方案描述

在下文中，将详细描述本发明的实施方案。

本发明的聚合物微粒是包含具有两个以上链段的嵌段共聚物的聚合物微粒，其中所述聚合物微粒在其表面上具有微相分离结构，数均粒度为50nm至1000nm，并且变动系数小于20％。

在本发明的聚合物微粒的表面上形成的微相分离结构是基于构成嵌段共聚物的两个以上链段之间的物理性质的差异而形成的，并且更特别是基于这些链段之间的排斥力而形成的。本发明的聚合物微粒的微相分离结构的具体形状可以使用电子显微镜、光学显微镜、扫描探针显微镜、小角度X射线(中子)散射、光散射或本领域中本身已知的类似方法进行确认。这种方法可以与仅与构成两个以上链段之一的链段选择性反应的化合物(例如，四氧化锇)组合使用。

构成本发明的聚合物微粒的嵌段共聚物的种类没有特别限制，只要嵌段共聚物能够形成微相分离即可。由于微相分离结构的形成基于构成该结构的链段之间的物理性质的差异，更特别地，基于这些链段之间的排斥力，所以构成嵌段共聚物的链段需要具有物理性质的差异或者足以形成微观区域的排斥力。

具有两个以上链段的嵌段共聚物在粒子表面上形成微相分离结构。微相分离结构的实例包括海岛、层状、螺旋形、圆柱形和双连续结构。其中，海岛结构是优选的，因为抗原或抗体可以在粒子表面上以固定规律排列。

具有两个以上链段的嵌段共聚物在至少一个链段中具有与待检测的物质的结合部。

具有与待检测的物质的结合部的链段以两种方式与待检测的物质结合：经由化学结合的吸附和物理吸附。经由化学结合的吸附是指经由存在于具有与待检测的物质的结合部的链段中的羧基或缩水甘油基与存在于蛋白质中的氨基、羟基或硫醇基的缩合反应的结合。物理吸附是指经由与芳烃的电相互作用的吸附。

在使用经由化学结合的吸附的情况下，具有与待检测的物质的结合部的链段的实例包括：含有具有羧基的单体(诸如丙烯酸或甲基丙烯酸)作为重复单元的聚合物，以及含有具有缩水甘油基的单体(诸如(甲基)丙烯酸缩水甘油酯)作为重复单元的聚合物。

在使用物理吸附的情况下，具有与待检测的物质的结合部的链段是含有含芳烃单体作为重复单元的聚合物，并且特别是指例如苯乙烯、C_1-3烷基取代的苯乙烯(诸如甲基苯乙烯)、卤素取代的苯乙烯(诸如氯苯乙烯)、羧基取代的苯乙烯(诸如4-乙烯基苯甲酸)、磺酸取代的苯乙烯(诸如苯乙烯磺酸)、具有苯乙烯的稠环的化合物(诸如乙烯基萘)或多官能乙烯基苯(诸如二乙烯基苯)。可以加入取代基的苯环上的位置可以是2、3和4位中的任何位置。此外，羧基取代的苯乙烯或磺酸取代的苯乙烯可以与钠、钾等形成盐。

缺乏与待检测的物质的结合部的链段的具体实例包括不具有化学结合位点的高极性或低极性单体，诸如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸甲酯、异戊二烯、丁二烯、乙烯、丁烯、(甲基)丙烯酸正丁酯、(甲基)丙烯酸叔丁酯、丙烯酸二环戊烯酯、丙烯酸二环戊烯基氧乙酯和丙烯酸二环戊酯。其中，甲基丙烯酸甲酯、异戊二烯或丁二烯是优选的。

具有两个以上链段的嵌段共聚物没有特别限制，并且优选是具有A-B结构的二嵌段共聚物、具有A-B-A结构的三嵌段共聚物、具有A-B-C结构的三嵌段共聚物等，这是因为这些嵌段共聚物被便利地合成并且作为许多市售产品获得。

具有A-B结构的二嵌段共聚物的实例包括苯乙烯-异戊二烯二嵌段共聚物和苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯二嵌段共聚物。

具有A-B-A结构的三嵌段共聚物的实例包括诸如苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯(SIS)三嵌段共聚物、苯乙烯-丁二烯-苯乙烯(SBS)三嵌段共聚物、异戊二烯-苯乙烯-异戊二烯三嵌段共聚物和丁二烯-苯乙烯-丁二烯三嵌段共聚物的三嵌段共聚物。

具有A-B-C结构的三嵌段共聚物的实例包括诸如苯乙烯-丁二烯-甲基丙烯酸甲酯三嵌段共聚物的三嵌段共聚物。

这些嵌段共聚物可以通过本领域已知的方法合成，或者可以使用市售产品。本领域已知的方法的实例包括：可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合、原子转移自由基聚合(ATRP)、碲介导的自由基聚合(TERP；使用有机碲化合物的活性自由基聚合方法)、硝基氧介导的自由基聚合(NMP)、使用引发-转移-终止剂(iniferter)等的活性自由基聚合、活性阴离子聚合、活性阳离子聚合、活性配位聚合和转移聚合。

具有A-B结构的二嵌段共聚物的市售产品的实例包括：聚(苯乙烯-b-丁二烯)(由Polymer Source Inc.制造，P2124-SBd，平均分子量：74100，与待检测的物质的结合部的含量：12.2w/w％)、聚(苯乙烯-b-甲基丙烯酸甲酯)(由Polymer Source Inc.制造，P18258P-SMMA，平均分子量：391000，与待检测的物质的结合部的含量：14.0w/w％)和聚(乙烯基苄基氯-b-甲基丙烯酸甲酯)(由Polymer Source Inc.制造，P19317B-4VBCMMA，平均分子量：79000，与待检测的物质的结合部的含量：30.3w/w％)。

具有A-B-A结构的三嵌段共聚物的市售产品的实例可以包括：SIS三嵌段共聚物，诸如产品名D1114P(由Kraton Polymers Japan Ltd.制造，目录号K0169，与待检测的物质的结合部的含量：19.0w/w％)和产品名D1164P(由Kraton Polymers Japan Ltd.制造，目录号K0377，与待检测的物质的结合部的含量：29.0w/w％)；和SBS三嵌段共聚物，诸如产品名D1116B(由Kraton Polymers Japan Ltd.制造，目录号K0037，与待检测的物质的结合部的含量：23.0w/w％)和聚(甲基丙烯酸甲酯-b-苯乙烯-b-甲基丙烯酸甲酯)(由PolymerSource Inc.制造，P18287C-MMASMMA，平均分子量：82000，与待检测的物质的结合部的含量：16.5w/w％)。

具有A-B-C结构的三嵌段共聚物的市售产品的实例可以包括苯乙烯-丁二烯-甲基丙烯酸甲酯三嵌段共聚物(由Polymer Source Inc.制造，P8925-SBdMMA，平均分子量：330000，与待检测的物质的结合部的含量：14.0w/w％)。

对于具有两个以上链段的嵌段共聚物，优选地，三嵌段共聚物的重均分子量为3000至3000000，并且与待检测的物质的结合部的含量为5至50w/w％。重均分子量更优选为6000至1000000，进一步优选为9000至100000。与待检测的物质的结合部的含量更优选为10至40w/w％，进一步优选15至35w/w％。

与待检测的物质的结合部的含量意指具有与待检测的物质的结合部的单体单元与聚合物的总重量的重量比。与待检测的物质的结合部的含量可以通过热解气相色谱等测量。

在本发明的聚合物微粒中，针对待检测的物质的结合相和针对待检测的物质的非结合相形成微相分离结构。在聚合物微粒表面上，针对待检测的物质的蛋白质的结合部相的微观区域与针对非结合相的微观区域的面积比为5/95至50/50。在聚合物微粒表面上，针对待检测的物质的蛋白质的结合部相的微观区域与非结合相的微观区域的面积比更优选为10/90至40/60，进一步优选15/85至35/65。

控制面积比的方法通过控制构成聚合物微粒的嵌段共聚物的组成来实现。特别地，蛋白质结合相的面积比基本上与具有针对待检测的物质的结合部的单体单元与聚合物的总重量的重量比一致。

图2显示了具有微相分离结构的聚合物微粒的表面照片(SEM照片)和其一部分的放大图的示意图。当微相分离结构为海岛结构时，优选的是，如图2所示，在海相分离的同时，岛相分离结构(岛微观区域)A应该由针对待检测的物质的结合相形成，而海相分离结构(海微观区域)B应该由针对待检测的物质的非结合相形成。在图2所示的海岛聚合物微粒中，岛相分离结构A的直径D优选为1至100nm，更优选3至50nm，进一步优选5至30nm。在上述范围内，因为将一个抗体分子固定在一个岛相分离结构上，所以可以进一步提高效率。

由于岛微观区域形成针对待检测的物质的结合部，所以针对待检测的物质的抗体等可以选择性地吸附于其上。与常规聚合物微粒不同，本发明的聚合物微粒不太可能引起抗体等在粒子表面上的不均匀吸附。另一方面，由于海相分离结构形成针对待检测的物质的非结合相，所以如常规聚合物微粒中对封闭处理的需要自然很低。由于这样的原因，本发明的聚合物微粒可以实现非特异性反应的抑制和高灵敏度的测定两者。

具有形成于表面上的微相分离结构的本发明的聚合物微粒通过例如使用聚合物作为起始材料的粒子制备方法或通过使用单体作为起始材料进行聚合来合成粒子的方法来获得。前一种方法的实例包括再沉淀法、溶剂扩散法、液中干燥法和自组装沉积法。后一种方法的实例包括乳液聚合、分散聚合和细乳液聚合。

本发明的聚合物微粒的平均粒度为1000nm以下，优选50nm至1000nm。如果用于在粒子免疫比浊法中使用的平均粒度小于50nm，则由于来源于聚合物微粒的凝集的光学变化量太小而不能获得测定所需的灵敏度。这在试剂制备中需要大量时间用于离心，并且增加了试剂成本。如果平均粒度大于1000nm，则由聚合物微粒的凝聚引起的光学变化量在高浓度的待检测的物质下超过可测定的范围，使得无法获得响应于该光学变化量的待检测的物质的量。平均粒度根据使用本发明的聚合物微粒的测定方法或测定仪器而不同，并且优选为50nm至700nm，更优选50nm至400nm。

聚合物微粒的粒度的变动系数(CV值)优选为20％以下。如果变动系数超过20％，则在试剂制备中批次再现性可能很差，导致测试试剂再现性降低。变动系数更优选为15％以下，进一步优选10％以下。根据以下表达式计算粒度的变动系数：

粒度的变动系数(CV值)＝粒度的标准偏差/平均粒度。

据报道，包含具有两个以上链段的嵌段共聚物的聚合物微粒通过其表面上的微相分离结构形成微观区域。例如，日本专利公开号2006-077076描述了包含苯乙烯-异戊二烯(SI)二嵌段共聚物并且在其表面上具有层状微相分离结构的聚合物细粒。还有一份报告指出，通过这种方法制备的SI二嵌段共聚物粒子的粒度分布为大约100nm至600nm(Higuchi等人；Macromolecular Rapid Communications,31,1773-1778(2010))。尽管报道了包含嵌段共聚物并且具有形成于其表面上的相分离结构的聚合物微粒，但是对于在免疫测定中使用其粒度分布很宽泛。迄今为止还未报道实用的聚合物微粒。

在这方面，本发明的聚合物微粒具有如上所述的预定粒度和粒度分布。此外，后面提到的结合部可以在具有再现性的情况下固定在粒子表面上。因此，本发明的聚合物微粒可应用于经由使用微观区域之间的特性差异的免疫测定。

本发明的聚合物微粒以悬浮在不良溶剂中的状态获得，并且因此以悬浮在合适的水性介质(诸如缓冲溶液)中的状态使用，用以制备用于粒子免疫比浊法的试剂。粒子的浓度没有特别限制，并且通常优选为1至20w/v％。如果浓度低于1w/v％，则富集对于试剂制备是必要的。如果浓度高于20w/v％，则粒子可能会凝集。

其中经由物理吸附将与待检测的物质特异性反应的物质(下文中也称为“结合部”)固定在表面上的聚合物微粒(敏化聚合物微粒)和包含聚合物微粒的用于粒子免疫比浊法的试剂也是本发明的一个方面。“与待检测的物质特异性反应的物质”没有特别限制，只要该物质能够用于免疫凝集反应和凝集抑制反应即可。其中，可以用于抗原-抗体反应的物质是优选的。

可以用于抗原-抗体反应的物质的实例包括抗原，诸如蛋白质、核酸、脂质和激素，以及针对这些抗原的抗体。抗原没有特别限制，并且可以是适于检测样本中的抗体的抗原，例如各种变应原、各种类固醇激素、梅毒脂质抗原、来源于各种细菌的抗原以及毒素抗原。抗体的实例包括，但不特别限于，针对物质丰度根据疾病或病理条件的各种原因而不同的物质的抗体，例如病原体或疾病特异性分子标记。这些抗体的具体实例包括抗流感抗体、抗-AFP抗体、抗-CRP抗体、抗胰岛素抗体和抗-BNP抗体。抗体本身可以是免疫球蛋白分子，或者可以是片段，例如F(ab’)₂。抗体可以是任何供使用的多克隆抗体和单克隆抗体，并且不受限于生产该抗体的方法。

用于将与待检测的物质特异性反应的物质固定到聚合物微粒上(或用与待检测的物质特异性反应的物质敏化聚合物微粒)的方法没有特别限制，只要该方法是物理吸附法即可。固定可以通过本领域已知的常规方法进行。

在固定后，如有需要，可以对聚合物微粒进行使用牛血清白蛋白(BSA)等的封闭处理，并且将其分散于适当的缓冲液中，以制备敏化聚合物微粒分散体。该敏化聚合物微粒分散体可以与用于测定的缓冲溶液和标准物质等组合，并且用作用于粒子免疫比浊法的试剂(试剂盒)。

本发明的聚合物微粒即使在不进行封闭处理的情况下也可以产生良好的测定结果。一些待检测的物质可能容易吸附到粒子表面上。因此，如有需要，可以进行封闭处理。封闭剂可以选自本领域已知的物质，例如，牛血清白蛋白、脱脂牛奶、鱼明胶和表面活性剂。其中，优选使用牛血清白蛋白。

在使用这些物质的情况下，可取的是应该根据待封闭的物质、粒子表面状态等适当选择封闭处理时间、温热条件、浓度等。

与待检测的物质特异性反应的物质(结合部)固定在聚合物微粒上的量根据与所用的测试物质特异性反应的物质的类型而不同，并且没有特别限制。

例如，与待检测的物质特异性反应的物质的固定量可以通过以下确定：将粒子与与待检测的物质特异性反应的物质进行混合以将与待检测的物质特异性反应的物质固定到粒子上，然后进行离心，并且测量没有固定在粒子上的与待检测的物质特异性反应的物质在上清液中的残留量。

为了使用包含聚合物微粒的测定试剂用于抗原、抗体等的固定，测定试剂可以含有各种敏化剂用以改善测定灵敏度或加速抗原-抗体反应。敏化剂的实例包括烷基化多糖(诸如甲基纤维素和乙基纤维素)、支链淀粉和聚乙烯吡咯烷酮。

使用本发明的聚合物微粒高度抑制了非特异性反应。为了进一步抑制由样本中存在的其它物质引起的非特异性反应或增强试剂的保存稳定性，测定试剂可以含有免疫测定方法和使用聚合物微粒的试剂的领域中已知的组分，例如，蛋白质(诸如白蛋白(牛血清白蛋白或卵白蛋白)、酪蛋白或明胶)、其分解产物、肽、氨基酸或表面活性剂。

待检测的物质可以用适当的稀释剂稀释。pH 5.0至9.0的任何缓冲溶液都可以用作稀释剂。其实例包括磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、Tris缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液和柠檬酸盐缓冲溶液。

使用包含聚合物微粒的测定试剂用于固定本发明的抗原或抗体等可以通过光学测量聚合物微粒的凝集程度来测量样本中待检测的物质的反应量，所述聚合物微粒的凝集程度由样本中待检测的物质与固定在聚合物微粒上的与待检测的物质特异性反应的物质反应产生。光学测量可以采用以例如能够检测散射光强度、透射光强度、吸光度等的光学仪器或者提供有多个这些检测方法的光学仪器为代表的用于临床检查的任何一般仪器。

使用本领域已知的常规方法作为用于光学测量凝集程度的方法。其实例包括作为浊度增加检测凝集形成的比浊法，作为粒度分布或平均粒度变化凝集形成检测的方法，以及使用积分球测量由凝集形成引起的前向散射光变化并将比率与透射光强度进行比较的积分球浊度测定。

用于测量凝集程度的变化量的方法的实例包括：在不同时间点获得至少两个测量值并基于这些时间点之间的测量值中的增量(增长率)确定凝集程度的速率测定，以及在特定时间点(通常，考虑的时间点为反应的终点)获得一个测量值并基于该测量值确定凝集成度的终点测定。其中，就测定的便利性和快速性而言，基于比浊法的终点测定是优选的。

尽管上面描述了粒子免疫比浊法，但是本发明的聚合物微粒也可以用于膜免疫测定如侧流测定或免疫层析中，例如通过使微粒含有、结合或包覆有染料或金属、与染料或金属结合或用染料或金属包覆。

本说明书中使用的术语“粒子免疫测定”包括粒子免疫比浊法和膜免疫测定。在本说明书中，将如上所述的含有染料或金属、与染料或金属结合或用染料或金属包覆的本发明的聚合物微粒也称为本发明的复合粒子。

作为使本发明的聚合物微粒含有染料或金属、与染料或金属结合或被覆盖并通过改性或组合使用的方法，可以适当选择包括日本特开2010-185023号公报中记载的方法的现有技术中的现有方法。本发明的所得复合粒子也可以用作膜免疫测定和根据本领域已知的常规方法的测定方法的试剂制剂。

实施例

在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不旨在受到以下给出的实施例的限制。如下所述对所得聚合物微粒的数均粒度进行测量。

根据常规方法，将聚合物微粒置于火棉胶薄膜上，并且在透射电子显微镜(TEM)下拍摄粒子图像。测量图像上的粒度(100个粒子)，并且确定数均粒度和标准偏差。

[比较例1]

(a)主要由聚苯乙烯组成的聚合物粒子(聚苯乙烯粒子)的制造

将装有搅拌器、回流冷凝器、温度检测器、氮气入口和夹套的玻璃反应容器(容量：2L)装入1500g的蒸馏水、280g的苯乙烯、5g的苯乙烯磺酸钠和含有溶于10g的蒸馏水中的0.5g过硫酸钾的水溶液。在用氮气吹扫容器后，在70℃在搅拌下进行聚合24小时。在聚合完成后，将溶液经由滤纸过滤以分离聚苯乙烯粒子。然后，将聚苯乙烯粒子对着透析膜透析48小时以获得纯化的聚苯乙烯粒子。所得聚合物微粒的粒度为215nm(CV：16.1％)。

[参考例1]

<具有微相分离结构的聚合物微粒的制造>

(a)嵌段共聚物

使用聚苯乙烯-聚异戊二烯(SI)二嵌段共聚物[Mn：聚苯乙烯(17,800)-b-聚异戊二烯(12,000)；Mw/Mn＝1.02；由Polymer Source,Inc.制造]。

(b)聚合物微粒的制造

将SI二嵌段共聚物溶于四氢呋喃(THF)溶液(含有稳定剂；由Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造，EP级)中以制备浓度为0.1g/L的THF溶液。该THF溶液以THF溶液:Milli-Q水＝1:2的比率混合。然后，将混合物置于常压和室温下以使良溶剂THF完全蒸发，以获得聚合物微粒分散体。将分散体经由滤纸过滤以分离所得聚合物微粒。然后，将聚合物微粒对着透析膜透析48小时以获得纯化的聚合物微粒。所得聚合物微粒的粒度为400nm(CV：40.3％)。

(c)聚合物微粒的结构

将包含SI二嵌段共聚物的所得聚合物微粒用仅与聚异戊二烯嵌段链段选择性反应的四氧化锇染色，然后在装有高灵敏度YAG反射电子检测器的FE-SEM(S-4800，由HitachiHigh-Technologies Corp.制造)下进行观察。图3是反射电子图像并且显示了锇存在于白色部分中。经确认，在该聚合物微粒的表面上形成了层状的周期性微相分离结构。

[实施例1]

<具有微相分离结构的本发明的聚合物微粒的制造>

(a)嵌段共聚物

使用聚苯乙烯-聚异戊二烯-聚苯乙烯(SIS)三嵌段共聚物[D1114P，Mn：聚苯乙烯(8000)-b-聚异戊二烯(26000)-b-聚苯乙烯(5000)；Mw/Mn＝1.04；由Polymer Source,Inc.制造]。

(b)聚合物微粒的制造

将1.0g的SIS三嵌段共聚物溶于10mL的乙酸乙酯中以获得聚合物溶液。将该聚合物溶液添加到50mL的水中并使用超声波均化器进行乳液分散。将所得乳液在具有减压装置的反应器中在50℃、6小时和0.1MPa的条件下加热和减压以除去乙酸乙酯，从而获得聚合物微粒分散体。将所得聚合物微粒在水中反复离心以除去散粒。将所得溶液经由滤纸过滤以分离所得聚合物微粒。然后，将聚合物微粒对着透析膜透析48小时以获得纯化的聚合物微粒。所得聚合物微粒的粒度为210nm(CV：18.9％)。

(c)聚合物微粒的结构

将包含SIS三嵌段共聚物的所得聚合物微粒用仅与聚异戊二烯嵌段链段选择性反应的四氧化锇染色，然后在装有高灵敏度YAG反射电子检测器的FE-SEM(S-4800，由HitachiHigh-Technologies Corp.制造)下进行观察。图1是反射电子图像并且显示了锇存在于白色部分中。经确认，在本发明的聚合物微粒的表面上形成了海岛微相分离结构。

[实施例2]

<具有微相分离结构的本发明的聚合物微粒的制造>

(a-2)单体

使用苯乙烯[由Wako Pure Chemical Industries,Ltd.制造]作为具有针对待检测的物质的结合部的单体，并且使用甲基丙烯酸叔丁酯[由Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.制造]作为不具有针对待检测的物质的结合部的单体。

(b-2)聚合物微粒的制造

将装有搅拌器、回流冷凝器、温度检测器、氮气入口和夹套的玻璃反应容器(容量：50mL)装入12g的蒸馏水、8g的乙醇、1.4g的甲基丙烯酸叔丁酯、0.0036g的S-十二烷基-S’-(α,α’-二甲基-α”-乙酸)三硫代碳酸酯和0.00012g的2,2’-偶氮双(2,4-二甲基戊腈)。在用氮气吹扫容器后，在80℃在搅拌下进行聚合48小时。然后，向其中添加1.0g的苯乙烯，并且在80℃在搅拌下进一步进行聚合48小时。在聚合完成后，通过添加10ml的四氢呋喃使粒子溶胀，然后在室温下搅拌24小时以除去THF。在离心机中将固体物质从所得溶液中回收，用水重复洗涤，然后对着透析膜透析48小时以获得纯化的相分离粒子。所得相分离粒子的粒度为300nm(CV：10.3％)。

(c-2)聚合物微粒的结构

将包含嵌段共聚物的所得聚合物微粒用仅与聚甲基丙烯酸叔丁酯嵌段链段选择性反应的四氧化钌染色，然后在装有高灵敏度YAG反射电子检测器的FE-SEM(S-4800，由Hitachi High-Technologies Corp.制造)下进行观察。

如上所述，与常规聚合物微粒相比，实施例1和2的聚合物微粒具有适于临床检查的实际用途的平均粒度和变动系数。

[应用实施例]

将适于待检测的物质的抗原或抗体固定到本发明的聚合物微粒上以制备用于待检测的物质的测定试剂。固定在粒子上的抗原或抗体的控制状态可以通过使用广泛使用的用于临床检查的自动分析装置的测定来确认。

使用以下试剂和材料。

<试剂和材料>

抗-D二聚体抗体

用于抗体固定的聚合物微粒制备的缓冲溶液：使用20mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)。

用于封闭的缓冲溶液：使用含有2％BSA的20mmol/L Tris-HCL(pH 8.0)。

用于样本稀释的缓冲溶液：使用含有0.15％BSA的30mmol/L Tris-HCL(pH 8.5)。

<用于D二聚体测定的试剂的制备>

将实施例1和比较例1的每一个中获得的聚合物微粒通过离心进行纯化，然后使用用于抗体固定的聚合物微粒制备的缓冲溶液稀释至5％(w/v)，以制备聚合物微粒稀释液。

另一方面，使用用于抗体固定的聚合物微粒制备的缓冲溶液将抗-D二聚体抗体稀释至0.1mg/mL的浓度，以制备抗体稀释液。

添加1体积的抗体稀释液并在搅拌下与1体积的聚合物微粒稀释液混合，并且进一步搅拌混合物。然后，向其进一步添加2体积的(1)用于抗体固定的聚合物微粒制备的缓冲溶液或(2)用于封闭的缓冲溶液，并且继续搅拌。然后，将该混合物回收并且使用用于抗体固定的聚合物微粒制备的缓冲溶液将其调节至0.5％(w/v)的聚合物微粒浓度，以制备抗体固定的聚合物微粒分散体。在此，使用(1)制备的分散体被称为“用于不进行封闭的测试”，并且使用(2)制备的分散体被称为“用于进行封闭的测试”。

使用这些抗体固定的聚合物微粒分散体和D二聚体抗原标准溶液制备校准曲线。

装置：Hitachi自动分析装置7170型

使用的波长：570/800nm，测定温度：37℃

待检查的物质(0至60μg/mL D二聚体标准溶液)：12μL

第一试剂(含有0.15％BSA的30mmol/L Tris-HCL(pH 8.5))：100μL

第二试剂(抗体固定的聚合物微粒(0.5％(w/v))分散体)：100μL

光测量点：18-34

[测定实施例1]

使用实施例1和比较例1的抗体固定的聚合物微粒(0.5％(w/v))分散体(用于不进行封闭的测试和用于进行封闭的测试)，通过根据上述测定方法的测定来制作标准曲线。在使用实施例1的聚合物微粒的情况下，无论存在或不存在封闭，都实现了具有轻微背景凝集的高灵敏度测定。另一方面，在使用比较例1的聚合物微粒的情况下，与实施例1相比，由于高背景凝集而不能获得实质的灵敏度。这些结果表明，本发明的聚合物微粒即使在不进行封闭处理的情况下也具有优异的SN比率，并且可用于粒子免疫测定等。

[表1]

数值表示mOD。

工业适用性

本发明的用于粒子免疫测定的聚合物微粒可以用于利用抗原-抗体反应的免疫测定，特别是使用聚合物微粒的粒子免疫比浊法。

Claims (8)

1.一种聚合物微粒，所述聚合物微粒包含具有两个以上链段的嵌段共聚物，其中

所述聚合物微粒在其表面上具有微相分离结构，

数均粒度为50nm至1000nm，并且

变动系数小于20％。

2.根据权利要求1所述的聚合物微粒，其中

具有所述微相分离结构的所述表面由以下组成：

具有针对待检测的物质的结合部的结合相，和

针对所述待检测的物质的非结合相。

3.根据权利要求2所述的聚合物微粒，其中所述微相分离结构为海岛或层状微相分离结构。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的聚合物微粒，其中所述具有两个以上链段的嵌段共聚物为具有A-B-A结构的三嵌段共聚物。

5.根据权利要求4所述的聚合物微粒，其中所述具有A-B-A结构的三嵌段共聚物为苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯(SIS)三嵌段共聚物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的聚合物微粒，其中所述结合相与所述非结合相的比率(所述结合相/所述非结合相)为10/90至40/60。

7.一种用于粒子免疫测定的试剂，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的聚合物微粒。

8.一种粒子免疫测定方法，其包括使用根据权利要求7所述的用于粒子免疫测定的试剂。