JP2001050963A - 免疫学的凝集反応試薬 - Google Patents
免疫学的凝集反応試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】免疫学的凝集反応の感度上昇がのぞまれてい
る。 【解決手段】ラテックスをはじめとする微粒子を用いた
免疫学的凝集反応において、モルフォリノアクリルアミ
ドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体が反応促進効
果が大きく、感度を向上させることができた。
る。 【解決手段】ラテックスをはじめとする微粒子を用いた
免疫学的凝集反応において、モルフォリノアクリルアミ
ドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体が反応促進効
果が大きく、感度を向上させることができた。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応を利
用した免疫学的凝集反応に基づく測定試薬における凝集
反応試薬に関する。
用した免疫学的凝集反応に基づく測定試薬における凝集
反応試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、抗原抗体反応を利用した測定試薬
として、抗原あるいは抗体を物理吸着あるいは共有結合
により感作した不溶性担体粒子（以下、感作粒子と略
す）が用いられている。この感作粒子と血清あるいは尿
等の検体中の対応する抗体あるいは抗原との間における
抗原抗体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を
観測することにより、検体中の対応する抗体あるいは抗
原を測定する試薬が知られている。この感作粒子を用い
る測定方法は検体中に含まれる微量の抗体あるいは抗原
を迅速に、高精度でかつ簡便に測定できるため広く利用
されている。
として、抗原あるいは抗体を物理吸着あるいは共有結合
により感作した不溶性担体粒子（以下、感作粒子と略
す）が用いられている。この感作粒子と血清あるいは尿
等の検体中の対応する抗体あるいは抗原との間における
抗原抗体反応に基づく凝集反応あるいは凝集阻止反応を
観測することにより、検体中の対応する抗体あるいは抗
原を測定する試薬が知られている。この感作粒子を用い
る測定方法は検体中に含まれる微量の抗体あるいは抗原
を迅速に、高精度でかつ簡便に測定できるため広く利用
されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、免疫学
的凝集反応試薬を使用する医療の現場から、疾病をより
早期に診断して早期に治療を開始するために、従来に増
してより微量の抗体または抗原を測定することが求めら
れている。従来の免疫学的凝集反応の試薬の中にポリエ
チレングリコール、デキストランあるいはポリビニルピ
ロリドン等の非イオン性の水溶性高分子を添加すると、
試薬の測定感度が向上し、反応促進作用を示すことが知
られている。しかしながら、分子量の大きい水溶性高分
子を添加すると試薬の粘度が大きくなり検体との混合が
素早く進まなかったり、自動測定機の試薬プローブでの
計量や用手法のピペッティング時の計量が一定にならな
かったりする。更にはそれら水溶性高分子と検体中の蛋
白が反応したり、感作粒子同士が凝集したりして測定の
特異性が劣る欠点があった。
的凝集反応試薬を使用する医療の現場から、疾病をより
早期に診断して早期に治療を開始するために、従来に増
してより微量の抗体または抗原を測定することが求めら
れている。従来の免疫学的凝集反応の試薬の中にポリエ
チレングリコール、デキストランあるいはポリビニルピ
ロリドン等の非イオン性の水溶性高分子を添加すると、
試薬の測定感度が向上し、反応促進作用を示すことが知
られている。しかしながら、分子量の大きい水溶性高分
子を添加すると試薬の粘度が大きくなり検体との混合が
素早く進まなかったり、自動測定機の試薬プローブでの
計量や用手法のピペッティング時の計量が一定にならな
かったりする。更にはそれら水溶性高分子と検体中の蛋
白が反応したり、感作粒子同士が凝集したりして測定の
特異性が劣る欠点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記欠点
を解消し得る免疫学的凝集反応試薬を得るため鋭意研究
してきた結果、感作粒子と緩衝液を含有して成る測定試
薬において、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−
ビニルアシルアミド重合体を含むことにより、臨床的な
診断においてその抗原抗体反応の特異性を損なわず、か
つ感度が向上することを見出し、本発明を完成するに至
った。即ち、本発明は、抗原あるいは抗体を感作した不
溶性担体粒子を含む免疫学的測定試薬において、モルフ
ォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド
重合体を含有することを特徴とする免疫学的凝集反応試
薬である。
を解消し得る免疫学的凝集反応試薬を得るため鋭意研究
してきた結果、感作粒子と緩衝液を含有して成る測定試
薬において、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−
ビニルアシルアミド重合体を含むことにより、臨床的な
診断においてその抗原抗体反応の特異性を損なわず、か
つ感度が向上することを見出し、本発明を完成するに至
った。即ち、本発明は、抗原あるいは抗体を感作した不
溶性担体粒子を含む免疫学的測定試薬において、モルフ
ォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド
重合体を含有することを特徴とする免疫学的凝集反応試
薬である。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニ
ルアシルアミド重合体の分子量は、プルランを基準とす
るＧＰＣ法において１万から２００万程度のものが好ま
しく、３０万から１００万程度のものが特に好ましい。
本発明のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニ
ルアシルアミド重合体の分子量は、プルランを基準とす
るＧＰＣ法において１万から２００万程度のものが好ま
しく、３０万から１００万程度のものが特に好ましい。
【０００６】本発明で使用するＮ−ビニルアシルアミド
のアシル基としては、直鎖または分岐した炭素数１乃至
５のアシル基、例えばホルミル基、アセチル基、プロピ
オニル基、イソブチリル基等が好ましく、ホルミル基、
アセチル基が特に好ましい。即ち、Ｎ−ビニルホルムア
ミド、Ｎ−ビニルアセトアミドが特に好ましい。本発明
のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシ
ルアミド重合体は、モルフォリノアクリルアミドあるい
はＮ−ビニルアシルアミドの単独重合体、あるいはモル
フォリノアクリルアミドとＮ−ビニルアシルアミドとの
共重合体、あるいはモルフォリノアクリルアミドあるい
はＮ−ビニルアシルアミドと共重合可能な非イオン性重
合性モノマーとの共重合体等を示す。モルフォリノアク
リルアミドとＮ−ビニルアシルアミドとの共重合比は、
１：９９モル％から９９：１モル％の任意の値をとり得
る。共重合可能な非イオン性重合性モノマーとしては、
例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ヒ
ドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエ
チレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピ
ロリドン等の水溶性モノマー類、あるいはメチル（メ
タ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチ
ル（メタ）アクリレート、スチレン、酢酸ビニル、アク
リロニトリル等の疎水性モノマー類が挙げられる。その
共重合比はモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミドに対して水溶性モノマー類では、通常
１〜９０モル％、好ましくは１〜５０モル％、更に好ま
しくは１〜３０モル％、疎水性モノマー類では、通常１
〜５０モル％、好ましくは１〜２５モル％、更に好まし
くは１〜１０モル％である。また、これら共重合可能な
モノマーを複数組み合わせた３元以上の多元共重合体も
採用できる。
のアシル基としては、直鎖または分岐した炭素数１乃至
５のアシル基、例えばホルミル基、アセチル基、プロピ
オニル基、イソブチリル基等が好ましく、ホルミル基、
アセチル基が特に好ましい。即ち、Ｎ−ビニルホルムア
ミド、Ｎ−ビニルアセトアミドが特に好ましい。本発明
のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシ
ルアミド重合体は、モルフォリノアクリルアミドあるい
はＮ−ビニルアシルアミドの単独重合体、あるいはモル
フォリノアクリルアミドとＮ−ビニルアシルアミドとの
共重合体、あるいはモルフォリノアクリルアミドあるい
はＮ−ビニルアシルアミドと共重合可能な非イオン性重
合性モノマーとの共重合体等を示す。モルフォリノアク
リルアミドとＮ−ビニルアシルアミドとの共重合比は、
１：９９モル％から９９：１モル％の任意の値をとり得
る。共重合可能な非イオン性重合性モノマーとしては、
例えば、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ヒ
ドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエ
チレングリコール（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピ
ロリドン等の水溶性モノマー類、あるいはメチル（メ
タ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチ
ル（メタ）アクリレート、スチレン、酢酸ビニル、アク
リロニトリル等の疎水性モノマー類が挙げられる。その
共重合比はモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミドに対して水溶性モノマー類では、通常
１〜９０モル％、好ましくは１〜５０モル％、更に好ま
しくは１〜３０モル％、疎水性モノマー類では、通常１
〜５０モル％、好ましくは１〜２５モル％、更に好まし
くは１〜１０モル％である。また、これら共重合可能な
モノマーを複数組み合わせた３元以上の多元共重合体も
採用できる。
【０００７】これらモノマーを重合するには、一般的な
ラジカル重合を採用することで達成できる。即ち、攪拌
可能な反応装置にモノマーと溶媒、開始剤を加え、窒素
置換の後加熱することで重合が開始し、一定時間その温
度を保つことで重合は完結する。必要に応じさらに温度
を上げて重合を完結することも高重合度の重合体を得る
には良い。得られた重合体は乾燥により固体として得ら
れる。必要に応じて粉砕し粉末とすることができる。
ラジカル重合を採用することで達成できる。即ち、攪拌
可能な反応装置にモノマーと溶媒、開始剤を加え、窒素
置換の後加熱することで重合が開始し、一定時間その温
度を保つことで重合は完結する。必要に応じさらに温度
を上げて重合を完結することも高重合度の重合体を得る
には良い。得られた重合体は乾燥により固体として得ら
れる。必要に応じて粉砕し粉末とすることができる。
【０００８】重合の際に用いられる溶剤としては、メタ
ノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアル
コール類、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、メチルエ
チルケトン等の有機溶剤、あるいは水が用いられる。ま
た、これらを混合して用いることもできる。水を用いる
と得られた重合体をそのまま使用することもできるので
便利である。
ノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアル
コール類、酢酸エチル、トルエン、ベンゼン、メチルエ
チルケトン等の有機溶剤、あるいは水が用いられる。ま
た、これらを混合して用いることもできる。水を用いる
と得られた重合体をそのまま使用することもできるので
便利である。
【０００９】重合開始剤としては、一般的にラジカル重
合で用いられる過酸化物系、アゾ系のラジカル開始剤が
用いられる。例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニ
ウム、過酸化水素等の無機系過酸化物、ベンゾイルパー
オキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、クメ
ンパーオキサイド等の有機過酸化物系開始剤、２，２’
−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス
（２−アミジノプロパン）ジハイドロクロライド、ジメ
チル ２，２’−アゾビスブチレート、ジメチル２，
２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）等のアゾ
系の開始剤が用いられる。また、過酸化物系の開始剤に
還元剤を組み合わせたレドックス開始剤も採用できる。
合で用いられる過酸化物系、アゾ系のラジカル開始剤が
用いられる。例えば、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニ
ウム、過酸化水素等の無機系過酸化物、ベンゾイルパー
オキサイド、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、クメ
ンパーオキサイド等の有機過酸化物系開始剤、２，２’
−アゾビスイソブチロニトリル、２，２’−アゾビス
（２−アミジノプロパン）ジハイドロクロライド、ジメ
チル ２，２’−アゾビスブチレート、ジメチル２，
２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）等のアゾ
系の開始剤が用いられる。また、過酸化物系の開始剤に
還元剤を組み合わせたレドックス開始剤も採用できる。
【００１０】重合する際の温度は、溶剤の種類、開始剤
の種類によって異なるが、開始剤の１０時間半減期温度
付近を採用するのが好ましい。一般的には、５０〜８０
℃の温度が採用される。モルフォリノアクリルアミドあ
るいはＮ−ビニルアシルアミド重合体の使用量は、感作
粒子が非特異的に凝集して特異性が低下しない程度であ
ればよく、測定時の濃度として０．０１〜５％の範囲に
ある場合が好ましく、０．１〜２％の範囲が特に好まし
い。本発明の測定試薬は、一つの分散液状である必要は
無く、複数の溶液および分散液で構成されていても良
い。測定試薬が一つの分散液状の場合、検体と測定試薬
を混合するだけで測定でき、測定試薬が複数の液からな
る場合は、一定の操作手順に従って試薬の各部と検体と
を混合して使用できる。測定試薬が複数に分かれている
場合には、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミド重合体を添加して保存中に試薬の特性
に変化が生じない様に構成成分を選べば良い。なお、測
定試薬を一つの分散液状にする場合には、感作粒子を分
散した液とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミド重合体を添加した緩衝液の二液を調製
し、使用直前に一液に混合すれば、保存中における感作
担体粒子とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミド重合体の非特異的な反応が完全に防止
できるため好ましい。また、感作粒子の乾燥品および固
体のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルア
シルアミド重合体をそれぞれ別個の測定試薬の一構成部
品とすることも可能である。
の種類によって異なるが、開始剤の１０時間半減期温度
付近を採用するのが好ましい。一般的には、５０〜８０
℃の温度が採用される。モルフォリノアクリルアミドあ
るいはＮ−ビニルアシルアミド重合体の使用量は、感作
粒子が非特異的に凝集して特異性が低下しない程度であ
ればよく、測定時の濃度として０．０１〜５％の範囲に
ある場合が好ましく、０．１〜２％の範囲が特に好まし
い。本発明の測定試薬は、一つの分散液状である必要は
無く、複数の溶液および分散液で構成されていても良
い。測定試薬が一つの分散液状の場合、検体と測定試薬
を混合するだけで測定でき、測定試薬が複数の液からな
る場合は、一定の操作手順に従って試薬の各部と検体と
を混合して使用できる。測定試薬が複数に分かれている
場合には、モルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミド重合体を添加して保存中に試薬の特性
に変化が生じない様に構成成分を選べば良い。なお、測
定試薬を一つの分散液状にする場合には、感作粒子を分
散した液とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミド重合体を添加した緩衝液の二液を調製
し、使用直前に一液に混合すれば、保存中における感作
担体粒子とモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビ
ニルアシルアミド重合体の非特異的な反応が完全に防止
できるため好ましい。また、感作粒子の乾燥品および固
体のモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルア
シルアミド重合体をそれぞれ別個の測定試薬の一構成部
品とすることも可能である。
【００１１】続いて、本発明の凝集反応試薬を使用する
免疫学的測定法について説明する。本発明において使用
するモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルア
シルアミド重合体を緩衝液中で用いる場合は、緩衝液は
種々の緩衝液が使用できるが、例えばリン酸緩衝液、グ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液あるいはグッ
ドの緩衝液などが好ましい。その濃度、ｐＨは特に限定
されずに使用できるが、１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で
ｐＨ４〜９の範囲が好ましい。感作粒子は抗原または抗
体を不溶性担体粒子に感作して調製する。
免疫学的測定法について説明する。本発明において使用
するモルフォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルア
シルアミド重合体を緩衝液中で用いる場合は、緩衝液は
種々の緩衝液が使用できるが、例えばリン酸緩衝液、グ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、塩化アンモニウム−アンモニア緩衝液あるいはグッ
ドの緩衝液などが好ましい。その濃度、ｐＨは特に限定
されずに使用できるが、１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で
ｐＨ４〜９の範囲が好ましい。感作粒子は抗原または抗
体を不溶性担体粒子に感作して調製する。
【００１２】不溶性担体粒子としては、感作、保存およ
び測定を行う時に用いられる液体媒体、一般的には緩衝
液に不溶性、即ち水に不溶性の粒子である。これらの微
粒子としてはすでに抗原抗体反応に使用されているもの
が種々知られており、本発明においてもこれらの公知の
微粒子が特に限定されず使用できる。特に好ましく用い
られるものを例示すると、ポリスチレン、スチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体、スチレン−ブタジエン共重合
体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリ
シジルメタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、ポリアクロレインの様な乳化重合法により得
られる有機高分子ラテックスなどの有機高分子物質の微
粒子、あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの
様な無機酸化物あるいは各種酸化鉄の様な磁性微粒子、
またはこれら無機酸化物などにシランカップリング処理
などの操作で官能基を導入したり、無機微粒子を有機高
分子で被覆した複合微粒子などがあり、生物由来の粒子
としてはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球、ニワトリ赤血
球などの生物由来の粒子などがある。
び測定を行う時に用いられる液体媒体、一般的には緩衝
液に不溶性、即ち水に不溶性の粒子である。これらの微
粒子としてはすでに抗原抗体反応に使用されているもの
が種々知られており、本発明においてもこれらの公知の
微粒子が特に限定されず使用できる。特に好ましく用い
られるものを例示すると、ポリスチレン、スチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体、スチレン−ブタジエン共重合
体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリ
シジルメタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、ポリアクロレインの様な乳化重合法により得
られる有機高分子ラテックスなどの有機高分子物質の微
粒子、あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、アルミナの
様な無機酸化物あるいは各種酸化鉄の様な磁性微粒子、
またはこれら無機酸化物などにシランカップリング処理
などの操作で官能基を導入したり、無機微粒子を有機高
分子で被覆した複合微粒子などがあり、生物由来の粒子
としてはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球、ニワトリ赤血
球などの生物由来の粒子などがある。
【００１３】上記不溶性担体粒子の粒子径については、
粒子径が大きい場合、凝集にともなう粒子径の変化量は
大きいが凝集反応速度が遅く、粒子径が小さいとブラウ
ン運動が活発で凝集反応速度は速いが一次粒子径が小さ
いために凝集反応にともなう粒子径の変化量が小さい。
このために凝集反応に用いられる不溶性担体粒子の平均
粒子径は１０μｍ以下、好ましくは０．０５〜５．０μ
ｍ、特に好ましくは０．１〜１．０μｍの不溶性担体粒
子が用いられる。
粒子径が大きい場合、凝集にともなう粒子径の変化量は
大きいが凝集反応速度が遅く、粒子径が小さいとブラウ
ン運動が活発で凝集反応速度は速いが一次粒子径が小さ
いために凝集反応にともなう粒子径の変化量が小さい。
このために凝集反応に用いられる不溶性担体粒子の平均
粒子径は１０μｍ以下、好ましくは０．０５〜５．０μ
ｍ、特に好ましくは０．１〜１．０μｍの不溶性担体粒
子が用いられる。
【００１４】不溶性担体粒子に感作する抗原あるいは抗
体としては、特に限定されず公知のものが使用できる。
代表的なものは、例えば抗ヒトアルファフェトプロテイ
ン（ＡＦＰ）抗体、抗癌胎児性蛋白（ＣＥＡ）抗体、抗
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｈ
Ｂｓ）、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト反応性蛋白（ＣＲＰ）抗
体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗アルブミン抗体、抗
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体、抗イムノグロブリ
ンＡ（ＩｇＡ）抗体、抗イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）
抗体、抗補体第三成分（Ｃ３）抗体、抗補体第四成分
（Ｃ４）抗体、、変性ガンマグロブリン、抗ヒト胎盤ラ
クトゲン（ｈＰＬ）、抗ヒト絨毛性ゴナドロビン（ｈＣ
Ｇ）抗体、インスリン、抗インスリン抗体、梅毒トレポ
ネーマ抗原、風疹抗原、抗ロタウィルス抗体等の公知の
抗原あるいは抗体をあげることができる。
体としては、特に限定されず公知のものが使用できる。
代表的なものは、例えば抗ヒトアルファフェトプロテイ
ン（ＡＦＰ）抗体、抗癌胎児性蛋白（ＣＥＡ）抗体、抗
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）抗体、Ｂ型肝炎表面抗原（Ｈ
Ｂｓ）、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト反応性蛋白（ＣＲＰ）抗
体、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗アルブミン抗体、抗
イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体、抗イムノグロブリ
ンＡ（ＩｇＡ）抗体、抗イムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）
抗体、抗補体第三成分（Ｃ３）抗体、抗補体第四成分
（Ｃ４）抗体、、変性ガンマグロブリン、抗ヒト胎盤ラ
クトゲン（ｈＰＬ）、抗ヒト絨毛性ゴナドロビン（ｈＣ
Ｇ）抗体、インスリン、抗インスリン抗体、梅毒トレポ
ネーマ抗原、風疹抗原、抗ロタウィルス抗体等の公知の
抗原あるいは抗体をあげることができる。
【００１５】不溶性担体粒子に抗原あるいは抗体を感作
する方法は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のいず
れでもよい。物理的吸着法による感作は、一般的に行わ
れているように、不溶性担体粒子と抗原あるいは抗体を
適当な緩衝液中で混合すれば良く、緩衝液の種類、濃
度、ｐＨ、抗原あるいは抗体の濃度、あるいは感作時の
温度、時間等の最適な条件を選べばよい。化学的共有結
合の形成については、すでに多くの方法が提案されてお
り、感作する抗原あるいは抗体の特性に合わせ公知の方
法から感作方法を選択すれば良い。一般には分散媒中で
抗体を必要に応じて架橋剤の存在下に不溶性担体粒子と
混合すれば良い。架橋剤としてはグルタルアルデヒド、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩などの公知のものが使用できる。さら
に、抗原あるいは抗体を感作した後、抗原あるいは抗体
のついていない不溶性担体粒子表面をブロックするため
免疫学的に不活性な蛋白、例えば牛血清アルブミン、カ
ゼイン、ゼラチン等を感作することも一般的に行われて
いる。
する方法は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のいず
れでもよい。物理的吸着法による感作は、一般的に行わ
れているように、不溶性担体粒子と抗原あるいは抗体を
適当な緩衝液中で混合すれば良く、緩衝液の種類、濃
度、ｐＨ、抗原あるいは抗体の濃度、あるいは感作時の
温度、時間等の最適な条件を選べばよい。化学的共有結
合の形成については、すでに多くの方法が提案されてお
り、感作する抗原あるいは抗体の特性に合わせ公知の方
法から感作方法を選択すれば良い。一般には分散媒中で
抗体を必要に応じて架橋剤の存在下に不溶性担体粒子と
混合すれば良い。架橋剤としてはグルタルアルデヒド、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド塩酸塩などの公知のものが使用できる。さら
に、抗原あるいは抗体を感作した後、抗原あるいは抗体
のついていない不溶性担体粒子表面をブロックするため
免疫学的に不活性な蛋白、例えば牛血清アルブミン、カ
ゼイン、ゼラチン等を感作することも一般的に行われて
いる。
【００１６】不溶性担体粒子に抗原または抗体を感作す
る際の分散媒は特に限定されるものではなく公知のもの
が使用されるが、上記の架橋剤を使用する場合には分散
媒中の成分が架橋剤と反応しない分散媒を用いる必要が
ある。感作する際の不溶性担体粒子の分散媒中の濃度は
特に限定されるものではないが、一般には抗原または抗
体と混合した時点で０．０５重量％以上、好ましくは
０．２〜２．０重量％となるように選ぶのが好ましい。
る際の分散媒は特に限定されるものではなく公知のもの
が使用されるが、上記の架橋剤を使用する場合には分散
媒中の成分が架橋剤と反応しない分散媒を用いる必要が
ある。感作する際の不溶性担体粒子の分散媒中の濃度は
特に限定されるものではないが、一般には抗原または抗
体と混合した時点で０．０５重量％以上、好ましくは
０．２〜２．０重量％となるように選ぶのが好ましい。
【００１７】本発明において、感作担体粒子を用いた免
疫学的測定方法、即ち、抗体感作担体粒子上の抗原また
は抗体と被検体中の反応する抗体または抗原などとの間
における抗原抗体反応に基づく凝集反応を観測する方法
は、目視、光学的測定方法など公知の方法が特に限定さ
れず使用できる。光学的測定方法には、一定波長の吸光
度、濁度あるいは散乱光の変化または可視光の全波長に
よる濁度の変化による方法などがある。
疫学的測定方法、即ち、抗体感作担体粒子上の抗原また
は抗体と被検体中の反応する抗体または抗原などとの間
における抗原抗体反応に基づく凝集反応を観測する方法
は、目視、光学的測定方法など公知の方法が特に限定さ
れず使用できる。光学的測定方法には、一定波長の吸光
度、濁度あるいは散乱光の変化または可視光の全波長に
よる濁度の変化による方法などがある。
【００１８】
【実施例】以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説
明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 （１） ＡＦＰの測定 （ａ）抗ＡＦＰ感作ラテックスの作成 平均粒径０．３２μｍのラテックスを５０ｍＭグリシン
緩衝液（ｐＨ９．５）に１Ｗ／Ｖ％の濃度で分散し、抗
ＡＦＰ血清（ヤギ、ＩｇＧ分画）を０．２５ｍｇ／ｍｌ
の濃度で同緩衝液に溶解したものを等量混合し、４℃で
一晩静置した。さらに、上記溶液の半量の同緩衝液に溶
解した５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）液を加え、室温
で４時間ゆっくり振とうし、０．１％ＢＳＡを含む５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で遠心洗浄を３回
行い、最終的にラテックス濃度０．２５％となるように
０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に分散し、抗ＡＦＰ感作ラテックスを得た。
明するが本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 （１） ＡＦＰの測定 （ａ）抗ＡＦＰ感作ラテックスの作成 平均粒径０．３２μｍのラテックスを５０ｍＭグリシン
緩衝液（ｐＨ９．５）に１Ｗ／Ｖ％の濃度で分散し、抗
ＡＦＰ血清（ヤギ、ＩｇＧ分画）を０．２５ｍｇ／ｍｌ
の濃度で同緩衝液に溶解したものを等量混合し、４℃で
一晩静置した。さらに、上記溶液の半量の同緩衝液に溶
解した５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）液を加え、室温
で４時間ゆっくり振とうし、０．１％ＢＳＡを含む５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で遠心洗浄を３回
行い、最終的にラテックス濃度０．２５％となるように
０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に分散し、抗ＡＦＰ感作ラテックスを得た。
【００１９】（ｂ）検体希釈用緩衝液 実施例１ ポリモルフォリノアクリルアミド ポリモルフォリノアクリルアミド水溶液は、モルフォリ
ノアクリルアミド８０ｇ、次亜リン酸ナトリウム２０ｍ
ｇを２４０ｍｌの水に溶解し、過硫酸カリウム８０ｍｇ
を重合触媒として、常法により６５℃で８時間、８０℃
で２時間重合して得られた。この重合体を０．５Ｗ／Ｖ
％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 実施例２ モルフォリノアクリルアミド：アクリルアミ
ド共重合体 モルフォリノアクリルアミド：アクリルアミド共重合体
は、モルフォリノアクリルアミド７０ｇ、アクリルアミ
ド１０ｇと次亜リン酸ナトリウム２０ｍｇを２４０ｍｌ
の水に分散溶解し、実施例１の重合と同様にして得られ
た。この共重合体を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように
０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に溶解した。
ノアクリルアミド８０ｇ、次亜リン酸ナトリウム２０ｍ
ｇを２４０ｍｌの水に溶解し、過硫酸カリウム８０ｍｇ
を重合触媒として、常法により６５℃で８時間、８０℃
で２時間重合して得られた。この重合体を０．５Ｗ／Ｖ
％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 実施例２ モルフォリノアクリルアミド：アクリルアミ
ド共重合体 モルフォリノアクリルアミド：アクリルアミド共重合体
は、モルフォリノアクリルアミド７０ｇ、アクリルアミ
ド１０ｇと次亜リン酸ナトリウム２０ｍｇを２４０ｍｌ
の水に分散溶解し、実施例１の重合と同様にして得られ
た。この共重合体を０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように
０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）に溶解した。
【００２０】実施例３ モルフォリノアクリルアミド：
酢酸ビニル：Ｎ−ビニルピロリドン共重合体 モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニル
ピロリドン共重合体は、モルフォリノアクリルアミド４
０ｇ、酢酸ビニル１６．４ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン
２．３６ｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１の
重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ／
Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 実施例４ モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：
Ｎ−ビニルホルムアミド共重合体 モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニル
ホルムアミド共重合体は、モルフォリノアクリルアミド
４０ｇ、酢酸ビニル１６．４ｇ、Ｎ−ビニルホルムアミ
ド２．３６ｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１
の重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ
／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
酢酸ビニル：Ｎ−ビニルピロリドン共重合体 モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニル
ピロリドン共重合体は、モルフォリノアクリルアミド４
０ｇ、酢酸ビニル１６．４ｇ、Ｎ−ビニルピロリドン
２．３６ｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１の
重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ／
Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 実施例４ モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：
Ｎ−ビニルホルムアミド共重合体 モルフォリノアクリルアミド：酢酸ビニル：Ｎ−ビニル
ホルムアミド共重合体は、モルフォリノアクリルアミド
４０ｇ、酢酸ビニル１６．４ｇ、Ｎ−ビニルホルムアミ
ド２．３６ｇを２４０ｍｌの水に分散溶解し、実施例１
の重合と同様にして得られた。この共重合体を０．５Ｗ
／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２１】実施例５ ポリＮ−ビニルホルムアミド ポリＮ−ビニルホルムアミド（三菱化学（株）製）を
０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 実施例６ ポリＮ−ビニルアセトアミド ポリＮ−ビニルアセトアミド（昭和電工（株）製）を
０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 実施例６ ポリＮ−ビニルアセトアミド ポリＮ−ビニルアセトアミド（昭和電工（株）製）を
０．５Ｗ／Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２２】比較例１ ０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．４）。 比較例２ ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）を０．５Ｗ／Ｖ％濃
度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 比較例３ デキストラン（平均分子量２５００００）を１．０Ｗ／
Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
７．４）。 比較例２ ポリビニルピロリドン（Ｋ−９０）を０．５Ｗ／Ｖ％濃
度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。 比較例３ デキストラン（平均分子量２５００００）を１．０Ｗ／
Ｖ％濃度となるように０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。
【００２３】（Ｃ）ＡＦＰの測定 感作ラテックスを用いたラテックス凝集法の測定は凝集
による濁度即ち一定波長の吸光度の変化量を求めれば良
い。ここでは生化学検査で汎用されている日立７１５０
型自動分析装置を用いて測定した。その測定パラメータ
を示す。 検体 １５μＬ 検体希釈用緩衝液（Ｒ−１） ２５０μＬ ラテックス懸濁液（Ｒ−２） ８０μＬ 測定波長 ７５０ｎｍ 測光ポイント ２ポイントエンド（３５−５０ポイント） 日立７１５０型自動分析装置では、検体分注後、直ちに
検体希釈用緩衝液が添加され、検体は希釈・混合され
る。その５分後、ラテックス懸濁液が添加され、３５ポ
イントから５０ポイントまでの濁度変化量（ΔＡｂｓ．
（７５０ｎｍ））を求め、これを反応量とした。この結
果を以下に示す。
による濁度即ち一定波長の吸光度の変化量を求めれば良
い。ここでは生化学検査で汎用されている日立７１５０
型自動分析装置を用いて測定した。その測定パラメータ
を示す。 検体 １５μＬ 検体希釈用緩衝液（Ｒ−１） ２５０μＬ ラテックス懸濁液（Ｒ−２） ８０μＬ 測定波長 ７５０ｎｍ 測光ポイント ２ポイントエンド（３５−５０ポイント） 日立７１５０型自動分析装置では、検体分注後、直ちに
検体希釈用緩衝液が添加され、検体は希釈・混合され
る。その５分後、ラテックス懸濁液が添加され、３５ポ
イントから５０ポイントまでの濁度変化量（ΔＡｂｓ．
（７５０ｎｍ））を求め、これを反応量とした。この結
果を以下に示す。
【００２４】 生理食塩液 ＡＦＰ（２０００ｎｇ／ｍｌ） 実施例１ ０．００１ ０．３３６ 実施例２ ０．００１ ０．３０３ 実施例３ ０．００１ ０．２９４ 実施例４ ０．００１ ０．２８９ 実施例５ ０．００２ ０．３５８ 実施例６ ０．００１ ０．３３１ 比較例１ ０．００１ ０．０２５ 比較例２ ０．００１ ０．２０３ 比較例３ ０．００１ ０．１３２
【００２５】（２） 抗梅毒トレポネーマ（ＴＰ）抗体
の測定 （ａ） ＴＰ抗原感作ラテックスの作成 平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックスを５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１Ｗ／Ｖ％の濃度
で分散し、梅毒菌体破砕物（蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍ
ｌ）を等量混合し、４℃で一晩ゆっくり振とうした。さ
らに、上記溶液の半量の同緩衝液に溶解した５％ＢＳＡ
溶液を加え、室温で４時間ゆっくり振とうしブロッキン
グした。その後、０．０１％のノニルフェノール系界面
活性剤を含む０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４）にて遠心洗浄を３回行い、最終的に
ラテックス濃度０．１５％となるように０．１％ＢＳＡ
含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散
し、ＴＰ感作ラテックスを得た。
の測定 （ａ） ＴＰ抗原感作ラテックスの作成 平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックスを５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１Ｗ／Ｖ％の濃度
で分散し、梅毒菌体破砕物（蛋白濃度０．２５ｍｇ／ｍ
ｌ）を等量混合し、４℃で一晩ゆっくり振とうした。さ
らに、上記溶液の半量の同緩衝液に溶解した５％ＢＳＡ
溶液を加え、室温で４時間ゆっくり振とうしブロッキン
グした。その後、０．０１％のノニルフェノール系界面
活性剤を含む０．１％ＢＳＡ含有５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．４）にて遠心洗浄を３回行い、最終的に
ラテックス濃度０．１５％となるように０．１％ＢＳＡ
含有５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に分散
し、ＴＰ感作ラテックスを得た。
【００２６】（ｂ） 検体希釈用緩衝液 検体希釈用緩衝液として、（１）ＡＦＰの測定で用いた
緩衝液を使用した。 （ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 （１）ＡＦＰの測定と同じように日立７１５０型自動分
析装置を用いて測定した。この結果を以下に示す。 生理食塩液 ＴＰ抗体価（４８０倍血清） 実施例１ ０．００１ ０．２２４ 実施例２ ０．００１ ０．２０８ 実施例３ ０．００１ ０．１８５ 実施例４ ０．００１ ０．１８８ 実施例５ ０．００２ ０．２４３ 実施例６ ０．００１ ０．２２０ 比較例１ ０．００１ ０．００９ 比較例２ ０．００１ ０．１２４ 比較例３ ０．００１ ０．０４２
緩衝液を使用した。 （ｃ）抗ＴＰ抗体の測定 （１）ＡＦＰの測定と同じように日立７１５０型自動分
析装置を用いて測定した。この結果を以下に示す。 生理食塩液 ＴＰ抗体価（４８０倍血清） 実施例１ ０．００１ ０．２２４ 実施例２ ０．００１ ０．２０８ 実施例３ ０．００１ ０．１８５ 実施例４ ０．００１ ０．１８８ 実施例５ ０．００２ ０．２４３ 実施例６ ０．００１ ０．２２０ 比較例１ ０．００１ ０．００９ 比較例２ ０．００１ ０．１２４ 比較例３ ０．００１ ０．０４２
【００２７】（３）＜結果＞ 実施例で示した通り、感作粒子の表面の抗原または抗体
と、検体中の対応する抗体または抗原との間で、モルフ
ォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド
重合体が相互に作用して凝集反応を起こしやすくし、そ
の結果として抗原と抗体の反応が促進され、測定感度が
向上したものと考えら、比較例の水溶液高分子と比べて
優れた効果がある。
と、検体中の対応する抗体または抗原との間で、モルフ
ォリノアクリルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド
重合体が相互に作用して凝集反応を起こしやすくし、そ
の結果として抗原と抗体の反応が促進され、測定感度が
向上したものと考えら、比較例の水溶液高分子と比べて
優れた効果がある。
Claims (1)
- 【請求項１】抗原あるいは抗体を感作した不溶性担体粒
子を含む免疫学的測定試薬において、モルフォリノアク
リルアミドあるいはＮ−ビニルアシルアミド重合体を含
有することを特徴とする免疫学的凝集反応試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22188699A JP4151771B2 (ja) | 1999-08-05 | 1999-08-05 | 免疫学的凝集反応試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22188699A JP4151771B2 (ja) | 1999-08-05 | 1999-08-05 | 免疫学的凝集反応試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001050963A true JP2001050963A (ja) | 2001-02-23 |
| JP4151771B2 JP4151771B2 (ja) | 2008-09-17 |
Family
ID=16773728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22188699A Expired - Fee Related JP4151771B2 (ja) | 1999-08-05 | 1999-08-05 | 免疫学的凝集反応試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4151771B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077238A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-12 | Qiagen Gmbh | Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen |
| JP2009053071A (ja) * | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Adeka Corp | 凝集検査用微粒子 |
| JP2015036624A (ja) * | 2013-08-12 | 2015-02-23 | オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 | 検出対象を検出又は定量するためのキット、及び方法 |
| CN108026287A (zh) * | 2015-09-30 | 2018-05-11 | 积水化学工业株式会社 | 提供有微相分离结构颗粒的聚合物微粒、使用其的用于粒子免疫测定的试剂和粒子免疫测定方法 |
-
1999
- 1999-08-05 JP JP22188699A patent/JP4151771B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077238A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-12 | Qiagen Gmbh | Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen |
| JP2009053071A (ja) * | 2007-08-28 | 2009-03-12 | Adeka Corp | 凝集検査用微粒子 |
| JP2015036624A (ja) * | 2013-08-12 | 2015-02-23 | オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会社 | 検出対象を検出又は定量するためのキット、及び方法 |
| CN108026287A (zh) * | 2015-09-30 | 2018-05-11 | 积水化学工业株式会社 | 提供有微相分离结构颗粒的聚合物微粒、使用其的用于粒子免疫测定的试剂和粒子免疫测定方法 |
| EP3357956A4 (en) * | 2015-09-30 | 2019-03-20 | Sekisui Chemical Co., Ltd. | POLYMER MICROPARTICLES HAVING MICROPHASE-SEPARATING STRUCTURE GRAINS, REAGENT FOR PARTICULATE IMMUNOLOGICAL DETERMINATION USING THE SAME, AND PARTICULATE IMMUNOLOGICAL DETERMINATION METHOD |
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|---|---|
| JP4151771B2 (ja) | 2008-09-17 |
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