WO2007077238A1 - Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen - Google Patents

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WO2007077238A1
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PCT/EP2007/050033
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Peter Porschewski
Kerstin Steinert
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Qiagen Gmbh
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    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to the increase of the signal intensity with simultaneous reduction of non-specific background binding when carrying out detection reactions - in particular of immunoassays.
  • the area in which the biomarker is detectable and quantifiable is called the dynamic range.
  • the biomarker concentration increases, the binding saturates. However, the measurement at high concentrations above saturation is no longer possible. By contrast, low concentrations can not be detected due to the low sensitivity or because of the unspecific background signal.
  • the assay sensitivity can thus be improved, resulting in a larger dynamic range and an improved signal-to-background ratio (S / B).
  • buffers comprising the mentioned polyvinyl derivatives improve protein-protein and protein-DNA interaction assays as well as DNA applications in LiquiChip assays on polystyrene surfaces as mentioned above.
  • the polyvinyl derivatives especially polyvinyl alcohol (PVA) or polyvinylpyrrolidone PVP contribute to prevent the unwanted aggregation of the beads.
  • the present invention allows an increase in the signal intensity - also with simultaneous reduction of non-specific binding in the detection of bound analytes by means of so-called planar protein arrays.
  • planar protein arrays contain the
  • a molecular weight range of 5,000 to 500,000 Da, preferably 10,000 to 450,000 Da, and more preferably 24,000 to 360,000 Da is practically suitable.
  • Assay buffer II (contains no PVA or PVP):
  • the polymeric substances were also included in the first step in the binding of the antigens to the capture antibody beads in the incubation buffer.
  • SAPE Phycoerythrin

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Hintergrundbindung bei der Durchführung von Nachweisreaktionen - insbesondere von Immunoassays durch die Verwendung von Polyvinylderivaten.

Description

Verwendung von Polymeren zur Erhöhung der Signalintensität bei der Durchführung von Nachweisreaktionen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Hintergrundbindung bei der Durchführung von Nachweisreaktionen - insbesondere von Immunoassays.
Immunoassays finden u.a. in der Analytik der medizinischen Diagnostik und der Humantherapie eine breite Anwendung. So werden mit Hilfe der ELISA-Technik und Antikörpern in medizinischen Analytiklabors routinemäßig Blutkonserven auf relevante Krankheitserreger untersucht. Dabei werden polyklonale Antikörper - ein Gemisch von Antikörpern mit verschiedenen Bindungsepitopen - am häufigsten eingesetzt. Neben der bewährten ELISA-Technik waren in den letzten Jahren immer wieder Bestrebungen zu beobachten, neuere Methoden in der Diagnostik zu etablieren, die sich durch höhere Sensitivität, geringere Kosten und kürzere Bearbeitungszeiten auszeichnen sollten. So sind aus dem Stand der Technik Entwicklungen bekannt geworden, auf der Basis der sog. Luminex-xMap-Technologie Nachweistechniken zu entwickeln, welche die oben geschilderten Anforderungen so weit wie möglich erfüllen.
Grundlage der Luminex-xMAP-Technologie sind mikroskopisch kleine sphärische Polymerpartikel, insbesondere Polystyrolpartikel, im Stand der Technik gemeinhin als Mikrosphären oder Beads bezeichnet werden. Diese weisen in ihrem Inneren mindestens zwei verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe auf. Die Variation von verschiedenen Anteilen der beiden Farbstoffe definiert dabei spektral eindeutig unterscheidbare Populationen von Beads. Somit sind z.B. einhundert verschiedene Mikrosphären-Typen verfügbar. Jede Spezies der verschiedenen Beads kann mit einem spezifischen Nachweisreagenz oder Antigen durch einfache Kopplungschemie beschichtet werden. Auf diese Weise wird es theoretisch möglich, bis zu einhundert verschiedene Nachweisreaktionen simultan in einer Probe durchzuführen. Bis zum Jahr 2004 waren ca. 30 dieser Nachweisreaktionen bereits etabliert. Bei der erwähnten Inkubation mit wenigen Mikrolitern einer Probe bindet jede Mirosphärenpopulation mit dem entsprechend beschichteten Nachweisreagenz ihr spezifisches Zielmolekül. Die auf der Oberfläche der Mikrosphären gebundenen Zielmoleküle werden von einem spezifischen Detektionsmolekül, welches - in dem geschilderten Beispiel - einen grünen Fluoreszenzmarker trägt, auch als Reporter bezeichnet, erkannt.
So können beispielsweise in einem Luminex 100- Analysegerät Tausende von Mikrosphären innerhalb von Sekunden individuell ausgewertet werden. Ein erster Laser im Gerät dient der Anregung der roten Fluoreszenzfarbstoffe innerhalb der Beads, die aufgrund ihrer Fluoreszenzemission klassifiziert werden. Durch einen zweiten Laser wird - im vorliegenden Beispiel - z.B. der grüne Fluoreszenzfarbstoff des Reporters angeregt und die Intensität des emittierten Lichts wird aufgezeichnet. Mit Hilfe des ersten Lasers wird also die Identität des Antigens spezifiziert, während durch den zweiten Laser qualitativ und quantitativ die an das jeweilige Antigen spezifisch gebundenen Antikörper nachgewiesen werden können.
Innerhalb von weniger als 3 Stunden können mit dieser Technologie bis zu 9.600 diagnostische Tests in einer einzigen 96-Well Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Damit bietet die Luminex-xMAP-Technologie gegenüber konventionellen Verfahren - wie z. B. dem bekannten ELISA - entscheidende Vorteile:
• so erfolgt der Nachweis in einem Well ohne Waschschritte, womit kürzere Bearbeitungszeiten und geringere Kosten verbunden sind;
• aufgrund der sehr hohen Sensitivität werden nur geringste Mengen der Probe benötigt;
• daneben ist der Prozess vollständig automatisierbar. Demgemäß sind aus dem Stand der Technik bereits spezielle Immunoassays bekannt, die für die Luminex-Technologie entworfen wurden. Hierzu gehören insbesondere die von der Firma Qiagen in Hilden entwickelten LiquiChip-Immunoassys.
Das Prinzip eines LiquiChip-Immunoassays beruht auf der Verwendung eines (ELISA-) Antikörper-Sandwich-Pairs auf LiquiChip-Beads. Dazu wird ein Antikörper des Sandwich-Pairs kovalent als Fänger-Molekül (Capture-Antikörper) auf die Oberfläche der Polystyrol-Beads immobilisiert. Der zweite Antikörper wird als Antigen- spezifischer Primärantikörper verwendet. Dieser Primärantikörper kann z.B. biotinyliert sein und mit Hilfe eines Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugates oder durch einen entsprechend (Fluorophor)-Marker-konjugierten Spezies-spezifischen Detektions-Antikörper nachgewiesen werden.
Wie bei einem Western-blot oder einem ELISA kann es allerdings auch bei einem LiquiChip-Immunoassay zu unspezifischen Bindungen von einzelnen Proben- oder Assay-Komponenten an die Matrix-Oberfläche oder an den immobilisierten Capture- Antikörper kommen (Hintergrundbindung). Ein weiteres Problem betrifft die Affinität, eine der physiko-chemischen Eigenschaften des Antikörpers für den jeweiligen Biomarker. Die Affinität des jeweiligen Antikörpers bestimmt - wie aus dem Stand der Technik bekannt ist - das Ausmaß der Bindung des Biomarkers in der Probe mit.
Der Bereich, in dem der Biomarker detektierbar und quantifizierbar ist, wird dabei als dynamischer Bereich bezeichnet. Mit steigender Konzentration des Biomarkers wird die Bindung gesättigt. Die Messung bei hohen Konzentrationen oberhalb der Sättigung ist dabei allerdings nicht mehr möglich. Geringe Konzentrationen können dagegen aufgrund der niedrigen Sensitivität bzw. aufgrund des unspezifischen Hintergrundsignals ebenfalls nicht detektiert werden.
Für die Quantifizierung eines Analyten bzw. Biomarkers ist es daher wichtig, einen möglichst großen dynamischen Bereich abzudecken. Dies ist insbesondere dann von großer Bedeutung, wenn nur eine geringe Menge an Ausgangsmaterial bzw. Probe zur Verfügung steht.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, in den entsprechenden Assays Bedingungen zu schaffen, die für den gebundenen Analyt die Ausbildung eines maximalen Signals ermöglichen - und zwar über einen möglichst großen dynamischen Bereich hinweg - und, die auf der anderen Seite gleichzeitig nur ein minimales Hintergrundsignal entstehen lassen.
In ihrer Gesamtheit betrachtet stellt sich die vorliegende Erfindung somit die Aufgabe, ein verbessertes Signal-zu-Hintergrund- Verhältnis (Signal-to-Background, S/B) zu ermöglichen.
Aus dem Stand der Technik ist zwar die Reduktion von unspezifischer Hintergrundbindung durch die Verwendung von sog. Blocking Reagenzien („blocking agent") wie z.B. BSA (bovine serum albumin), Gelatine, Casein und/oder in Kombination mit verschiedenen Detergentien (NP-40, Tween20, Triton X-100) bekannt. - Auf der anderen Seite ist dem Stand der Technik auch zu entnehmen, dass eine Signal- Erhöhung bei Immunoassays im Wesentlichen nur durch Enzym-vermittelte Signal- Amplifikationsmethoden erreicht werden kann. Derartige Lösungsvorschläge beinhalten z.B. klassische ELISA Anwendungen, ECL-basierte Ansätze (Electro- ChemiLuminescence), RCAT (Rolling Circle Amplification Technology) und weitere Methoden, die auch bei Protein- Arrays angewendet werden können.
Mit einer Signal-Amplifikation kann also die Assay-Sensitivität verbessert werden, was in einem größeren dynamischen Bereich und einem verbesserten Signal-zu-Hintergrund Verhältnis (S/B) resultiert.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch die Erreichung höherer Sensitivitäten auch Assays mit reduzierten Probenmengen durchgeführt werden können, vor allem dann, wenn nur eine geringe Ausgangsmenge an Probenmaterial zur Verfügung steht. Mit Blick auf die Lösung der oben geschilderten Problematik, ist dem Stand der Technik bereits zu entnehmen, dass zur Vermeidung der unspezifischen Bindung von Antikörpern oder Antigenen an die Matrix-Oberfläche oder an den Capture-Antikörper in Western Blot- oder ELIS A- Applikationen proteinogene Substanzen - wie z.B. BSA, Casein oder Gelatine - oder nicht-proteinogene Substanzen - insbesondere Detergenzien - eingesetzt werden können. Diese Substanzen kommen in den entsprechenden Reaktionspuffern zur Anwendung.
Daneben ist aber aus dem Stand der Technik auch bekannt, dass die Detektions- Antikörper unspezifisch an die Capture-Antikörper zu binden vermögen.
Bei den im Stand der Technik verwandten Puffern handelt es sich in der Regel um Standardpuffer wie PBS- oder Tris-Puffer (pH 7 - 7.8). Detergenzien, die in den entsprechenden Puffern Verwendung finden, um die unspezifischen Bindungen, die durch Protein-Protein- oder Protein-Matrix-Interaktionen entstehen, zu reduzieren, weisen allerdings den gravierenden Nachteil auf, dass diese in zu hoher Konzentration die spezifischen Antigen- Antikörper- Interaktionen auflösen oder sogar denaturierend auf Antigen und Antikörper wirken können und somit letztendlich eine inaktivierende Wirkung haben.
Die Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, besteht angesichts des oben beschriebenen Standes der Technik nunmehr darin, die geschilderten Nachteile des Standes der Technik zu überwinden und eine Optimierung von Immunoassays - LiquiChip-Immunoassays - in Bezug auf die Erhöhung der Signalintensität - bei nicht enzymatisch vermittelter Signal-Amplifikation - und bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Hintergrundbindung zu ermöglichen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen auf sog. planaren Protein- Arrays zu ermöglichen, bei denen der Nachweis von gebundenen Analyten auf einem im wesentlichen planaren Array erfolgt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Assaybedingungen in einem Nachweisverfahren zu schaffen, die es daneben auch ermöglichen, mit geringen Probenmengen ein möglichst hohes spezifisches Signal zu generieren.
Gelöst werden diese Aufgaben durch den Einsatz von unter den Assay-/Verfahrensbedingungen löslichen Polyvinylderivaten. Als Polyvinyldervivate im Sinne der Erindung werden alle Abkömmlinge eines Polymeren oder Oligomeren, die durch Polymerisation eines Monomeren mit einer Vinylstruktur erhalten wurde, worunter insbesondere Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) fallen. Daneben werden erfindungsgemäß aber unter Polyvinylderivaten Oligomere bzw. Polymere mit Ester-Partialstrukturen verstanden wie z.B. Polyvinylacetat, ggf. teilweise verseift sowie Copolymere, wie z.B. Ethylen-Vinylacetat-Copolymere, (l-Vinyl-2-pyrrolidon)- Vinylacetat-Copolymere, Vinylacetat-Vinyllaurat-Copolymere verstanden.
Überraschenderweise wurde gefunden dass die Gegenwart der erwähnten Polyvinylderivate - insbesondere Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) - in den Reaktionspuffern die Bildung spezifischer Antikörper-Antigen Interaktionen unterstützen - was in einem höheren Signal resultiert - und die offensichtlich dafür verantwortlich sind, unspezifische Interaktionen zu reduzieren.
Erfindungsgemäß resultiert hieraus ein verbessertes Signal-zu-Hintergrund Verhältnis über einen größeren dynamischen Bereich.
Durch die Verwendung löslicher Polyvinylderivate können somit die Nachteile des Standes der Technik überwunden werden. Lösliche Polyvinylderivate können daneben in einem - im Vergleich zu Detergenzien - größeren Konzentrationsbereich eingesetzt werden und bewirken eine Erhöhung der Signalintensität und Sensitivität und tragen gleichzeitig noch zur Reduktion unspezifischer Bindungen bei. - Hieraus resultiert ein verbessertes Signal- zu-Hintergrund Verhältnis über einen größeren dynamischen Bereich hinweg.
Grundsätzlich steigert die erfindungsgemäße Verwendung von löslichen Polyvinylderivaten wie z.B. Polyvinylalkohol (PVA) oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) in den Reaktionspuffern bei allen Immunoassays bzw. ELISAs, die auf hydrophoben Oberflächen durchgeführt werden, die Signalintensitäten bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen.
Des Weiteren wurde überraschenderweise gefunden, dass durch den Einsatz von Polyvinylderivaten auch die Resultate von Nachweisreaktionen verbessert werden können, die in einem höheren Reaktionsgrad (Multiplex-Assay) durchgeführt werden. Erfindungsgemäß wird durch den Einsatz der Polyvinylderivate die Möglichkeit eröffnet, dass durch die Steigerung der Sensitivität auch solche Parameter parallel in dem Setup analysiert werden können, deren Signalintensitäten sich unter den bisherigen Bedingungen als zu niedrig erwiesen.
Von besonderem Interesse ist dies, wenn in einem Assay-Setup neben hochexprimierten Analyten gleichzeitig niedrigexprimierte Analyten beobachtet werden sollen. Der erfindungsgemäße Einsatz der erwähnten Polivinylderivate verkörpert somit einen weiteren Vorteil gegenüber auf ELISA oder Western-Blot basierenden Verfahren, bei denen in der Regel lediglich ein Analyt betrachtet wird.
Die Verwendung dieser Substanzen führt daneben nicht nur bei Immunoassays bzw. ELISAs zu einer überraschenden Verbesserung der Assayresultate, sondern ermöglicht auch einen verbesserten Nachweis solubilisierter Membranproteine. Daneben verbessern Puffer, welche die erwähnten Polyvinylderivate aufweisen, in der oben erwähnten Weise Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktions-Assays sowie DNA-Applikationen in LiquiChip-Assays auf Polystyrol-Oberflächen. Des Weiteren wurde überraschenderweise gefunden, dass die Polyvinylderivate, insbesondere Polyvinylalkohol (PVA) bzw. Polyvinylpyrrolidon PVP dazu beitragen, die unerwünschte Aggregation der Beads zu verhindern.
Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung eine Erhöhung der Signalintensität - ebenfalls bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen beim Nachweis von gebundenen Analyten mittels sogenannter planarer Protein- Arrays. Bei diesen Protein- Arrays befinden sich die
Fängermoleküle auf einer Trägersubstanz, wie z.B. Glas oder Glasslides, Nitrocellulose, PVDF oder Polystyroloberflächen und verkörpert beispielsweise einen Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, ein Aptamer, ein Peptid oder ein Anticalin.
Als besonders vorteilhaft hat sich freilich die Verwendung der oben genannten Polyvinylderivate in den sog. Liquichip-Immunoassays herausgestellt. Das Prinzip eines
LiquiChip-Immunoassays ist die Verwendung eines (ELISA-) Antikörper-Sandwich- pairs auf LiquiChip Beads. Dazu wird ein Antikörper des Sandwich-pairs kovalent als
Fänger-Molekül (Capture-Antikörper) auf die Oberfläche der Polystyrol-Beads immobilisiert. Diese Beads werden mit einer Probe (z.B. Serum, Lysat von Zellkulturen oder Gewebe, Zellkulturüberstand) inkubiert, die das entsprechende Antigen enthält.
Nach der Inkubation können die Beads optional gewaschen werden. Das spezifische
Antigen sollte über den Fänger- Antikörper gebunden an den Beads verbleiben.
In einem weiteren Schritt kann das spezifisch gebundene Antigen z.B. mit einem zweiten Antigen-spezifischen Antikörper markiert und anschließend detektiert werden. Dies kann z.B. mit einem Fluorophor-gelabelten- Antikörper erfolgen, der gegen diesen zweiten Antikörper gerichtet ist. Bei jedem dieser Schritte kann es zu unspezifischen Bindungen von anderen Assay-Komponenten (z.B. andere Proteine aus der Probe) an die Bead- Oberfläche oder an die Fänger- Antikörper kommen. Zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen wird die Inkubation der Capture-Antikörper-Beads mit der Probe (Antigen) in einem Puffer durchgeführt der ein lösliches Polyvinylderivat enthält.
Als Polyvinylderivate kommen bei der Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe alle Polyvinylderivate in Frage, die unter den vorgegebenen Reaktionsbedingungen löslich bzw. wasserlöslich sind. Bevorzugte Polyvinylderivate sind, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol in Form ihrer reinen Polymerisate, als Copolymerisate miteinander und/oder mit anderen geeigneten Comonomeren sowie als Mischungen.
Polymere sowie Copolymere des Vinylalkohols bzw. dessen Ester sowie des Vinylpyrrolidons sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik wohlbekannt, da sie in zahlreichen Anwendungsgebieten des täglichen Lebens - so z.B. als Verdickungsmittel in der Nahrungsmittelindustrie sowie als Hilfsstoffe in der Galenik und in der Textilindustrie - um nur einige Einsatzgebiete zu nennen - seit Jahrzehnten Verwendung finden. Mit Blick auf den Einsatz geeigneter Copolymerisate ist die Verwendung jedes Copolymerisats des Vinylalkohols bzw. Vinylacetats sowie des Vinylpyrrolidons wie auch Copolymerisate beider - Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylacetat] bzw. Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylalkohol] neben den bereits oben erwähnten Copolymerisaten - möglich, sofern sie ein geeignetes Löslichkeitsverhalten in einem - im wesentlichen - wässrigen Milieu aufweisen.
Die jeweiligen Molekulargewichte sind für die erfolgreiche Realisierung des erfindungsgemäßen Verfahrens in weiten Grenzen variierbar. Sie liegen praktischerweise in einem Bereich von 5.000 bis 500.000 Da, bevorzugt in einem Intervall von 24.000 bis
360.000 Da und besonders bevorzugt von 31.000 bis 186.000 Da. Diese Bereiche gelten sowohl für die einzelnen Polymere wie auch für Mischungen aus zwei, drei oder mehr
Polymeren, wobei Mischungen aus Polyvinylakohol und Polyvinylpyrrolidon bevorzugt werden. Für die Verwendung von Polyvinylalkohol alleine oder in Mischungen mit Polyvinylpyrrolidon eignet sich praktischerweise ein Molekulargewichtsbereich von 9.000 bis 500.000 Da, bevorzugt 31.000 bis 186.000 Da und besonders bevorzugt zwischen 86.000 und 126.000 Da sowie zwischen 146.000 und 186.000 Da.
Für die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon alleine oder in Kombination mit Polyvinylalkohol eignet sich praktischerweise ein Molekulargewichtsbereich von 5.000 bis 500.000 Da, bevorzugt 10.000 bis 450.000 Da und besonders bevorzugt 24.000 bis 360.000 Da.
Die Konzentration - einzeln oder in Kombination - der Polyvinylderivate liegt beispielsweise in den LiquiChip-Imunoassays in einem Intervall von 0.025 bis 5 % (w/v), bevorzugt in einem Intervall von 0.025 bis 2 % (w/v) und besonders bevorzugt in einem Intervall von 0.1 bis 1 % (w/v).
Die Beads werden mit dem das Polyvinylderivat enthaltenden Puffer vorinkubiert, wonach die Zugabe der Probe und eine weitere Inkubation erfolgen. Die löslichen Polyvinylderivate - wie z.B. vorzugsweise Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon - können aber auch bei den folgenden Schritten in den jeweiligen Puffern enthalten sein, so z.B. bei der Zugabe und Inkubation des zweiten Antigen-spezifischen- Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen, das sich dadurch auszeichnet dass der Nachweis von gebundenen Analyten auf Beads oder auf planaren Protein-Arrays in Gegenwart eine Polyvinylderivats erfolgt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren bei dem die Fängermoleküle auf Glas (Glasslides), Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder auf Polystyroloberflächen aufgebracht sind und die die Nachweisreaktion in Gegenwart eine Polyvinylderivats erfolgt.
Dabei kann das Fängermolekül beispielsweise einen Antikörper, das Fragment eines Antikörpers, ein Aptamer, ein Peptid oder ein Anticalin darstellen. In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Durchführung eines Immunoassays enthaltend zumindest einen Puffer mit einem Polyvinylderivat als Komponente. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung daneben auch ein Kit bei dem die Fängermoleküle an die Beads oder an planare Arrays gebunden sind. - Dabei können die Beads oder planaren Arrays ein Trägermaterial aus Glas, Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder Polystyrol aufweisen.
Der positive Effekt der erfindungsgemäßen Verwendung der Polyvinylderivate lässt sich experimentell eindrucksvoll belegen. - So konnte z.B. in einem Monoplex-Immuno- Sandwichassay zum Nachweis von ß-Catenin (vgl. Protokoll in Beispiel 1) eine deutliche Signalerhöhung bei gleichzeitiger Reduktion der unspezifischen Hintergrundbindung erreicht werden. In der graphischen Darstellung (Fig. 1) ist eindeutig zu erkennen, dass sich die Signale unter Verwendung der Polyvinylderivate besonders im unteren Bereich der Kurve deutlich vom Hintergrund absetzen. Als weiteres Merkmal ist zu beobachten, dass unter Verwendung der Polyvinylderivate bereits bei niedrigeren Proteinkonzentrationen Signalwerte erhalten werden, die in der Kurve ohne Polyvinylderivate erst bei wesentlich höheren Proteinkonzentrationen erreicht werden. So erhält man in der Probe, die mit Polyvinylakohol versetzt wurde, bei einer Konzentration von ca. 3000 pg Protein einen Wert von ca. 2000 MFI (Median-Fluorescence-Intensity), wohingegen dieser Wert in der Probe ohne Polyvinylalkohol erst bei einer Konzentration von ca. 6000 pg Protein erreicht werden kann. Daneben ist ersichtlich, dass sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren für alle Messwerte ein besseres Signal-zu-Hintergrund- Verhältnis (S/B) erreichen lässt.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern und die oben geschilderten Befunde untermauern. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungsformen werden aus den Beispielen ersichtlich. Beispiele
In den Beispielen werden folgende Pufferlösungen eingesetzt:
Puffer- Lösungen:
Assay-Puffer I (mit PVA oder PVP):
10 mM NaH2PO4 H2O 1.4 g NaH2PO4 H2O (MW 137.99 g/mol), mit Natronlauge auf einen H- Wert von 7,4 eingestellt
150 mM NaCl 8.77 g NaCl (MW 58.44 g/mol)
0.1% (w/v) BSA I g BSA
0.02% (v/v) Tween® 20 200 μl Tween 20
2% (w/v) PVA 20 g Polyvinylalkohol (MW 86000-126000, 98-99% hdrolysiert) oder
2% (w/v) PVP 20 g Polyvinylpyrrolidon (MW 40000)
Assay-Puffer II (enthält kein PVA bzw. PVP):
10 mM NaH2PO4 1.4 g NaH2PO4-H2O (MW 137.99 g/mol), mit
Natronlauge auf einen pH- Wert von 7,4 eingestellt 150 mM NaCl 8.77 g NaCl (MW 58.44 g/mol)
0.1% (w/v) BSA I g BSA
0.02% (v/v) Tween® 20 200 μl Tween 20
Natriumchlorid, NaH2PO4-H2O und das Polyvinylderivat wurden in 900 ml destilliertem Wasser autoklaviert und dabei aufgelöst. Danach wird der pH- Wert mit Natronlauge (NaOH) auf 7.4 eingestellt. Danach werden BSA und Tween 20 zugefügt und das Gesamtvolumen auf 1 Liter aufgefüllt. Vor der Verwendung wird die Lösung durch ein 0.45 μm Filter filtriert.
Beispiel 1:
Die Experimente wurden nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: In einer 96-Well Platte wurden pro Well wurden folgende Lösungen in eine Filterplatte pipettiert. Die Filterplatte wird mit 50 μl Assay-Puffer I äquilibriert und Puffer danach abgesaugt.
Danach wurden 30 μl Assay-Puffer I zugefügt und mit 10 μl Bead- Lösung (1250 Beads Assay-Puffer II) versetzt. Danach erfolgt die Zugabe der Probe in 10 μl Probe Assay- Puffer IL Die Multiwell-Platte wird daraufhin verschlossen und unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur (ca. 18 - 25 0C) über einen Zeitraum von 2h auf einem Schüttler (MTPShaker) bei 450 Umdrehungen/min inkubiert (optional kann die Inkubation bei 40C o/n erfolgen). Danach wird der Puffer in der Filterplatte abgesaugt und die Beads werden mit 150 μl Assay-Puffer II gewaschen. Daraufhin wird erneut abgesaugt und die Beads werden in 100 μl Assay-Puffer II resuspendiert. Darauf erfolgt die Zugabe von 15-20 ng (bis 200 ng) des zweiten Antigen-spezifischen Antikörpers in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer II und es wird über einen Zeitraum von 90 min bei Raumtemperatur auf Schüttler bei 450 Umdrehungen/min inkubiert. Nach der Zugabe von 200 ng Fluorophor- gelabelten-Detektions-Antikörper (optional 100 ng Streptavidin-R-Phycoerythrin [SAPE] bei Verwendung eines biotinylierten Antikörpers) jeweils in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer II wird erneut bei Raumtemperatur über ein Zeitintervall von 30 min auf einem MTP-Shaker bei 450 Umdrehungen/min inkubiert und anschließend im Reader analysiert.
Der Einfluss, den die Polyvinylderivate auf einen Multiplex-Immunoassay haben ist in Fig. 2 abgebildet. Gezeigt wird das Ergebnis eines Cytokin-Multiplex Immuno-
Sandwichassays zum Nachweis der Interleukine IL- 12, IL-10, IL 8 und IL-6, bei dem 1% (w/v) PVA (MW 86000-126000) bzw. 1% (w/v) PVP (MW 40000) im Puffer während der Capture-Antikörper/Antigen-Reaktion verwendet wurde [in dem dreidimensionalen Schaubild von Fig. 2 sind die Wertebalken für IL 12, ILIO, IL 8 und IL 6 in der Betrachtungsrichtung von vorne nach hinten angeordnet!]. Auch bei diesem Experiment konnte gezeigt werden, das neben PVA auch PVP einen positiven Effekt auf die Hintergrundreduktion bzw. auf die Erhöhung der Signalintensität der einzelnen Interleukine hat. Bei diesem Experiment waren die polymeren Substanzen ebenfalls im ersten Schritt bei der Bindung der Antigene an die Capture-Antikörper-Beads im Inkubationspuffer enthalten.
Beispiel 2:
Die Experimente wurden nach dem folgenden Protokoll durchgeführt: In einer 96-Well Platte wurden pro Well wurden folgende Lösungen in eine Filterplatte pipettiert: Die Filterplatte wurde zunächst mit 50 μl Assay-Puffer I äquilibriert und Puffer danach abgesaugt.
Danach wurden 50 μl Assay-Puffer I vorgelegt und mit 25 μl Probe gelöst in Assay- Puffer II versetzt. Daraufhin erfolgt die Zugabe von 25 μl Assay-Puffer II enthaltend je
2500 Beads pro Cytokin (Assay-buffer II). Die Multiwell-Platte wird daraufhin verschlossen und unter Lichtausschluß bei Raumtemperatur (ca. 18 - 25 0C) über einen
Zeitraum von 2h auf einem Schüttler (MTPShaker) bei 450 Umdrehungen/min inkubiert
(optional kann die Inkubation bei 40C o/n erfolgen). Danach wird der Puffer in der Filterplatte abgesaugt und die Beads werden mit 100 μl Assay-Puffer II gewaschen.
Daraufhin wird erneut abgesaugt und die Beads werden in 100 μl Assay-Puffer II resuspendiert. Darauf erfolgt die Zugabe von 15-20 ng (bis 200 ng) des zweiten Antigen- spezifischen Antikörpers (biotinyliert) in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer II und es wird über einen Zeitraum von 90 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler bei 450 Umdrehungen/min inkubiert. Danach erfolgt die Zugabe 100 ng Streptavidin-R-
Phycoerythrin [SAPE] in einem Volumen von 10 μl Assay-Puffer IL Es wird erneut bei Raumtemperatur über ein Zeitintervall von 30 min auf einem MTP-Shaker bei 450 Umdrehungen/min inkubiert und anschließend im Reader analysiert.
Das Ergebnis zeigt (Fig. 2), dass die Signale für die einzelnen Analyten signifikant gesteigert werden konnten. Somit konnten einheitliche Bedingungen geschaffen werden, die es ermöglichen mehrere Analyten in einem Multiplex- Ans atz messen zu können.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Polyvinylderivaten zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyvinylderivate Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol in Form ihrer reinen Polymerisate, als Copolymerisate miteinander und/oder mit anderen geeigneten Comonomeren sowie als Mischungen eingesetzt werden.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Copolymerisat ein Copolymerisat des Vinylacetats oder und/oder des Vinylpyrrolidons, Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylacetat] und/oder Poly[vinylpyrrolidon-co-vinylalkohol] eingesetzt werden.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polymeren oder Copolymeren in einem Intervall von 5.000 bis 500.000 Da liegt.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polymeren oder Copolymeren in einem Intervall von 24.000 bis 360.000 Da liegt.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polymeren oder Copolymeren in einem Intervall von
31.000 bis 186.000 Da liegt.
7. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargwicht des Polyvinylalkohols alleine oder in Mischungen mit
Polyvinylpyrrolidon in einem Intervall von 9.000 bis 500.000 Da liegt.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht in einem Intervall von 31.000 bis 186.000 Da liegt.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht in einem Intervall von 86.000 und 126.000 Da liegt.
10. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht in einem Intervall von 146.000 und 186.000 Da liegt.
11. Verwendung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyvinylpyrrolidons alleine oder in Kombination mit Polyvinylalkohol in einem Intervall von 5.000 bis 500.000 Da liegt.
12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyvinylpyrrolidons in einem Intervall von 10.000 bis 450.000 Da liegt.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des Polyvinylpyrrolidons in einem Intervall von 24.000 bis
360.000 Da liegt.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylderivats in einem Assay in einem Intervall von 0.025 bis 5 % (w/v) liegt.
15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylderivats in einem Assay in einem Intervall von 0.025 bis 2 % (w/v) liegt.
16. Verwendung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Polyvinylderivats in einem Assay in einem Intervall von 0.1 bis 1 % (w/v) liegt.
17. Verfahren zur Erhöhung der Signalintensität bei gleichzeitiger Reduktion unspezifischer Bindungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis von gebundenen Analyten auf Beads oder auf planaren Protein- Arrays in Gegenwart eines Polyvinylderivats erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Fängermoleküle auf Glas (Glasslides), Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder auf Polystyroloberflächen aufgebracht werden.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Fängermolekül ein Antikörper, ein Fragment eines Antikörpers, ein Aptamer, ein
Peptid oder ein Anticalin ist.
20. Kit zur Durchführung eines Immunoassays enthaltend zumindest einen Puffer mit einem Polyvinylderivat als Komponente.
21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es Fängermoleküle enthält, die auf Beads oder planaren Arrays gebunden sind.
22. Kit nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Beads oder planaren Arrays ein Trägermaterial aus Glas, Nitrocellulose, PVDF (Polyvinylidenfluorid) oder Polystyrol aufweisen.
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