JPH10300753A - HBs抗体の定量方法及びHBs抗体測定用免疫学的キット - Google Patents
HBs抗体の定量方法及びHBs抗体測定用免疫学的キットInfo
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Abstract
法、及び、このHBs抗体の定量法を実施するためのH
Bs抗体測定用免疫学的キットを提供する。 【解決手段】 試料中のHBs抗体を定量するにあた
り、上記試料と、HBs抗原を感作した不溶性担体とを
溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさ
せ、上記凝集反応に基づく吸光度変化量を測定して検量
線と照合することよりなるHBs抗体の定量方法であっ
て、上記不溶性担体は、ラテックス粒子であり、上記溶
液中に、平均分子量1000〜200万のポリビニルピ
ロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体が
各々0.1〜5重量%含有されているHBs抗体の定量
方法。
Description
体の高感度かつ迅速、簡便な定量方法、及び、このHB
s抗体の定量方法を実施するためのHBs抗体測定用免
疫学的キットに関する。
に血中に出現する関連抗体の中で唯一ウィルス中和活性
を有する抗体である。このHBs抗体を高感度で定量す
ることは、臨床予防上、治療上極めて重要である。すな
わち、健康人においては、HBs抗体を保持しているか
否かにより、初期感染を受けたことがあるか否かを判別
することができるとともに、感染の危険性を判断するこ
とができ、患者においては、症状の経過を追跡するのに
役立つ。また、HBs抗原ワクチンの効果判定やHBs
抗原ワクチンの必要性等の検査においても重要である。
更には、HBs抗体のγ−グロブリンがB型肝炎の治
療、予防に有効であることが明らかにされている。この
ようなことから、優れたHBs抗体の定量方法は、極め
て重要である。
クタロニー法、一元免疫拡散法、交叉免疫電気泳動法、
受身赤血球凝集反応法(PHA法)、酵素免疫測定法
(EIA法)、ラジオイムノアッセイ法(RIA法)等
が知られている。
拡散法及び交叉免疫電気泳動法は、操作が煩雑で測定に
時間がかかり、感度も比較的低い。PHA法は、「医学
のあゆみ」(今井光信ら、第78巻、759頁、197
1年)に記載されているように、安定した抗原感作赤血
球を用意することが困難である。EIA法及びRIA法
は、感度はオクタロニー法の2000〜1万倍にもなる
が、試薬価格が高い。また、RIA法は、放射性元素を
用いるため、特別な施設が必要になるという欠点があっ
た。
開平3−152467号公報には、補体依存性リポソー
ム膜損傷反応を利用する方法が開示されている。しかし
ながら、この方法は、感度はPHA法と同程度であり、
反応に要する時間も2時間から一晩と長い。
み、高感度かつ迅速、簡便なHBs抗体の定量方法、及
び、このHBs抗体の定量法を実施するためのHBs抗
体測定用免疫学的キットを提供することを目的とする。
s抗体を定量するにあたり、上記試料と、HBs抗原を
感作した不溶性担体とを溶液中で混合して抗原抗体反応
による凝集反応を生じさせ、上記凝集反応に基づく吸光
度変化量を測定して検量線と照合することよりなるHB
s抗体の定量方法であって、上記不溶性担体は、ラテッ
クス粒子であり、上記溶液中に、平均分子量1000〜
200万のポリビニルピロリドン及びビニルピロリドン
−酢酸ビニル共重合体が各々0.1〜5重量%含有され
ていることを特徴とするHBs抗体の定量方法である。
以下に本発明を詳述する。
定量するにあたり、まず、試料と、HBs抗原を感作し
た不溶性担体とを溶液中で混合して抗原抗体反応による
凝集反応を生じさせる。
ば、血清、血漿等が挙げられる。また、本発明のHBs
抗体の定量方法は、これら以外の各種の生体試料、非生
体試料に適用することも可能である。
て、粒径が比較的一定であり、また、工業的に一定の品
質、性能のものを大量生産することができるラテックス
粒子が用いられる。上記ラテックス粒子としては特に限
定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニ
トリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル
酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合
体;スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレ
ート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等
の微粒子等が挙げられる。これらのうち、抗原の吸着性
に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持
できる等の理由から、ポリスチレン系のラテックス粒子
が好適に用いられる。
の粒径は、0.05〜1μmが好ましい。小さすぎる
と、凍結乾燥を行ったときに分散が困難となり、大きす
ぎると、自己凝集が進み、分散性が低下する。より好ま
しくは、0.1〜0.5μmである。
たものである。上記HBs抗原としては特に限定され
ず、例えば、既知の方法によりHBs抗原陽性ヒト血清
から精製されたもの、遺伝子組換えによって得られたも
の等が挙げられる。また、純度や処理方法によって制限
されるものではない。
は、物理的又は化学的に吸着させる方法等により行うこ
とができる。この場合において、上記HBs抗原は、凝
集反応を生じせしめる溶液中において、0.1〜100
μg/mlとなるように、上記不溶性担体に感作され
る。少なすぎると、感度が低く、低濃度での正確な測定
ができず、多すぎると、非特異反応による凝集が生じ、
正確な測定ができない。
担体とを溶液中で混合する。上記溶液としては特に限定
されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
性担体の濃度は、0.01〜0.5重量%が好ましい。
低すぎると、凝集塊の形成が不充分であり、必要な感度
が得られず、高すぎると、バックグラウンドとしての吸
光度が高すぎ、正確な定量を行うことができない。
ニルピロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体が含有される。ポリビニルピロリドンが上記溶液中
に含有されることにより、感度の向上及び反応の促進を
図ることができ、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体が上記溶液中に含有されることにより、反応の促進及
び再現性の向上を図ることができる。
は、1000〜200万である。小さすぎると、感度の
向上又は反応促進の効果が不充分であり、大きすぎる
と、上記溶液への溶解度が著しく低くなり、溶解性の点
で問題が生じるので、上記範囲に限定される。好ましく
は、5000〜200万である。
体における、ビニルピロリドンの割合は、特に限定され
ないが、55〜95モル%が好ましい。
び及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体の濃度
は、各々0.1〜5重量%である。低すぎると、感度が
低く、低濃度域での正確な測定ができず、高すぎると、
非特異的反応による凝集が生じ、正確な測定ができない
ので、上記範囲に限定される。好ましくは、各々0.4
〜3.0重量%である。
リドン−酢酸ビニル共重合体は、適宜な媒体に分散又は
溶解させて使用することが好ましい。この場合において
は、上記不溶性担体と、上記ポリビニルピロリドン及び
ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを同一の媒体
に分散又は溶解させることにより1液型のラテックス試
薬として使用してもよく、また、それぞれ、別個の媒体
に分散又は溶解させることによりラテックス試薬と溶液
状の試薬である検体希釈用液との2液型試薬として使用
してもよい。
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のpHは、
5.5〜8.5が好ましい。より好ましくは、6.5〜
8.0である。
に、牛血清アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調
整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。
また、上記2液型試薬中にも、それぞれに牛血清アルブ
ミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調整のために塩化ナ
トリウム等を適宜溶解させてもよい。
る凝集反応は、恒温において行われるのが好ましい。好
ましくは、25〜37℃である。また、上記凝集反応
は、好ましくは、5秒〜15分間行う。短すぎると、正
確な測定ができず、長すぎると、非特異的反応による凝
集が生じ、正確な測定ができない。
釈用液を反応容器に分注し、インキュベートした後、ラ
テックス試薬を添加・混合する。
基づく吸光度変化量を測定して検量線と照合することに
より、HBs抗体を定量する。上記吸光度変化量は、凝
集反応に伴う吸光度の増加量が好ましい。
は、通常、500〜1000nm、好ましくは、500
〜800nmの範囲から適切な波長が選択される。上記
吸光度変化量の測定に用いられる測定装置としては、経
時的に上記溶液の吸光度を測定することできるものであ
れば特に限定されず、例えば、汎用の生化学自動分析装
置等が挙げられる。上記測定波長、検体量、試薬量等
は、上記測定装置に合わせて適宜選択することができ
る。
は、例えば、HBs抗体の希釈系列等の濃度既知のHB
s抗体試料について、吸光度変化量の測定を行い、その
測定値とHBs抗体量とから検量線を作成しておき、濃
度未知のHBs抗体試料について同一条件で測定した吸
光度変化量の測定値から上記検量線において対応するH
Bs抗体量を求めることにより実施することができる。
クス粒子と、平均分子量1000〜200万のポリビニ
ルピロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体とを含むことを特徴とする請求項1記載のHBs抗体
の定量方法を実施するためのHBs抗体測定用免疫学的
キットである。
トとしては、例えば、不溶性担体と、ポリビニルピロリ
ドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを同
一の媒体に分散又は溶解させることにより1液型のラテ
ックス試薬としたもの、また、それぞれ、別個の媒体に
分散又は溶解させることによりラテックス試薬と溶液状
の試薬である検体希釈用液との2液型試薬としたものな
どが挙げられる。
トを用いてHBs抗体を定量する具体的な方法として
は、例えば、HBs抗体の定量を行おうとする試料と、
上記検体希釈用液とを反応容器に分注し、インキュベー
トした後、上記HBs抗原を感作したラテックス粒子か
らなるラテックス試薬を添加混合することにより実施す
ることができる。
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
ス塩酸緩衝液(pH7.4)に溶解した液7.5ml
に、平均粒径が0.3μmのポリスチレンラテックス
(固形分10%(W/V)、積水化学工業社製)1ml
と、リン酸−食塩緩衝液(0.036Mのリン酸緩衝液
(pH6.6)、0.1MのNaCl)とを添加し、3
0℃にて60分間攪拌した。次いで、この液にウシ血清
アルブミン(以下「BSA」という)を1重量%含有す
るリン酸−食塩緩衝液(0.05Mのリン酸緩衝液(p
H7.0)、0.1MのNaCl)(以下「PBS」と
いう)を添加し、30℃にて60分間攪拌した後、4℃
にて20分間、18000rpmで遠心分離することに
より洗浄した。洗浄操作は3回行った。得られた沈殿物
にBSAを1重量%含有するPBS10mlを添加し、
ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機にて分散処理を
行い、固形分0.1%(W/V)のHBs抗原感作ラテ
ックス液を調製した。
万のポリビニルピロリドン(Luviskol K−9
0、BASF社製)(以下「PVP」という)を0.7
5重量%の濃度に、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体(ビニルピロリドン:酢酸ビニル=7:3(モル
比)、BASF社製)(以下「PVP−VA」という)
を2重量%の濃度になるように溶解した。
s抗原感作ラテックス液からなる第1試薬と、上記
(2)項のPVP及びPVP−VA含有溶液からなる第
2試薬とから構成される2液型の試薬である。
IU/ml濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。
とを混合し、37℃で適時保持した後、上記(1)項の
HBs抗原感作ラテックス液120μlを添加攪拌し
た。この後、1分後及び5分後の波長750nmでの吸
光度を測定し、この差を吸光度変化量(ΔAbs)とし
た。測定は、日立自動分析装置7150形を使用した。
標準HBs抗体液を測定して、予め検量線を作成してお
き、検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿して、検体
中のHBs抗体量を算出した。
記の測定方法(以下「ラテックス法」という)に従っ
て、HBs抗体量を測定した。 (7)同時再現性試験 また、HBs抗体を150mIU/ml含有する血清及
びHBs抗体陰性の血清を検体とし、上記の測定方法に
従って、HBs抗体量を各10回多重測定した。
うに行ったこと、および(6)検体の測定を行わなかっ
たこと以外は、実施例1と同様に行った。
のPVP(Luviskol K−60、BASF社
製)を2重量%の濃度に、実施例1と同様のPVP−V
Aを2重量%の濃度になるように溶解した。
のPHA法によるHBs抗体測定キット(リバースセル
Ab、山之内製薬社製)を用いて、検体中のHBs抗体
量を測定した。方法は、キットの能書に従って行った。
のEIA法によるHBs抗体測定キット(エンザイグノ
スト Anti−HBs micro、ヘキストジャパ
ン社製)を用いて、検体中のHBs抗体量を測定した。
方法は、キットの能書に従って行った。
うに行ったこと以外は、実施例2と同様に行った。
た。
うに行ったこと以外は、実施例2と同様に行った。
万のPVP(Luviskol K−90、BASF社
製)を0.75重量%の濃度になるように溶解した。
うに行ったこと以外は、実施例2と同様に行った。
のPVP(Luviskol K−60、BASF社
製)を2重量%の濃度になるように溶解した。
うに行ったこと以外は、実施例2と同様に行った。
PVP−VAを2重量%の濃度になるように溶解した。
1に示した。また、実施例1、2および比較例4、5の
同時再現性試験の結果を表6に示した(なお、比較例3
及び6の同時再現性試験の結果については、HBs抗体
を150mIU/ml含有する血清においても、吸光度
変化量(ΔAbs)が非常に小さいので表6に記載しな
かった)。PVP及びPVP−VAを添加することによ
り反応量が増大するとともに、、同時再現性も向上し、
C.V.値が5%以下と良好であった。
を表2、3に示した。更に、ラテックス法とPHA法と
の一致率及びラテックス法とEIA法との一致率を表
4、5に示した。表2〜5より、比較例1のPHA法は
低濃度域の感度が低いため実施例1のラテックス法との
一致率が80%であった。一方、ラテックス法と比較例
2のEIA法との一致率は100%であり、本発明のラ
テックス試薬は、EIA法と同等の感度を有することが
明らかになった。
同時に使用することにより、感度、同時再現性に優れた
測定系が得られることが明らかとなった。
は、得られた吸光度変化量(ΔAbs)を10000倍
した数値を示している。
s抗体測定用免疫学的キットは、上述の構成からなるの
で、EIA法と同等の高い感度を有し、かつ、迅速、簡
便に試料中のHBs抗体を定量することができる。
る。縦軸は、吸光度変化量(ΔAbs)であり、横軸
は、標準HBs抗体液の濃度である。
Claims (2)
- 【請求項1】 試料中のHBs抗体を定量するにあた
り、上記試料と、HBs抗原を感作した不溶性担体とを
溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさ
せ、上記凝集反応に基づく吸光度変化量を測定して検量
線と照合することよりなるHBs抗体の定量方法であっ
て、上記不溶性担体は、ラテックス粒子であり、上記溶
液中に、平均分子量1000〜200万のポリビニルピ
ロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体が
各々0.1〜5重量%含有されていることを特徴とする
HBs抗体の定量方法。 - 【請求項2】 HBs抗原を感作したラテックス粒子
と、平均分子量1000〜200万のポリビニルピロリ
ドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを含
むことを特徴とする請求項1記載のHBs抗体の定量方
法を実施するためのHBs抗体測定用免疫学的キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9111198A JPH10300753A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | HBs抗体の定量方法及びHBs抗体測定用免疫学的キット |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9111198A JPH10300753A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | HBs抗体の定量方法及びHBs抗体測定用免疫学的キット |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH10300753A true JPH10300753A (ja) | 1998-11-13 |
Family
ID=14554997
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9111198A Pending JPH10300753A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | HBs抗体の定量方法及びHBs抗体測定用免疫学的キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH10300753A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007077238A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-12 | Qiagen Gmbh | Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen |
-
1997
- 1997-04-28 JP JP9111198A patent/JPH10300753A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007077238A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-12 | Qiagen Gmbh | Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen |
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