JPH10300753A - ＨＢｓ抗体の定量方法及びＨＢｓ抗体測定用免疫学的キット - Google Patents
ＨＢｓ抗体の定量方法及びＨＢｓ抗体測定用免疫学的キットInfo
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- JPH10300753A JPH10300753A JP9111198A JP11119897A JPH10300753A JP H10300753 A JPH10300753 A JP H10300753A JP 9111198 A JP9111198 A JP 9111198A JP 11119897 A JP11119897 A JP 11119897A JP H10300753 A JPH10300753 A JP H10300753A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 高感度かつ迅速、簡便なＨＢｓ抗体の定量方
法、及び、このＨＢｓ抗体の定量法を実施するためのＨ
Ｂｓ抗体測定用免疫学的キットを提供する。 【解決手段】 試料中のＨＢｓ抗体を定量するにあた
り、上記試料と、ＨＢｓ抗原を感作した不溶性担体とを
溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさ
せ、上記凝集反応に基づく吸光度変化量を測定して検量
線と照合することよりなるＨＢｓ抗体の定量方法であっ
て、上記不溶性担体は、ラテックス粒子であり、上記溶
液中に、平均分子量１０００〜２００万のポリビニルピ
ロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体が
各々０．１〜５重量％含有されているＨＢｓ抗体の定量
方法。
法、及び、このＨＢｓ抗体の定量法を実施するためのＨ
Ｂｓ抗体測定用免疫学的キットを提供する。 【解決手段】 試料中のＨＢｓ抗体を定量するにあた
り、上記試料と、ＨＢｓ抗原を感作した不溶性担体とを
溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさ
せ、上記凝集反応に基づく吸光度変化量を測定して検量
線と照合することよりなるＨＢｓ抗体の定量方法であっ
て、上記不溶性担体は、ラテックス粒子であり、上記溶
液中に、平均分子量１０００〜２００万のポリビニルピ
ロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体が
各々０．１〜５重量％含有されているＨＢｓ抗体の定量
方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のＨＢｓ抗
体の高感度かつ迅速、簡便な定量方法、及び、このＨＢ
ｓ抗体の定量方法を実施するためのＨＢｓ抗体測定用免
疫学的キットに関する。
体の高感度かつ迅速、簡便な定量方法、及び、このＨＢ
ｓ抗体の定量方法を実施するためのＨＢｓ抗体測定用免
疫学的キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＢｓ抗体は、Ｂ型肝炎ウィルス感染後
に血中に出現する関連抗体の中で唯一ウィルス中和活性
を有する抗体である。このＨＢｓ抗体を高感度で定量す
ることは、臨床予防上、治療上極めて重要である。すな
わち、健康人においては、ＨＢｓ抗体を保持しているか
否かにより、初期感染を受けたことがあるか否かを判別
することができるとともに、感染の危険性を判断するこ
とができ、患者においては、症状の経過を追跡するのに
役立つ。また、ＨＢｓ抗原ワクチンの効果判定やＨＢｓ
抗原ワクチンの必要性等の検査においても重要である。
更には、ＨＢｓ抗体のγ−グロブリンがＢ型肝炎の治
療、予防に有効であることが明らかにされている。この
ようなことから、優れたＨＢｓ抗体の定量方法は、極め
て重要である。
に血中に出現する関連抗体の中で唯一ウィルス中和活性
を有する抗体である。このＨＢｓ抗体を高感度で定量す
ることは、臨床予防上、治療上極めて重要である。すな
わち、健康人においては、ＨＢｓ抗体を保持しているか
否かにより、初期感染を受けたことがあるか否かを判別
することができるとともに、感染の危険性を判断するこ
とができ、患者においては、症状の経過を追跡するのに
役立つ。また、ＨＢｓ抗原ワクチンの効果判定やＨＢｓ
抗原ワクチンの必要性等の検査においても重要である。
更には、ＨＢｓ抗体のγ−グロブリンがＢ型肝炎の治
療、予防に有効であることが明らかにされている。この
ようなことから、優れたＨＢｓ抗体の定量方法は、極め
て重要である。
【０００３】ＨＢｓ抗体の検出方法としては、従来、オ
クタロニー法、一元免疫拡散法、交叉免疫電気泳動法、
受身赤血球凝集反応法（ＰＨＡ法）、酵素免疫測定法
（ＥＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等
が知られている。
クタロニー法、一元免疫拡散法、交叉免疫電気泳動法、
受身赤血球凝集反応法（ＰＨＡ法）、酵素免疫測定法
（ＥＩＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）等
が知られている。
【０００４】しかしながら、オクタロニー法、一元免疫
拡散法及び交叉免疫電気泳動法は、操作が煩雑で測定に
時間がかかり、感度も比較的低い。ＰＨＡ法は、「医学
のあゆみ」（今井光信ら、第７８巻、７５９頁、１９７
１年）に記載されているように、安定した抗原感作赤血
球を用意することが困難である。ＥＩＡ法及びＲＩＡ法
は、感度はオクタロニー法の２０００〜１万倍にもなる
が、試薬価格が高い。また、ＲＩＡ法は、放射性元素を
用いるため、特別な施設が必要になるという欠点があっ
た。
拡散法及び交叉免疫電気泳動法は、操作が煩雑で測定に
時間がかかり、感度も比較的低い。ＰＨＡ法は、「医学
のあゆみ」（今井光信ら、第７８巻、７５９頁、１９７
１年）に記載されているように、安定した抗原感作赤血
球を用意することが困難である。ＥＩＡ法及びＲＩＡ法
は、感度はオクタロニー法の２０００〜１万倍にもなる
が、試薬価格が高い。また、ＲＩＡ法は、放射性元素を
用いるため、特別な施設が必要になるという欠点があっ
た。
【０００５】このような欠点を解決する方法として、特
開平３−１５２４６７号公報には、補体依存性リポソー
ム膜損傷反応を利用する方法が開示されている。しかし
ながら、この方法は、感度はＰＨＡ法と同程度であり、
反応に要する時間も２時間から一晩と長い。
開平３−１５２４６７号公報には、補体依存性リポソー
ム膜損傷反応を利用する方法が開示されている。しかし
ながら、この方法は、感度はＰＨＡ法と同程度であり、
反応に要する時間も２時間から一晩と長い。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、高感度かつ迅速、簡便なＨＢｓ抗体の定量方法、及
び、このＨＢｓ抗体の定量法を実施するためのＨＢｓ抗
体測定用免疫学的キットを提供することを目的とする。
み、高感度かつ迅速、簡便なＨＢｓ抗体の定量方法、及
び、このＨＢｓ抗体の定量法を実施するためのＨＢｓ抗
体測定用免疫学的キットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中のＨＢ
ｓ抗体を定量するにあたり、上記試料と、ＨＢｓ抗原を
感作した不溶性担体とを溶液中で混合して抗原抗体反応
による凝集反応を生じさせ、上記凝集反応に基づく吸光
度変化量を測定して検量線と照合することよりなるＨＢ
ｓ抗体の定量方法であって、上記不溶性担体は、ラテッ
クス粒子であり、上記溶液中に、平均分子量１０００〜
２００万のポリビニルピロリドン及びビニルピロリドン
−酢酸ビニル共重合体が各々０．１〜５重量％含有され
ていることを特徴とするＨＢｓ抗体の定量方法である。
以下に本発明を詳述する。
ｓ抗体を定量するにあたり、上記試料と、ＨＢｓ抗原を
感作した不溶性担体とを溶液中で混合して抗原抗体反応
による凝集反応を生じさせ、上記凝集反応に基づく吸光
度変化量を測定して検量線と照合することよりなるＨＢ
ｓ抗体の定量方法であって、上記不溶性担体は、ラテッ
クス粒子であり、上記溶液中に、平均分子量１０００〜
２００万のポリビニルピロリドン及びビニルピロリドン
−酢酸ビニル共重合体が各々０．１〜５重量％含有され
ていることを特徴とするＨＢｓ抗体の定量方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００８】本発明においては、試料中のＨＢｓ抗体を
定量するにあたり、まず、試料と、ＨＢｓ抗原を感作し
た不溶性担体とを溶液中で混合して抗原抗体反応による
凝集反応を生じさせる。
定量するにあたり、まず、試料と、ＨＢｓ抗原を感作し
た不溶性担体とを溶液中で混合して抗原抗体反応による
凝集反応を生じさせる。
【０００９】上記試料としては特に限定されず、例え
ば、血清、血漿等が挙げられる。また、本発明のＨＢｓ
抗体の定量方法は、これら以外の各種の生体試料、非生
体試料に適用することも可能である。
ば、血清、血漿等が挙げられる。また、本発明のＨＢｓ
抗体の定量方法は、これら以外の各種の生体試料、非生
体試料に適用することも可能である。
【００１０】本発明においては、上記不溶性担体とし
て、粒径が比較的一定であり、また、工業的に一定の品
質、性能のものを大量生産することができるラテックス
粒子が用いられる。上記ラテックス粒子としては特に限
定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニ
トリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル
酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合
体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレ
ート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等
の微粒子等が挙げられる。これらのうち、抗原の吸着性
に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持
できる等の理由から、ポリスチレン系のラテックス粒子
が好適に用いられる。
て、粒径が比較的一定であり、また、工業的に一定の品
質、性能のものを大量生産することができるラテックス
粒子が用いられる。上記ラテックス粒子としては特に限
定されず、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニ
トリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル
酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体や共重合
体；スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレ
ート−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等
の微粒子等が挙げられる。これらのうち、抗原の吸着性
に優れており、かつ、生物学的活性を長期間安定に保持
できる等の理由から、ポリスチレン系のラテックス粒子
が好適に用いられる。
【００１１】上記不溶性担体である上記ラテックス粒子
の粒径は、０．０５〜１μｍが好ましい。小さすぎる
と、凍結乾燥を行ったときに分散が困難となり、大きす
ぎると、自己凝集が進み、分散性が低下する。より好ま
しくは、０．１〜０．５μｍである。
の粒径は、０．０５〜１μｍが好ましい。小さすぎる
と、凍結乾燥を行ったときに分散が困難となり、大きす
ぎると、自己凝集が進み、分散性が低下する。より好ま
しくは、０．１〜０．５μｍである。
【００１２】上記不溶性担体は、ＨＢｓ抗原が感作され
たものである。上記ＨＢｓ抗原としては特に限定され
ず、例えば、既知の方法によりＨＢｓ抗原陽性ヒト血清
から精製されたもの、遺伝子組換えによって得られたも
の等が挙げられる。また、純度や処理方法によって制限
されるものではない。
たものである。上記ＨＢｓ抗原としては特に限定され
ず、例えば、既知の方法によりＨＢｓ抗原陽性ヒト血清
から精製されたもの、遺伝子組換えによって得られたも
の等が挙げられる。また、純度や処理方法によって制限
されるものではない。
【００１３】上記不溶性担体への上記ＨＢｓ抗原の感作
は、物理的又は化学的に吸着させる方法等により行うこ
とができる。この場合において、上記ＨＢｓ抗原は、凝
集反応を生じせしめる溶液中において、０．１〜１００
μｇ／ｍｌとなるように、上記不溶性担体に感作され
る。少なすぎると、感度が低く、低濃度での正確な測定
ができず、多すぎると、非特異反応による凝集が生じ、
正確な測定ができない。
は、物理的又は化学的に吸着させる方法等により行うこ
とができる。この場合において、上記ＨＢｓ抗原は、凝
集反応を生じせしめる溶液中において、０．１〜１００
μｇ／ｍｌとなるように、上記不溶性担体に感作され
る。少なすぎると、感度が低く、低濃度での正確な測定
ができず、多すぎると、非特異反応による凝集が生じ、
正確な測定ができない。
【００１４】本発明においては、上記試料と上記不溶性
担体とを溶液中で混合する。上記溶液としては特に限定
されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
担体とを溶液中で混合する。上記溶液としては特に限定
されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリ
ス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。
【００１５】本発明においては、上記溶液中の上記不溶
性担体の濃度は、０．０１〜０．５重量％が好ましい。
低すぎると、凝集塊の形成が不充分であり、必要な感度
が得られず、高すぎると、バックグラウンドとしての吸
光度が高すぎ、正確な定量を行うことができない。
性担体の濃度は、０．０１〜０．５重量％が好ましい。
低すぎると、凝集塊の形成が不充分であり、必要な感度
が得られず、高すぎると、バックグラウンドとしての吸
光度が高すぎ、正確な定量を行うことができない。
【００１６】本発明においては、上記溶液中に、ポリビ
ニルピロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体が含有される。ポリビニルピロリドンが上記溶液中
に含有されることにより、感度の向上及び反応の促進を
図ることができ、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体が上記溶液中に含有されることにより、反応の促進及
び再現性の向上を図ることができる。
ニルピロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体が含有される。ポリビニルピロリドンが上記溶液中
に含有されることにより、感度の向上及び反応の促進を
図ることができ、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体が上記溶液中に含有されることにより、反応の促進及
び再現性の向上を図ることができる。
【００１７】上記ポリビニルピロリドンの平均分子量
は、１０００〜２００万である。小さすぎると、感度の
向上又は反応促進の効果が不充分であり、大きすぎる
と、上記溶液への溶解度が著しく低くなり、溶解性の点
で問題が生じるので、上記範囲に限定される。好ましく
は、５０００〜２００万である。
は、１０００〜２００万である。小さすぎると、感度の
向上又は反応促進の効果が不充分であり、大きすぎる
と、上記溶液への溶解度が著しく低くなり、溶解性の点
で問題が生じるので、上記範囲に限定される。好ましく
は、５０００〜２００万である。
【００１８】上記ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体における、ビニルピロリドンの割合は、特に限定され
ないが、５５〜９５モル％が好ましい。
体における、ビニルピロリドンの割合は、特に限定され
ないが、５５〜９５モル％が好ましい。
【００１９】上記溶液中の上記ポリビニルピロリドン及
び及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体の濃度
は、各々０．１〜５重量％である。低すぎると、感度が
低く、低濃度域での正確な測定ができず、高すぎると、
非特異的反応による凝集が生じ、正確な測定ができない
ので、上記範囲に限定される。好ましくは、各々０．４
〜３．０重量％である。
び及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体の濃度
は、各々０．１〜５重量％である。低すぎると、感度が
低く、低濃度域での正確な測定ができず、高すぎると、
非特異的反応による凝集が生じ、正確な測定ができない
ので、上記範囲に限定される。好ましくは、各々０．４
〜３．０重量％である。
【００２０】上記ポリビニルピロリドン及びビニルピロ
リドン−酢酸ビニル共重合体は、適宜な媒体に分散又は
溶解させて使用することが好ましい。この場合において
は、上記不溶性担体と、上記ポリビニルピロリドン及び
ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを同一の媒体
に分散又は溶解させることにより１液型のラテックス試
薬として使用してもよく、また、それぞれ、別個の媒体
に分散又は溶解させることによりラテックス試薬と溶液
状の試薬である検体希釈用液との２液型試薬として使用
してもよい。
リドン−酢酸ビニル共重合体は、適宜な媒体に分散又は
溶解させて使用することが好ましい。この場合において
は、上記不溶性担体と、上記ポリビニルピロリドン及び
ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを同一の媒体
に分散又は溶解させることにより１液型のラテックス試
薬として使用してもよく、また、それぞれ、別個の媒体
に分散又は溶解させることによりラテックス試薬と溶液
状の試薬である検体希釈用液との２液型試薬として使用
してもよい。
【００２１】上記媒体としては特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、
５．５〜８．５が好ましい。より好ましくは、６．５〜
８．０である。
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッド緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨは、
５．５〜８．５が好ましい。より好ましくは、６．５〜
８．０である。
【００２２】上記１液型のラテックス試薬中には、更
に、牛血清アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調
整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。
また、上記２液型試薬中にも、それぞれに牛血清アルブ
ミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調整のために塩化ナ
トリウム等を適宜溶解させてもよい。
に、牛血清アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調
整のために塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。
また、上記２液型試薬中にも、それぞれに牛血清アルブ
ミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調整のために塩化ナ
トリウム等を適宜溶解させてもよい。
【００２３】本発明においては、上記抗原抗体反応によ
る凝集反応は、恒温において行われるのが好ましい。好
ましくは、２５〜３７℃である。また、上記凝集反応
は、好ましくは、５秒〜１５分間行う。短すぎると、正
確な測定ができず、長すぎると、非特異的反応による凝
集が生じ、正確な測定ができない。
る凝集反応は、恒温において行われるのが好ましい。好
ましくは、２５〜３７℃である。また、上記凝集反応
は、好ましくは、５秒〜１５分間行う。短すぎると、正
確な測定ができず、長すぎると、非特異的反応による凝
集が生じ、正確な測定ができない。
【００２４】上記定量の手順は、通常、試料及び検体希
釈用液を反応容器に分注し、インキュベートした後、ラ
テックス試薬を添加・混合する。
釈用液を反応容器に分注し、インキュベートした後、ラ
テックス試薬を添加・混合する。
【００２５】本発明においては、次に、上記凝集反応に
基づく吸光度変化量を測定して検量線と照合することに
より、ＨＢｓ抗体を定量する。上記吸光度変化量は、凝
集反応に伴う吸光度の増加量が好ましい。
基づく吸光度変化量を測定して検量線と照合することに
より、ＨＢｓ抗体を定量する。上記吸光度変化量は、凝
集反応に伴う吸光度の増加量が好ましい。
【００２６】上記吸光度変化量の測定の際の測定波長
は、通常、５００〜１０００ｎｍ、好ましくは、５００
〜８００ｎｍの範囲から適切な波長が選択される。上記
吸光度変化量の測定に用いられる測定装置としては、経
時的に上記溶液の吸光度を測定することできるものであ
れば特に限定されず、例えば、汎用の生化学自動分析装
置等が挙げられる。上記測定波長、検体量、試薬量等
は、上記測定装置に合わせて適宜選択することができ
る。
は、通常、５００〜１０００ｎｍ、好ましくは、５００
〜８００ｎｍの範囲から適切な波長が選択される。上記
吸光度変化量の測定に用いられる測定装置としては、経
時的に上記溶液の吸光度を測定することできるものであ
れば特に限定されず、例えば、汎用の生化学自動分析装
置等が挙げられる。上記測定波長、検体量、試薬量等
は、上記測定装置に合わせて適宜選択することができ
る。
【００２７】上記検量線と照合する具体的な方法として
は、例えば、ＨＢｓ抗体の希釈系列等の濃度既知のＨＢ
ｓ抗体試料について、吸光度変化量の測定を行い、その
測定値とＨＢｓ抗体量とから検量線を作成しておき、濃
度未知のＨＢｓ抗体試料について同一条件で測定した吸
光度変化量の測定値から上記検量線において対応するＨ
Ｂｓ抗体量を求めることにより実施することができる。
は、例えば、ＨＢｓ抗体の希釈系列等の濃度既知のＨＢ
ｓ抗体試料について、吸光度変化量の測定を行い、その
測定値とＨＢｓ抗体量とから検量線を作成しておき、濃
度未知のＨＢｓ抗体試料について同一条件で測定した吸
光度変化量の測定値から上記検量線において対応するＨ
Ｂｓ抗体量を求めることにより実施することができる。
【００２８】本発明２は、ＨＢｓ抗原を感作したラテッ
クス粒子と、平均分子量１０００〜２００万のポリビニ
ルピロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体とを含むことを特徴とする請求項１記載のＨＢｓ抗体
の定量方法を実施するためのＨＢｓ抗体測定用免疫学的
キットである。
クス粒子と、平均分子量１０００〜２００万のポリビニ
ルピロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合
体とを含むことを特徴とする請求項１記載のＨＢｓ抗体
の定量方法を実施するためのＨＢｓ抗体測定用免疫学的
キットである。
【００２９】本発明２のＨＢｓ抗体測定用免疫学的キッ
トとしては、例えば、不溶性担体と、ポリビニルピロリ
ドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを同
一の媒体に分散又は溶解させることにより１液型のラテ
ックス試薬としたもの、また、それぞれ、別個の媒体に
分散又は溶解させることによりラテックス試薬と溶液状
の試薬である検体希釈用液との２液型試薬としたものな
どが挙げられる。
トとしては、例えば、不溶性担体と、ポリビニルピロリ
ドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを同
一の媒体に分散又は溶解させることにより１液型のラテ
ックス試薬としたもの、また、それぞれ、別個の媒体に
分散又は溶解させることによりラテックス試薬と溶液状
の試薬である検体希釈用液との２液型試薬としたものな
どが挙げられる。
【００３０】本発明２のＨＢｓ抗体測定用免疫学的キッ
トを用いてＨＢｓ抗体を定量する具体的な方法として
は、例えば、ＨＢｓ抗体の定量を行おうとする試料と、
上記検体希釈用液とを反応容器に分注し、インキュベー
トした後、上記ＨＢｓ抗原を感作したラテックス粒子か
らなるラテックス試薬を添加混合することにより実施す
ることができる。
トを用いてＨＢｓ抗体を定量する具体的な方法として
は、例えば、ＨＢｓ抗体の定量を行おうとする試料と、
上記検体希釈用液とを反応容器に分注し、インキュベー
トした後、上記ＨＢｓ抗原を感作したラテックス粒子か
らなるラテックス試薬を添加混合することにより実施す
ることができる。
【００３１】
【発明の実施の形態】以下に実施例を掲げて本発明を更
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定
されるものではない。
【００３２】実施例１ （１）ＨＢｓ抗原感作ラテックス液の調製 ＨＢｓ抗原を２．０ｍｇ／ｍｌの濃度で１０ｍＭのトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液７．５ｍｌ
に、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１ｍｌ
と、リン酸−食塩緩衝液（０．０３６Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．６）、０．１ＭのＮａＣｌ）とを添加し、３
０℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウシ血清
アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を１重量％含有す
るリン酸−食塩緩衝液（０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、０．１ＭのＮａＣｌ）（以下「ＰＢＳ」と
いう）を添加し、３０℃にて６０分間攪拌した後、４℃
にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離することに
より洗浄した。洗浄操作は３回行った。得られた沈殿物
にＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳ１０ｍｌを添加し、
ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機にて分散処理を
行い、固形分０．１％（Ｗ／Ｖ）のＨＢｓ抗原感作ラテ
ックス液を調製した。
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した液７．５ｍｌ
に、平均粒径が０．３μｍのポリスチレンラテックス
（固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１ｍｌ
と、リン酸−食塩緩衝液（０．０３６Ｍのリン酸緩衝液
（ｐＨ６．６）、０．１ＭのＮａＣｌ）とを添加し、３
０℃にて６０分間攪拌した。次いで、この液にウシ血清
アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）を１重量％含有す
るリン酸−食塩緩衝液（０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）、０．１ＭのＮａＣｌ）（以下「ＰＢＳ」と
いう）を添加し、３０℃にて６０分間攪拌した後、４℃
にて２０分間、１８０００ｒｐｍで遠心分離することに
より洗浄した。洗浄操作は３回行った。得られた沈殿物
にＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳ１０ｍｌを添加し、
ラテックスを懸濁した後、超音波破砕機にて分散処理を
行い、固形分０．１％（Ｗ／Ｖ）のＨＢｓ抗原感作ラテ
ックス液を調製した。
【００３３】（２）検体希釈用液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１２０
万のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−９
０、ＢＡＳＦ社製）（以下「ＰＶＰ」という）を０．７
５重量％の濃度に、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体（ビニルピロリドン：酢酸ビニル＝７：３（モル
比）、ＢＡＳＦ社製）（以下「ＰＶＰ−ＶＡ」という）
を２重量％の濃度になるように溶解した。
万のポリビニルピロリドン（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−９
０、ＢＡＳＦ社製）（以下「ＰＶＰ」という）を０．７
５重量％の濃度に、ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重
合体（ビニルピロリドン：酢酸ビニル＝７：３（モル
比）、ＢＡＳＦ社製）（以下「ＰＶＰ−ＶＡ」という）
を２重量％の濃度になるように溶解した。
【００３４】（３）ＨＢｓ抗体測定試薬 本実施例のＨＢｓ抗体測定試薬は、上記（１）項のＨＢ
ｓ抗原感作ラテックス液からなる第１試薬と、上記
（２）項のＰＶＰ及びＰＶＰ−ＶＡ含有溶液からなる第
２試薬とから構成される２液型の試薬である。
ｓ抗原感作ラテックス液からなる第１試薬と、上記
（２）項のＰＶＰ及びＰＶＰ−ＶＡ含有溶液からなる第
２試薬とから構成される２液型の試薬である。
【００３５】（４）標準ＨＢｓ抗体液 ＨＢｓ抗体を０、１５０、３００、６００、１２００ｍ
ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。
ＩＵ／ｍｌ濃度で含むヒト血清を標準品として使用し
た。
【００３６】（５）測定方法 検体２０μｌと上記（２）項の検体希釈用液１２０μｌ
とを混合し、３７℃で適時保持した後、上記（１）項の
ＨＢｓ抗原感作ラテックス液１２０μｌを添加攪拌し
た。この後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍでの吸
光度を測定し、この差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とし
た。測定は、日立自動分析装置７１５０形を使用した。
標準ＨＢｓ抗体液を測定して、予め検量線を作成してお
き、検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿して、検体
中のＨＢｓ抗体量を算出した。
とを混合し、３７℃で適時保持した後、上記（１）項の
ＨＢｓ抗原感作ラテックス液１２０μｌを添加攪拌し
た。この後、１分後及び５分後の波長７５０ｎｍでの吸
光度を測定し、この差を吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とし
た。測定は、日立自動分析装置７１５０形を使用した。
標準ＨＢｓ抗体液を測定して、予め検量線を作成してお
き、検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿して、検体
中のＨＢｓ抗体量を算出した。
【００３７】（６）検体の測定 ＨＢｓ抗体陽性の血清及び陰性の血清を検体として、上
記の測定方法（以下「ラテックス法」という）に従っ
て、ＨＢｓ抗体量を測定した。 （７）同時再現性試験 また、ＨＢｓ抗体を１５０ｍＩＵ／ｍｌ含有する血清及
びＨＢｓ抗体陰性の血清を検体とし、上記の測定方法に
従って、ＨＢｓ抗体量を各１０回多重測定した。
記の測定方法（以下「ラテックス法」という）に従っ
て、ＨＢｓ抗体量を測定した。 （７）同時再現性試験 また、ＨＢｓ抗体を１５０ｍＩＵ／ｍｌ含有する血清及
びＨＢｓ抗体陰性の血清を検体とし、上記の測定方法に
従って、ＨＢｓ抗体量を各１０回多重測定した。
【００３８】実施例２ 実施例１における（２）検体希釈用液の調製を以下のよ
うに行ったこと、および（６）検体の測定を行わなかっ
たこと以外は、実施例１と同様に行った。
うに行ったこと、および（６）検体の測定を行わなかっ
たこと以外は、実施例１と同様に行った。
【００３９】（２）検体希釈用液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量９０万
のＰＶＰ（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社
製）を２重量％の濃度に、実施例１と同様のＰＶＰ−Ｖ
Ａを２重量％の濃度になるように溶解した。
のＰＶＰ（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社
製）を２重量％の濃度に、実施例１と同様のＰＶＰ−Ｖ
Ａを２重量％の濃度になるように溶解した。
【００４０】比較例１ ＰＨＡ法による測定 実施例１における（６）で測定した検体について、市販
のＰＨＡ法によるＨＢｓ抗体測定キット（リバースセル
Ａｂ、山之内製薬社製）を用いて、検体中のＨＢｓ抗体
量を測定した。方法は、キットの能書に従って行った。
のＰＨＡ法によるＨＢｓ抗体測定キット（リバースセル
Ａｂ、山之内製薬社製）を用いて、検体中のＨＢｓ抗体
量を測定した。方法は、キットの能書に従って行った。
【００４１】比較例２ ＥＩＡ法による測定 実施例１における（６）で測定した検体について、市販
のＥＩＡ法によるＨＢｓ抗体測定キット（エンザイグノ
スト Ａｎｔｉ−ＨＢｓ ｍｉｃｒｏ、ヘキストジャパ
ン社製）を用いて、検体中のＨＢｓ抗体量を測定した。
方法は、キットの能書に従って行った。
のＥＩＡ法によるＨＢｓ抗体測定キット（エンザイグノ
スト Ａｎｔｉ−ＨＢｓ ｍｉｃｒｏ、ヘキストジャパ
ン社製）を用いて、検体中のＨＢｓ抗体量を測定した。
方法は、キットの能書に従って行った。
【００４２】比較例３ 実施例２における（２）検体希釈用液の調製を以下のよ
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００４３】（２）検体希釈用液の調製 ＰＢＳにＢＳＡを１重量％の濃度になるように溶解し
た。
た。
【００４４】比較例４ 実施例２における（２）検体希釈用液の調製を以下のよ
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００４５】（２）検体希釈用液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量１２０
万のＰＶＰ（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社
製）を０．７５重量％の濃度になるように溶解した。
万のＰＶＰ（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−９０、ＢＡＳＦ社
製）を０．７５重量％の濃度になるように溶解した。
【００４６】比較例５ 実施例２における（２）検体希釈用液の調製を以下のよ
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００４７】（２）検体希釈用液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、平均分子量９０万
のＰＶＰ（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社
製）を２重量％の濃度になるように溶解した。
のＰＶＰ（Ｌｕｖｉｓｋｏｌ Ｋ−６０、ＢＡＳＦ社
製）を２重量％の濃度になるように溶解した。
【００４８】比較例６ 実施例２における（２）検体希釈用液の調製を以下のよ
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
うに行ったこと以外は、実施例２と同様に行った。
【００４９】（２）検体希釈用液の調製 ＢＳＡを１重量％含有するＰＢＳに、実施例１と同様の
ＰＶＰ−ＶＡを２重量％の濃度になるように溶解した。
ＰＶＰ−ＶＡを２重量％の濃度になるように溶解した。
【００５０】結果 実施例１、２および比較例３〜６の検量線を表１及び図
１に示した。また、実施例１、２および比較例４、５の
同時再現性試験の結果を表６に示した（なお、比較例３
及び６の同時再現性試験の結果については、ＨＢｓ抗体
を１５０ｍＩＵ／ｍｌ含有する血清においても、吸光度
変化量（ΔＡｂｓ）が非常に小さいので表６に記載しな
かった）。ＰＶＰ及びＰＶＰ−ＶＡを添加することによ
り反応量が増大するとともに、、同時再現性も向上し、
Ｃ．Ｖ．値が５％以下と良好であった。
１に示した。また、実施例１、２および比較例４、５の
同時再現性試験の結果を表６に示した（なお、比較例３
及び６の同時再現性試験の結果については、ＨＢｓ抗体
を１５０ｍＩＵ／ｍｌ含有する血清においても、吸光度
変化量（ΔＡｂｓ）が非常に小さいので表６に記載しな
かった）。ＰＶＰ及びＰＶＰ−ＶＡを添加することによ
り反応量が増大するとともに、、同時再現性も向上し、
Ｃ．Ｖ．値が５％以下と良好であった。
【００５１】実施例１及び比較例１、２の検体測定結果
を表２、３に示した。更に、ラテックス法とＰＨＡ法と
の一致率及びラテックス法とＥＩＡ法との一致率を表
４、５に示した。表２〜５より、比較例１のＰＨＡ法は
低濃度域の感度が低いため実施例１のラテックス法との
一致率が８０％であった。一方、ラテックス法と比較例
２のＥＩＡ法との一致率は１００％であり、本発明のラ
テックス試薬は、ＥＩＡ法と同等の感度を有することが
明らかになった。
を表２、３に示した。更に、ラテックス法とＰＨＡ法と
の一致率及びラテックス法とＥＩＡ法との一致率を表
４、５に示した。表２〜５より、比較例１のＰＨＡ法は
低濃度域の感度が低いため実施例１のラテックス法との
一致率が８０％であった。一方、ラテックス法と比較例
２のＥＩＡ法との一致率は１００％であり、本発明のラ
テックス試薬は、ＥＩＡ法と同等の感度を有することが
明らかになった。
【００５２】以上のように、ＰＶＰ及びＰＶＰ−ＶＡを
同時に使用することにより、感度、同時再現性に優れた
測定系が得られることが明らかとなった。
同時に使用することにより、感度、同時再現性に優れた
測定系が得られることが明らかとなった。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【表２】
【００５５】
【表３】
【００５６】
【表４】
【００５７】
【表５】
【００５８】
【表６】
【００５９】なお、表６に示した同時再現性試験の結果
は、得られた吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を１００００倍
した数値を示している。
は、得られた吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を１００００倍
した数値を示している。
【００６０】
【発明の効果】本発明のＨＢｓ抗体の定量方法及びＨＢ
ｓ抗体測定用免疫学的キットは、上述の構成からなるの
で、ＥＩＡ法と同等の高い感度を有し、かつ、迅速、簡
便に試料中のＨＢｓ抗体を定量することができる。
ｓ抗体測定用免疫学的キットは、上述の構成からなるの
で、ＥＩＡ法と同等の高い感度を有し、かつ、迅速、簡
便に試料中のＨＢｓ抗体を定量することができる。
【図１】実施例１、２および比較例３〜６の検量線であ
る。縦軸は、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）であり、横軸
は、標準ＨＢｓ抗体液の濃度である。
る。縦軸は、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）であり、横軸
は、標準ＨＢｓ抗体液の濃度である。
Claims (2)
- 【請求項１】 試料中のＨＢｓ抗体を定量するにあた
り、上記試料と、ＨＢｓ抗原を感作した不溶性担体とを
溶液中で混合して抗原抗体反応による凝集反応を生じさ
せ、上記凝集反応に基づく吸光度変化量を測定して検量
線と照合することよりなるＨＢｓ抗体の定量方法であっ
て、上記不溶性担体は、ラテックス粒子であり、上記溶
液中に、平均分子量１０００〜２００万のポリビニルピ
ロリドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体が
各々０．１〜５重量％含有されていることを特徴とする
ＨＢｓ抗体の定量方法。 - 【請求項２】 ＨＢｓ抗原を感作したラテックス粒子
と、平均分子量１０００〜２００万のポリビニルピロリ
ドン及びビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体とを含
むことを特徴とする請求項１記載のＨＢｓ抗体の定量方
法を実施するためのＨＢｓ抗体測定用免疫学的キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9111198A JPH10300753A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | ＨＢｓ抗体の定量方法及びＨＢｓ抗体測定用免疫学的キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9111198A JPH10300753A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | ＨＢｓ抗体の定量方法及びＨＢｓ抗体測定用免疫学的キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10300753A true JPH10300753A (ja) | 1998-11-13 |
Family
ID=14554997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9111198A Pending JPH10300753A (ja) | 1997-04-28 | 1997-04-28 | ＨＢｓ抗体の定量方法及びＨＢｓ抗体測定用免疫学的キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10300753A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077238A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-12 | Qiagen Gmbh | Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen |
-
1997
- 1997-04-28 JP JP9111198A patent/JPH10300753A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007077238A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-12 | Qiagen Gmbh | Verwendung von polymeren zur erhöhung der signalintensität bei der durchführung von nachweisreaktionen |
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Effective date: 20071023 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080311 |