CN113933506A - 测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒 - Google Patents

测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113933506A
CN113933506A CN202111269151.3A CN202111269151A CN113933506A CN 113933506 A CN113933506 A CN 113933506A CN 202111269151 A CN202111269151 A CN 202111269151A CN 113933506 A CN113933506 A CN 113933506A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
chi3l1
protein
chitinase
reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111269151.3A
Other languages
English (en)
Inventor
王海森
王鹏
路鹏晓
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Original Assignee
Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Leadman Biochemistry Co ltd filed Critical Beijing Leadman Biochemistry Co ltd
Priority to CN202111269151.3A priority Critical patent/CN113933506A/zh
Publication of CN113933506A publication Critical patent/CN113933506A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G01N21/763—Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明为测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：磁分离试剂、R1试剂、R2试剂、校准品液系列和化学发光底物液；磁分离试剂包括包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，R1试剂为样品处理液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体稀释液，校准品液系列为含有不同浓度壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原的稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液；所述R1试剂包括缓冲液、能促进碱性磷酸酶反应的表面活性剂和鼠抗。该试剂盒工艺简单、线性范围宽、检测速度快、灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好并且成本低廉。

Description

测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光 检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医用诊断试剂领域，特别是涉及一种采用磁微粒化学发光技术和抗原-抗体结合技术检测人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。
背景技术
壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase-3-like protein 1，缩写为CHI3L1):chitinase-3-like蛋白1(CHI3L1)，又称人软骨糖蛋白39(YK-40)，是几丁质酶蛋白家族的一员，是一种分泌型糖蛋白，分子量约40kDa。
通过系统生物学方法，结合二代测序表达谱技术和蛋白质组学技术，发现CHI3L1可作为肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测的标记物。研究表明，CHI3L1诊断显著肝纤维化ROC曲线下面积均高于HA、LN、PⅢNP和CⅣ。血清CHI3L1水平在酒精性肝硬化病人中升高。Kamal等的研究表明血液中的CHI3L1蛋白水平与丙肝病毒慢性感染和肝纤维化有关。
对于中国人群乙肝病毒感染后血液中CHI3L1水平与肝纤维化和肝硬化的关系，用最新的二代测序技术分析表明:肝细胞CHI3L1的表达量是552，分析的其他15个组织器官中(心脏，脑，胸，大肠，肾脏,肺，前列腺，卵巢，肌肉，脂肪，淋巴结，甲状腺，肾上腺，血液白细胞，睾丸)，最高的表达是在肾脏，为36。肝细胞表达量为其他组织器官的15-227倍。胞外基质蛋白的增加和积累是肝纤维化过程的起因。CHI3L1是肝脏表达最多的，分泌到胞外基质的蛋白。因此，CHI3L1表达水平反映了肝纤维化的程度。
现有技术壳多糖酶3样蛋白1的检测方法主要有酶联免疫法、免疫层析、化学发光法等，然而这些方法具有工艺复杂，线性范围窄(最大线性6-1500pg/mL)，检测时间长(检测时间一般为60min以上)等缺点，无法满足临床需求。
因此，目前尚需一种污染小、线性范围宽、灵敏度高、操作简单、自动化程度高、特异性好、成本低、检测速度快的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)检测试剂盒和使用方法。
发明内容
本发明旨在开发一种工艺简单、线性范围宽、检测速度快、灵敏度高、无污染、操作简单、特异性好并且成本低廉的一种测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒。
基于上述目的，本发明提供一种测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：磁分离试剂、R1试剂、R2试剂、校准品液系列和化学发光底物液；磁分离试剂包括包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，R1试剂为样品稀释液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体稀释液，校准品液系列为含有不同浓度壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原的稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液；所述R1试剂包括缓冲液、能促进碱性磷酸酶反应的表面活性剂和鼠抗。
磁分离试剂中包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠浓度为1.4-1.6mg/mL，封闭液中加入聚乙烯吡咯烷酮。
所述包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠的包被方法为：
(1)洗涤磁珠：取100mg/mL的磁珠100μL，加入0.05M的MES缓冲液1mL，混匀5分钟，磁分离，去上清，重复洗涤3次；
(2)包被：取洗涤完成的磁珠，加入50μL 20mg/mL的EDC溶液(EDC溶液使用冷藏的MES缓冲液配制后5分钟内使用)同时加入用0.05M MES稀释后的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体，充分混匀，室温(18-25℃)混匀反应18h；
(3)封闭：将孵育后的磁珠磁分离，去上清，加入1mL封闭液，混匀5分钟，磁分离，去上清，重复洗涤3次，得到包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，浓度为10mg/mL；
(4)定容：用封闭液最终定容到6.67mL，浓度为1.5mg/mL，置于2-8℃平衡24h，得到壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体包被的磁分离试剂；
所述封闭液为pH值为7.0～8.0，包括：PBS，浓度为0.02M；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1M的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为10.0～50.0g/L；蔗糖：浓度为20.0～100.0g/L；Proclin300，浓度为1.05～4.20g/L；BRO(Bronidox)，浓度为1.05～4.20g/L；10.0～20.0g/L的甘油，聚乙烯吡咯烷酮(PVP360)，15-25g/L；其余组分为去离子水。在较高浓度磁珠时容易发生沉降而使磁珠聚集，本发明封闭液中聚乙烯吡咯烷酮的加入降低了其非特异性，同时能防止高浓度磁珠的沉降聚集，提高其悬浮性，有助于提高试剂盒检测的线性及精度。
优选地，所述封闭液pH值为7.4，包括：PBS，浓度为0.02M；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1M的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为10.0g/L；蔗糖：浓度为100.0g/L；Proclin300，浓度为2.1g/L；Bronidox，浓度为2.1g/L，甘油，浓度为20.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮(PVP360)，20g/L；其余组分为去离子水。
另一方案，所述R1试剂的缓冲液pH值为7.2～7.8；缓冲液包括：Tris，浓度为6.0～6.5g/L；Proclin-300，浓度为1.0～3.0g/L；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/L；牛血清白蛋白，浓度为2～5g/L；其余为去离子水。所述R1试剂中表面活性剂Tween20的质量分数为0.1-0.3％，鼠抗浓度为50～200μg/mL。本发明中R1试剂无需加入阻断剂和EDTA-2Na，加入适量的牛血清白蛋白，保持合适的非特异性，同时加入表面活性剂能够促进人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的反应，缩短反应时间。
另一方案，所述R1试剂为样品稀释液，缓冲液pH值为7.4，缓冲液包括Tris，浓度为6.05g/L；Proclin-300，浓度为2.00g/L；氯化钠，浓度为9g/L；牛血清白蛋白，浓度为3g/L；表面活性剂Tween20，0.2％，鼠抗100μg/mL，其余为去离子水。
另一方案，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体稀释液是由用SMCC活化的碱性磷酸酶与2-亚氨基硫烷盐酸盐活化的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体按照摩尔比混合均匀进行偶联反应后，使用三乙醇胺缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片段的分离纯化，制得碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)标记抗体。
另一方案，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体稀释液是用SMCC活化的碱性磷酸酶与2-亚氨基硫烷盐酸盐活化的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体按照摩尔比混合均匀进行偶联反应后，使用三乙醇胺缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片段的分离纯化，制得碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)标记抗体，具体由浓度为0.8～1.5μg/mL碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体经缓冲液稀释而成。
另一方案，所述R2试剂缓冲液为pH值为7.2-7.5，缓冲液包括Tris，浓度为5.98～6.52g/L；Proclin-300，浓度为1.5～2.5g/L；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/L；牛血清白蛋白，浓度为10～30g/L；Gelatin，浓度为5～10g/L；新生牛血清，浓度为30～50g/L；N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为0.85～2.05g/L；TritonX-100，浓度为0.98～1.99g/L，吐温-20，浓度为0.98-1.99g/L，MgCl2，浓度为0.9-1.1mol/L，其余为去离子水。
另一方案，所述R2试剂即碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体稀释液是由浓度为1.0μg/mL碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体经缓冲液稀释而成。
另一方案，所述R2试剂缓冲液pH值为7.4，缓冲液包括Tris，浓度为6.05g/L；Proclin-300，浓度为2.0g/L；氯化钠，浓度为9g/L；牛血清白蛋白，浓度为29.88g/L；Gelatin，浓度为9.86g/L；新生牛血清，浓度为50g/L；N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为1.05g/L；TritonX-100，浓度为0.98g/L；吐温-20，浓度为1.99g/L，MgCl2，浓度为1.0mol/L；其余为去离子水。
另一方案，所述校准品液系列为含有不同浓度壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原的稀释液。
另一方案，所述校准品液系列的缓冲液为pH值为7.0～8.0，缓冲液组分包括Tris，浓度为0.05M；马血清，浓度为300～400g/L；牛血清白蛋白，浓度为20～30g/L；Proclin-300，浓度为2～4g/L，其余组分为去离子水。
另一方案，所述校准品液系列，浓度为0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL，缓冲液pH值为7.4，缓冲液组分包括Tris，浓度为0.05M；马血清，浓度为500g/L；牛血清白蛋白，浓度为25g/L；Proclin-300，浓度为3g/L；其余组分为去离子水。
另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度0.1～0.3M的碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，pH值为8～10的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液，并含有0.2～0.4mg/mL的二氧杂环乙烷化合物(APCL)。
另一方案，所述化学发光底物液是摩尔浓度为0.2M二氧杂环乙烷化合物(APCL)，pH值为9.3的摩尔浓度0.2M的Tris-HCl缓冲液作为稀释液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明试剂盒针对人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的检测而设计，为一种磁微粒化学发光检测试剂盒，结合壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的特殊性本申请中R1试剂不需要生物素标记，且在R1试剂中添加了能促进碱性磷酸酶反应的表面活性剂和鼠抗，使待测物质更快速、更容易与抗体结合，提高了样本检测速度，减少了工艺复杂性，避免了生物素对样本测值的干扰；同时针对壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的特殊性磁分离试剂包被采用一步法室温包被，与先活化磁珠后加入抗体的两步法包被工艺相比，降低了磁珠的非特异性，提高了线性，另外相对37度包被条件，降低了高温对于抗体的破坏，提高了包被后磁珠的稳定性；R2试剂中添加了二价氧离子MgCl2在不影响体系pH值的前提下，可减少碱性磷酸酶活性基团的破坏，有效的提升了试剂盒稳定性。
本发明成功地将磁微粒化学发光法用于人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的检测，且所获得的试剂盒相对于现有技术集高线性、宽跨度、高灵敏性、高稳定性于一体。本发明提供的人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒与全自动化学发光分析仪搭配使用，基本无需人为干预，避免了人为操作导致的误差，同时加快了检测速度，提高了检测效率，同时本发明的试剂盒磁珠制作工艺简单，重现性好，非特异性低、灵敏度高、线性宽，检测速度快，稳定性好，能很好地用于人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的检测，更能满足市场需求。
附图说明
图1为本发明实施例2试剂盒中壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)的浓度－发光值曲线图；
图2为本发明实施例2试剂盒中与普望试剂盒样本检测相关性的结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图进一步解释本发明，但并不以此作为对本申请保护范围的限定。
本发明测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的组成包括磁分离试剂、R1试剂、R2试剂、校准品液系列和化学发光底物液。
磁分离试剂包括：1)磁微粒：包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，浓度为10mg/mL；2)封闭液：PBS，浓度为0.02M；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1M的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为10.0～50.0g/L；蔗糖：浓度为20.0～100.0g/L；Proclin300，浓度为1.05～4.20g/L；Bronidox，浓度为1.05～4.20g/L，10.0～20.0g/L的甘油，聚乙烯吡咯烷酮(PVP360)，15-25g/L；其余组分为去离子水。磁分离试剂的封闭液pH值为7.0～8.0。
R1试剂包括：Tris，浓度为6.0～6.5g/L；Proclin-300，浓度为1.0～3.0g/L；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/L；牛血清白蛋白，浓度为2～5g/L；表面活性剂Tween20，0.1-0.3％，鼠抗，浓度为50～200ug/mL；其余为去离子水。R1试剂的缓冲液pH值为7.4，R1试剂的缓冲液为不包含表面活性剂和鼠抗的剩余组分。
R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体，浓度为0.3～0.6μg/mL；2)缓冲液：包括Tris，浓度为5.98～6.52g/L；Proclin-300，浓度为1.5～2.5g/L；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/L；牛血清白蛋白，浓度为10～30g/L；Gelatin，浓度为5～10g/L；新生牛血清，浓度为30～50g/L；N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为0.85～2.05g/L；TritonX-100，浓度为0.98～1.99g/L，吐温-20，浓度为0.98-1.99g/L，MgCl2，浓度为0.9-1.1mol/L，其余为去离子水。R2试剂的缓冲液pH值为7.2-7.5。
校准品液系列包括：1)壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原的稀释液；2)缓冲液：Tris，浓度为0.05M；马血清，浓度为300～400g/L；牛血清白蛋白，浓度为20～30g/L；Proclin-300，浓度为2～4g/L；其余组分为去离子水。校准品液系列的缓冲液pH值为7.4。校准品液系列为含有不同浓度(0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL)的试剂系列。
底物液为摩尔浓度0.1～0.3M碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度为0.2～0.4mg/mL，缓冲液为摩尔浓度为0.2M的Tris-HCl，pH值为8～10。
一种测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
配制磁分离试剂：1)按照磁微粒封闭液组分含量配制封闭液，对磁珠进行洗涤、包被、封闭，获得包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠；2)用磁分离试剂的封闭液对包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠进行定容，制备壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体包被的磁分离试剂。
配制R1试剂：1)按照R1试剂缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)添加表面活性剂及鼠抗(表面活性剂和鼠抗不属于缓冲液的组分)。
配制R2试剂：1)按照R2试剂缓冲液组分含量配制缓冲液，调节pH；2)制备碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体；3)将碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体用R2试剂缓冲液进行稀释。
配制校准品：1)按照校准品缓冲液组分含量配制磷酸盐缓冲液；2)将壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原溶解于校准品缓冲液中配制成不同的浓度。
配制化学发光底物液：1)配制0.2M，pH值为9.3的Tris-HCl缓冲液，并添加0.3mg/mL的二氧杂环乙烷；2)将碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物溶解于缓冲液中。
人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的测定方法和绘制标准曲线
(1)首先，将50μL的校准品系列(浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL)分别与50μLR1试剂、25μL磁分离试剂、50μLR2试剂，依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
(2)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；
(3)加入发光底物液150μL，ALP催化底物发光后采用利德曼公司的化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)，获得壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度-发光值系列数值；
(4)根据壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度-发光值系列数值进行拟合，获得壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度-发光值标准曲线。
(5)根据拟合的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度-发光值标准曲线计算测定待测样本的浓度值。
在一定范围内RLU与壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原浓度呈正比，通过内插法就可以从标准曲线上读取待测样本的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量。
实施例1一种测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒包括R1试剂、磁分离试剂、R2试剂、校准品液系列和化学发光底物液。
本实施例中，磁分离试剂包括：1)磁微粒：包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，浓度为1.5mg/mL；2)封闭液：PBS，浓度为0.02M；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1M的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为10.0g/L；蔗糖：浓度为100.0g/L；Proclin300，浓度为2.1g/L；Bronidox，浓度为2.1g/L，甘油，浓度为20.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮(PVP360)，20g/L；其余组分为去离子水。磁分离试剂的封闭液pH值为7.4。
本实施例中，R1试剂包括：1)缓冲液包括Tris，浓度为6.05g/L；Proclin-300，浓度为2.00g/L；氯化钠，浓度为9g/L；牛血清白蛋白，浓度为3g/L；2)表面活性剂Tween20，0.2％，3)鼠抗100mg/L；其余为去离子水。
本实施例中，R2试剂包括：1)R2抗体：碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体，浓度为1.0μg/ml；2)缓冲液：Tris，浓度为6.05g/L；Proclin-300，浓度为2.0g/L；氯化钠，浓度为9g/L；牛血清白蛋白，浓度为29.88g/L；Gelatin，浓度为9.86g/L；新生牛血清，浓度为50g/L；N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为1.05g/L；TritonX-100，浓度为0.98g/L；吐温-20，浓度为1.99g/L，MgCl2，浓度为1.0mol/L；其余为去离子水。R2试剂的缓冲液pH值优选为7.4。
本实施例中，校准品液系列包括：1)含有不同浓度壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原的稀释液；2)缓冲液：Tris，浓度为0.05M；马血清，浓度为500g/L；牛血清白蛋白，浓度为25g/L；Proclin-300，浓度为3g/L；其余组分为去离子水。校准品液系列的缓冲液pH值为7.4。校准品系列由含有不同浓度(0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL)壳多糖酶3样蛋白1的校准点组成。
本实施例中，底物液为碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物液，其中，发光底物液中二氧杂环乙烷化合物(APCL)的浓度为0.3mg/mL，缓冲液为摩尔浓度为0.2M的Tris-HCl，pH值为9.3。
实施例2测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒的制备和测定方法
(1)首先，将实施例1的50μL的校准品系列(浓度分别为0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL)分别与实施例1的50μLR1试剂、25μL磁分离试剂、50μLR2试剂，依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
(2)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；
(3)加入实施例1的发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼公司的化学发光检测仪测定相对发光强度(RLU)，结果如下表所示：
表1
校准品(pg/mL) 0 10 50 100 500 2000
RLU(10000) 0.12 2.42 14.26 30.82 174.91 619.82
(6)根据表1的数值进行拟合，获得(图1)所示壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度-发光值标准曲线，纵坐标为发光值，横坐标为壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度；
(7)将50μl的待测样品与实施例1的50μlR1试剂、25μl磁分离试剂50μlR2试剂依次加入反应管中，37℃条件下混合温育10min；
(8)用清洗液洗涤3次以去除未结合的抗体和杂质；
(9)加入实施例1的发光底物液150μl，ALP催化底物发光后采用利德曼自研化学发光检测仪测定相对发光强度RLU为1566471；
(10)根据步骤(5)的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度-发光值标准曲线计算待测样品1566471对应的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度值为18.26pg/mL。
采用本发明上述检测试剂盒测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量时的方法学鉴定数据可达到如下指标：
首次出样本时间15min，通量220测试/小时；
试剂盒效期稳定性可达18月；
空白限为≤0.5pg/mL；
壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)线性检测范围，2.0～2000pg/mL；
分析内精密度平均为2.06％(n＝10)，分析间精密度平均为4.65％(n＝30)，精密度远低于国家要求，说明本发明试剂盒在实验过程中具有很好的可重复性；
准确度－将已知壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度的高值血清采用已知壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度的低值血清按1:9比例稀释后回收率为90％～100％；
内源性干扰：800mg/dl的血红蛋白、2000mg/dl的脂肪乳剂、20mg/dl胆红素、1500IU/ml类风湿因子检测结果偏差均小于10％；
HOOK-CHI3L1浓度高达40000pg/mL时无高剂量钩状效应；
本实施例的试剂盒与杭州普望生物检测结果一致性较好，R2＝0.9975(图2)。
上述步骤表明，本发明采用的双抗体夹心法的反应模式，利用化学发光检测技术与磁微粒免疫分离技术相结合的原理，一步法包被磁珠，定量检测人血清或血浆样品中的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量，确保了检测结果的快速、灵敏、高线性，同时检测过程自动化程度高、特异性强、操作简单、并且对样品的前处理要求低、可快速高通量检测大批量样本，提高检测效率，另外试剂盒拥有较长的效期稳定性，方便了临床试剂的使用。本发明为临床检测人血清中的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)提供了一种更稳定、灵敏、快速和简单的方法。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明未述及之处适用于现有技术。

Claims (10)

1.一种测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，包括：磁分离试剂、R1试剂、R2试剂、校准品液系列和化学发光底物液；磁分离试剂包括包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，R1试剂为样品处理液，R2试剂为碱性磷酸酶标记的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体稀释液，校准品液系列为含有不同浓度壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)抗原的稀释液，化学发光底物液为碱性磷酸酶催化发光的底物液；其特征在于，所述R1试剂包括缓冲液、能促进碱性磷酸酶反应的表面活性剂和鼠抗。
2.根据权利要求1所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，磁分离试剂中包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠浓度为1.4-1.6mg/mL，封闭液中加入聚乙烯吡咯烷酮。
3.根据权利要求1所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠的包被方法为：
(1)洗涤磁珠：取100mg/mL的磁珠100μL，加入0.05M的MES缓冲液1mL，混匀5分钟，磁分离，去上清，重复洗涤3次；
(2)包被：取洗涤完成的磁珠，使用冷藏的MES缓冲液配制20mg/mL的EDC溶液，且配制后5min内使用，将50μL、20mg/mL的EDC溶液加入洗涤完的磁珠内，同时加入用0.05MMES稀释后的壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体，充分混匀，在18-25℃下混匀反应18h；
(3)封闭：将孵育后的磁珠磁分离，去上清，加入1mL封闭液，混匀5分钟，磁分离，去上清，重复洗涤3次，得到包被壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体的免疫磁珠，浓度为10mg/mL；
(4)定容：用封闭液最终定容至磁珠浓度为1.5mg/mL，置于2-8℃平衡24h，得到壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)单克隆抗体包被的磁分离试剂；
所述封闭液为pH值为7.0～8.0，包括：PBS，浓度为0.02M；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1M的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为10.0～50.0g/L；蔗糖：浓度为20.0～100.0g/L；Proclin300，浓度为1.05～4.20g/L；BRO(Bronidox)，浓度为1.05～4.20g/L；10.0～20.0g/L的甘油，聚乙烯吡咯烷酮(PVP360)，15-25g/L；其余组分为去离子水。
4.根据权利要求3所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液pH值为7.4，包括：PBS，浓度为0.02M；摩尔浓度为1M的氯化镁溶液；摩尔浓度为0.1M的氯化锌；牛血清白蛋白，浓度为10.0g/L；蔗糖：浓度为100.0g/L；Proclin300，浓度为2.1g/L；Bronidox，浓度为2.1g/L，甘油，浓度为20.0g/L，聚乙烯吡咯烷酮(PVP360)，20g/L；其余组分为去离子水。
5.根据权利要求1所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中缓冲液pH值为7.2～7.8；缓冲液包括：Tris，浓度为6.0～6.5g/L；Proclin-300，浓度为1.0～3.0g/L；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/L；牛血清白蛋白，浓度为2～5g/L；其余为去离子水；在R1试剂中表面活性剂为Tween20表面活性剂，其质量分数为0.1-0.3％，所述鼠抗浓度为50-200μg/mL。
6.根据权利要求5所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中缓冲液pH值为7.4，缓冲液包括Tris，浓度为6.05g/L；Proclin-300，浓度为2.00g/L；氯化钠，浓度为9g/L；牛血清白蛋白，浓度为3g/L；其余为去离子水；在R1试剂中Tween20表面活性剂的质量分数为0.2％，所述鼠抗浓度为100μg/mL。
7.根据权利要求1所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂的缓冲液为pH值为7.2-7.5，缓冲液包括Tris，浓度为5.98～6.52g/L；Proclin-300，浓度为1.5～2.5g/L；氯化钠，浓度为8.5～9.5g/L；牛血清白蛋白，浓度为10～30g/L；Gelatin，浓度为5～10g/L；新生牛血清，浓度为30～50g/L；N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为0.85～2.05g/L；TritonX-100，浓度为0.98～1.99g/L，吐温-20，浓度为0.98-1.99g/L，MgCl2，浓度为0.9-1.1mol/L，其余为去离子水。
8.根据权利要求7所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂缓冲液pH值为7.4，缓冲液包括Tris，浓度为6.05g/L；Proclin-300，浓度为2.0g/L；氯化钠，浓度为9g/L；牛血清白蛋白，浓度为29.88g/L；Gelatin，浓度为9.86g/L；新生牛血清，浓度为50g/L；N-乙基顺丁烯二酰亚胺，浓度为1.05g/L；TritonX-100，浓度为0.98g/L；吐温-20，浓度为1.99g/L，MgCl2，浓度为1.0mol/L；其余为去离子水。
9.根据权利要求1所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述校准品液系列的缓冲液为pH值为7.0～8.0，缓冲液组分包括Tris，浓度为0.05M；马血清，浓度为300～400g/L；牛血清白蛋白，浓度为20～30g/L；Proclin-300，浓度为2～4g/L，其余组分为去离子水；
所述校准品液系列，浓度为0pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、2000pg/mL，优选地，校准品液系列的缓冲液pH值为7.4，缓冲液组分包括Tris，浓度为0.05M；马血清，浓度为500g/L；牛血清白蛋白，浓度为25g/L；Proclin-300，浓度为3g/L；其余组分为去离子水。
10.根据权利要求1所述的测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，上述检测试剂盒测定人体壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)含量时的方法学鉴定数据达到如下指标：
首次出样本时间15min，通量220测试/小时；
试剂盒效期稳定性可达18月；空白限为≤0.5pg/mL；
壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)线性检测范围，2.0～2000pg/mL；
分析内精密度平均为2.06％(n＝10)，分析间精密度平均为4.65％(n＝30)；
将已知壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度的高值血清采用已知壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)浓度的低值血清按1:9比例稀释后回收率为90％～100％；
内源性干扰：800mg/dl的血红蛋白、2000mg/dl的脂肪乳剂、20mg/dl胆红素、1500IU/ml类风湿因子检测结果偏差均小于10％；
HOOK-CHI3L1浓度高达40000pg/mL时无高剂量钩状效应。
CN202111269151.3A 2021-10-29 2021-10-29 测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒 Pending CN113933506A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111269151.3A CN113933506A (zh) 2021-10-29 2021-10-29 测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111269151.3A CN113933506A (zh) 2021-10-29 2021-10-29 测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113933506A true CN113933506A (zh) 2022-01-14

Family

ID=79284782

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111269151.3A Pending CN113933506A (zh) 2021-10-29 2021-10-29 测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113933506A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114486865A (zh) * 2022-02-16 2022-05-13 杭州博岳生物技术有限公司 一种磁微粒保存液及其应用
CN114705641A (zh) * 2022-03-21 2022-07-05 江西乐成生物医疗有限公司 壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法
CN117233404A (zh) * 2023-11-13 2023-12-15 北京豪迈生物工程股份有限公司 一种测定人卷曲螺旋结构领域蛋白2含量的试剂盒
CN114705641B (zh) * 2022-03-21 2024-07-02 江西乐成生物医疗有限公司 壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977435A (en) * 1997-10-21 1999-11-02 Performance Plants, Inc. Plant phosphatases
US20090131267A1 (en) * 2006-01-03 2009-05-21 Peter Porschewski Use of polymers for increasing the signal intensity when carrying out detection reactions
US20110178028A1 (en) * 2008-09-17 2011-07-21 Stefano Pesaro Method for the detection of proventricular dilatation disease and kit thereof
WO2015199423A1 (ko) * 2014-06-24 2015-12-30 (주)바이오니아 자성 입자를 이용한 핵산 분리 방법
CN109254159A (zh) * 2018-11-07 2019-01-22 郑州安图生物工程股份有限公司 一种血清淀粉样蛋白a定量检测试剂盒
CN111208298A (zh) * 2020-02-11 2020-05-29 潍坊市康华生物技术有限公司 一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法
CN111965361A (zh) * 2020-08-05 2020-11-20 上海长征医院 一种定量检测人几丁质酶3样蛋白1的化学发光试剂盒
CN112782156A (zh) * 2021-01-04 2021-05-11 美康生物科技股份有限公司 一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977435A (en) * 1997-10-21 1999-11-02 Performance Plants, Inc. Plant phosphatases
US20090131267A1 (en) * 2006-01-03 2009-05-21 Peter Porschewski Use of polymers for increasing the signal intensity when carrying out detection reactions
US20110178028A1 (en) * 2008-09-17 2011-07-21 Stefano Pesaro Method for the detection of proventricular dilatation disease and kit thereof
WO2015199423A1 (ko) * 2014-06-24 2015-12-30 (주)바이오니아 자성 입자를 이용한 핵산 분리 방법
CN109254159A (zh) * 2018-11-07 2019-01-22 郑州安图生物工程股份有限公司 一种血清淀粉样蛋白a定量检测试剂盒
CN111208298A (zh) * 2020-02-11 2020-05-29 潍坊市康华生物技术有限公司 一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法
CN111965361A (zh) * 2020-08-05 2020-11-20 上海长征医院 一种定量检测人几丁质酶3样蛋白1的化学发光试剂盒
CN112782156A (zh) * 2021-01-04 2021-05-11 美康生物科技股份有限公司 一种壳多糖酶3样蛋白1试剂盒及其制备方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114486865A (zh) * 2022-02-16 2022-05-13 杭州博岳生物技术有限公司 一种磁微粒保存液及其应用
CN114486865B (zh) * 2022-02-16 2022-11-18 杭州博岳生物技术有限公司 一种磁微粒保存液及其应用
CN114705641A (zh) * 2022-03-21 2022-07-05 江西乐成生物医疗有限公司 壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法
CN114705641B (zh) * 2022-03-21 2024-07-02 江西乐成生物医疗有限公司 壳多糖酶3样蛋白1的测定试剂、试剂盒及定量方法
CN117233404A (zh) * 2023-11-13 2023-12-15 北京豪迈生物工程股份有限公司 一种测定人卷曲螺旋结构领域蛋白2含量的试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190219569A1 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
CN113933506A (zh) 测定人体壳多糖酶3样蛋白1(chi3l1)含量的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN107817354A (zh) 一种白介素6的化学发光检测试剂盒及其制备方法
CN112684166A (zh) 测定人体胃泌素g17含量的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN108362687B (zh) 化学发光增强液和化学发光底物及其应用
CN110824159A (zh) 一种碱性磷酸酶标记物的稀释液及其应用
CN112255406B (zh) 测定人体高尔基体蛋白含量的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN107957495B (zh) 一种ck-mb检测试剂盒及其使用方法
CN112526140A (zh) 测定超敏肌钙蛋白t含量的磁微粒化学发光检测试剂盒
CN110672849B (zh) 一种s100蛋白的检测试剂盒
CN102072957A (zh) 丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法
CN112067826B (zh) 基于高比活力碱性磷酸酶构建的NT-proBNP检测试剂盒及其应用
CN107918022B (zh) 一种cTnI检测试剂盒及其使用方法
Rosenthal et al. Evaluation of enzyme-multiplied immunoassay technique (EMIT) for determination of serum digoxin.
CN109725162A (zh) 一种完全均相测定胰岛素的检测试剂盒及其方法
CN113433318A (zh) 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用
CN113125695A (zh) 一种用于检测游离脂肪酸的试剂盒
CN111579781A (zh) 丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒、制备方法及检测方法
CN110988368A (zh) 一种游离甲状腺素发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN113933521A (zh) 磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用
CN111273033A (zh) 一种高尔基体蛋白73的测定试剂盒及其化学发光测定方法
CN111487407A (zh) 一种s100b蛋白的检测试剂盒及其使用方法
CN114965986A (zh) 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒
CN107247144B (zh) 一种预处理丙肝抗原的方法和检测试剂盒
CN110579614A (zh) 消除纤维蛋白原干扰的化学发光法试剂盒配方

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20220114