JPH04339808A - カルボキシ含有ポリマーから製造された生物活性試薬、分析要素及び使用方法 - Google Patents
カルボキシ含有ポリマーから製造された生物活性試薬、分析要素及び使用方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
製造された生物活性試薬に関する。本発明はまた、この
ような試薬を含む分析要素、ならびにそれらを用いるイ
ムノアッセイ及び特異的結合分析法に関する。さらに、
本発明はその試薬を用いる分析的精製方法に関する。本
発明は種々の臨床、診断、医学及び研究の目的に使用で
きる。
断法において種々の液体、たとえば、生物学的液体中に
存在する化学的及び生物学的物質の迅速且つ正確な定量
が必要とされ続けている。たとえば、ヒトまたは動物の
体液または組織中における薬物、麻薬、ホルモン、ステ
ロイド、ポリペプチド、代謝産物、毒素、ウィルス、微
生物または核酸の存在は、有効な研究、診断または治療
のために迅速且つ正確に定量されなければならない。
法が前記物質を検出するために開発された。一般に、技
術の状態は、分析及び診断方法が信頼性が高く、且つオ
ートメーションまたは医院または家庭で容易に使用でき
る試験キットによる使用に適当になる程度まで進歩した
。このような方法の大部分は、検出すべき未知の物質(
「リガンド」として知られる)が対応する「レセプター
」分子と特異的且つ優先的に反応する「特異的結合」反
応として公知であることによる。最もよく知られた特異
的結合反応は免疫反応体、たとえば、抗体と抗原(免疫
応答を生じる異物)との間で起こるが、他の特異的結合
反応(たとえば、アビジンとビオチン及び糖とレクチン
との間におけるような)も公知である。
般に、未反応(及び一般に水溶性)物質が次に水不溶性
反応生成物(しばしば「複合体」と称する)から分離で
きるように反応体の1つもしくはそれ以上または両者が
ある型の固体支持体上に固定されることを必要とする。 さらに、このような固定された反応体は、このような物
質の混合物から目的の生物活性物質を除去するためにア
フィニティークロマトグラフィー中に使用できる。
動物及びヒトの赤血球、細菌細胞及び公知の他の固体物
質のような粒状支持体上に有利に固定されてきた。たと
えば、エポキシ基含有モノマーから製造された担体粒子
がUS−A−4,415,700中に記載されている。 ポリマー粒子を担体支持体として使用する場合には、生
物活性物質は粒子表面上に反応性基を通して結合させ、
このような基はポリマー組成物からまたは粒子に結合し
た結合部分から提供される。US−A−4,401,7
65はポリマー粒子上の多数の反応性基を記載している
。これに関する当業界のいくつかの進歩は特開昭64−
54259号公報及びEP−A−0 308235中
に記載されている。これらの出願は、アクリル酸及びメ
タクリル酸によって提供される基のような表面カルボキ
シ基を含む種々の反応性表面基を有するポリマー粒子に
生物活性物質を結合させる種々の手段を記載している。
S−A−4,181,636中に示されるような診断試
薬を通過するのに使用されてきた。これらの粒子はアク
リル酸、メタクリル酸、イタコン酸、アコニチン酸、フ
マル酸またはマレイン酸のようなカルボキシル含有モノ
マーを用いて製造される。同様な粒子はUS−A−3,
857,931、US−A−4,138,383、US
−A−4,264,766中に記載されている。
−3−メチルブタン酸及び2−アクリルアミド−2−ヒ
ドロキシ酢酸は重合されてポリマーを形成する。これら
のモノマーは一般に水溶性であり、親油性モノマーと共
重合するのが困難であり、重合して単分散粒子を形成す
るのが容易ではない。
るタンパク質吸着の改良が、ポリマー技術をバイオテク
ノロジーにおけるイン・ビボ及びイン・ビトロの使用に
適用しようとする多くの研究者たちの共通の目的であっ
た。不所望のタンパク吸着が絶えず問題であった。たと
えば、非特異的吸着は、タンパク質の精製のためのアフ
ィニティークロマトグラフィーにポリマーを使用する場
合に重要な問題である。
グ、グラフト共重合、化学的処理及びプラズマガス放電
処理を含む多くの形態を取る。ポリマー表面の親水性は
、親水性の増加はいくつかのタンパク質の吸着を減少さ
せるが他の吸着は減少させないのでかなりの議論及び研
究の問題であった。前に引用した技術に示されるように
、反応性側鎖の使用はまた、当業界においてかなり配慮
されている。
た標準試薬より進歩した新規な生物学的試薬を見い出す
ことが当業界において要求されている。生物学的物質が
結合したこのような試薬は研究ならびに種々の分析及び
診断方法において使用するのに特に有用であろう。
(I)少なくともその表面が、 (a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー約60〜約9
9.8モル%、 (b)構造:
3のアルキルであり、Mは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素
、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜
50個の原子を有する有機結合基である]によって表さ
れる反応性カルボキシ基またはその塩を有する1種また
はそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー約0.2
〜約40モル%、ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜約15モル%から誘導される反復単位を有す
るコポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)
反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有
結合した生物活性物質を含んでなる生物活性試薬によっ
て克服される。本発明はまた、前記生物活性試薬を含ん
でなる分析要素を提供する。
A.(I)少なくともその表面が、 (a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー約60〜約9
9.8モル%、 (b)構造:
3のアルキルであり、Mは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素
、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜
50個の原子を有する有機結合基である]によって表さ
れる反応性カルボキシ基またはその塩を有する1種また
はそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマー約0.2
〜約40モル%、ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜約15モル%から誘導される反復単位を有す
るコポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)
特異的結合リガンドまたはそのレセプターと特異的に反
応性である、反応性カルボキシ基またはその塩を介して
該粒子に共有結合した生物活性物質を含んでなる生物活
性試薬によって特異的結合リガンドまたはそれに対する
レセプターの水不溶性特異的結合複合体を形成し、そし
て B. 複合体の存在を検出する ことを含んでなる。
)少なくともその表面が前記コポリマーからなる水不溶
性粒子、及び (II)反応性カルボキシ基またはその塩を介して粒子
に共有結合したリガンドのレセプター を含んでなる試薬の一成分として提供されるそのレセプ
ターの間において形成された水不溶性特異的結合複合体
の存在または量を検出することを含んでなる特異的結合
リガンドの定量のためのアッセイを提供する。
物活性物質の混合物を含む検体を、(I)少なくともそ
の表面が前記コポリマーから成る水不溶性粒子、ならび
に (II)検体混合物中の所定の生物活性物質に特異的で
ある、反応性カルボキシ基を介して該粒子に共有結合し
た特異的結合物質を含んでなるアフィニティークロマト
グラフィー試薬上に通過させ、そして B. 溶離剤中に残る複合体または物質を回収するこ
とを含んでなる。
コポリマーの多くは、1990年6月18日に出願され
たUSSN539,768及び1991年2月12日に
出願されたUSSN654,112に対応する日本特許
出願中に詳述されている。
3のアルキルであり、Mは水素、アルカリ金属イオンま
たはアンモニウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素
、窒素、酸素及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜
50個の原子を有する有機結合基である]を有する1種
またはそれ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーから
誘導された反復単位を必須成分として有する。このよう
なモノマーを1つだけ使用して各コポリマーを製造する
のが好ましいが、所望ならばモノマーの混合物を使用で
きる。
水素、ハロ(たとえば、クロロまたはブロモ)または炭
素数1〜3のアルキル(たとえば、メチル、エチル、イ
ソプロピル及びn−プロピル)である。より好ましくは
、Rは水素またはメチルである。
とえば、リチウム、ナトリウム及びカリウム)またはア
ンモニウムイオン(たとえば、アンモニウム、テトラメ
チルアンモニウム及びテトラエチルアンモニウム)であ
る。好ましくは、Mは水素またはアルカリ金属イオン、
特に好ましくは、水素またはナトリウムである。
または硫黄原子の組合せを有する有機結合基である。結
合は、前記ヘテロ原子またはヘテロ原子含有基、たとえ
ば、カルボニル、スルホニル、イミノ及び公知の他の基
によって結合したかまたは終了したアルキレン、アリー
レン、アルキレンアリーレン、アリーレンアルキレン及
び同様な基のような2個またはそれ以上の二価炭化水素
基を含んでなる。このような炭化水素基は1個(たとえ
ば、メチレン)〜12個の炭素原子を有することができ
、1個またはそれ以上のアルキル基(好ましくは炭素数
1〜12個のアルキル基、たとえば、メチル、エチル、
イソプロピル、ヘキシル及びオクチル)、アルコキシ(
好ましくは炭素数1〜12個のアルコキシ、たとえば、
メトキシ、エトキシ、プロポキシ、t−ブトキシ及びオ
クチルオキシ)、シクロアルキル(好ましくは炭素数4
〜6のシクロアルキル、たとえば、シクロブチル、シク
ロヘキシル及びシクロペンチル)、アリール(好ましく
は炭素数6〜12のアリール、たとえば、フェニル、ト
リル、キシリル、ナフチル、4−メトキシフェニル及び
クロロフェニル)によって置換されたか未置換の分枝鎖
、直鎖または環状の基であることができる。このような
基は、合成化学に熟練した者にとっては設計または合成
が困難ではない。
−NR1−)、カルボニルオキシ(−COO−)、カル
ボニルイミノ(−CONR1−)、ウレイレン(−NR
1CONR1−)またはスルホニルイミノ(−SO2N
R1−)基と結合したまたはその基で終了する2個また
はそれ以上のアルキレンまたはアリーレンアルキレン基
を含んでなり、前記基中の各R1は独立して、水素、炭
素数1〜10のアルキル(たとえば、メチル、エチル、
イソプロピル、n−ブチル、ヘキシル、ベンジル及び2
,4−ジメチルペンチル)、主鎖中に4〜10個の炭素
原子を有するシクロアルキル(たとえば、シクロペンチ
ル、シクロヘキシル及び1,3−ジメチルシクロヘキシ
ル)または主鎖中に6〜14個の炭素原子を有するアリ
ール(たとえば、フェニル、キシリル、p−クロロフェ
ニル、ナフチル及びアントリル)である。
るが、それらに限定されない:p−フェニレンメチレン
オキシカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシエチ
レンオキシカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシ
エチレンウレイレンペンタメチレン、カルボニルペンタ
(オキシエチレン)オキシカルボニルトリメチレン、カ
ルボニルデカ(オキシエチレン)オキシカルボニルトリ
メチレン、p−フェニレンメチレンチオエチレンオキシ
カルボニルトリメチレン、カルボニルオキシエチレンイ
ミノカルボニルトリメチレン、カルボニルオキシテトラ
メチレンオキシカルボニルテトラメチレン、p−フェニ
レンメチレンイミノカルボニルトリメチレン、p−フェ
ニレンエチレンイミノカルボニルトリメチレン、p−フ
ェニレン(メチル)イミノエチレンオキシカルボニルト
リメチレン、p−フェニレンメチレンチオエチレン、p
−フェニレンメチレンチオエチレンイミノカルボニルメ
チレンオキシメチレン、p−フェニレンメチレンチオエ
チレンイミノカルボニルメチレンチオメチレン、p−フ
ェニレンメチレンチオエチレンイミノカルボニルトリメ
チレン、フェニレンメチレンチオ−1−カルボキシエチ
レン、フェニレンメチレンチオフェニレン、フェニレン
メチレンチオエチレンオキシエチレンチオメチレンオキ
シカルボニルエチレン、フェニレンメチレンオキシフェ
ニレンメチレンチオエチレン、フェニレンメチレンチオ
エチレンオキシエチレンチオエチレンオキシカルボニル
エチレン、フェニレンメチレンオキシフェニレンメチレ
ンチオフェニレンメチレンチオトリメチレン、及びフェ
ニレンメチレンチオエチレンオキシエチレンチオエチレ
ンオキシカルボニ ルフェニレン。
的なモノマーとしては以下のものが挙げられるが、これ
らに限定されない:モノ−m&p−ビニルベンジルグル
タレート、モノ−p−ビニルベンジルグルタレート、モ
ノ−2−メタクリロイルオキシエチルグルタレート、2
−(4−カルボキシブチルアミド)エチルメタクリレー
ト、2−[N′−(5−カルボキシペンチル)ウレイド
]エチルメタクリレート、モノ−メタクリロイルペンタ
(オキシエチレン)グルタレート、モノ−(4−アクリ
ロイルオキシブチル)グルタレート、4−(4−カルボ
キシブチルアミド)スチレン、モノ−メタクリロイルデ
カ(オキシエチレン)グルタレート、モノ−2−(p−
ビニルベンジルチオ)エチルグルタレート、モノ−2−
(m−及びp−ビニルベンジルチオ)エチルグルタレー
ト、4−(4−カルボキシブチルアミドメチル)スチレ
ン、モノ−2−[N−メチル−N−(4−ビニルベンジ
ル)アミノ]エチルグルタレート、3−(p−ビニルベ
ンジルチオ)プロピオン酸、4−[2−(4−カルボキ
シブチルアミド)エチルチオメチル]スチレン、4−[
2−(カルボキシメトキシアセトアミド)エチルチオメ
チル]スチレン、4−[2−(カルボキシメチルチオア
セトアミド)エチルチオメチル]スチレン、モノ−2−
(4−ビニルベンジルチオ)エチルスクシネート、4−
[2−(カルボキシメトキシアセトキシ)エチルチオメ
チル]スチレン、モノ−4−ビニルベンジルスクシネー
ト、2−(4−ビニルベンジルチオ)コハク酸、2−(
4−ビニルベンジルチオ)安息香酸、モノ−2−[2−
(4−ビニルベンジルチオ)エトキシ]エチルチオメチ
ルマロネート、モノ−メタクリロイルペンタ(オキシエ
チレン)フタレート、モノ−メタクリロイルデカ(オキ
シエチレン)フタレート、モノ−2−{2−[2−(4
−ビニルベンジルチオ)エトキシ]エチルチオ}エチル
スクシネート、モノ−2−{2−[2−(4−ビニルベ
ンジルチオ)エトキシ]エチルチオ}エチルフタレート
、3−[4−(4−ビニルベンジルオキシ)ベンジルチ
オ]プロピオン酸及び4−{4−[4−(4−ビニルベ
ンジルオキシ)ベンジルチオ]ベンジルチオ}酪酸。最
も好ましいモノマーは3−(p−ビニルベンジルチオ)
プロピオン酸である。
上の別のエチレン系不飽和重合性モノマーと共重合させ
る。(a)モノマーとして前に識別した親油性モノマー
は、得られたコポリマーに疎水性または水不溶性を与え
るのに有用である。所望ならば、このようなモノマーの
混合物を使用できる。このようなモノマーとしては以下
のものが挙げられるが、これらに限定されない:ビニル
芳香族炭化水素(たとえば、スチレン及びスチレン誘導
体、たとえば、4−ビニルトルエン、α−メチルスチレ
ン、2,5−ジメチルスチレン、4−t−ブチルスチレ
ン及び2−クロロスチレン)、アクリル酸及びメタクリ
ル酸エステル及びアミド(たとえば、アクリル酸メチル
、メタクリル酸メチル、n−ブチルアクリレート、2−
エチルヘキシルメタクリレート、ベンジルアクリレート
及びN−フェニルアクリルアミド)、ブタジエン、アク
リロニトリル、酢酸ビニル、ビニルベンジルアセテート
、臭化ビニル、塩化ビニリデン及び2個またはそれ以上
の重合性基を有する架橋性モノマー。有用な架橋性モノ
マーとしては以下のものが挙げられるが、これらに限定
されない:ジビニルベンゼン、アリルアクリレートなら
びにジ−及びトリアクリレート及びメタクリレート(た
とえば、2,2−ジメチル−1,3−プロピレンジアク
リレート、1,4−シクロヘキシレンジメチレンジメタ
クリレート、エチレンジアクリレート、エチレンジメタ
クリレート、プロピレンジアクリレート、プロピレンジ
メタクリレート、エチリジントリメタクリレート)なら
びに高分子化学における熟練者にとって容易にわかる他
の化合物。
して前述した以外のエチレン系不飽和重合性モノマー(
c)を共重合させて所望の性質を与えることができる。 たとえば、このようなモノマーとしては、スルホン酸基
またはそれらの塩を含む陰イオン性モノマー、たとえば
、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸
、3−メタクリロイルオキシプロパン−1−スルホン酸
、p−スチレンスルホン酸及びそれらの塩ならびに当業
者には容易にわかる他の化合物が挙げられる。モノマー
の(c)群には、非イオン性親水性モノマー、たとえば
、アクリルアミド、メタクリルアミド、N−イソプロピ
ルアクリルアミド、2−ヒドロキシエチルアクリレート
、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、N−ビニル−
2−ピロリドン及び当業者には容易にわかる他の化合物
が含まれる。さらに、活性メチレン基を有するモノマー
、たとえば、2−アセトアセトキシエチルメタクリレー
ト、ならびに陽イオン性モノマー、たとえば、N,N,
N−トリメチル−N−ビニルベンジルアンモニウムクロ
リド及び3−ヒドロキシエチル−1−ビニルイミダゾリ
ウムクロリドが使用できるであろう。
60〜99.8モル%、(b)約0.2〜40モル%及
び(c)0〜約15モル%から誘導された反復単位から
なる。好ましいコポリマーは(a)85〜99.5モル
%、(b)0.5〜15モル%及び(c)0〜10モル
%から製造される。
重合法を用いて製造する。本明細書中に記載したコポリ
マーは、本発明の試薬を製造するために粒子の形態で使
用する。一般に、それは0.01〜20μm、好ましく
は0.1〜10μmである。
ボキシ基を介してポリマー粒子に共有結合した1種また
はそれ以上の生物活性物質を含む。本明細書中で使用す
る用語「生物活性物質」とは、生体内に見られるかまた
は診断、治療もしくは細胞物質もしくは生体の遺伝子工
学において有用であって、且つ別の生物学的もしくは化
学的物質と相互作用する能力を有する任意の有機化合物
を含むものである。このような物質は生物学的液体中に
天然に存在するものであってもよいし、存在しないもの
であってもよい。このような物質は後述のように適当な
活性化剤を用いて反応性カルボキシ基を介して粒子に結
合できるものでなければならない。従って、一般に、こ
れは、生物活性物質が反応に利用できるアミノまたはス
ルフヒドリル基を有することを意味する。
物質は種々の天然に存在するまたは合成によって製造さ
れた物質であることができ、その例としては以下のもの
が挙げられるがそれらに限定されない: アミン、酵
素、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質(
たとえば、抗生物質、C−反応性タンパク質ならびにア
ビジン及びその誘導体)、リポタンパク、糖タンパク、
ホルモン、薬物(たとえば、ジゴキシン、フェニトイン
、フェノバルビタール、チロキシン、トリヨードチロニ
ン、ゲンタマイシン、カルバマゼピン及びテオフィリン
)、ステロイド、ビタミン、多糖類、糖脂質、アルカロ
イド、微生物、ウィルス、原生動物、真菌類、寄生虫、
リケッチア、カビ、血液成分、組織及び器官成分、医薬
、ハプテン、レクチン、毒素、核酸(一本鎖及び二本鎖
オリゴヌクレオチドを含む)、抗原性物質(タンパク質
及び炭水化物を含む)、ビオチンまたはその誘導体、及
びここに列挙した物質のいずれかの成分、ならびに当業
者に公知の他の物質。
が問題のリガンドに特異的なレセプター分子であるもの
である。従って、試薬を含む特異的結合反応は種々の方
法(以下においてより詳細に記載する)に使用できる。 リガンド−レセプター複合体(すなわち、リガンドとレ
セプターとの反応)の例は抗体−抗原、抗体−ハプテン
、アビジン−ビオチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィ
ブロネクチン及びProteinA−IgG複合体を含
むが、これらに限定されない。本発明のためには、相補
的核酸(すなわち、相補的ストランドのハイブリット形
成生成物)も特異的結合物質と考えられる。このような
相補的核酸(少なくとも2個の塩基を有するオリゴヌク
レオチド)は全塩基対において相補的である必要はなく
、核酸配列の全ての位置に匹敵する塩基である必要はな
い。すなわち、ストランドの一方が他方より長くてもよ
いし、一方が差の配列においてそれに相補的な多数のオ
リゴヌクレオチドを有することもできる。
質として公知であるものである。たとえば、免疫物質は
抗原物質または抗体(抗−抗体を含む)であることがで
きる。単クローン及び多クローン性抗体は共に有用であ
り、粒子上に反応性カルボキシ基との反応のための反応
性部位を少なくとも1つ有する限りはそれらは分子全体
であるかまたはそれらの種々のフラグメントであること
ができる。
患、カルバマゼピン、チロシン、ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン、フェノバルビタール、フェニトイン、ジゴキシン
またはC−反応性タンパク質と関連した微生物であるS
treptococcusAに関する抗体が挙げられる
。
結合のための反応性基を有する酵素である。代表的な酵
素としては以下のものが挙げられるがこれに限定されな
い:西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダ
ーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アスパルテ
ートアミノトランスアミナーゼ、アラニンアミノトラン
スアミナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、クレアチ
ンホスホキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ
、アルカリホスファターゼ、酸フォスファターゼ及び前
立腺酸ホスファターゼ。
たは妊娠を測定するための競合的結合アッセイに関して
は、生物活性物質が、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、フェ
ノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンに関す
る抗体である。
の結合部分を提供することを含めて、結合のための反応
性基を提供するために改質または化学的に変化させるこ
とができる。
記載したコポリマーの粒子に結合させる。これらの活性
化剤はカルボキシ基を、利用可能なアミンまたは物質の
スルフヒドリル基と反応性である中間体(たとえば、エ
ステル)に変換することができる化合物である。
−フェニルイソキサゾリウム−3′−スルホネート、ク
ロロホルメート、水溶性カルボジイミド、ジカチオンエ
ーテル及びカルバモイルオニウム化合物が挙げられるが
、これに限定されることはない。
は2つの工程で起こる。第1の工程はポリマー粒子の水
性懸濁液(またはラテックス)と活性化剤とを接触させ
て、元のカルボキシ基の代わりに粒子に結合した反応性
中間体(たとえば、エステルまたは混合無水物)を生成
することを含む。この工程は、適当である酸または緩衝
剤を用いて適当なpHにおいて実施する。カルバモイル
オニウム化合物及びジカチオンエーテルの場合には、p
Hは一般に6未満である。カルボジイミドの場合には、
pHは一般に4.5〜7である。製造において使用する
活性化剤の量は一般に、ポリマー粒子中の全カルボキシ
ル基の理論濃度より少なくとも2倍過剰であるが、最適
量は、ここに示す、公知の教示を用いて日常実験によっ
て容易に測定される。
一般に0.01〜10%である。生物活性物質の量は一
般に物質対コポリマーの重量比0.0005:1〜0.
5:1によって示される。
℃において2〜30時間実施する。生物活性物質は試薬
中にポリマー粒子の0.0025〜30重量%の量で存
在するのが望ましい。
またはスルフヒドリル基を有さない場合には、それらの
公知の手法を用いて添加できる。
薬を使用して、レセプター分子が存在する全ての特異的
結合リガンドを検出することができる。本発明の試薬中
の生物活性物質はリガンドまたはそのレセプターと特異
的に反応性であることができる。リガンドの検出は、水
性液体(たとえば、生物学的液体)または組織または細
胞物質の溶液の検体を用いて溶液または乾燥形態(後述
)において実施でき、定性、定量または両者であること
ができる。特に、本発明は動物、ヒトまたは植物の生物
学的液体、好ましくは、全血、血清、血漿、リンパ、胆
汁、尿、脊髄液、痰、涙、汗、綿棒標本、組織培養物、
糞便分泌物、細胞性液、膣分泌物及び精液を含むヒトの
液体をアッセイするのに使用できる。また、骨格筋、心
臓、腎臓、肺、脳、骨髄または皮膚のようなヒトまたは
動物の組織の液体標本をアッセイすることもできる。
たは異なるレセプター分子との複合体形成のための部位
を1個またはそれ以上有する薬物、ハプテン、ホルモン
、抗原物質(リポポリサッカライドまたはタンパク質)
または抗体であることができる。本発明のイムノアッセ
イにおいて、リガンドは薬物(たとえば、ジゴキシン、
フェニトイン及びカルバマゼピン)、ホルモン(たとえ
ば、甲状腺刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、
leutinizing hormone、及びチロ
キシン)、レトロウィルス(たとえば、HIV−I成分
またはその抗体)、細菌感染剤もしくはその成分または
それに対する抗体(たとえば、Streptococc
us A抗原、クラミジア属または淋菌抗原または抗
体)、ウィルスまたはその成分(たとえば、肝炎、サイ
トメガロウィルスまたはヘルペス抗原)またはそれに対
する抗体、癌形成物質、またはC−反応性タンパク質で
あることができる。リガンドはまた、ビオチンまたはそ
の誘導体であることができ、レセプターはアビジンまた
はその誘導体である。
通常は一本鎖型)であることができ、その量または存在
を、レセプター分子として相補的一本鎖核酸を用いて検
出する。核酸検出のためには多くの種々のアッセイ形態
があるが、それはすべて当業者に容易にわかるものであ
る。HIV−IDNA、β−グロビンDNAまたはサイ
トメガロウィルスDNAの検出は本発明の実施において
特に重要である。
、 A. 問題の特異的結合リガンドまたはそのレセプタ
ーの水不溶性特異的結合複合体を、 (I)前記水不溶性非孔質粒子、及び (II)リガンドまたはそれに対するレセプターと特異
的に反応性である、反応性基を介して粒子に共有結合し
た生物活性物質を含んでなる試薬によって形成し、そし
て B. 検体中のリガンドの存在または不存在の指標と
して複合体の存在を検出することを含んでなる。
合リガンドの定量のための競合的結合アッセイにおいて
使用できる。一般に、このようなアッセイは、A.
水溶性特異的結合リガンドをその水溶性レセプターと、
及び前記試薬と接触させて、レセプターとリガンドとの
間の特異的結合複合体(a)、ならびにレセプターと水
不溶性試薬との間の特異的結合複合体(b)を形成し、
そして B. 複合体(a)及び(b)の分離後にいずれかの
複合体の存在を検出することを含んでなる。
いて実施できる。所望ならば、結合及び未結合物質の物
理的分離は、任意の適当な分離法を用いて実施できる。 分析要素(後述)を使用する場合には、垂直方向または
水平方向の分離のいずれも使用できる。結合リガンドは
公知の光散乱、濁度測定、放射線測定または分光光度測
定法を用いて定量できる。
実施できる。最も簡単な要素は、吸収剤、液体透過性支
持体、たとえば、自立吸収剤または吸水性材料、の薄い
シートたとえば、濾紙または紙ストリップからなること
ができる。この支持体は、化学的、生物学的または特異
的結合反応が中で起こる1つまたはそれ以上の反応帯域
を有する。本発明の試薬はこれらの帯域の少なくとも1
つの中に存在する。他の任意の帯域としては、色素、色
素形成化合物、掃去剤、酸化防止剤、酵素基質または緩
衝剤及び当業者に容易にわかる他の材料が挙げられる。 このような要素は試験片、分析要素、スライドまたは浸
漬スティックとして公知である。
うな酵素で標識し、リガンドは抗原物質、ホルモン、ハ
プテンまたは薬物であり、レセプターは対応する抗体で
ある。このような要素はカルバマゼピン、チロキシン、
フェノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンの
定量に特に有用である。最も好ましくは、それらはフェ
ノバルビタール、フェニトインまたはジゴキシンの定量
に有用である。
明の試薬と複合体形成させて粒子の検出可能な凝集また
は集塊を形成する凝集アッセイとして公知であるもので
ある。得られた凝集は種々の方法、たとえば、目視でま
たは適当な光散乱検出装置によって検出できる。
たとえば、粒子中もしくはそれに結合した生物活性物質
中の放射性同位体によって、または粒子と会合した比色
または蛍光測定色素によって標識されて検出可能な本発
明の試薬を用いて実施する。最も好ましくは、色素は、
生物活性物質の結合またはその複合体形成を妨害しない
ように表面から離れた粒子の内部にある。このような粒
子はコアポリマー内に色素を有するコアシェル粒子であ
ることができ、シェルコポリマーは色素を含まない。
する本発明の試薬と接触させて該免疫物質とレセプター
と水不溶性免疫複合体を形成し、そして B. 複合体形成しなかった物質を該複合体から分離
後、複合体の存在を検出することを含んでなる。
それに対する抗体であることができる。あるいは、免疫
物質が抗体であって、レセプターがそれに対して特異的
な抗原物質であることができる。さらにまた、免疫物質
が抗体であって、レセプターがそれに対して特異的な抗
体であることもできる。
薬は免疫測定アッセイにおいて使用できる。このような
アッセイにおいて、問題のリガンドは2個またはそれ以
上のレセプター分子(同一であっても異なってもよい)
と複合体を形成し、このレセプター分子の一方は不溶化
されているかまたは不溶化されることができ(たとえば
、アビジン−ビオチン結合によって)、他方は水溶性で
あって適当に標識される(たとえば、放射性同位体、酵
素、化学蛍光部分または他の公知の標識によって)。
ては、本発明の試薬による水不溶性複合体の形成の前に
、それと同時にまたはその後に、問題のリガンドをそれ
に対して特異的反応性である水溶性特異的結合成分と反
応させる。
いて検出できる他のリガンドとしては、Strepto
coccus抗原、歯周疾患に関連した微生物から抽出
された抗原、肝炎抗原、H1V−I及び他のレトロウィ
ルス抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
的プローブを用いて検出されるハイブリッド形成アッセ
イとして知られるものである。相補的プローブの一方は
適当に標識されており、他方は固定されているか固定さ
れることができるものである。本発明の試薬はこのよう
なアッセイにおいて固定プローブ(捕獲プローブとして
も知られる)として使用できる。これらの試薬はまた、
ポリメラーゼ連鎖反応増幅として公知であるものの後に
捕獲プローブとして使用できる。
して粒子に共有結合した、核酸に対して実質的に相補的
であるオリゴヌクレオチドを含むここに記載した試薬と
の間で水不溶性ハイブリッド形成生成物を形成し、そし
てB. 該ハイブリッド形成生成物の存在を検出する
ことを含んでなる。
て、問題の核酸は、本発明の試薬による捕獲の前に、適
当な試薬(たとえば、DNAポリメラーゼ、dNTP、
プライマー)とのポリメラーゼ連鎖反応(公知)を用い
て増幅する。HIV−IDNA、サイトメガロウィルス
DNA及びβ−グロビンDNAは増幅及び本発明に係る
検出を用いて容易に検出される。
ッド形成アッセイは、複合体形成またはハイブリッド形
成生成物を捕獲しまたは複合体を形成していない物質か
ら濾過によって分離する適当な装置及び手法を用いて実
施できる。好ましくは、このようなアッセイは微孔質濾
過膜を含む使い捨て試験装置を用いて実施する。
混合物から1種またはそれ以上の問題の分析物を単離す
るのに使用できる。従って、本発明の試薬(または粒子
に種々の物質が結合したいくつかの試薬)は一般に、生
物学的物質の混合物を含む液体を注ぐカラム中に入れ、
試薬に、単離したい物質を液体から抽出させる。これは
、核酸、酵素、炭水化物、タンパク質、脂質、ビタミン
、ステロイド、抗体、ペプチドまたはホルモンの精製に
有用であることができる。この手法はまた、アフィニテ
ィークロマトグラフィーとして知られている。
、タンパク質の変性型を精製タンパク質から除去するた
めに、ならびに特異的化学的改質から生ずるタンパク質
及びペプチド成分の分離及び分割においてタンパク質の
希薄溶液を濃縮するために使用できる。
独材料として、あるいは前記分析要素中に、または診断
試験キット中において他の試薬、試験装置及び装備と組
み合わせて供給できる。精製方法に関しては、試薬はま
たアフィニティークロマトグラフィーカラム中に供給で
きる。
トグラフィーカラム中の試薬はカラムを通って流れる物
質の混合物中の1種またはそれ以上の物質を捕獲する。
薬によって捕獲され、最初の溶離剤は廃棄され、捕獲さ
れた物質は、物質が複合体形成され得ないように物質の
結合特性を変化させる溶媒を用いてカラムから除去され
る。このような溶媒としてはpHを変化させる緩衝剤、
複合体のイオン性を変化させる塩溶液、または試薬を特
異的に結合し且つ捕獲された物質に取って代わる第2の
物質を含む溶液が挙げられる。あるいは、試薬によって
捕獲された所定の物質は廃棄され、最初の溶離剤中に残
る他の化学的または生物学的物質が回収される。
の範囲を限定するものではない。全ての百分率は、特に
断わらない限り重量に基づく。
ンを含む試薬 この実施例は、ポリマー粒子に結合した、放射性同位体
で標識されたタンパク質を含む本発明のいくつかの試薬
の製造を説明する。2つの異なる活性化剤を用いて試薬
を製造した。試薬は、本発明の範囲外のコポリマーを用
いて同様にして製造した対照試験に比較した。
ポリ(スチレン−コ−モノ−2−メタクリロイルオキシ
エチルグルタレート)(モル比97.84:2.16)
, 試験B:ポリ(スチレン−コ−モノ−m&p−ビニルベ
ンジルグルタレート)(モル比97.8:2.2),試
験C:ポリ[スチレン−コ−モノメタクリロイルペンタ
(オキシエチレン)グルタレート](モル比98.7:
1.3), 対照 :ポリ(スチレン−コ−アクリル酸)(モル比
95:5)。
(4−モルホリノカルボニル)−4−(2−スルホエチ
ル)ピリジニウムヒドロキシド、内部塩、または(b)
1−(1−ピロリジニルカルボニル)ピリジニウムクロ
リドのいずれかを活性化剤として用いたこれらのポリマ
ーのカルボキシ基にタンパク質を結合させた。同一条件
下で全てのポリマーを処理した。最終分散液は2−(4
−モルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液(0.1M,p
H5.5)中にポリマー粒子g当り3Hウシガンマグロ
ブリン1%、粒子乾燥重量30mg当りタンパク質0.
3mgを含んでいた。活性化剤の量は管当り(a)16
.6mgまたは(b)9.6mgであった。
g)の懸濁液を大きなミクロフュージ(microfu
ge)管中に入れることによって調製し、各々を前記緩
衝液を用いて容量1.5mlとした。得られた懸濁液を
14,000rpmにおいて15分間遠心分離した。各
管に緩衝液(1ml,0.1M)を加え、次いで、活性
化剤の溶液(300μL)を加えた。活性化剤(a)の
溶液は、0.1M緩衝液3.6ml中に199mgを溶
解させることによって調製し、活性化剤の溶液(b)は
0.1M緩衝液3.6ml中に115mgを溶解するこ
とによって調製した。次いで、管を蓋締めし、室温にお
いて10分間転倒型で回転させた。標識タンパク質(1
0mg/ml)の溶液(30μL)を各管に加え、次に
室温で4時間転倒型で回転させた。
応は、各管にウシ血清アルブミン(250μL,タンパ
ク質100mg/リットル)を加えることによって抑え
た。次いで、室温においてさらに16時間、管を再び回
転させ、各反応混合物(250μL)を除去して全標識
タンパク質を定量した。
また、除去し、緩衝液(400μL,0.1M)及びド
デシル硫酸ナトリウム(脱イオン蒸留水中10%溶液1
00μL)によっ処理した。得られた混合物を、45゜
の角度で取り付けられた回転円盤上で37℃において1
6時間混転することによって混合した(界面活性剤によ
る処理によって吸着されたが共有結合していないタンパ
ク質が粒子から除去された)。反応混合物を遠心分離し
、アリコート(各500μL)を除去して遊離標識タン
パク質の量を測定した。
ガンマグロブリンの総量、粒子に共有結合した3Hウシ
ガンマグロブリンの量及び共有結合/全結合の比を示す
。結果は、本発明に従って製造された試薬がイムノアッ
セイにおいて使用するための抗体に許容され得る程度に
結合することを示す。
の実施例は、ポリマー粒子に共有結合したチロキシンに
対する抗体分子を含む本発明の試薬の製造を説明する。 標識ウシガンマグロブリンの代わりに抗体溶液(130
μL,タンパク質2.3mg/ml)を用いる以外は、
実施例1に記載された手法を用いて単クローン性抗チロ
キシン抗体(Cambridge/Ventrex
Laboratories,Inc.から入手)を同一
コポリマーに結合させた。両活性化剤(a)及び(b)
を用いて試薬を調製した。反応を抑え、反応混合物を遠
心分離し、上澄み液をデカントし、粒子を燐酸塩緩衝化
生理的塩溶液(1ml,pH7.4)中に再懸濁させた
。この工程を4回繰り返し、最後の回の間に固形分を燐
酸塩緩衝化生理的塩溶液(1.8ml)中に再懸濁させ
、メルチオレート(merthiolate)保存剤(
0.02%)を加えた。
試薬分散液の連続希釈を一定濃度のアルカリホスファタ
ーゼ及びチロキシンの酵素標識類似体(Itoらによっ
てClin.Chem.,30(10),1682〜1
685頁、1984年に記載されたようにして調製した
)と混合するアッセイにおいて測定した。希釈度はウシ
血清アルブミン(1%)を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶
液中において室温で約1時間絶えず撹拌しながらインキ
ュベートした。遠心分離後に溶液中に残っている標識類
似体の量を測定し、類似体50%を結合するのに必要な
チロキシン結合部位の濃度を計算した。結果を表2中に
次のように要約する。これらのデータは、本発明の試薬
がいずれの活性化剤を用いても、対照試薬よりもかなり
低い(3〜5倍)濃度において標識類似体を結合するこ
とを示す。
レオチドを含む試薬 この実施例は、問題の核酸に対して相補的であるオリゴ
ヌクレオチド(または核酸)を含む本発明の試薬の製造
を説明する。ポリ(スチレン−コ−モノ−m&p−ビニ
ルベンジルグルタレート(モル比97.8:2.2)粒
子のサンプル(50mg,13.18%懸濁液0.37
9ml)を2−(4−モルホリノ)エタンスルホン酸緩
衝液(5ml,0.1M,pH6)に加えた。得られた
懸濁液を3,200rpmにおいて遠心分離し、ポリマ
ー粒子をペレット化した。上澄み液をデカントした後、
粒子を遠心管中で緩衝液(5ml)中に再懸濁させた。 これに、活性化剤、N−[3−(ジメチルアミノ)プロ
ピル]−N′−エチルカルボジイミドヒドロクロリド(
18.8mg)、次いでβ−グロビンDNAに対して相
補的な以下の配列:
ACCATGGT GCACCTGACTC−3′
0084】[式中、Xは構造:
教示に従って結合されたテトラエチレングリコールアミ
ンリンカーを表す]を有するオリゴヌクレオチド(光学
濃度0.625,1.875nmole)を加えた。管
を蓋締めし、室温において18時間転倒型で回転した。
て遠心分離し、上澄み液をデカントし、固形分をメルチ
オレート(0.01%)を含むグリシン(0.1M,p
H8.5)中に再懸濁させた。この洗浄法を2回繰り返
した。最終懸濁液は、分光光度的光散乱を用いて測定し
たところ、試薬の固形分0.87%を含んでいた。
する抗体を含む試薬 この実施例は実施例2と同様である。これはイムノアッ
セイにおいて有用な試薬の製造を説明する。 実施例
3に記載したポリマー粒子のサンプル(10mg,15
.2%懸濁液65.8μL)を2−(4−モルホリノ)
エタンスルホン酸緩衝液(1ml,0.1M,pH6)
に加えた。得られた懸濁液を3,200rpmにおいて
遠心分離して、ポリマー粒子をペレット化した。上澄み
液をデカントした後、粒子を遠心管中において緩衝液(
1ml)中に懸濁させた。これに活性化剤、N−[3−
(ジメチルアミノ)プロピル]−N′−エチルカルボジ
イミドヒドロクロリド(3.76mg)を加えた。管を
蓋締めし、室温において10分間、転倒型で回転した。 ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)のβサブユニット
に対するアフィニティ精製ヤギ抗体(0.123mg)
を管に加え、再び18時間回転した。懸濁液を3,20
0rpmにおいて遠心分離し、上澄み液を廃棄し、ペレ
ットを、メルチオレート(0.01%)を含むグリシン
(0.1M,pH8.5)中に再懸濁させた。この手法
を2回繰り返して、粒子に共有結合した抗体を含む本発
明の試薬が提供される。
ニトイン及びジゴキシンに対する抗体を含む試薬これら
の実施例は溶液及び乾燥競合的結合アッセイにおいて有
用な本発明の試薬の製造を説明する。実施例1中に使用
したポリマー粒子の懸濁液を用いた[試験A〜C及び対
照(ただし、対照のポリマー粒子はモル比96.65:
3.35を有していた)]。使用した活性化剤は1−(
1−ピロリジニルカルボニル)ピリジニウムクロリドで
あった。粒子全てを同様に処理した。最終分散液は抗体
(実施例5の場合には抗フェニトイン、実施例6の場合
には抗フェノバルビタール及び実施例7の場合には抗ジ
ゴキシン)、2−(4−モルホリノ)−エタンスルホン
酸緩衝液(0.1M,pH5.5)中粒子乾燥重量30
mg当りタンパク質0.3mg、及び活性化剤(1.5
mmole/g粒子、すなわち、0.045mmole
)を含んでいた。
g)の懸濁液を大きなミクロフュージ管中に入れること
によって調製し、各々を前記緩衝液を用いて容量1.5
mlとした。得られた懸濁液を13,000rpmにお
いて15分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した。各管に
緩衝液(1ml,0.1M)を加え、次いで活性化剤(
緩衝液中0.15Mの溶液0.3ml)を加えた。次い
で、管を蓋締めし、室温において10分間転倒型で回転
させた。抗体の溶液を各管に加えた:抗一フェニトイン
(4.3mg/ml)0.07ml、抗−フェノバルビ
タール(2.6mg/ml)0.115ml及び抗−ジ
ゴキシン(1.53mg/ml)0.196ml(それ
ぞれ全抗体0.3mg)。次に室温で4時間転倒型で回
転させた。
血清アルブミン(300μL,タンパク質100mg/
ml)を加えることによって抑えた。次いで、室温にお
いてさらに16時間、管を再び回転させ、遠心分離し、
次のELISA分析のために上澄み液を除去し、燐酸緩
衝化生理的塩溶液(1ml,pH7.4)中に再懸濁さ
せた。この工程を3回繰り返し、最終再懸濁液はメルチ
オレート(0.02%)を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶
液(1.8ml)中であった。
よって全抗体濃度について分析した。ELISAの結果
から粒子に共有結合した抗体の量を計算した。試薬の連
続希釈を一定濃度の接合体:アルカリホスファターゼ−
標識フェニトイン、アルカリホスファターゼ−標識フェ
ノバルビタールまたは西洋わさびペルオキシダーゼ−標
識ジゴキシンと混合するアッセイにおいて標本中の活性
抗体の相対量を測定した。希釈試薬分散液と酵素標識類
似体との反応は、室温において1時間、0.1または1
%ウシ血清アルブミンを含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液
中において絶えす撹拌しながらインキュベートした。遠
心分離後に上澄み液中に残る酵素標識類似体の量を測定
し、酵素標識類似体の50%を結合するのに必要な抗体
結合部位の濃度を計算した。結果を以下のように表3中
に要約する。
対照の一部として固定された同一の抗体に比べて少ない
試薬を必要とするので、実施例5及び6の試薬はそれぞ
れ、活性が高いことが示される。実施例7において、フ
ェルバルビタール試薬は対照より優れた活性を示したが
、他の2種の試薬は対照よりわずかに活性が低かった。
試薬 これらの例は、ポリマー粒子に共有結合したヨウ素化ウ
シガンマグロブリンを含む本発明の試薬の製造を示す。 粒子はすべて同様に処理し、最終反応分散液は2−(4
−モルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液(0.1M,p
H5.5)中に125I−ウシ血清ガンマグロブリン(
0.3mg)、ポリマー粒子(乾燥重量30mg)、1
−(1−ピロリジニルカルボニル)ピリジニウムクロリ
ド活性化剤(0.5mmole/g粒子)を含んでいた
。
C(実施例9)及び前記実施例1の対照として識別され
るものであった。粒子分散液のアリコートを2mlミク
ロフュージ管中に入れ、緩衝液(0.1M)を全量1.
5mlとなるように加えた。分散液を13,000rp
mにおいて10分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した。 ビーズを緩衝液(1ml)及び活性化剤(0.3ml,
0.15M)中に再分散させた。間を蓋締めし、10分
間転倒型で回転させた。ヨウ素化タンパク質の溶液を各
管に総量0.3mgとなるように加え、一方のセットの
反応混合物を室温において6時間転倒型で回転し、他方
のセットは室温において52時間転倒型で回転させた。 反応混合物を遠心分離し、上澄み液を除去して放射能に
ついて分析した。得られた試薬を燐酸塩緩衝化生理的塩
溶液(1ml)中に再懸濁させ、遠心分離し、ドデシル
硫酸ナトリウム(1%)中に再懸濁させ、放射能につい
て分析して、粒子に結合したヨウ素化タンパク質の総量
を測定した。
においてドデシル硫酸ナトリウム(1%)中で16時間
インキュベートして、吸着されたタンパク質は除去した
が共有結合したタンパク質は結合したままにした。試薬
をペレット化し、上澄み液を除去し、放射能について分
析し、次いで、ドデシル硫酸ナトリウム(1%)中に再
懸濁させた。試薬を再び、遠心分離し、上澄み液を廃棄
し、試薬を放射能について分析した。
化タンパク質の%を以下のように表4中に示す。
たポリマー粒子は対照粒子よりも速くタンパク質と反応
するので、タンパク質と粒子との完全な反応に必要な時
間はより短いことを示す。これは製造上の利点である。 また、結合に必要な条件に感受性であり得る抗体は反応
時間がより短いためにそれらの条件によってはより奪活
されにくい点で有利である。反応の6時間後、実施例9
の粒子は対照と同様な優れた結果を提供しなかったが、
この実施例はそれがそれでも有用な試薬であることを証
明する。タンパク質と粒子カルボキシ基との反応の時間
が長いほど全粒子の完全な結合が起こる。これは、目的
の試薬を製造するためには種々のポリマー及びタンパク
質が種々の反応条件を必要とする可能性があることを示
し、それは当業者には容易に理解できることであろう。
に対するオリゴヌクレオチドを含む試薬の製造この実施
例は、前述のようにしてカルボキシ含有コポリマーに共
有結合したオリゴヌクレオチドを含む試薬の製造を証明
する。オリゴヌクレオチドはサイトメガロウィルスDN
Aの核酸配列に関する。ここで使用するオリゴヌクレオ
チドは、活性化剤(Beckmanから入手されるAc
tivator Gold)、追加の水性洗浄工程(
酸化前)及び4−(N,N−ジメチルアミノ)ピロジン
の代わりのキャッピング試薬としての1−メチルイミダ
ゾールにおいていくつかの改良をされたホスホアミダイ
ト(phosphoramidite)法によってBi
osearch 8650 DNA合成機を用いて
合成した。リンカー及びスペーサーに加えるためにオリ
ゴヌクレオチドを誘導するのに使用する試薬はUS−A
−4,914,210中に記載されている。オリゴヌク
レオチド試薬は、(1)3′−末端における単一のアミ
ノリンカー(LB09として識別)または(2)3′−
末端におけるアミノリンカー及び2個のテトラエチレン
グリコールスペーサー(LB08として識別)によって
設計された。オリゴヌクレオチド配列は標準塩基固定(
A、C、G及びT)を用いて以下の通りである:5′−
TCACCCCCAG AGTCCCCTGT A
CCC−X−3′[LB08の場合にはXは2個のテト
ラエチレングリコールスペーサー単位に結合したアミン
リンカーを表し、LB09に関してはXは構造:
00】
ノリンカーを表す]。
の5′−末端をδ32P−ATPで燐酸化することによ
って32Pで標識した。LB08及びLB09[各々2
0μL中2.0OD(260nm)単位]を標識し、試
験において直接使用した。LB08及びLB09オリゴ
ヌクレオチド(2μL)をここに示すような活性化ビー
ズサンプルに加えた。
は以下の通りであった: ポリマーA:ポリ(スチレン−コ−モノ−2−メタクリ
ロイルオキシエチルグルタレート)(モル比97.8:
2.2) ポリマーB:ポリ[スチレン−コ−モノ−m&p−(6
0:40)−ビニルベンジルグルタレート](モル比9
7.7:2.2) ポリマーC:ポリ[スチレン−コ−モノメタクリロイル
−ペンタ(オキシエチレン)グルタレート](モル比9
8.7:1.3) ポリマーD:ポリ[スチレン−コ−モノメタクリロイル
−デカ(オキシエチレン)グルタレート](モル比98
.3:1.7) ポリマーE:ポリ[スチレン−コ−モノ−2−(m&p
(60:40)ビニルベンジルチオ)エチルグルタレー
ト](モル比98.3:1.7) ポリマーF:ポリ(スチレン−コ−モノ−p−ビニルベ
ンジルグルタレート)(モル比97.2:2.2)ポリ
マーG:ポリ[スチレン−コ−モノ−2−(p−ビニル
ベンジルチオ)エチルグルタレート)(モル比98.3
:1.7) ポリマーH:ポリ[スチレン−コ−3−(p−ビニルベ
ンジルチオ)プロピオン酸](モル比97.6:2.4
) 対照A :ポリ(スチレン−コ−3−アクリル酸
)(モル比97.5:2.5) 対照B :ポリ(スチレン−コ−3−アクリルア
ミド−3−メチルブタン酸)(モル比96.9:3.1
)。
有する水性ラテックス分散液として提供した。オリゴヌ
クレオチドの結合は、2種の活性化剤:(a)N−(3
−(N,N−ジメチルアミノ)プロピル)−N′−エチ
ルカルボジイミドヒドロクロリド(試験1〜6について
は170mg/1.35ml溶液100μL、または試
験7〜16については538mg/ml溶液100μL
)、及び(b)1−(1−ピロリジニルカルボニル)ピ
リジニウムクロリド(538mg/ml溶液100μL
)のいずれかを用いて行った。活性化剤を各分散液のサ
ンプルに加え、10分間(試験1〜6)または25分間
(試験7〜16)反応させた。
ずれかの標識オリゴヌクレオチド(LB08またはLB
09,2.0μL)で処理し、試験1〜6は混合後1時
間反応させ、試験7〜16は混合後2.5時間反応させ
た。次いで、結合オリゴヌクレオチドを遠心分離(2分
間)によって分離し、放射能計数のために上澄み液をデ
カントした。得られた試薬を3回水洗し、再懸濁させ、
且つ遠心分離した。各試験からの合した上澄み液及び再
懸濁した試薬を次に放射能について評価し、結果を以下
の表5に示す。
オチドの量(%)が本発明の試薬の場合には対照試薬に
比較して改良されたことを示す。いくつかの試験では他
よりはるかに優れた改良を示し、いくつかの試薬ではあ
る活性化剤の場合のみ改良を示した。これらのデータは
、サイトメガロウィルスDNAの検出のための実質的に
改良された試薬をいかにして見い出すかを当業者に示唆
するであろう。
アッセイ この実施例は、本発明に試薬を用いてhCGを検出する
本発明の実施を証明する。
剤(0.05g/m2)が塗布されたLoProdyn
eTM微孔質膜(5μm)を含むSurecellTM
使い捨て試験装置を用いた。本発明の試薬は、活性化剤
として1−(1−ピロリジニルカルボニル)ピリジニウ
ムクロリドを用いてポリ[スチレン−コ−3−(p−ビ
ニルベンジルチオ)プロピオン酸](モル比97.6:
2.4)の粒子にアフィニティー精製ヤギ抗−hCGα
−多クローン性抗体を共有結合させることによって調製
した。抗体を結合させる手法は次の通りであった:
111】ポリマー粒子の懸濁液(固形分3%)をミクロ
フュージ管中、2−(4−モルホリノ)エタンスルホン
酸緩衝液中において活性化剤(0.1M)を混合した。 管を蓋締めし、室温において10分間転倒型で回転した
。多クローン性抗体(13.2mg/ ml)の溶液
(810μL)を管に加え、室温において18時間転倒
型で回転させた。得られた試薬はポリマー粒子に共有結
合した理論的抗体の約99%を含んでいた。
中に試薬(0.9%)、ポリアクリルアミド(5%)、
UvitexTM色素(0.01%)及びチメロサール
保存剤(0.01%)を含んでなる組成物(2μL)を
、試験ウェル(サンプルウェルとも称する)の1つにお
いて 膜の限定された領域に沈着させた。
いて同様な型の粒子に共有結合させ 、得られた試薬
を、別の試験ウェル(負の対照ウェルとも称する)中で
膜に沈着 させた。第3の試験ウェル(正の対照ウェ
ルとも称する)は、同様な型の粒子に 共有結合した
抗−hCG抗体及び抗体にあらかじめ結合したhCG抗
原を含んで いた。
塩化ナトリウム150mM,燐酸ナトリウム50mM,
pH6.2)、ウシ血清アルブミン(0.7%)及びメ
ルチオレート(0.01%)の溶液中にhCG(50m
I.U./ml)を含んでいた。
ペルオキシダーゼとの接合体を、ヨシタケら、Eur.
J.Biochem.,101,395(1979)に
よって記載された手法を用いて調製した。この接合体を
、LonzaineTMC両性界面活性剤(0.1%)
を含むMedix Peroxidase Dil
uentと混合した。最終接合体濃度は3.38μg/
mlであった。
pH7.2)、デシル硫酸ナトリウム(100mM,2
.7%)、塩化ナトリウム(0.3M)及びチメロサー
ル(0.01%)から調製した。
−3−メトキシフェニル)−4,5−ビス(4−メトキ
シフェニル)イミダゾールロイコ色素(0.005%)
、ポリ(ビニルピロリドン)(1%)、燐酸ナトリウム
緩衝液(5mM,pH6.8)、ジエチレントリアミン
ペンタ酢酸(10μM)、4′−ヒドロキシアセトアニ
リド(2mM)及び過酸化水素(10mM)を含むもの
であった。
l)を含む試験溶液(150μL)を、試験装置の3つ
の試験ウェルに加え、膜を通して液体を排水させた。標
識抗体を含む緩衝化組成物(1滴、約40μL)を各試
験ウェルに加え、排水させた。試験ウェルを2回洗浄し
(各回300μL)、排水させた。次いで、色素形成組
成物(50μL)を各試験ウェルに加え、排水させた。 室温で1分未満インキュベーション後、膜上の色素濃度
を、10が最も高い濃度を示す色素濃度のカラーチャー
トと対照して評価した。試験ウェル中の、適用した組成
物の回りの領域をバックグラウンドとして評価した。ア
ッセイは3回実施した。
試験ウェル中に見られる可視色素濃度として、以下の表
6中に示す:
イにおいて、本発明の試薬を用いて極めて低濃度のhC
G(50mI.U.)をゼロバックグラウンドによって
容易に検出できることが示される。
p−(2−クロロエチルスルホニルメチル)スチレン]
(モル比95.5:4.5)から同様にして調製した粒
子に共有結合した多クローン性抗体によって調製した対
照試薬を用いる以外は前記例を繰り返した(1989年
7月12日に発行されたEP−A−0 323 6
92中の教示を参照)。対照粒子の懸濁液(固形分3%
)と硼酸塩緩衝液(0.1M,pH8.5)とをミクロ
フュージ管中で混合することによって抗体を結合させた
。多クローン性抗体(13.2mg/ml)の溶液(8
10μL)を管に加えた後、室温において18時間転倒
型で回転させた。得られた試薬は、粒子に共有結合した
理論的抗体の99%を含んでいた。
形成組成物を含む試験溶液は前記と同様であった。前記
手法を用いた対照アッセイの結果は以下のようであるこ
とがわかった:低濃度(50mI.U./ml)のhC
Gでは色素形成がより少なく、背景は無視され得るもの
であった。アッセイは2分未満以内に実施したので、8
個の異なる試験についての色素シグナルは平均してわず
か1.9であった。それは、本発明によって提供される
結果(表6)よりもかなり低かった。
の試薬及びアッセイ この実施例は、ポリマー粒子に共有結合したオリゴヌク
レオチドを有する本発明のいくつかの試薬の製造、なら
びにHIV−IDNA、β−グロビンDNAまたは両方
の検出のための核酸アッセイにおけるそれらの使用を説
明する。試薬をLoProdyneTM微孔質膜(5μ
m)上に試薬を固定する方法を実施する。
下の通りである: 対照 :ポリ(スチレン−コ−アクリル酸)
(モル比97.5:2.5) ポリマーA:ポリ(スチレン−コ−モノ−m&p(60
:40)−ビニルベンジル
グルタレート(モル比97.84:2.16) ポリマーB:ポリ[スチレン−コ−モノ−3−(p−ビ
ニルベンジルチオ)プロピオン酸](モル比97.59
:2.41) ポリマーC:ポリ[スチレン−コ−モノ−2−(4−ビ
ニルベンジルチオ)エチルスクシネート](モル比98
.17:1.83) ポリマーD:ポリ(スチレン−コ−モノ−4−ビニルベ
ンジルスクシネート)(モル比97.71:2.29)
オチドはgag領域においてHIV−IDNAの一部分
に相補的なものであって、以下の核酸配列:
】5′−X−ATTAAATAAA ATAGTAA
GAAT−3′[式中、XはUS−A−4,914,2
10に従ってエチレングリコールスペーサーによってオ
リゴヌクレオチドに結合したアミノ基を表す]を有する
。
モルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液(0.1M,pH
6)で洗浄した。粒子のサンプル(30μg)を緩衝液
(1ml)中に懸濁させ、オリゴヌクレオチド(57.
3OD/ml精製水の0.0288ml,1.65OD
単位)及び1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−
エチルカルボジイミドヒドロクロリド(100mg/m
l緩衝液の0.15ml)と混合した。得られた混合物
を室温において15時間転倒型で回転させ、遠心分離し
た。試薬を精製水で3回洗浄し、固形分0.9%で精製
水中に再懸濁させた。
捨て試験装置の試験ウェル中に位置する別々のLoPr
odyneTM微孔質膜上において直径2mm2未満の
一定の領域に沈着させ、室温で約30分間乾燥させた。 得られた診断試験要素を次に下記のアッセイにおいて使
用した。
プライマーは以下の核酸配列を有していた:
】5′−X−TTTGGTCCTT GTCTTAT
GTC CAGAATGC−3′及び5′−ATAA
TCCACC TATCCCAGTA GGAGA
AAT−3′[式中、XはUS−A−4,914,21
0に従って調製し且つ結合させたビオチンテトラエチレ
ングリコールエステルスペーサーを表す]。
たプライマー配下の核酸配列を有していた:
】5′−X−CAACTTCATC CACGTTC
ACC−3′及び5′−ACACAACTGT GT
TCACTAGC−3′[式中、XはUS−A−4,9
14,210に従って調製し且つ結合させたビオチンア
ミノリンカーを表す]。
施例)において使用した全てのプライマー及びオリゴヌ
クレオチドは、標準ホスホアミダイト(phospho
ramidite)化学を用いて製造し、高速液体クロ
マトグラフィーによって精製し、標準配列法によって特
性決定した。
9,818に記載された手法に従ってThermus
aquaticusから単離した(1単位は37℃に
おいて30分でプライマー拡張生成物中に組み込まれた
dNTP10mmoleに対応する)。
シダーゼ接合体をZymed Labsから入手し、
カゼイン(0.5%)、3−(N−モルホリノ)プロパ
ンスルホン酸緩衝剤(100mM,pH7.5)及び保
存剤(0.01%)を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液で
1:4000に希釈した。最終接合体濃度は312ng
/mlであった。燐酸塩緩衝化生理的塩溶液は燐酸ナト
リウム(25mM,pH7.3)及び塩化ナトリウム(
75mM)を含んでいた。
3−メトキシフェニル)−4,5−ビス(4−メトキシ
フェニル)イミダゾールロイコ色素(0.005%)、
ポリ(ビニルピロリドン)(1%)、燐酸ナトリウム緩
衝剤(5mM,pH6.8)、ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸(10μM)、4′−ヒドロキシアセトアニリ
ド(5mM)及び過酸化水素(10mM)を含んでいた
。
にして実施した。HIV−IDNA標的を、Syrac
use UniversityのDr.Bernie
Poieszから入手したHIVウィルスゲノムの
単一組み込みコピー(single integra
ted copy)を含むHUT細胞系から単離した
。
供した: サンプルA:HIV−IDNA標的、β−グロビンDN
A標的及びHIV−IDNA標的のみに対するプライマ
ーを含んでいた。 サンプルB:β−グロビンDNA標的及びそれのみに対
するプライマーを含んでいた。 サンプルC:両標的及び両標的に対するプライマーを含
んでいた。
ーゼ連鎖反応のための混合物はトリス(ヒドロキシメチ
ル)アミノメタン緩衝剤(10mM,pH8)、塩化カ
リウム(50mM)、塩化マグネシウム(10mM)、
ゼラチン(10μg)、前記の適当なプライマー(各1
00pM)、dNTP(各々1.5mM)、前記DNA
ポリメラーゼ(7.5単位)及び標的:β−グロビンD
NA(1μg)またはHIV−IDNA(約10−16
M)を含んでいた。各混合物の総量は100μLであっ
た。
管に入れ、プライマー拡張生成物を形成し、標的核酸の
増幅を以下のようにして30回の熱サイクルを用いて実
施した: 70℃, 95℃に上昇
1分間95℃,
0.5分間95℃, 55℃に低
下 1.25分間55℃,
0.5分間55
℃, 70℃に上昇 0.75分
間70℃,
1分間
のアリコート(5μL)を、トリス(ヒドロキシメチル
)アミノメタン緩衝剤(10mM,pH8)、塩化カリ
ウム(50mM)、塩化マグネシウム(10mM)及び
ゼラチン(1μL/10ml溶液)を含む溶液(95μ
L)に加え、熱変性させ(95℃において5分間)、試
薬が固定されたSurecellTM前記試験装置に加
えた(各試験ウェル中において各混合物約95μL)。
2℃で5分間インキュベートして、試験ウェル中で固定
された水不溶性試薬に対して増幅された標的HIV−I
DNAをハイブリッド形成させた。各試験ウェルから密
封テープを取り除き、55℃において燐酸塩緩衝剤(2
0mM,pH7.4)、塩化ナトリウム(300mM)
及びエチレンジアミン四酢酸(2mM)を含む緩衝化溶
液(250μL)で洗浄を行った。
.6ng)を各試験ウェルに加え、試験装置を室温で2
分間インキュベートした。第2の洗浄(250μL)を
前記緩衝化溶液を用いて行った。次いで、色素形成組成
物(100μL)を各試験ウェルに加え、次いで室温で
2分間もう一度インキュベートした。アジ化ナトリウム
(0.1%溶液100μL)の添加によって色素形成を
停止させ、試験ウェル中の得られた赤色色素を目視評価
した。各アッセイを繰り返した。
表す0〜10の尺度で評価した。以下の表7の結果は、
各試薬及びサンプルに関する二重反復試験の読みである
。
たHIV−IDNAの検出のためのプローブとしてうま
く使用されたことを示す。しかしながら、β−グロビン
DNAはその増幅後でさえ認知できる程度に検出されな
かったが、これはβ−グロビンDNAに対して相補的な
オリゴヌクレオチドを含む捕獲試薬を用いなかったため
である。バックグラウンド色素濃度(サンプルB)は許
容され得る程度に低かった。
ロビンDNA検出のための試薬及びアッセイこの実施例
は、HIV−IDNA検出用の試薬の調製において種々
のオリゴヌクレオチドを用い且つβ−グロビンDNAに
対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む試薬を用いて
標的核酸の増幅後にβ−グロビンDNAも検出する以外
は実施例12と同様にして実施した。
下の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて調製した
:
AATAAAAT AGTAAGAATG TAT
AGCCCTAC−3′[式中、XはUS−A−4,9
14,210に記載された手法を用いてスペーサーによ
ってオリゴヌクレオチドに結合させたアミノ基である]
。
の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて調製した:
ACCATGGT GCACCTGACTC−3′[
式中、XはUS−A−4,914,210に記載された
手法を用いてオリゴヌクレオチドに結合させたアミノ基
である]。
試薬及びβ−グロビンDNA試薬を用いて増幅及び検出
法に供した: サンプルA:HIV−IDNA標的、β−グロビンDN
A標的及びHIV−IDNA標的のみに対するプライマ
ーを含んでいた。 サンプルB:β−グロビンDNA標的及びそれのみに対
するプライマーを含んでいた。 サンプルC:両標的及び両標的に対するプライマーを含
んでいた。
実施し、得られた色素濃度をここに示すようにして評価
した。試験結果を各試薬及び試験サンプルについて以下
の表8中に示す。
IV−IDNAのアッセイ この実施例は、アッセイ用の試薬を保持するのに有用な
明確な形の容器を用いてHIV−IDNAを検出する以
外は実施例12と同様である。
のポリエチレンの貼合わせシートである、Scotch
pak 241TMヒートシール可能なフィルム(3
M Corp.)の2枚のシートからアッセイ用の容
器を調製した。フィルムのポリエチレン側は熱活性化接
着剤として役立つ。溝を有する金型上にシートのうち1
枚を置き、ポリエチレンの融点未満の温度において加熱
し、熱緩和させながら、フィルムを溝の中に機械的に伸
ばすことによって、1枚のシート中に流路を形成した。 次いで、流路形成片を、本発明の試薬(後記)が特定の
領域中に固定されたScotchpak 241TM
ヒートシール可能なフィルムの第2の試験片とそろえた
。これは、互いに向かい合う2枚のフィルムのポリエチ
レン表面とそろえた。次いで、2枚のフィルムを流路の
両側の境界に沿ってヒートシールしたので、それらの両
側に沿って漏れはなかった。
−バイ」アッセイ形態をシミュレートした。各検出流路
はサンプル導入のための入口、固定された本発明の試薬
、及び液体を流路から出させ且つ回収させる出口を有し
ていた。液体試薬は流路へ押し込まれて、固定された試
薬と接触させられてから、流路から出る。
例12のポリマーB、C及びDを使用し且つその実施例
の手法を用いて調製した。得られた試薬(0.9%懸濁
液2μL)を、前記の個々のパウチの検出流路の一定の
領域(直径約2mm)上に沈着させ(流路寸法は約19
mm×8mmであった)、室温で乾燥させた。
施例12において使用したのと同一であった。ポリメラ
ーゼ連鎖反応のための反応混合物は、ゼラチンが0.0
1%で且つプライマーが各々、1μMで存在する以外は
同一であった。
16M)を含む溶液を、以下のプロトコールを用いて、
30〜33周期の間、標準サーモサイクラー上のポリメ
ラーゼ連鎖ブリスター(chain blister
)及びポリメラーゼ連鎖反応混合物(100ml)を用
いて増幅した: 94℃におけるインキュベーション
4秒、及び65℃におけるインキュベーション30秒。
アミノメタン緩衝剤(10mM,pH8.3)、塩化カ
リウム(50mM)、塩化マグネシウム(10mM)及
びゼラチン(0.01%)を含む]中における得られた
増幅反応混合物の5:95希釈のサンプル(200μL
)を95℃において5分間、管中で加熱して2本鎖標的
を変性させた。加熱した溶液をシリンジバレルに移し、
流路中において固定試薬の均一な付着量を保証するよう
に各検出流路に注入した。次いで、42℃において5分
間、各流路をインキュベートして、一本鎖HIV−I核
酸標的に試薬をアニールした。空気によって液体を追い
出すことによって液体を検出流路から除去し、液体をシ
リンジによって回収した。
に注入した。この溶液は、燐酸二水素ナトリウム(10
mM,pH7.4)、塩化ナトリウム(150mM)、
エチレンジアミン四酢酸(1mM)及びデシル硫酸ナト
リウム(1%)を含んでなる緩衝剤溶液(400μL)
からなるものであった。洗浄溶液を除去し、次いで、実
施例12のストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシ
ダーゼ接合体(200μL)を各検出流路中に注入し、
室温で2分間インキュベートした。液体を除去し、第2
の洗浄溶液(400μL)を導入し、除去した。次いで
、実施例12の色素形成組成物(200μL)を各流路
に導入し、室温で1〜2分間インキュベートして除去し
た。最後に、アジ化ナトリウムの溶液(0.1%溶液2
00μL)を導入して色素形成を停止させ、それを除去
した。
0が最高色素濃度を示す0〜10の尺度で目視によって
等級分けした。各試薬に関する3つの別々の試験の平均
について、読みの結果を以下の表9中に示す。
な全試薬及び溶液のための区分室及び反応のための別の
区分室を有する自蔵容器(またはパウチ)である同様な
実験を行って成功した。このような自蔵容器については
U.S.S.N.339,923(前記)中により詳細
に述べられている。
の検出に有用な試薬の製造 本実施例は、ハイブリッド形成またはポリメラーゼ連鎖
反応アッセイにおいて使用できるハイブリッド形成試薬
の新規製造方法を記載する。試薬はサイトメガロウィル
スDNAの検出に有用である。
ニルベンジルチオ)プロピオン酸]からなるポリマー粒
子(モル比97.6:2.4,平均直径1.4μm)を
用いて試薬を調製した。活性化剤は1−(3−ジメチル
アミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドヒドロク
ロリドであり、緩衝剤は2−(N−モルホリノ)エタン
スルホン酸(0.1M,pH6)であった。
を有している(塩基に関する標準表示法を用いて識別)
: #1 5′−GGTGTCACCC CCAGAG
TCCC CTGTACCCGC−3′ #2 5′−GACACAGTGT CCTCCC
GCTC CTCCTGAGCA−3′ #3 5′−GTGGAAGGCG GCTCCC
TGGA AGCCGGTCGT−3′ #4 5′−GAACCGAGGG CCGGCT
CACC TCTATGTTGG−3′
171】
せた。
分約12〜16%)を遠心分離し(5000rpm)、
得られたペレットを2−(4−モルホリノ)エタンスル
ホン酸緩衝剤(500μL,0.1M,pH6)に加え
、再び、約7分間遠心分離した。この手法を繰り返し、
最後に粒子を緩衝液(固形分約12%)に再懸濁させた
。
0μL)に加えることによって、粒子の前記懸濁液を含
む4つの管を調製した。活性化剤(500μLナノピュ
ア水中125mg)の溶液(100μL)を各管に加え
、得られた混合物を室温において約5分間手動転倒型回
転によって混合して活性化ポリマー粒子を生成した。
種々の管に以下の容量で加えた:#148.3μL、#
2 37.7μL、#3 45.4μL及び#43
2.3μL。各管は活性化粒子を600μL含んでいた
。次いで、管を室温において約18時間転倒型で回転し
て、オリゴヌクレオチドを活性化粒子に共有結合させた
。
トをナノピュア水(500μL)中に再懸濁させ、再び
遠心分離した。水による処理及び遠心分離をさらに2回
繰り返し、最終ペレットをナノピュア水(600μL)
中に再懸濁させて、試薬の懸濁液(固形分約12%)を
調製した。この懸濁液を、アッセイに使用するために固
形分約1%まで希釈した。濃度を、希釈及び標準希釈曲
線との比較によって分光光度法で測定した。
のアッセイ ポリマー粒子の12%懸濁液を用いて調製した、実施例
15中に前記した試薬を使用して、サイトメガロウィル
スDNAのアッセイを実施した。ポリマー粒子の約1〜
3%懸濁液を用いて先行技術の方法を用いて調製した本
発明の試薬を用いて実施したアッセイBに、それを比較
した。
後期(late)抗原(LA)領域の200ヌクレオチ
ド分節、及びCMV Towne菌株(ATCC
VR9 77)のMajor Immediate
Early(MIE)領域の265ヌクレオチド分
節であった。
ヌクレオチドは以下の配列を有していた:5′−GTC
GAAGGCG GCTCGCTGGA AGCC
GGTCGT−3′及び5′−GAACCGAGGC
CGGCTCACCTCTATGTTGG−3′
180】LA領域の検出に使用したプライマーは以下の
配列を有していた:5′−CACCACGCAG C
GGCCCTTGA TGTTT−3′及び5′−G
TCGCCTGCG CCAGGTGCTT CG
−3′
オチドは以下の配列を有していた:5′−GGTGTC
ACCC CCAGAGTCCC CTGTACC
CGC−3′及び5′−GACACAGTGTCCTC
CCGCTC CTCCTGAGCA−3′
2】MIE領域のためのプライマーは以下の配列を有し
ていた:5′−CAGCACCATC CTCCTC
TTCC TCTGG−3′及び5′−GAGGCT
ATTG TAGCCTACAC TTTGG−3
′
レオチドを実施例15に記載したポリマー粒子に結合さ
せて、アッセイAのための本発明の試薬(またはプロー
ブ)を調製した。アッセイBに関しては、粒子の1〜3
%懸濁液を用いてオリゴヌクレオチドをポリマー粒子に
結合させてアッセイBのための試薬(またはプローブ)
を調製した。
合し(各試薬の0.5%懸濁液1μL)、1セットのS
urecellTM試験装置(Eastman Ko
dakCo.)の試験ウェル中の膜(5μm Lop
rodyneTM微孔質膜)の所定の領域上にスポット
した。MIE領域のためにアッセイA用試薬を同様に混
合し、同一装置中の同一膜の第2の所定の領域上にスポ
ットした。適用した試薬は室温で約30分間乾燥させた
。
行技術の方法を用いて調製)を混合して、第2のセット
の試験装置中に前述したようにしてスポットした。MI
E領域のためのアッセイB用試薬を混合して、同一膜の
第2の所定の領域上にスポットした。
シダーゼ接合体はZymed Labsから入手し、
カゼイン(0.5%)、3−(N−モルホリノ)プロパ
ンスルホン酸緩衝剤(100mM,pH7.5)及び保
存剤(0.01%)を含む燐酸塩緩衝化生理的塩溶液で
1:8000に希釈した。最終接合体濃度は156ng
/mlであった。燐酸塩緩衝化生理的塩溶液は燐酸ナト
リウム(25mM,pH7.3)及び塩化ナトリウム(
75mM)を含んでいた。
シフェノール)−4,5−ビス(4−メトキシフェニル
)イミダゾールを含む色素形成組成物を以下のようにし
て調製した:固体ロイコ色素(0.1%溶液を調製する
ため)を燐酸ナトリウム緩衝液(5mM)中20%ポリ
(ビニルピロリドン)の溶液中に溶解させた。次いで、
この溶液を、燐酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素(1
0mM)、4′−ヒドロキシアセトアニリド電子剤(e
lectron agent)(5mM)及びジエチ
レントリアミン五酢酸キレート化剤(10μM)を含む
溶液に加えて、最終濃度をポリ(ビニルピロリドン)1
%及びロイコ色素0.005%とした。
載された手法に従って調製されたDNAポリメラーゼ(
1単位は37℃において30分でプライマー拡張生成物
中に取り込まれたdNTP10mmoleに対応する)
はCetus Corpから入手した。
ミノメタン緩衝剤(10mM,pH8)、塩化カリウム
(50mM)、塩化マグネシウム(10mM)及びゼラ
チン(10μg)を含む緩衝剤溶液に前記プライマー(
各40pmole)、dNTP(各1.5M)及び前記
ポリメラーゼ(7.5単位)を加えた。さらに、前記の
Towne菌株標的を加えた。総容量は100μLであ
った。
ジ管に入れ、プライマー拡張生成物を形成し、以下のよ
うな33回の逐次熱サイクルを用いて増幅を促進した:
66℃ 92.5℃まで上昇
35秒間92.5℃
1分間92.5℃
66℃まで低下 45秒間
66℃
1分間。
を、塩化カリウム(50mM)、塩化マグネシウム(1
0mM)及びゼラチン(1μg/10ml溶液)を含む
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝剤(10
mM,pH8)の溶液に加え、熱変性させ(95℃にお
いて5分間)、次いで、前記SurecellTM試験
装置の試験ウェルに加えた(個々のウェル中に各溶液約
95μL)。
ベートして、試験ウェル中において固定された各試薬(
またはプローブ)に増幅DNA標的をハイブリッド形成
した。ハイブリッド形成された生成物を、55℃におい
て燐酸塩緩衝剤(10mM,pH7.4)、塩化ナトリ
ウム(150mM)、エチレンジアミン四酢酸(1mM
)及びデシル硫酸ナトリウム(1%)を含む緩衝化溶液
(250μL)で洗浄した。
体(50μL,7.8ng)を各試験ウェルに加え、装
置を室温で2分間インキュベートした。前記緩衝化溶液
を用いて2度目の洗浄(250μL)を行った。ロイコ
色素溶液(100μL)を各試験ウェルに加え、次いで
、室温で2分間もう一度インキュベーションを行った。 色素の形成を、アジ化ナトリウム(0.1%溶液100
μL)の添加によって加え、得られる色素シグナルを膜
上で評価した。
素濃度を表す0〜10の値を有する色尺度と対照して目
視評価した。結果を、アッセイA及びBのそれぞれに関
する4つの別々の試験について以下の表10中に示す。
発明のいくつかの試薬の調製、及び本発明の範囲外のポ
リマーを用いて製造した試薬とのそれらの比較を説明す
る。
コポリマーからなるものであった: 試験A:ポリ(スチレン−コ−モノ−m&p−ビニルベ
ンジルグルタレート)(モル比97.84:2.16)
, 試験B:ポリ(スチレン−コ−モノ−p−ビニルベンジ
ルグルタレート−コ−ジビニルベンゼン)(モル比97
.01:2.16:0.83), 試験C:ポリ(スチレン−コ−モノ−2−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート)(モル比97.84:2
.16), 試験D:ポリ(スチレン−コ−モノ−2−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート−コ−ジビニルベンゼン)
(モル比97.01:2.16:0.83),試験E:
ポリ[スチレン−コ−モノメタクリロイルペンタ(オキ
シエチレン)グルタレート](モル比98.7:1.3
), 試験F:ポリ[スチレン−コ−モノメタクリロイルデカ
(オキシエチレン)グルタレート](モル比99.2:
0.8), 試験G:ポリ[スチレン−コ−モノ−2−(m&p−ビ
ニルベンジルチオ)エチルグルタレート](モル比98
.3:1.7), 試験H:ポリ[スチレン−コ−モノ−2−(p−ビニル
ベンジルチオ)エチルグルタレート](モル比98.2
5:1.75), 試験I:ポリ[スチレン−コ−3−(p−ビニルベンジ
ルチオ)プロピオン酸](モル比97.59:2.41
), 試験J:ポリ[スチレン−コ−モノ−2−(4−ビニル
ベンジルチオ)エチルスクシネート](モル比98.1
7:1.83), 試験K:ポリ{スチレン−コ−4−[2−(カルボキシ
メトキシアセトキシ)エチルチオメチル]スチレン}(
モル比98.26:1.74), 試験L:ポリ(スチレン−コ−モノ−4−ビニルベンジ
ルスクシネート)(モル比97.71:2.29),試
験M:ポリ[スチレン−コ−モノ−メタクリロイルペン
タ(オキシエチレン)フタレート](モル比98.81
:1.19), 対照A:ポリ(スチレン−コ−アクリル酸)(モル比9
5:5),及び 対照B:ポリ(スチレン−コ−3−アクリルアミド−3
−メチルブタン酸)(モル比96.9:3.1)。
ルボニル)ピリジニウムクロリドを用いてポリマー粒子
にタンパク質を結合させた。全ての粒子を同一条件下で
処理した。最終分散液は、2−(4−モルホリノ)エタ
ンスルホン酸緩衝液(0.1M,pH5.5)中1.7
mg/m2の量の抗体(前記実施例1と同様なトリチウ
ム標識ウシガンマグロブリンまたは前記実施例2と同様
なチロキシン抗体)及び活性化剤(1.5mmole/
g粒子または0.045mmole)を含んでいた。
クロフュージ管に加えることによって分散液を調製し、
示した緩衝液を用いて各々を容量1.5mlとした。得
られた懸濁液を13,000rpmにおいて15分間遠
心分離し、上澄み液を廃棄した。各管に緩衝液(1ml
,0.1M)を加え、次いで、活性化剤(緩衝液中0.
15Mの溶液0.3ml)を添加した。次に、管を蓋締
めし、室温で10分管転倒型で回転させて、活性化ポリ
マー粒子を生成した。
子を含む各管に加えて、最終濃度を1.7mg/m2ポ
リマー粒子とした。トリチウム標識ウシガンマグロブリ
ンをいくつかの管に加え、他の管にはチロキシン単クロ
ーン抗体(Cambridge/Ventrex)を加
えた。次いで、全ての管に緩衝液を加えて、最終容量を
1.5mlとした。管を室温において24時間転倒型で
回転させて、タンパク質を活性化粒子と反応させた。
ルブミン(250μL,タンパク質100mg/ml)
を添加することによって抑えた。次いで、管を再び室温
でさらに16時間回転させた。結合した3Hウシガンマ
グロブリンを含む試薬を、実施例1に記載されたように
して処理して、結合したタンパク質の総量及び共有結合
した量を測定した。チロキシン抗体が都合した試薬を洗
浄し、得られた分散液中の活性抗体の相対量を実施例2
に記載したようにして測定した。
、本発明の試薬のほとんどにおいて、トリチウム標識ウ
シガンマグロブリンが非常によく共有結合したことを示
す。試験E及びFの試薬はタンパク質も他の試薬も共有
結合しなかった。しかしながら、芳香族カルボキシ官能
基を結合基の末端に加えた場合には(試験Mにおける試
薬に関する)、共有結合したタンパク質の量はかなり増
加した。
た抗体を含む試薬は、対照の試薬よりも3〜20倍の大
きい活性を示した。
シンのイムノアッセイ この実施例は、本発明の乾燥分析要素の製造及び液体サ
ンプル中のホルモンチロキシンを測定するための競合的
イムノアッセイにおけるその使用を説明する。アッセイ
において、本発明の2つの試薬を対照試薬に比較した。
薬をこのアッセイに用いた。対照試薬は、EP−A−0
280 556に記載された手法を用いて調製し
た。 使用した活性化剤は1−(1−ピロリジニルカルボニル
)ピリジニウムクロリドであった。試薬を2種の量で要
素の標準硫酸バリウム塗布層に取り入れた:ポリマー2
5mg/m2層表面、またはポリマー50mg/m2層
表面。
以下の通りであった: 試験A:ポリ(スチレン−コ−モノ−m&p−ビニルベ
ンジルグルタレート)(モル比97.84:2.16)
, 試験B:ポリ(スチレン−コ−モノ−2−メタクリロイ
ルオキシエチルグルタレート)(モル比97.84:2
.16)、ならびに 対照 :ポリ(スチレン−コ−エチレンジメタクリレ
ート)(モル比99:1)のコア及びポリ[スチレン−
コ−m&p−(2−クロロエチルスルホニルメチル)ス
チレン−コ−エチレンジメタクリレート](モル比94
.5:4.5:1)のシェルを有するコア/シェルポリ
マー粒子。
下の通りであった:
一連のチロキシン標準溶液をジメチルスルホキシド中1
×10−3Mチロキシン原液から下記の緩衝液中に調製
した。緩衝液は燐酸塩緩衝化生理的塩溶液(pH7.4
)、ウシ血清アルブミン(1%)及び8−アニリノ−1
−ナフタレンスルホン酸(8.7×10−4M)からな
るものであった。アルカリホスファターゼ標識チロキシ
ンの溶液を2.0×10−8Mの濃度で調製した。チロ
キシン標準液及び標識類似体溶液を1:1で混合して、
標識類似体の最終濃度が1.0×10−8Mとなるよう
にした。
素の塗布層上にスポットした。37℃において5分間イ
ンキュベーション後、p−ニトロフェニルホスフェート
(15mM)を含む洗浄溶液(10μL)を要素に加え
て、塗布層において形成された全ての複合体から、複合
体を形成していない標識類似体を除去した。1分間のイ
ンキュベーション後に、反射濃度(△DR)の変化を標
準分光光度計を用いて37℃及び400nmにおいて要
素の中心で30秒間、測定した。
結果を以下の表12中に示す。これらの結果は、要素中
の本発明の2種の試薬上に固定されたチロキシン抗体が
対照試薬よりも優れた結果を提供することを示す。さら
に詳しくは、本発明の試薬は、チロキシンレベルが低い
「比較的速い反応」速度を示す。従って、試薬は標識類
似体に対して高い結合反応性を示し、アッセイに対する
比較的大きい使用範囲を提供する。使用範囲はここでは
、チロキシン10−10及び10−5Mにおける速度の
差として定義する。
ンのアッセイ この実施例は、競合的結合アッセイ及び西洋わさびペル
オキシダーゼ標識接合体を用いて乾燥分析要素中におい
てチロキシンを検出するための本発明の実施を説明する
BioPacificから入手したもの(クローン03
5−A 2206A)及び、(b)Beckman
Instrumentsから入手したもの(#684
823)。実施例2に記載した手法及び活性化剤として
の1−(1−ピロリジニルカルボニル)ピリジニウムク
ロリドを用いてそれらをポリ[スチレン−コ−3−(p
−ビニルベンジルチオ)プロピオン酸](モル比97.
59:2,41)の粒子に共有結合させた。得られた試
薬を以下に説明する分析要素の塗布層中に取り入れた。
液中で10−3M原液(ジメチルスルホキシド中)から
、10−5〜10−10Mの濃度を生じるように調製し
た。緩衝液は3−(4−モルホリノ)プロパンスルホン
酸緩衝剤(0.2M,pH7)、4−ヒドロキシアセト
アニリド(0.01M)、8−アニリノナフタレン−1
−スルホン酸(8.7×10−4M)及びウシガンマグ
ロブリン(0.1%)からなるものであった。西洋わさ
びペルオキシダーゼ標識チロキシン類似体溶液を2×1
0−9Mの濃度で調製した。
類似体の最終濃度が10−9Mとなるようにした。チロ
キシンを含まない対照溶液も試験した。混合物のアリコ
ート(10μL)を要素の塗布層上にスポットした。3
7℃において5分間インキュベーション後、過酸化水素
(10μL)を含む洗浄溶液を加えて、要素の中心にお
いて複合体から、複合体を形成していない類似体を洗い
流した。室温で40秒間インキュベーション後、標準分
光光度計を用いて37℃及び680nmにおいて要素の
中心で30秒間、反射濃度の変化(△DR)を測定した
。Williams−Clapper transf
orm(J. Opt.Soc.Am.,43,59
5,1953)を用いて反射濃度を透過率値(△DT)
に変換した。結果を以下の表13中に示す。それらは、
本発明の2種の試薬を用いた場合、所望のチロキシン濃
度範囲において速度がかなり変化することを示す。
において有用な試薬を提供する。これらの試薬は標準カ
ルボキシ含有ポリマーを用いて製造された公知の試薬と
比べて改良されている。
表面から伸張するカルボキシ基を有するいくつかのコポ
リマーを使用して、生物活性物質の結合及びそれらのそ
れ以後の使用に改良された結果を生ずることによって提
供される。従って、前記構造において、“L”として識
別される有機基は長さに関して臨界が8〜50個の炭素
、窒素、酸素及び硫黄原子である。
マー上の伸張親水性カルボキシ基は公知の比較的短いカ
ルボキシ基を有するモノマーより優れたいくつかの利点
を提供する。乳化重合の間に、改良されたモノマーは水
相において溶液(または水溶性)ポリマーとして重合す
る傾向が比較的少ない。従って、改良されたモノマーは
比較的容易に且つ比較的完全に水不溶性ラテックス粒子
に取り入れられ、それによって、タンパク質または他の
生物学的化合物の結合を促進する。アクリル酸から製造
されたラテックスは水相中に不所望の可溶性ポリマーを
含むが、ある用途ではそれはかなりの費用を費やして除
去しなければならない。ここに記載した改良モノマーは
比較的水溶性でないポリマーを生成する。
えば、スチレン誘導体)を有するものである、本発明の
実施において使用する好ましいモノマーの反応性比は、
スチレン及びスチレン誘導体のような芳香族コモノマー
との重合のための公知カルボキシ含有モノマーよりも好
ましい。さらに、伸張結合基は、生物学的化合物が粒子
に結合する場合にカルボジイミドまたは他の活性化剤に
よってカルボキシ基が比較的容易に活性化されるように
する。
Claims (7)
- 【請求項1】 (I)少なくともその表面が、(a)
コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上のエチ
レン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.8モル
%、 (b)構造: 【化1】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)反
応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有結
合した生物活性物質を含んでなる生物活性試薬。 - 【請求項2】 (I)少なくともその表面が、(a)
コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上のエチ
レン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.8モル
%、 (b)構造: 【化2】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)反
応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有結
合した生物活性物質を含んでなる生物活性試薬を含む分
析要素。 - 【請求項3】 A.(I)少なくともその表面が、(
a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.8
モル%、 (b)構造: 【化3】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)リ
ガンドまたはそのレセプターと特異的に反応性である、
反応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有
結合した生物活性物質を含んでなる試薬によって特異的
結合リガンドまたはそのレセプターの水不溶性特異的結
合複合体を形成し、そして B. 該複合体の存在を検出することを含んでなる特
異的結合リガンドの定量方法。 - 【請求項4】 A. 水溶性特異的結合リガンドを
その水溶性レセプターならびに (I)少なくともその表面が、 (a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.
8モル%、 (b)構造: 【化4】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)反
応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有結
合したリガンドの分子を含んでなる試薬と接触させて、
レセプターとリガンドとの間に特異的結合複合体(a)
を、ならびにレセプターと水不溶性試薬との間に特異的
結合複合体(b)を形成せしめ、そしてB. 該複合
体(a)または(b)の存在を検出することを含んでな
る特異的結合リガンドの定量のための競合的結合アッセ
イ。 - 【請求項5】 リガンドとそれに対するレセプターと
の間に形成される水不溶性特異的結合複合体を検出する
ことを含んでなる特異的結合リガンドの定量のためのア
ッセイであって、該レセプターが (I)少なくともその表面が、 (a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.
8モル%、 (b)構造: 【化5】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において識別される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)反
応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有結
合した、リガンドに対するレセプターを含んでなる試薬
の一成分として提供される特異的結合リガンドの定量の
ためのアッセイ。 - 【請求項6】 A. 生物活性物質の混合物を含む
検体を、 (I)少なくともその表面が、 (a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.
8モル%、 (b)構造: 【化6】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)検
体混合物中の所定の生物活性物質に特異的である、反応
性カルボキシ基を介して該粒子に共有結合した特異的結
合物質 を含んでなるアフィニティークロマトグラフィー試薬上
に通過させて試薬と所定の物質との複合体を形成させ、
そして B. 溶離剤中に残る複合体または物質を回収するこ
とを含んで成る分析的分離方法。 - 【請求項7】 A. 核酸と (I)少なくともその表面が、 (a)コポリマーに疎水性を与える1種またはそれ以上
のエチレン系不飽和重合性親油性モノマー60〜99.
8モル%、 (b)構造: 【化7】 [式中、Rは水素、ハロまたは炭素数1〜3のアルキル
であり、Mは水素、アルカリ金属イオンまたはアンモニ
ウムイオンであり、Lは結合鎖中の、炭素、窒素、酸素
及び硫黄原子からなる群から選ばれた8〜50個の原子
を有する有機結合基である]によって表される反応性カ
ルボキシ基またはその塩を有する1種またはそれ以上の
エチレン系不飽和重合性モノマー0.2〜40モル%、
ならびに (c)前記(a)及び(b)中において特定される以外
の1種またはそれ以上の別のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー0〜15モル%から誘導される反復単位を有する
コポリマーから成る水不溶性粒子、ならびに(II)反
応性カルボキシ基またはその塩を介して該粒子に共有結
合した、核酸に対して実質的に相補的であるオリゴヌク
レオチドを含んでなる試薬との間において水不溶性ハイ
ブリッド形成生成物を形成し、そしてB. 該ハイブ
リッド形成生成物の存在を検出することを含んでなる核
酸の検出方法。
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