JPS60192706A - 診断試薬用ラテツクスの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、免疫血清学的診断試薬に有効なラテックスの
製造方法に関する。

（従来技術） 免疫血清学の進歩に伴い、臨床検査における技術の向上
はめざましい。免疫血清学検査は、試験管を用いて行わ
れ、血清希釈にはメスピペットが使用される。このよう
な試験管やピペットによる作業の繁雑さと、検査件数の
増加に伴う大量の検体処理とが免疫血清学検査の精度を
低くしている原因でもある。しかし、臨床検査の自動化
導入によって、免疫血清学検査の領域においても患者か
らの採血量を少なくシ、微量の検査材料で正確な検査デ
ータが得られる微量検査法（マイクロタイター法）が実
施されるに至っている。　このマイクロタイター法は１
９５５年ハンガリーのＴａｋａｔｓｙによって考案され
、さらに、　１９６２年に、アメリカの５ｅｖｅｒによ
って改良された。１９６３年にアメリカでマイクロタイ
ターキットが市販されて以来、これが免疫血清学的検査
に採用され１世界中で使用されるようになった。　１９
６７年、アメリカのＣＩ）Ｃ（Ｃｅｎｔｅｒ　Ｆｏｒ　
Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）がこれを補体結合反
応の標準検査法として採用した。　ＰｕｂｌｉｃＨｅａ
ｌｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅのトレーニングマニュアルにマ
イクロタイター法の手法が使用されている。我国では、
ウィルス学の研究者によって比較的はやく紹介され、輸
入品によってウィルスの血清学的検査（血球凝集反応、
血球凝集阻止反応、補体結合反応など）や細胞・組織な
どの培養が行なわれている。これらマイクロタイクー法
の特徴は、■ｍＷの血清で多項目の検査ができること；
■操作が簡便で多数の検体を短時間で迅速に希釈するこ
とができること；■抗原、抗血清、試薬などが現行法に
くらべ少量ですみ経済的であること；０１枚のプレート
で全体の反応がみられ、凝集像や溶血が鮮明で判定しや
すいこと；■現行法との反応の感度や精度が変わらず、
再現性もよいことなどである。これらマイクロタイター
法に用いられるのは比較的比重の大きい血球であり、主
としてヒツジ赤血球およびニワトリの血球である。これ
ら動物血球を用いた場合には血球の腐敗および変性が激
しく、長期の保存性に欠けること、および個体差が大き
いために検査値のバラツキ幅が広く正確なデータがなか
なか得られないこと等の問題点がある。そのうえ、血球
そのもの自体に抗原を含んでいるため、これが検査を受
ける血清中の種々の抗体と反応し、その結果、まぎられ
しい反応を起こしやすい。

（発明の目的） 本発明の目的は、ロフト間のバラツキがなく長期間安定
に保持しうる診断試薬用ラテックスの製造方法を提供す
ることにある。本発明の他の目的は、自己凝集および非
特異凝集が少なく誰もが簡単にしかも短時間で評価でき
る。マイクロタイター法に最適なソープフリー系ラテッ
クスの製造方法を提供することにある。本発明のさらに
他の目的は、高精度で検査値を得ることのできるラテッ
クスの製造方法を提供することにある。本発明のさらに
他の目的は、所望の粒径および比重のラテックスを製造
しうる方法を提供することにある。

（発明の構成） 本発明の診断試薬用ラテックスの製造方法は。

スチレンとスチレンスルホン酸塩とを乳化剤の不存在下
で過硫酸塩を開始剤として共重合させ共重合体粒子の懸
濁液を得る工程、該懸濁液をアルカリ性の条件下で加熱
処理し次いで中性もしくは酸性の条件下で加熱処理する
工程、そして該懸濁液を塩素化処理する工程を包含し、
そのことにより上記目的が達成される。

本発明に用いられるスチレンスルホン酸塩としては１例
えば、スチレンスルボン酸ナトリウム。

スチレンスルホン酸カリウム、スチレンスルホン酸リチ
ウム、スチレンスルホン酸アンモニウムなどがある。こ
のスチレンスルポン酸塩のスチレンに対する使用割合は
３重量％以下、好ましくは０．０００１〜３重量％、よ
り好ましくは、　ｏ、ｏｏｔ〜２重量％の範囲である。

開始剤として用いられる過硫酸塩としては１例えば、過
硫酸アンモニウム。

過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムなどがある。

これらの過硫酸塩のモノマー全体に対する割合は０．０
１ないし１重量％の範囲が好ましい。本発明において使
用される原子価が２価の金属の酸化物または水酸化物と
しては９例えば、鉄、マグネシウム、カルシウム、銅な
どである。これら酸化物または水酸化物の使用量は、ス
チレンモノマーに対し０．００３〜３．０重量％の範囲
が好ましい。

本発明における共重合反応は、水の仕込まれた反応器内
で行われるが９反応時間は用いられるスチレン、スチレ
ンスルボン酸塩および開始剤の種類や２価の金属の酸化
物または水酸化物濃度等により異なる。通常、５〜５０
時間の範囲で行われる。

共重合反応により得られる共重合体粒子の懸濁液は９次
いで、アルカリ性の条件下で加熱される。

このときの加熱温度は９通常、５０〜９０℃好ましくは
６０〜８０℃である。このときの加熱時間は１０〜ｌＯ
Ｏ時間が好ましい。　その際の反応系のｐＨは７．５〜
１２．５．特に８．０〜１１．０の範囲に保たれるのが
よい。

アルカリ性条件下での加熱処理のち、さらに中性もしく
は酸性側条件下で行われる加熱処理は。

加熱温度が６０〜８０℃であり、加熱時間は１０〜５０
時間である。これら加熱処理された懸濁液は１次いで、
塩素化処理に供される。そのときの温度は。

懸濁液の仕込み量および処理条件により異なるが。

通常、５〜６５℃好ましくは１０〜６０℃である。最終
塩素化量は５〜４０％好ましくは１０〜３０％であるこ
とが好ましい。塩素化処理時間は１０〜５００分好まし
くは３０〜４００分であり、より好ましくは６０〜３６
０分である。

上記処理条件を外れると、得られるラテックスの表面の
損傷が激しく自己凝集の原因となる。かりにうまく処理
できても今度はラテックス自体の比重が大きずぎてマイ
クロタイター法等で評価したとき早く沈降しすぎ、±（
１０分以内に起こる明らかな凝集）〜＋（３分以内に起
こる明らかなａ集）付近のａ集がずべ゛ζ逆転してしま
い正確なデータが得られない。得られるラテックス粒子
の比重がｔ、ｉｏ〜１．６０の範囲に調整されたものは
、マイクロタイター法のラテックスとして好適である。

本発明では、場合により、原子価が２価の金属の酸化物
または水酸化物が使用されるが、それは次の理由による
。

乳化剤の不存在下（ソープフリー系）でスチレンとスチ
レンスルホン酸塩を共重合させて得られるラテックスの
粒子径を揃わせるためには、スチレンモノマーに対する
触媒量を増加するだけでも可能である。しかしこうした
場合、得られたラテックスを用いて試薬化した際に感度
が悪く、かつ非特異的凝集反応を示す確率が高いために
、安定性にすぐれたラテックス試薬が得られない。非特
異的凝集反応の少ない良好なラテックス試薬を得ようと
すれば、非常に純度（力価の高い）の高い精製された抗
体または抗原を用いなげればならず。

試薬製造に時間と手間を要し高価な試薬となる。

これに対し、原子価が２価の金属の酸化物または水酸化
物を使用するとこれらがラテックス粒子の核となりこの
核のまわりをスチレンとスチレンスルホン酸塩の共重合
体が取巻いて均一な粒子のラテックスを形成する。この
場合において前記核を中心として形成されたラテックス
粒子は反応系内において沈降や浮き上がりを生じること
なく均一な分散状態を保持し９粒子の形状および大きさ
がよく揃ったものとなる。

本発明では、また、共重合ラテックス粒子の懸濁液がア
ルカリ性条件下で加熱処理され１次いで中性もしくは酸
性条件下で加熱処理されるが、その理由は次のように説
明できる。

開始剤として過硫酸塩を用いるからポリマー鎖の両端に
硫酸基（５Ｏ４−）が存在することになる。

ポリマー鎖同志の間にはこの硫酸基による電気的反発力
が作用して分散状態が安定化される。しかし、ポリマー
鎖末端の硫酸基による電気的反発力のみでは分散状態の
安定化には不充分であり、これに加えてスチレンスルボ
ン酸塩を共重合させてポリマー鎖中にスルホン基を導入
することにより。

それによる電気的反発力が加わってはじめて充分に安定
な分散状態が得られる。しかしながら、免疫診断試薬用
ラテックスとしては、抗原抗体反応に鋭敏に感応し高感
度の凝集性を有することが要求される。高感度の凝集性
を得るには分散状態が安定化しすぎないことが必要であ
り、常時は分散状態が安定しているが抗原抗体反応に鋭
敏に感応し凝集性が得られる程度の不安定化要素を有す
ることが必要となる。このような分散状態の指標は表面
荷電の程度を示すゼータポテンシャルで表わされる。ラ
テックスの分散状態の安定性はこのゼータポテンシャル
が低い程良くなり一６０ｍＶ以下ではきわめてずぐれた
安定性が得られる。しかし。

このようなゼータポテンシャル領域では安定にすぎるた
め抗原抗体反応におに３る鋭敏な凝集性は得られない。

そこで高感度の凝集性を得るためにゼータポテンシャル
を一４９ｍＶ近傍に調節することが必要となる。このた
めには硫酸基を加水分解し水酸基を経てカルボキシル基
にするのが最適の手段である。そこで、前記共重合体粒
子の懸濁液がアルカリ性条件下で加熱されると、硫酸基
は水酸基となる。しかしながら、硫酸基が水酸基になっ
た場合のゼータポテンシャルは一４０ｍＶ近傍に保たれ
ない。そこで、ゼータポテンシャルを一４０ｍＶ近傍に
調整して凝集性をよくするためにさらに中性もしくは酸
性条件下で加熱処理して上記アルカリ性条件下での処理
により生しる水酸基をカルボキシル基とするのである。

このようにして、ゼータポテンシャルが一４０ｍＶ近傍
に調整される。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

実施例１ スチレンモノマー９０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウ
ム０．６３　ｇ　、水酸化マグネシウム１０ｇ、過硫酸
カリウム０．５ｇおよびイオン交換水４５０ｇを反応容
器に仕込んだ。そして、容器を窒素ガスで置換し反応温
度を７０℃〜７２℃の範囲におさまるようコントロール
しながら２４時間共重合した。共重合終了後１反応容器
内部を空気で置換し、ラテックス懸濁液のｐＨを８．６
に調節した。これを１次いで。

７０℃で２０時間アルカリ性の条件下で加熱処理した。

次いで、　ｐｎを６．０に保ちながら７０℃で２０時間
加熱処理した。反応器を停止し容器からラテックスを取
り出し東洋濾紙１１に２１２．５ＣＭを用いて濾過精製
処理を行なった。次いで、７０℃乾燥機を用いてこのラ
テックスを乾燥し、得られた精製固型分を秤量したとこ
ろ、　１３．８　（Ｗ／Ｗ）％であった。次に。

３１反応容器に水２０００　ｇと、精製ラテックスを蒸
留水で１″ｏ％に希釈したラテックス５００ｇとを投入
したのち、自然光下において反応温度を１５〜２０℃に
保ちながら３２０分間塩素ガスを吹きこみ塩素化処理し
た。Ｎ２ガスで容器内を１５０分間置換した後、得られ
た塩素処理ラテックス取り出し東洋濾紙Ｎｃｉ２１２．
５ＣＭを用いて濾過精製処理した。塩素化処理後のラテ
ックス中の塩素量は反応溶液中のＨＣｌ分析を行なった
結果２７．５％であった。塩素処理後のラテックスを電
子顕微鏡で観察した結果。

平均粒径は０．７１μｍそして粒径のバラツキは変動係
数（粒径の標準偏差／平均粒径）で表して０．０１６で
あった。このラテックスの比重は１．４２であった。

得られた塩素処理ラテックスを超音波にて１分間分散処
理した。分散処理されたラテックスを透析膜を用い２４
時間蒸留水にて精製処理した。

去ｌｕ１影 スチレンモノマー９０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウ
ム０．２０ｇ、過硫酸カリウム０．５ｇおよびイオン交
換水４５０ｇを反応容器に仕込んだ。容器を窒素ガスで
置換し反応温度を７０℃〜７２℃範囲におさまるようコ
ントロールしながら２４時間共重合した。共重合終了後
２反応容器の内部を空気で置換した。得られたラテック
ス懸濁液のｐＨを８．６に調節し、７０℃で２０時間ア
ルカリ性の条件下で加熱処理した。次いで、ｐＨを６．
０に保ちながら７０℃で２０時間加熱処理した。加熱処
理後１反応器を停止し得られたラテックスを取り出した
。これを東洋濾紙Ｎ１１２１２．５ｇＭを用い濾過精製
処理した。これを７０℃で乾燥機を用い乾燥精製後の固
形分を秤量したところ１３．１　（Ｗ／Ｗ）％であった
。次に、３ｘ反応容器に水２０００　ｇと、精製ラテッ
クスを蒸留水で１０％に希釈したラテックス５００ｇと
を投入したのち、自然光下において反応温度１５〜２０
℃に保ちながら３２０分間塩素ガスを吹きこみ塩素化処
理した。　Ｎ２ガスで容器内を１５０分間置換した後。

得られた塩素処理ラテックスを取り出し東洋濾紙Ｎ１２
１−２．５ＣＭを用いて濾過精製処理した。

次に、これら処理されたラテックスを超音波にて１分間
分散処理した。分散処理されたラテックスを透析膜を用
い２４時間蒸留水にて精製処理した。

塩素化処理後のラテックス中の塩素量は反応溶液中のＨ
Ｃｌ分析から１７．４％であった。塩素処理後のラテッ
クスを電子顕微鏡で観察したところ、平均粒径は０．６
７μｍそして粒径のバラツキは変動係数で表して０．０
０７であった。このラテックスの比重は１．２８であっ
た。

Ｒ−ＰＨＡ法凝集反応によるラテックス評価：上記実施
例１と２で得られたポリスチレンラテックスをｐＨ７，
４のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％としたちの１容
と１モルモットの産生じたＨＢｓモノスベシフィックス
抗体（セファローズ４Ｂに固定したＨＢｓ抗原のカラム
に２回通液したアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製品）を同じくリン酸緩衝液中に４０ｇｇ　／　ｃ
ｃの濃度に溶解したもの１容とを混合し、３７℃で６０
分間インキュベートしてラテックスに抗体を結合させた
。次に。

この感作ラテツクスを１８００Ｏｒｐｍにて８分間遠心
分離し、未吸着の抗体を除去した。この上澄中の抗体価
はＰＨＡ　（受身赤血球凝集反応）法により測定され少
なくとも９９．５％以上の抗体がラテックスに吸着して
いることがわかった。この沈降したラテックスを１８０
０Ｏｒｐｍで８分間遠心分離し、上澄み液を捨て、沈降
した処理後の感作ラテツクスをｐＨ７，０のリン酸緩衝
液に再分散してラテックス試薬の調製を終了した。この
ようにして調製されたラテックスを用い現在市販されて
いるリバーセイア（ＨＢｓ抗原検出ＥＴＡキット　山の
内製薬製）を用いてＲ−ＰＨＡ（逆受身血球凝集反応）
試験法を試みた。

マイクロタイターにマイクロドロッパーを用い緩衝液５
０μｌを容管に分注した。そして、１８ｇのＨＢｓ抗原
を含む検体２５μｌを取り出し、すみやかにグイリュー
タ−で倍々希釈した。そして、上記方法で得られたラテ
ックスを２５μｌ各管に分注したのちミキサーで分注し
、３０秒間振盪した。これを３時間・７時間静置後凝集
像を判定した。比較のために、ラテックスの代わりにあ
らかじめヒツジ赤血球に抗Ｈ８ｓ抗体を吸着させたＲ−
ＰＨＡセルを同時に用いラテックス凝集との比較として
評価した。その結果を第１表および第２表に示す。

第１表および第２表は、それぞれ３時間静置後および７
時間静置後の凝集像の判定結果である。

（以下余白） 第１表 （以下余白） 第２表 以下の試験結果から９本発明により得られたラテックス
は、乳化剤が使用されていないため、自己凝集および非
特異凝集が少な（、保存性に優れロット間のバラツキも
ない。粒子がよ（揃いかつ比重が比較的大きいため凝集
反応を、だれもが簡単に、しかも短時間で評価できる。

しかも検査値への影響が少なくマイクロタイター法等に
もっとも適したラテックスであることが明らかである。

比較例１ スチレンモノマー９０ｇ、スチレンスルボン酸ナトリウ
ム０．６３　ｇ　、水酸化マグネシウム１０ｇ、過硫酸
カリウム０．５ｇおよびイオン交換水４５０ｇを反応容
器に仕込め、容器を窒素ガスで置換し反応温度−１”７
０〜７２℃の範囲におさまるようコントロールしながら
２４時間共重合した。共重合終了後９反応容器の内部を
空気で置換し、得られたラテックス懸濁液のｐｌ＋を８
．６に調節して７０℃で２０時間加熱処理した。次いで
、これをｐＨ６，０に保ちながら７０℃で２０時間加熱
処理した。そして９反応器を停止し得られたラテックス
を取り出し東洋濾紙１１ｍ２１２．５ＣＭを用いて濾過
精製処理した。これを２次いで。

７０℃乾燥機を用いて乾燥精製した。得られた固型分を
秤量したところ、　１３．４　（Ｗ／Ｗ）％であった。

このラテックスを電子顕微鏡で観察したところ。

平均粒径が０．６９５μｍ、そして粒径のバラツキは変
動係数で表して０．０１９であった。このラテックスの
比重は１．０３であった。

此Ｊｆｄ江Ｉ スチレンモノマー９０ｇ、ノニオン乳化剤（第一’工業
製薬社製、商品エマルジット４９）２ｇ、過硫酸カリウ
ム０．６　ｇおよびイオン交換水４５０　ｇを反応容器
に仕込み、容器を窒素ガスで置換し反応温度ヲ７０〜７
２℃の範囲におさまるようコントロールしながら２４時
間重合した。得られたラテックスを電子顕微鏡で観察し
た結果、平均粒径ば０．７２５μｍそして粒径のバラツ
キは変動係数で表して０．１２７であった。このラテッ
クスの比重は１．０４であった。

Ｒ７ＰＨＡ法擬集反応によるラテックス評価：比較例１
および比較例２で得られたポリスチレンラテックスをｐ
Ｈ７，４のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％としたも
の１容と１モルモットの産生したＨＢｓモノスペシフィ
ックス抗体（セファローズ４Ｂに固定したＨＢｓ抗原の
カラムに２回通液したアフィニティークロマトグラフィ
ーによる精製品）を同じくリン酸緩衝液中に４０μｇ　
／　ｃｃの濃度に溶解したちの１容とを混合し、３７℃
で、　６０分間インキュベートしてラテックスに抗体を
結合させた。

次に、この感作ラテツクスを１８００Ｏｒｐｍにて８分
間遠心分離し、未吸着の抗体を除去した。この沈降した
ラテックスを１８００Ｏｒｐｍで８分間遠心分離し、上
澄み液を捨て、沈降した処理後の愚作ラテックスをｐＨ
７，０のリン酸緩衝液に再分散してラテックス試薬の調
製を終了した。このようにして調製されたラテックスを
用い市販のリバーセイア（ＨＢｓ抗原検出ＥＩＡキット
　山の内製薬製）を用いてＲ−Ｐ　ＩＩΔ（逆受身血球
凝集反応）試験法を試みた。マイクロタイターにマイク
ロドロンパーを用いて緩衝液５０μβを容管に分注した
。次に。

１ｇｇのＩ（Ｂｓ抗原を含む検体２５μｌを取り出し。

ずみやかにダイリュータ−で倍々希釈した。そして、上
記方法で得られたラテックスを２５μ１８Ｔｒに分注し
たのちミキサーで分注後３０秒間振盪した。

そして、これを３時間および７時間静置して後。

得られる凝集像を判定した。３時間・７時間判定では静
置前と全く凝集像の変化は認められなかった。比較例２
で製造したものについては１２時間判定では非特異凝集
像が明らかとなったために比較例２で得られたラテック
スを用い上記のようにしてラテックス試薬を調製しこれ
を用いて種々の濃度のＨＢｓ抗原を含むヒト血清に対す
る凝集の強さを測定した。その結果を第３表に示す。

（以下余白） 次に、リバーセイア（ＨＢｓ抗原検出ＥＩＡキット　山
の内製薬製）を用いて、血清中のＨＢｓ抗原が０．４ｎ
ｇ／ｃｃ以下であることが判明している３００人の正常
なヒト血清について同様のテストを行った。３００検査
中、陽性が１３件そして偽陽性が２１件であった。

以上の試験結果より、比較例２のラテックスを１史用し
試薬化したラテックスは非特異凝集を起こすことが明ら
かである。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、乳化剤を全く含まないに
もかかわらず、常時は安定で抗原抗体反応に鋭敏に感応
して高凝集性が得られるラテックスが製造される。この
ラテックスはしかも粒径がよく揃っており、かつ従来の
ラテックスに比較して比重が大きい。それゆえ、特にマ
イクロタイター法用として有効である。このラテックス
は、乳化剤を全く含まないために免疫血清学的診断試薬
として用いると、非特異的凝集反応による検査値のバラ
ツキのないすぐれた性能を有するマイクロタイター法等
に特に偉力を発揮しうる。

出願人　積水化学工業株式会社 手＃Ｊｒ：　−？２ｉｈ　ＪＪミ書（自発）昭和６０年
２月２６日 １、事件の表示 昭和５９年　特許願第４８４４７号 ２、発明の名称 診断試薬用ラテックスの製造方法 ３、補正をする壱 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５３０ 住　所　大阪市北区西天満二丁目４番４号特許部東京駐
在　置東京（０３）　４３４−９５５２４、補正の対象 明ｌｌ１Ｉ書′の発明の詳細な説明の欄翫　補正の内容 （１）　明細書第７頁第１６〜１８行に、「±（１０分
以内に起こる明らかな凝集）〜＋（３分以内に起こる明
らかな凝集）付近」とあるのを ｒ十〜十寸近」と訂正する。

（２）　明細書第１６頁第１行に。

「ミキサーで分注し、３０秒間振盪した。」とあるのを ［ミキサーで３０秒間振盪した。」と訂正する０ （３１明細書第１６頁第８行に、 「判定結果である。」とあるのを 「判定結果である。なお以下の表各ζおける符号の意味
は次の通りである。

一二＃！集が認められなめ ±：ゆるやかな凝集が認められる ＋：明瞭な凝集が認められる ＋＋：完全な凝集が顕著に認められるＪと訂正する。

以　上 手続補正書（自船 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４８４４７号 ２、発明の名称 診断試薬用ラテックスの製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５３０ 住　所　大阪市北区西天満二丁目４番４号玩　補正の内
容 （１１明細書ｍ１５頁第１２行〜１４行及び第２１頁第
８行〜ＩＯ行に、 ［リバーセイア（）ｉＢｓ抗原検出ＥＩＡキット山の内
製薬製）を用いて」とあるのを［リバーセル（ＨＢ　ａ
抗原検出キット山の内製薬製）のうちの感作赤血球を該
ラテックスにおきかえて」 と訂正する。

（２）　第１５頁第１８行、第２０行、隋２１頁第１３
行及び第１５行に、 「２５μｌ」とあるのを 「５０μｌ」と訂正する。

以　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、スチレンとスチレンスルホン酸塩とを乳化剤の不存
   在下で過硫酸塩を開始剤として共重合させ共重合体粒子
   の懸濁液を得る工程、該懸濁液をアルカリ性の条件下で
   加熱処理し次いで中性もしくは酸性の条件下で加熱処理
   する工程、そして該懸濁液を塩素化処理する工程を包含
   する診断試薬用ラテックスの製造方法。 ２、前記共重合は原子価が２価の金属の酸化物または水
   酸化物を含有する水溶液中で行なわれる特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 ３、前記アルカリ性条件下での加熱処理が５０〜９０℃
   にて１０〜１００時間そして中性もしくは酸性条件下で
   の加熱処理が６０〜８０℃にて１０〜５０時間行なわれ
   る特許請求の範囲第１項もしくは２項に記載の方法。 ４、前記塩素化処理が５〜６５℃にて１０〜５００分行
   なわれる特許請求の範囲第１項もしくは２項に記載の方
   法。