JPH0157687B2

JPH0157687B2 -

Info

Publication number: JPH0157687B2
Application number: JP56052929A
Authority: JP
Inventors: Eijiro Tagami; Shiro Yasukawa; Mari Kawakami; Haruhiro Hirai
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1981-04-10
Filing date: 1981-04-10
Publication date: 1989-12-07
Also published as: JPS57168163A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫血清学的検査試薬用担体として有
用な重合体粒子に関する。抗原又は抗体などの血清学的活性物質を担体に
吸着あるいは結合させて（以下本操作を感作と記
す）免疫血清学的凝集反応若しくは凝集抑制反応
を行い対応する抗体又は抗原などの存在を検査す
る免疫血清学的検査は簡便かつ鋭敏な方法であり
広く利用されている。免疫血清学的検査試薬としては妊娠診断テス
ト、リウマチ因子を検出するRAテスト、全身性
紅斑性狼瘡を診断するLEテスト、慢性甲状腺炎
を診断するTAテスト、Ｃ−反応性タンパクを検
出するCRPテストなどのための多くの検査試薬
が開発されている。免疫血清学的検査試薬用担体としてポリスチレ
ンなどの重合体粒子を用いることはよく知られた
ことである。さらにスルホン酸基、アミド基など
の官能基で変性した重合体粒子も用いられている
（例えば、特開昭55−131008号公報、特公昭56−
9161号公報）。これらの重合体粒子に要求される
性能としては抗原又は抗体などを重合体粒子に感
作した状態のラテツクス（以下感作ラテツクスと
記す）中の重合体粒子のコロイド化学的安定性と
免疫血清学的凝集反応性とが挙げられる。しかし重合体粒子のコロイド化学的安定性を向
上させると免疫血清学的凝集反応性は低下し（感
度の低下）、逆に免疫血清学的凝集反応性を高め
るためにコロイド化学的安定性を低下させると非
特異的に凝集し実用に供し得なくなる。このよう
に互いに相反するコロイド化学的安定性と免疫血
清学的凝集反応性とを同時に満足させる重合体粒
子を得ることは従来極めて困難であつた。特に近年、免疫血清学的検査の分野において抗
原又は抗体などの微量物質を定性的だけではなく
定量的に測定することが重要な課題となつてい
る。従来は感作ラテツクスをガラス板上で検査対
象物質と混合し反応させ、その重合体粒子の凝集
状態を肉眼で観察することによつて検査目的物質
を定性的に検出していたが、この凝集状態を肉眼
で観察することの代りに光学的測定装置、例えば
分光光度計、濁度計、準弾性光散乱測定装置など
を用いて測定することによつて定量的に検出しよ
うとする試みが多くなされている。例えば感作ラ
テツクス中の重合体粒子が凝集する現象を利用し
て上澄液の濁度の減少率を測定する方法及び感作
ラテツクス中の重合体粒子の凝集による吸光度や
散乱光を測定する方法などが知られている
（CROATICA CHEMICA ACTA 42（1970）
P.457〜466、Immunochemistry 12（1975）
P349〜351、特開昭53−24015、同54−109494な
ど）。これらの方法は感作ラテツクス中の重合体粒子
の免疫血清学的凝集反応による反応系の吸光強
度、散乱光強度などの光学的特性の変化を測定す
ることによつて定量化しようとするものである
が、いずれの方法も凝集反応による反応系の光学
的特性の変化が小さいために精度、再現性などに
問題があつた。また感作ラテツクスの光学的特性
の経時変化がしばしば起り、実用上支障を生じる
という問題もあつた。本発明者らは上記問題を改善すべく鋭意研究し
た結果、免疫血清学的検査試薬用担体として、特
に光学的測定装置に適用する免疫血清学的検査試
薬用担体として有用な重合体粒子を見出し本発明
を完成した。本発明の目的は良好なコロイド化学的安定性と
免疫血清学的凝集反応性を具備し、特に凝集反応
又は凝集抑制反応による反応系の光学的特性の変
化を光学的測定装置により測定し、検査目的物質
の定量的検出を良好な感度でもつて可能ならしめ
る免疫血清学的検査試薬用担体を提供することに
ある。本発明に従つて、一般式（式中、R¹は水素原子又はメチル基であり、R²
は水素原子、メチル基又はハロゲン原子であり、
R³は水素原子、メチル基、カルボキシメチル基、
カルボキシル基、又はアルキル部分の炭素原子数
が１〜12個のアルコキシカルボニル基であり、
R⁴は水素原子又はカルボキシル基であり、R⁵は
水素原子、メチル基又はハロゲン原子であり、
R⁶はハロゲン原子、アルキル部分の炭素原子数
が１〜12個のアルコキシカルボニル基又はシアノ
基である）で表される単量体単位をそれぞれ36〜99.5重量
％、0.5〜４重量％及び０〜60重量％含むランダ
ム共重合体からなる重合体粒子であつて、その平
均粒子径が0.1〜2μｍであり、該重合体粒子の表
面に存在するカルボン酸基の量が0.01〜
0.08meq.／ｇ重合体粒子であることを特徴とする
重合体粒子からなる免疫血清学的検査試薬用担体
が提供される。本発明は重合体粒子表面に存在するカルボン酸
基の含有量が抗原−抗体反応に重要な影響を及ぼ
すという知見にもとづくものであり、前記のよう
に重合体粒子は非特異凝集しない程度の安定性を
有しかつ免疫血清学的凝集反応性を備える必要が
ある。さらに凝集反応若しくは凝集抑制反応によ
る反応系の吸光強度、散乱光強度などの光学的特
性の変化が大きいことが重要である。これらの条
件を満すには重合体粒子表面のカルボン酸基が
0.01〜0.03meq.／ｇ重合体粒子が必要である。ま
た感作ラテツクスを調製した場合の光学的特性の
経時変化を考慮すると0.03〜0.08meq.／ｇ重合体
粒子が望ましい。カルボン酸基が0.01meq.／ｇ重
合体粒子未満の場合は非特異凝集を起し易く、一
方0.08meq／ｇ重合体粒子を越えると凝集反応性
が低下し感度が鈍くなる。なお、本発明において記述する「重合体粒子表
面に存在するカルボン酸基の量」はジヨンヘンに
よつて開発された測定方法によつて求めることが
できる（Journal of Colloid and Interface
Science、49(3)425、1974）。本発明の免疫血清学的検査試薬用担体である重
合体粒子は、一般式（式中、R¹及びR²は前記で定義した通りである）で表される芳香族ビニル化合物36〜99.5重量％、一般式（式中、R³及びR⁴は前記で定義した通りである）で表されるα，β−エチレン性不飽和カルボン酸
0.5〜４重量％、及び一般式（式中、R⁵及びR⁶は前記で定義した通りである）で表される、芳香族ビニル化合物以外のエチレン
性不飽和化合物０〜60重量％を含む単量体混合物を共重合させて得たランダム
共重合体からなる重合体粒子である。好ましく
は、上記の芳香族ビニル化合物96〜99.5重量％と
上記のα，β−エチレン性不飽和カルボン酸0.5
〜４重量％とからなる単量体混合物を共重合させ
て得た重合体粒子であり、更に好ましくは、上記
の芳香族ビニル化合物97〜99重量％と上記のα，
β−エチレン性不飽和カルボン酸１〜３重量％と
からなる単量体混合物を共重合させて得た重合体
粒子である。前記の芳香族ビニル化合物としては例えばスチ
レン、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、ハ
ロゲン化スチレンなどを挙げることができ、好ま
しくはスチレンである。これらの芳香族ビニル化
合物を併用することもできる。前記のα，β−エチレン性不飽和カルボン酸と
しては例えばアクリル酸、メタクリル酸などのモ
ノカルボン酸、イタコン酸、マレイン酸、フマー
ル酸などのジカルボン酸、イタコン酸モノメチル
エステル、マレイン酸モノラウリルエステルなど
のジカルボン酸モノエステルなどがあり、これら
を併用することもできる。好ましいα，β−エチ
レン性不飽和カルボン酸はメタクリル酸である。前記の芳香族ビニル化合物以外はエチレン性不
飽和化合物としては例えばアクリル酸メチル、ア
クリル酸ブチル、アクリル酸２−エチルヘキシル
などのアクリル酸エステル、メタクリル酸メチ
ル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ラウリル
などのメタクリル酸エステル、塩化ビニル、塩化
ビニリデンなどのハロゲン化ビニル化合物、アク
リロニトリル、メタクリロニトリルなどのシアノ
エチレン化合物などを挙げることができる。また、本発明の免疫血清学的検査試薬用担体で
ある重合体粒子の粒子径については、通常粒子径
分布は狭い方が望ましく、平均粒子径としては
0.1〜2μが好ましく、特に好ましくは0.3〜1.5μで
ある。上記重合体粒子の製造方法は特に限定するもの
ではないが、例えば芳香族ビニル化合物36〜99.5
重量％、α，β−エチレン性不飽和カルボン酸
0.5〜４重量％及び芳香族ビニル化合物以外のエ
チレン性不飽和化合物０〜60重量％からなる単量
体混合物100重量部にアルキルメルカプタン0.2〜
2.0重量部を混合し、これを過硫酸塩0.1〜５重量
部、乳化剤０〜0.5重量部を含む50〜100℃の水中
に３〜20時間かけて連続的に又は逐次添加して重
合する方法を挙げることができ、この方法の実施
態様を次に述べる。単量体100重量部にアルキルメルカプタン0.2〜
2.0重量部を混合する際、単量体に一括混合して
もよいし単量体の一部にアルキルメルカプタンを
混合してアルキルメルカプタンを混合しない単量
体と同時に連続的に又は逐次添加してもよい。アルキルメルカプタンが0.2重量部未満の場合
は重合中に多量の凝固物が生成しやすく、2.0重
量部を越える量を加えても重合中に凝固物が生成
しやすくなる。アルキルメルカプタンとしては例
えばｎ−オクチルメルカプタン、ｎ−デシルメル
カプタン、ｎ−ドデシルメルカプタン、ｔ−ドデ
シルメルカプタンなどの長鎖アルキルメルカプタ
ンがあり、アルキル基の炭素数は８〜16が適当で
ある。過硫酸塩としては例えば過硫酸アンモニウム、
過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムなどを挙げる
ことができる。使用量は0.1〜５重量部が好まし
い。0.1重量部未満では重合速度が著しく遅くな
る。５重量部を越えて用いると重合体粒子の粒子
径分布が広くなり好ましくない。重合温度は50〜100℃が好ましく、特に60〜90
℃が好ましい。50℃未満の温度では重合速度が遅
く重合体粒子の粒子径分布が広くなる傾向があ
る。単量体とアルキルメルカプタンの混合物は連続
的に又は逐次添加することが望ましい。混合物を
３時間未満で添加し終ると、得られた重合体粒子
を免疫血清学的検査試薬用担体として用いた場
合、経時的に感度が低下しやすくなる。また滴下
が20時間を越えると重合体粒子の粒子径分布が広
くなる場合があり好ましくない。好ましくは10〜
15時間で連続的に又は逐次添加することである。上記混合物の添加は重合溶液の液面上より滴下
または流下して行なつてもよいし、また液面下よ
り注入してもよい。また、混合物の添加は所定の
時間内に均等にかつ連続的に行なわれるが、場合
により実質的に連続添加と見なし得る程度に間欠
的にすなわち逐次添加してもよい。また乳化剤は単量体100重量部当り０〜0.5重量
部が適当であり、重合体粒子の平均粒子径を制御
する目的で用いる。0.5重量部を越えて用いると
粒子径分布が広くなり好ましくない。好ましいの
は０〜0.1重量部であり特に好ましくは使用しな
いことである。乳化剤としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫
酸アンモニウム、ドデシルジフエニルオキサイド
ジスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン乳化剤お
よびポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリ
オキシエチレンノニルフエノールエーテルなどの
非イオン性乳化剤などを単独又は組合せて用いる
ことができる。これらの内、特に好ましい乳化剤
はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウ
リル硫酸ナトリウム、ドデシルジフエニルオキサ
イドジスルホン酸ナトリウムである。重合終了後に必要に応じて脱単量体のためのス
トリツピングもしくは濃度調整のための希釈また
は濃縮を行なうことができる。また、上記ラテツクス中の重合体粒子を免疫血
清学的検査試薬用担体として用いる場合通常感作
前に遠心分離、限外過などの方法でラテツクス
中に混在する低分子量重合体や不純物を除去する
操作を行なう。本発明の免疫血清学的検査試薬用担体である重
合体粒子は従来の重合体粒子と比較して感作ラテ
ツクスとした場合に感度が優れ、かつ経時的感度
の低下の少なく、免疫血清学的検査試薬用担体と
して優れたものである。特に光学的測定装置を用
いて第１表に例示するような検査目的物質を定性
的および定量的に検出する免疫血清学的検査試薬
用担体として好適である。

【表】なお本発明重合体粒子及び感作した重合体粒子
は、通常水中に分散した状態、すなわちラテツク
ス状態で保存するが、凍結乾燥しておいてもよ
い。凍結乾燥するためにはラテツクスに安定剤と
して各種アミノ酸類、特にグリシン及びグルタミ
ン酸ナトリウムをそれぞれ0.2〜２重量％並びに
デキストランを0.3〜３重量％を加えて液体窒素
あるいは液体空気中などで急速凍結してから凍結
乾燥する。次に本発明の実施例を示す。なお実施例におい
て部及び％は重量による。実施例１、比較例１及び比較例２重合体粒子の製造撹拌機、冷却コイル、温度検出器、ジヤケツト
などを装備したステンレス製反応器（容量５）
を窒素置換して蒸留水150部を仕込み、撹拌しな
がら温度を80℃にした。次に蒸留水10部に過硫酸
カリウム0.5部を溶解して反応器に仕込み、続い
て第２表に示した組成の単量体100部と所定量の
ｔ−ドデシルメルカプタンの混合物を所定時間か
けて反応器に連続的に添加した。単量体添加終了
後、反応器の温度を90℃に上げさらに３時間重合
させた。重合転化率は全て98％以上であつた。得られた重合体粒子ラテツクスを水酸化ナトリ
ウムでPH９に調整しスチームストリツピング及び
減圧蒸留で残留未反応単量体を除去した。得られ
た重合体粒子の平均粒子径及び表面のカルボン酸
基の量を第２表に示す。重合体粒子の粒子径は比
較的揃つていた。

【表】注(1) 平均粒子径：電子顕微鏡により求め
た。
注(2) 表面のカルボン酸基の量：前記ジヨンヘン
によつて開発された測定方法によつて求めた。
すなわち重合体粒子ラテツクスを乾燥固形分で
10ｇになるように採り蒸留水で150mlになるよ
うに希釈し、次いで水酸化ナトリウムでPH11.5
±0.2に調整し、0.1Nの硫酸を3.43ml／分の割
合で滴下して電導度を経時的に測定する。試料
番号２の電導度と硫酸滴定量の関係を示す曲線
を第１図に図示する。次に第１図のような電導度と硫酸滴定量の関係
を示す曲線を用い次式によつて表面のカルボン酸
基の量(a)を求める。ａ（meq／ｇ）＝Vsb×Ｎ／Ｗ×Ｓ Vsb：表面のカルボン酸ナトリウム塩を中和する
のに必要な硫酸量（ml）Ｎ：硫酸の規定度（Ｎ＝meq／ml）Ｗ：重合体のラテツクス量（ｇ）Ｓ：重合体ラテツクス中の重合体粒子の濃度
（％）（Ｗ×Ｓ＝10ｇ）使用例１熱会合免疫グロブリンＧ感作ラテツクスの調製 1/15Ｍリン酸塩緩衝液（PH7.2）１容と生理食
塩液３容との混合液（以下PBSと略す）に実施
例１、比較例１及び比較例２で得た試料番号１〜
５のラテツクス並びに市販のラテツクス(1)及び(2)
を重合体粒子の濃度が0.25％になるように懸濁
し、これに熱会合免疫グロブリンＧの200μｇ／
ml液を等量加え、室温で60分間保ち、感作した。
感作後10000rpm30分遠心して重合体粒子を分取
し、PBSで洗浄した後、希釈液（牛血清アルブ
ミン0.1％をふくむPBS）に重合体粒子の濃度が
0.25％になるように懸濁して、熱会合免疫グロブ
リンＧ感作ラテツクスを得た。備考：市販ラテツクス(1)＝ダウケミカル社製ポリ
スチレンラテツクス粒子径0.33μ 市販ラテツクス(2)＝武田薬品工業(株)製ラテツ
クス、SDL−59 リウマチ因子の測定リウマチ因子陽性血清を10名分混合してプール
血清を調製し、これをPBSで１：10、１：20、
１：40、１：80、１：160及び１：320に希釈し
た。この希釈血清0.5mlに１：25に希釈した前記
感作ラテツクスを0.5ml加え、37℃で60分反応さ
せた後分光光度計（日立製作所製モデル200−20
型）を使用し吸光度を測定した。測定波長は
400nｍを用いた。測定値は感作ラテツクスに
PBSのみ0.5mlを加えたものの吸光度を基準にし、
各希釈液の吸光度との差を求めた。結果を第２図
に示す。第２図から明らかなように実施例１の試
料番号１〜３で得た重合体粒子を使用した感作ラ
テツクスはリウマチ因子陽性血清の希釈率によつ
て吸光度の差が大きく変化していることがわか
る。これに対して比較例１の試料番号４及び比較
例２の試料番号５並びに市販ラテツクス(1)及び(2)
を使用した感作ラテツクスはリウマチ因子陽性血
清の希釈率による吸光度の差が小さいことがわか
る。感作ラテツクスの経時変化前記の感作ラテツクスを調製後、４ケ月目及び
６ケ月目に再度上記と同様にしてリウマチ因子の
測定を行なつた。この結果、実施例１の試料番号
１〜３の重合体粒子を用いた感作ラテツクスは４
ケ月目、６ケ月目も第２図と同様の結果が得られ
た。比較例１の試料番号４の重合体粒子を用いた
感作ラテツクスは、４ケ月目の測定では第２図と
同様の結果が得られたが、６ケ月目の測定では第
２図とはやや異なつた結果になつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の重合体粒子において粒子表面
に存在するカルボン酸基の量の測定のため電導度
と硫酸滴定量との関係を示す。第２図は感作ラテ
ツクスとリウマチ因子陽性血清との反応系の吸光
度測定においてリウマチ因子陽性血清の希釈率と
吸光度の差との関係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中、R¹は水素原子又はメチル基であり、R²
は水素原子、メチル基又はハロゲン原子であり、
R³は水素原子、メチル基、カルボキシメチル基、
カルボキシル基、又はアルキル部分の炭素原子数
が１〜12個のアルコキシカルボニル基であり、
R⁴は水素原子又はカルボキシル基であり、R⁵は
水素原子、メチル基、ハロゲン原子であり、R⁶
はハロゲン原子、アルキル部分の炭素原子数が１
〜12個のアルコキシカルボニル基又はシアノ基で
ある）で表される単量体単位をそれぞれ36〜99.5重量
％、0.5〜４重量％及び０〜60重量％含むランダ
ム共重合体からなる重合体粒子であつて、その平
均粒子径が0.1〜2μｍであり、該重合体粒子の表
面に存在するカルボン酸基の量が0.01〜
0.08meq.／ｇ重合体粒子であることを特徴とする
重合体粒子からなる免疫血清学的検査試薬用担
体。