JPS63200065A - 抗原抗体反応測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮朶上生剋里光互 本発明は、抗原抗体反応測定方法に関し、詳しくは、ラ
テックス試薬を高濃度に用い得て、被検液中の抗体や抗
原を広い測定領域にて高精度にて定量することができる
抗原抗体反応測定方法に関する。

具】明りえ逝 近年、医療分野をはじめ、生化学、衛生学、免疫学等の
種々の分野において、微量物質、特に、抗原及び抗体を
定性的にのみならず、定量的に正確に測定する重要性が
著しく増しつつある。

このような抗原抗体反応測定方法の一つとして、ラテッ
クス免疫比濁法が知られている。この方法は、水不溶性
担体粒子に抗原又は抗体を支持させ、これに抗体、抗原
又はその混合物を含む被検液を反応させて、抗原抗体反
応によるラテックス凝集反応を起こさせ、可視光線、近
赤外光線、レーザー光線等の吸光度測定から、被検液中
の抗体や抗原量を定量する方法である。

従来、かかるラテックス免疫比濁法においては水不溶性
担体としては、平均粒子径０．０３〜１．６μｍのスチ
レン、メタクリル酸、メタクリル酸エステル等の単独重
合体又は共重合体からなる重合体粒子や、或いはシリカ
、アルミナ等の無機酸化物粒子が一般的に用いられてい
る。

しかし、このような担体粒子を用いる従来の方法によれ
ば、抗原又は抗体を支持させた担体を含むラテックス試
薬の光透過率が著しく低いために、ラテックス濃度を極
めて低くすることによって、はじめて吸光度を正確に測
定することが可能であり、また、担体粒子の凝集沈降が
生じやすいために、再現性や測定精度に劣る等の欠点が
ある。更には、被検液中の抗原又は抗体量が過剰である
場合は、所謂プロゾーン現象が生じるので、特別な装置
や検査方法を必要とし、或いは被検液中の抗体抗原量に
ついて測定可能領域が限られる等の欠点がある。

発■が解゛　しようとする間　々 本発明は、上記したような従来のラテックス免疫比濁法
における問題を解決するためになされたものであって、
ラテックス試薬を高濃度にて被検液と反応させることが
でき、しかも、この場合に何ら特別な装置や検査方法を
必要とせず、従って、被検液中の抗体や抗原量の幅広い
範囲において、高精度且つ再現性よくそれらを定量する
ことかできる抗原抗体反応測定方法を提供することを目
的とする。

１１　　寺を”′するための 本発明による抗原抗体反応測定方法は、（ａ）一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、Ｒ２は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ１
が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ低級
アルコキシ基であっでもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
び （ｂ）一般式 ％式％ （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は −（ＣＨｚ）、Ｓ−又は−（ＣＨｚ）　ＸＣＨ（ＣＩ□
）ｙ−ＯＲ’ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｚ＋ｙ−ｍ−１で
あり、Ｒ５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示し、ｎは
０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
ニル単量体との混合物であって、この混合物に基づいて
上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
１００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
なるカルボキシル基を有する水分散型高分子重合体粒子
からなる担体に抗体又は抗原を支持させたラテックス試
薬と、抗原、抗体又はその混合物を含む被検液とを混合
し、この混合液において、抗原抗体反応によるラテック
ス凝集反応を起こさせ、上記混合液の吸光度を測定する
抗原抗体反応測定方法において、上記重合体の屈折率を
Ｍｌとし、上記混合液の水性媒体の屈折率をＭ２とする
とき、Ｍ　＋　／　Ｍ　ｚにて規定される比屈折率Ｍが
１．０８〜１．１２の範囲にあり、且つ、平均粒子径が
０．０３〜１．３μｍの範囲にある担体を用いることを
特徴とする。

尚、本発明の方法において、抗原及び抗体には、補体を
も含むものとする。

本発明の方法において用いる水不溶性水分散型高分子重
合体粒子からなる担体は、その平均粒子径が０．０３〜
１．３μｍの範囲にある。０．０３．ｃｒｍよりも小さ
いときは、ラテックス凝集反応の光学的測定において、
ブランク吸光度は低く保つことはできるものの、感度が
低くなる。他方、１．３μｍよりも大きいときは、測定
において、再現性に劣ると共に、ブランク吸光度が大き
くなり、精度が低下し、更に、測定可能領域が極めて狭
くなる。

特に、被検液の抗原又は抗体の過剰領域としてプロゾー
ン現象が生じ、抗原抗体反応の測定のために特別な機器
や操作が必要となる。特に、本発明の方法においては、
担体は、その平均粒子径が０００３〜０．２μｍの範囲
にあることが好ましい。

更に、本発明の方法において用いる担体は、これを構成
する重合体の屈折率をＮ、とし、ラテックス試薬と被検
液とからなる混合物の水性媒体の屈折率をＭ２とすると
き、Ｍ＋／Ｌにて規定される比屈折率Ｍが１．０８〜１
．１２の範囲にあることが必要である。この比屈折率カ
月、１２を越えるときは、ラテックス試薬と被検液の混
合液の吸光度が高（なる結果、ブランク吸光度も高くな
って、測定精度が低下することとなる。他方、上記比屈
折率が１．０８よりも小さいときは、吸光度が小さくな
りすぎて、感度が悪くなる。即ち、凝集反応によって、
見掛は上の粒子径が太き（なっても、吸光度が増加が極
めて小さいからである。

ラテックス試薬と被検液の混合液の水性媒体は、通常、
生理食塩水であって、約０．９％の食塩を含む水溶液で
あるので、その屈折率は、通常、１．３３である。従っ
て、本発明においては、担体を構成する重合体の屈折率
は、１．４３〜１．５０の範囲にあることが好ましく、
特に、１．４３〜１．４９の範囲にあることが好ましい
。従って、前記した比屈折率は、１．０９〜１．１０の
範囲にあることが好ましい。

上記のような水不溶性担体を構成するための重合体粒子
としては、水分散型高分子重合体粒子であって、カルボ
キシル基を有することが好ましく、水性媒体中において
すぐれた分散安定性を有するためには、重合体粒子は、
その表面に０．５〜２０μｍｏｌ／ｍ”のカルボキシル
基を有することが好ましい。重合体粒子の有するカルボ
キシル基数が余りに少ないときは、ラテックス試薬が分
散性に劣り、自然凝集を起こすことがあるので、精度の
高い測定を行なうことが困難であり、他方、重合体粒子
の有するカルボキシル基数が余吟に多いときも、ラテッ
クス試薬が自然凝集することがあり、同様に、精度の高
い測定を行なうことが困難であるからである。

また、後述するように、担体に抗原又は抗体を共有結合
にて同定化して、ラテックス試薬とするときは、カルボ
キシル基に共有結合を形成させることができる。

重合体粒子上のカルボキシル基量は、後述するように、
乳化共重合における所定の単量体組成のうち、アクリル
酸誘導体の使用量によって任意に調整することができる
。

また、重合体粒子は、水性媒体中で安定に分散するよう
に、その比重が０．９〜１．５の範囲にあることが好ま
しい。

一般に、フッ素系単量体成分を含む重合体粒子に対して
は、抗原や抗体等の生理活性蛋白質は吸着し難く、従っ
て、得られる同定化粒子も活性が低いうえに、このよう
に、吸着された生理活性蛋白質は、特に、生理食塩水中
で粒子から脱着しやすく、また、保存中に感度が不安定
となり、ばらつきを生じることが多い。従って、本発明
においては、抗原又は抗体は、重合体粒子に共有結合に
て直接に、又はスペーサ基を介して共有結合にて固定化
されていることが好ましい。

このように、抗原又は抗体を重合体粒子からなる担体に
共有結合にて直接、又はスペーサ基を介して、固定化す
るには、例えば、担体に直接に共有結合にて抗原又は抗
体を結合させるには、例えば、千畑一部ばか著「実験と
応用アフイニテイ・クロマトグラフィーＪ　　（１９７
６年講談社発行）に記載されているように、担体の有す
るカルボキシル基と抗原又は抗体の有するアミノ基とを
水溶性のカルボジイミド試薬によって結合させればよい
。

また、スペーサ基を用いるときは、かかるスペーサ基と
しては、例えば、炭素数２〜８の炭素鎖を有するアミノ
カルボン酸やジアミン等が好ましく用いられるが、これ
らに限定されるものではない。

しかし、本発明においては、抗原又は抗体は、担体にイ
オン結合や物理吸着にて支持されていてもよい。

本発明においては、重合体粒子としては、以下に述べる
ように、特に、アクリル酸誘導体とアクリル酸フルオロ
アルキルエステル誘導体とを含む単量体混合物を乳化共
重合して得られる重合体粒子が用いられる。

かかる重合体粒子は、 （ａ）一般式 ％式％（ （但し、Ｒ１は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、Ｒ２は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ１
が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ低級
アルコキシ基であってもよい。）で表わされるアクリル
酸誘導体０．１〜２０重量％、及び （ｂ）一般式 ％式％ （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は −（ＣＨ，）、−又は−（ＣＨｚ）　−Ｃｔｌ　　（Ｃ
１ｌ□）ｙ−ＯＲ’ （但し、ｍはθ〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
あり、ＲＳは水素又はアセチル基を示す。：を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示し、ｎは
０〜１２の整数を示す。）で表わされるアクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体と、上記アクリル酸誘導体
を除くラジカル共重合性ビニル単量体との混合物であっ
て、この混合物に基づいて上記アクリル酸フルオロアル
キルエステル誘導体が１〜１００重量％である混合物９
９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
得ることができる。

上記アクリル酸誘導体としては、例えば、アクリル酸、
メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、
フマル酸、モノアルキルマレイン酸、モノアルキルフマ
ル酸、モノアルキルイタコン酸等を好ましい例として挙
げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリル酸
及びイタコン酸の１種又は２種以上の混合物が好ましく
用いられる。

また、上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、好ましくは、一般式 ％式％（１１ （但し、Ｒ３、Ｒ’、　ｍ及びｎは前記と同じである。

）で表わされ、従って、特に、好ましく用いることがで
きるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の具体
例として、例えば、 ＣＨｚ＝Ｃ（ＣＴｏ）ＣＯＯＣＨｚＣＦｓ　　　　　　
　　　　（５）ＣＨｚ＝Ｃ（ＣＩ３）ＣＯＯＣ）！ｇ（
ＣＦｚ）ｇＨ（６）Ｃ１ｌ□・Ｃ（Ｃ１ｈ）ＣＯＯＣＨ
ｔ（ＣＦｔ）　ｐＨ（７）ＣＨｚ＝（：（ＣＩ：＋）Ｃ
ＯＯ（Ｃｆｈ）　ｔ（ＣＦｚ）　ｓＦ　　　　　　　（
８）等を例示することができる。

前記アクリル酸誘導体は、乳化共重合時の重合安定性に
すぐれ、また、水性媒体中での分散安定性にすぐれる水
分散型高分子重合体粒子を得るためのみならず、得られ
る重合体粒子を前記したようにカルボジイミド等にて活
性化し、或いはスペーサ基を結合するためのカルボキシ
ル基を重合体粒子に付与するために必要な単量体であり
、単量体組成において、少なくとも０．１重量％を必要
とする。しかし、過多に共重合単量体成分として用いる
ときは、却って重合安定性と、得られる重合体粒子の分
散安定性を損なうので、２０重量％以下の範囲で用いら
れる。特に好ましい範囲は、０゜５〜１０重量％である
。

また、前記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、得られる重合体粒子の活性化時や、或いは活性化担
体粒子への抗原又は抗体の同定化時の水性分散系におい
て、粒子に水性媒体中で安定な分散性を保たしめる効果
を有する。このような効果を有効に得るためには、アク
リル酸フルオロアルキルエステル誘導体は、単量体組成
において９９．９〜８０重量％、好ましくは９９．５〜
９０重世％の範囲で用いられる。

しかも、かかる単量体成分の所定の割合の混合物を用い
ることにより、特に乳化剤を用いることなく、凝集物の
発生なしに安定に乳化共重合させ得て、粒径が均一であ
り、且つ、水性媒体中で分散状態が安定に保持されろ水
分散型高分子重合体粒子を得ることができる。

前記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の一部
は、前記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビニ
ル単量体に置換されてもよい。

かかるラジカル共重合性ビニル単量体としては、例えば
、それ自体の単独重合体が水不溶性である疎水性単量体
を挙げることができる、具体例として、エチレン、プロ
ピレン、塩化ビニル等のα−オレフィン又はそのハロゲ
ン置換体、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン
、ビニルトルエン、クロロスチレン等のアルケニルベン
ゼン、ブタジェン、イソプレン等の共役ジオレフィン、
（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸メチル
、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロ
ピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸
ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル等の（メタ）ア
クリル酸エステル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等
を挙げることができる。上記したラジカル共重合性ビニ
ル単量体のうちでは、特に、メタクリル酸メチルやメタ
クリル酸イソブチル等の（メタ）アクリル酸エステルが
好ましく用いられる。このような単量体は、得られる重
合体粒子の比重を調整し、又は前記したアクリル酸誘導
体とアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体との共
重合反応性を調整するために好適に用いられる。

また、必要に応じて、それ自体の単独重合体が水溶性又
は水膨潤性である親水性単量体も用いることができる。

かかる単量体の具体例として、例えば、ヒドロキシメチ
ル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）ア
クリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート
等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ
）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート等
を挙げることができる。

しかし、上記したラジカル共重合性ビニル単量体は、余
りに多量に使用すると、重合安定性を損じるのみならず
、得られる重合体粒子が水分散安定性に劣るようになる
ので、本発明においては、アクリル酸フルオロアルキル
エステル誘導体と上記ラジカル共重合性ビニル単量体と
の混合物において、アクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体を少なくとも１ｆｆｉ量％用いることが必要で
ある。

即ち、本発明においては、上記ラジカル共重合性ビニル
単量体は、このラジカル共重合性ビニル単量体とアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体との混合物の重量
に基づいて、９９重量％以下、好ましくは９７重量％以
下の範囲で用いられる。有効量の下限は特に制限されず
、目的に応じて適宜に選ばれるが、通常、アクリル酸フ
ルオロアルキルエステル誘導体とこのアクリル酸アルキ
ルエステル誘導体の混合物の重量に基づいて１重量％以
上である。

更に、重合体粒子の製造において、単量体成分として、
内部架橋用官能性単量体を用いることができる。この内
部架橋用多官能性単量体は、重合体に架橋構造を導入す
るので、存在する場合には好ましくない水溶性重合体の
生成を抑制すると共に、得られる重合体粒子のガラス転
移温度を高めることができる。更に、内部架橋剤は、重
合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中での
分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１，３
−ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレン
グリコールジアクリレート、トリメチロールプロパント
リメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等
が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、
　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部
架橋用単量体として用いることができる。

内部架橋用多官能性単量体は、必要な場合は、通常、単
量体組成において、０．１重量％以上が用いられるが、
しかし、過多に使用するときは、却って重合安定性と得
られる重合体粒子の水性媒体中での分散安定性を損なう
ので好ましくなく、通常、２０重量％以下の範囲で用い
られる。好ましくは０．２〜１０重景％重量囲である。

また、個々の単量体の具体的な種類は、得られる共重合
体のガラス転移点が０℃以上、好ましくは室温以上とな
るように選ばれる。重合体粒子のガラス転移点が０℃よ
りも低いときは、重合体粒子の相互の融着や凝集が生じ
やす（、分散液の分散安定性が低下する傾向があるから
である。

以上のような各単量体を水性媒体中にて、水溶性のラジ
カル重合開始剤を用いて、通常の方法にて乳化共重合さ
せることにより、水不溶性共重合体からなる水性分散液
、即ち、カルボキシル化ラテックスを得ることができる
が、得られるラテックス中に乳化剤が遊離の状態で、或
いは重合体粒子に吸着された状態にて存在するとき、前
述したように、特に、その使用に際して種々のを害な影
響が現れることがあるので、乳化共重合に際しては乳化
剤を用いないのが好ましい。前記単量体組成によれば、
乳化剤を要せずして安定に共重合させることができると
共に、得られるラテックス粒子の分散状態が安定に保持
される。しかし、重合体粒子の凝集や沈降が起こらず、
更には、ラテックス凝集反応を阻害しない範囲において
、乳化剤を用いることは何ら妨げられず、また、乳化剤
が有害な影響を与えない場合には、必要に応じて、乳化
剤を用いてもよい。

上記のような乳化共重合において、単量体成分混合物の
水性媒体中での濃度は、得られるラテックスにおける重
合体粒子の平均粒径とも関連するが、通常、１〜４０重
景％重量囲である。

重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、これら過硫酸塩とチ
オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸水素ナ
トリウム等のような千オ硫酸塩、又は亜硫酸ナトリウム
、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム等のような亜
硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が好ましく用いられ
るが、これらに限定されるものではない。これら重合開
始剤の使用量は、単量体混合物に対して０．０１〜１重
量％の範囲が好適である。重合の雰囲気も、特に制限さ
れないが、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が
用いられる。また、重合温度は、特に制限されないが、
通常、２０〜１００℃、好ましくは４０〜９０℃の範囲
である。

本発明の方法においては、抗原又は抗体を支持させた担
体のための分散媒体として、リン酸緩衝液又はホウＭ緩
衝液が好ましく用いられ、担体は、かかる水性媒体中に
適宜の濃度で分散せしめられ、ラテックス試薬とされる
。その固形分濃度は、本発明の方法においては、通常、
０．１〜５重量％の範囲が好適である。かかるラテック
ス試薬と被検液とを混合し、攪拌した後、静置すること
によって、抗原抗体反応によるラテックス凝集反応を起
こさせ、混合液の吸光度を比濁法にて測定して、被検液
中の抗体や抗原量を定量する。

本発明の方法においては、ラテックス試薬と被検液との
混合に際して、必要に応じて、緩衝液を更に加えて、ラ
テックス濃度を希釈してもよいが、最終的に吸光度測定
を行なう混合液においては、ラテックス粒子の濃度は、
０，０１〜０．２重量％の範囲とすることが好ましい。

ラテックス粒子の濃度が余りに高いときは、混合液の吸
光度を測定することが回連であり、反対に余りに低いと
きは、凝集反応が不十分となるからである。

ラテックス凝集反応は、通常、２０〜３７℃の温度にて
、１〜１５分間行なわれる。反応温度が余りに高いとき
や、余りに低いときは、抗原抗体反応が不安定となり、
高精度の測定が困難となり、また、反応時間が余りに短
いときは、凝集反応が不十分にしか起こらないからであ
る。反応時間を余りに長くすることは、測定の精度上は
何ら問題がないが、短時間の測定を目的とする点から不
利である。

ラテックス凝集反応液の吸光度は、４００〜９００ｎｍ
の範囲の適当な波長を用いて行なわれる。

測定方法としては、既に、エンドポイントアッセイ、レ
ートアッセイ等の方法が知られているが、本発明の方法
においては、いずれの方法をも採用することができる。

よく知られているように、検量線を予め作成しておけば
、いずれの方法よっても、吸光度測定から検波液中の抗
体又は抗原の濃度を直ちに計算にて得ることができる。

光所傅泣果 本発明の方法によれば、抗原又は抗体を支持させろ水不
溶性担体として、ラテックス凝集反応を起こさせる混合
液の水性媒体に対して所定の比屈折率を有する水不溶性
の水分散型高分子重合体粒子を用いるので、ブランク吸
光度が低く、そのために、ラテックス試薬を高濃度に用
いることができ、しかも、特別な操作や装置を必要とし
ないので、幅広い濃度範囲にわたる被検液について、そ
の抗体や抗原量を高精度にて、且つ、再現性よく定量す
ることができる。

特に、本発明の方法によれば、高濃度の被検液を用いる
場合でも、所謂プロゾーン現象が起こり難いので、例え
ば、レートアッセイにおいて、時間（Ｔ）に対する吸光
度（ΔＡ）の変化ΔＡ／Ｔの測定時に広い濃度範囲で直
線性を得ることができ、従って、広い濃度範囲の被検液
について、精度高く、且つ、再現性よ（、被検液中の抗
体又は抗原を定量することができる。

更に、本発明の方法によれば、水不溶性担体として、前
述したようなアクリル酸誘導体とアクリル酸フルオロア
ルキルエステル誘導体とからなる共重合体粒子を用いる
とき、得られる担体がその粒径分布において狭く、均一
であり、且つ、水性媒体中での分散安定性に著しくすぐ
れるので、高収率に安定して抗原又は抗体を支持させる
ことができ、勿論、このようにして得られるラテックス
試薬を用いる本発明の方法によれば、被検液中の抗体や
抗原量を高精度にて定量することができる。

更に、本発明に従って、担体粒子に抗原や抗体を直接に
、又はスペーサ基を介して、共有結合にて固定化するこ
とによって、フッ素系単量体成分を含む共重合体粒子に
多量の抗原や抗体を固定化することができ、従って、こ
のようにして得られるラテックス試薬は、高感度を有す
るのみならず、保存安定性にすぐれるものである。

大施炭 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例によって何ら制限されるものではない。

実施例１ （ａｌ　　カルボキシル化ラテックスの調製アクリル酸
６ｇと２．２．２−　）リフルオロエチルメタクリレー
ト１２０ｇとを蒸留水３６８ｇに加え、２５０　ｒｐｍ
にて撹拌し、反応容器内を窒素置換し、７０℃に昇温し
た。これに過硫酸アンモニウム０゜６３ｇを蒸留水１０
ｇに溶解させた水溶液を加え、撹拌下に８時間重合させ
て、カルボキシル化ラテックスを得た。アルカリ、酸及
び蒸留水の順序にて遠心洗浄による精製を行なった後、
蒸留水に５重量％となるように再分散させて、カルボキ
シル基を有する共重合体粒子からなる水分散液、即ち、
カルボキシル化ラテックスを得た。

上記共重合体の屈折率は１．４８３である。尚、２．２
．２−トリフルオロエチルメタクリレートのみからなる
重合体の屈折率は１．４１３である。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合上で得たカ
ルボキシル化ラテックス１００ｍ１とε−アミノカプロ
ン酸水溶液（０，０２ｍｏｌ／１　）　　１００ｍ１と
を混合し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７，２
に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩をホウ酸緩衝液（ｐＨ７
，２，０，ＯＩＭ）に溶解させた水溶液（２５■／ｍｌ
）　２０ｍｌを上記ラテックスに加え、室温で３時間、
攪拌下に反応させた。−夜、冷蔵庫に放置した後、ホウ
酸緩衝液（ｐ）＋７．２．０．０１Ｍ）にて３回遠心洗
浄して、スペーサ基の結合された重合体粒子を得、これ
を同じ緩衝液に固形分濃度５重量％となるように再分散
させた。

（Ｃ）　　抗体の固定化 上で得たスペーサ基を有する重合体粒子を含むラテック
ス５＋ｎｌ、ホウ酸緩衝液（ｐＨ７，５，０，１Ｍ）２
ｍｌ及び蒸留水１１ｍ１を混合し、これに１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩水溶液（２■／ｍｌ）　　２ｍｌを加え、１０分後
にウサギＩｇＧ＊溶液（５ｍｇ／ｍｌ）　、５　ｍｌを
添加し、１０℃で２時間反応させた。次に、反応混合物
中の過剰の上記カルボジイミドを消費させるために、１
００重量アルギニン水溶液（ｐＨ７，５）５ｍｌを加え
、１時間インキュベートした。次いで、ホウ酸緩衝液（
ｐＨ８，２，０，ＯＩＭ）にて遠心洗浄を３回行なった
後、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８’、２、ｏ、。

ＩＭ）に再分散させて、全量５ｍｌに調整し、かくして
、ウサギＩｇＧを前記スペーサ基を介して共有結合にて
固定化した水分散型高分子重合体粒子のラテックスを得
た。固定化量は重合体粒子１ｇ当たり約３０■であった
。

尚、このラテックスは、４〜２０℃の温度にて保存した
ところ、少なくとも１２か月間は安定であった。

（ｄ）　　ラテックス試薬の調製及び測定上記ラテック
ス０．１ｍｌにホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０。

０、ＯＩＭ、食塩１．（ｌｆｆｉ％を含む。）０．９ｍ
ｌを加え、ラテックス試薬（固形分濃度０．５重量％）
を調製した。

抗ウサギＩｇ　（ヤギ）抗体の濃度を種々に変えたホウ
酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，ＯＩＭ）溶液を被検液とし
、その３ｍｌと上記ラテックス試薬１ｍｌとをセル長さ
１０ｍｍの吸光度測定用セルに充填し、３０秒間撹拌し
、５分間静置した後、６００　ｎｍにおける吸光度を測
定した。結果を第１図に示す。

尚、ラテックス試薬と被検液との混合液の水性媒体の比
屈折率は１．０９８であった。

本発明の方法によれば、高濃度を含む抗つサギＩｇＧ抗
体（ヤギ）の広い濃度範囲について、吸光度との間に直
線性を得ることができることが明らかである。

比較例１ 水不溶性担体粒子として平均粒子径０．３３μｍのポリ
スチレン粒子を用い、実施例１と同様にして、これにε
−アミノカプロン酸をスペーサ基として結合させた後、
これにウサギ抗１ｇＧを固定化させた。固定化量は、粒
子１ｇ当たり３６．２■であった。これを固形分濃度０
．０３３重量％に調整し、ラテックス試薬とし、実施例
１と同様にして、種々の濃度の抗ウサギＩｇ　（ヤギ）
抗体溶液を被検液として、吸光度を測定した。結果を第
１図に示す。

ラテックス試薬と被検液との混合液の水性媒体の比屈折
率は１．２０３であった。

本比較例においては、ブランク吸光度を実施例１と同じ
水準にするために、ラテックス試薬濃度を上記のように
著しく低くすることが必要であった。また、プロゾーン
現象が生じるために、抗つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）の濃
度は、その低い限られた濃度範囲においてのみ、吸光度
との間に直線性を得ることができる。

比較例２ 水不溶性担体粒子として平均粒子径０．３２μｍのアク
リル酸−メチルメタクリル酸共重合体粒子を用い、これ
に実施例１と同じ方法にてスペーサ基を結合させた後、
実施例１と同じ方法にてウサギ抗１ｇを固定化させた。

固定化量は、粒子１ｇ当たり３３．０■であった。これ
を固形分濃度０．１重量％に調整し、ラテックス試薬と
した。

実施例１と同様にして、種々の濃度の抗ウサギｒｇ　（
ヤギ）抗体溶液を被検液として、吸光度を測定した。結
果を第１図に示す。

ラテックス試薬と被検液との混合液の水性媒体の比屈折
率は１．１２５であった。

本比較例の場合も、プロゾーン現象が生じるために、抗
つサギＩｇＧ抗体（ヤギ）の濃度は、その低い限られた
濃度範囲においてのみ、吸光度との間に直線性を得るこ
とができる。

実施例２ 実施例１（Ｃ）において得たウサギ抗ＩｇＧを固定化し
たラテックスを希釈してラテックス試薬とするに際して
、ホウ酸緩衝液にて１％に調整したラテックス１ｎ＋１
に希釈溶剤として塩酸にてｐＨ８，０に調整した２０重
量％ジェタノールアミン１ｍｌを用い、ラテックス試薬
（固形分濃度０．５重量％）を調製した。

実施例１と同様にして、抗ウサギＩｇ　（ヤギ）抗体の
濃度を種々に変えたホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０，０，０
１Ｍ）溶液を被検液とし、その３ｍｌと上記ラテックス
試薬Ｉｎ＋１とをセル長さ１０ｍｍの吸光度測定用セル
に充填し、３０秒間攪拌し、５分間静置した後、６００
ｎｍにおける吸光度を測定した。

結果を第２図に示す。

尚、ラテックス試薬と被検液との混合液の水性媒体の比
屈折率は１．１１２であった。

本発明の方法によれば、高濃度を含む抗つサギｉｇｃ抗
体（ヤギ）の広い濃度範囲について、吸光度との間に直
線性を得ることができることが明らかである。

比較例３ 実施例１（ａ）におけるカルボキシル化ラテックスの製
造において、アクリル酸６ｇに代えて、２，２゜２−ト
リフルオロエチルメタクリレート６ｇを用いた以外は、
実施例１と全く同様にして、屈折率１゜４１３の共重合
体の粒子の水分散液を得た。

次に、実施例１　（Ｃ１の抗体の固定化において、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミドを用いない以外は、同様にして、上記共重合体粒
子にウサギＩｇＧを吸着させた。ウサギＩｇＧの吸着量
は、粒子１ｇ当り約５■であった。この後、このウサギ
ＩｇＧを吸着させた重合体粒子を用いて、実施例１（ｄ
）と同様にして、ラテックス試薬を調製した。

このラテックス試薬は、感度が実施例１で得た試薬の約
１／３０であり、希釈率１の場合のみ、感度（活性値）
を得ることができた。また、このラテックス試薬を４０
℃の温度にて１か月間保存した後、実施例１と同じ試験
を行なったところ、希釈率１倍のときとブランク値とが
ほぼ同じとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の方法及び比較例としての方法におい
て、ウサギ■ｇＧを固定化させたラテックス試薬と抗つ
サギＩｇＧ抗体（ヤギ）を含む被検液との混合液におい
て、後者の濃度と６００ｎｍにおける吸光度との関係を
示すグラフ、第２図は、本発明の方法の別の実施例によ
る結果を示し、ラテックス試薬と被検液との混合液の水
性媒体の比屈折率が第１図の場合と異なる異なる場合を
示す。 ６００７ｔ、？υ疋光麦 ０θ？Ｌ？＞’Ｌν反老度

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であってもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
   び （ｂ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は −（ＣＨ＿２）＿ｍ−又は−（ＣＨ＿２）＿ｘ−ＣＨ−
   （ＣＨ＿２）＿ｙ−（但し、ｍは０〜１２の整数を示し
   、ｘ＋ｙ＝ｍ−１であり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基
   を示す。）を示し、Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又
   はＣＦ＿３を示し、ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
   ニル単量体との混合物であって、この混合物に基づいて
   上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
   １００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
   なるカルボキシル基を有する水分散型高分子重合体粒子
   からなる担体に抗体又は抗原を支持させたラテックス試
   薬と、抗原、抗体又はその混合物を含む被検液とを混合
   し、この混合液において、抗原抗体反応によるラテック
   ス凝集反応を起こさせ、上記混合液の吸光度を測定する
   抗原抗体反応測定方法において、上記重合体の屈折率を
   Ｍ＿１とし、上記混合液の水性媒体の屈折率をＭ＿２と
   するとき、Ｍ＿１／Ｍ＿２にて規定される比屈折率Ｍが
   １．０８〜１．１２の範囲にあり、且つ、平均粒子径が
   ０．０３〜１．３μｍの範囲にある担体を用いることを
   特徴とする抗原抗体反応測定方法。
2. （２）重合体の屈折率が１．４３〜１．５０の範囲にあ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗原抗
   体反応測定方法。
3. （３）重合体粒子が０．５〜２０μモル／ｍ＾２のカル
   ボキシル基を有することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の抗原抗体反応測定方法。
4. （４）抗原又は抗体が共有結合にて担体粒子に結合され
   ていることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の抗
   原抗体反応測定方法。