JPS6291183A - 固定化生理活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は固定化生理活性物質に関する。

（従来の技術） 固定化生理活性物質は、その生物学的反応を利用して種
々利用されている。その代表例として、酵素を水不溶性
の担体に固定化させてなる固定化酵素や、免疫活性物質
を固定化させてなる免疫学的診断試薬が知られており、
前者は近年、工業的な酵素反応に実用され、また後者は
従来より種々の診断に広く実用されている。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部工業的に
も実施されているが、従来は酵素を基質の水溶液に溶解
させて、この水溶液中で反応を行なわせている。しかし
、このような方法によれば、反応条件を一定に維持しつ
つ、新鮮な酵素を補給したり、また、反応後に酵素を失
活させることなく、生成物と酵素を分離することが非常
に困難であり、酵素が不経済に消費される。そのうえ、
反応が回分式であるから生産性に劣る。前記した固定化
酵素はかかる問題を解決するために実用化されたもので
あり、この固定化酵素に基質を反応させることによって
、酵素反応が行なわれる。

このような固定化酵素の製造方法として、代表的には、
水不溶性の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理
吸着によって結合させる担体結合法が知られている。し
かし、従来、用いられている担体は、通常、セルロース
、デキストラン、アガロース等の多糖類の誘五体、ポリ
アクリルアミドゲル、多孔性ガラス等の径１真■乃至故
■の粒子であり、このような粒子に酵素が固定化された
固定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定されて、
基質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場合、固
定化酵素表面に拡散し難く、反応に昼時間を要すると共
に、反応収率が低いという問題がある。

そこで、担体として水分散型高分子重合体粒子を用いる
ことも提案されている。例えば、従来の代表的な水分散
型高分子重合体粒子は、乳化剤及び水溶性ラジカル重合
開始剤の存在下に、例えばスチレンのような水難溶性ラ
ジカル重合性単量体を乳化重合させて製造されている。

ここに、上記乳化剤は、一般に、乳化重合時における重
合安定性を確保すると共に、粒径が小さく、分散安定性
のよい重合体粒子を得るのに効果がある。乳化剤がこの
ようにして得られる重合体粒子の分散安定性を高める作
用については、必ずしも明らかではないが、一般には、
乳化剤の一部が重合体粒子に吸着されており、残余は媒
体中に遊離の状態で存在し、このように水分散型高分子
重合体粒子の水分散液中において、これら重合体粒子に
吸着された乳化剤と遊離の乳化剤との間に吸着脱着平衡
が存在し、かかる平衡の結果として、重合体粒子の分散
安定化が達成されるとされている。従って、このように
乳化剤を含む水分散型高分子重合体粒子の水分散液は、
この重合体粒子に酵素等の生理活性物質を固定化するた
めに、これを緩衝液や生理食塩水中に分散させたとき、
乳化剤の前記したような吸着脱着平衡ｉがくずれる結果
、重合体粒子の分散安定性が損なわれて、重合体粒子が
凝集、沈降し、粒子の自由度が奪われ、生物学的反応性
が低下する。また、遊離の乳化剤は、酵素反応等の生物
学的反応の妨害物質となることが多い。更に、前記した
ような水難溶性単量体であるスチレンの乳化共重合によ
るポリスチレン重合体粒子は、重合体粒子が疎水性であ
るために、これを有機質の溶質を含有する緩衝液や生理
食塩水に分散させた場合に、容易に凝集を生しる。

また、水溶性ラジカル重合開始剤を用いてメタクリル酸
エステルを親水性のメタクリル酸、２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレート及び内部架橋用多官能性単量体と共に
、乳化剤の存在下に乳化共重合させて、重合体水性分散
液を得る方法も既に知られているが（Ｐｏｌｙｍｅｒ、
シｏ１．１９．八ｕｇｕｓ　ｔ＋　８６７−８７１　（
１９７８））、この方法により得られる分散液も乳化剤
を含有するために、上記と同様の問題を有する。更に、
粒子が含水性又は膨潤性であるので、分散液の緩衝剤濃
度によっては、粒子が凝集したり、或いは固定化された
生理活性物質の生物学的活性が不安定である等の問題も
生しる。

他方、前記した免疫学的診断試薬は、血液、尿その他の
体液中の生理活性物質が有する免疫活性を利用する免疫
学的診断のために用いられる試薬であって、かかる免疫
学的診断方法には、例えば、免疫学的な反応を起こす抗
原又は抗体のいずれか一方、又は両者を組合せて体液等
の被検液と反応させ、抗原又は抗体と、これらに対応す
る抗体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原抗体
反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によって、上記
のような免疫活性成分の存在を測定する方法等がある。

この場合、肉眼や光学的方法による測定を容易にするた
めに、一般に、抗原又は抗体は水不溶性の微粒子状の担
体、例えば、ラテックス、赤血球等に担持されて診断試
薬とされ、このような粒子の凝集反応を利用して、血清
等の体液中の被検成分が測定される。

このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質が微量に
でも被検液中に存在すれば、これを検出し得る高い感度
と、目的とする免疫活性物質とのみ反応する高い特異性
を有することが要求される。

更に、長期間の保存によっても、高い検出感度及び特異
性を保持することが要求される。

このような免疫学的診断試薬としては、従来、ポリスチ
レンラテックス粒子表面に生理活性物質を物理吸着によ
り固定化してなる診断試薬や、カルボキシル化ラテック
ス粒子にカルボジイミド、ジアルデヒド等を用いて共有
結合により固定化してなる診断試薬等が提案されている
。しかし、従来のかかる診断試薬は、いずれも、体液と
反応させたとき、対応する陽性物質のみならず、陰性物
質に対しても凝集反応を起こすことがある。このような
＆Ｅｉ！反応は非特異的凝集反応と呼ばれており、しば
しば診断を誤まらせるこきがある。

以上のように、酵素や免疫活性物質等の生理活性物質を
水不溶性の担体に固定化してなる固定化生理活性物質に
ついては、従来より種々の問題が指摘されており、また
、一層改善された特性が要求されている。

そこで、本発明者らは、かかる問題を解決し、また、要
望に応えるべく、水不溶性担体に関して鋭意研究し、例
えば、固定化酵素については、既に、特開昭５９−４５
８８３号公報？特開昭５９−４５８８６号公報等に記載
されているように、所定の単量体混合物を水性媒体中で
乳化共重合させて得られる水分散型高分子重合体粒子を
担体として用いることを提案している。

本発明者らは、かかる水分散型高分子重合体粒子を担体
とする固定化酵素について、更に研究を重ねた結果、水
分散型高分子重合体粒子を形成するための単量体成分と
して、アクリル酸誘環体とアクリル酸フルオロアルキル
エステル誘導体とを用いることによって、先ず、水分散
型高分子重合体粒子の製造においては、乳化剤を用いず
とも、乳化重合時の重合安定性にすくれ、また、得られ
る重合体粒子がその粒径分布において狭く、均一であり
、且つ、水性媒体中で安定な分散状態を保持する水分散
型高分子重合体粒子を得ることができ、従って、固定化
生理活性物質の製造においては、安定に、且つ、高い活
性収率にて酵素を固定化することができ、更に、このよ
うにして得られる固定化生理活性物質においては、その
酵素活性が一層長期間にわたって高く保持されることを
見出して、本発明に至ったものである。

（発明の目的） 従って、本発明は、固定化生理活性物質のための水不溶
性担体として水分散型高分子重合体粒子を用いるために
、一般に、反応系において遊離の酵素と同様に自由に移
動でき、従って、固定化酵素表面への基質の拡散が殆ど
問題にならない高活性及び高怒度を存するのみならず、
その製造に際しては、高い活性収率にて安定に酵素を固
定化することができ、且つ、このようにして得られる固
定化生理活性物質は、その酵素活性が長期間にわたって
高く保持される固定化生理活性物質を提供することを特
徴とする 特に、本発明は、有機物質や無機塩を含む反応系中にお
いても、その表面が反応系中の有害物質によって汚染さ
れず、又は被覆されないために、酵素活性が低下せず、
また、反応系において重合体粒子相互の凝集が起こらな
いために、見掛けの活性も低下しない固定化生理活性物
質を提供することを目的とする。

従って、本発明は、粒子が有害物質によって吸着されず
、又は吸着されることが少ないので、固定化された酵素
が構造変性を生じず、このようにして高活性を保持する
と共に、保存安定性にもすぐれる固定化生理活性物質を
提供することを目的とする。

（発明の構成） 本発明による固定化生理活性物質は、 （ａｌ一般式 ％式％ （但し、及び（ｂ）一般式ＣＨ２＝ＣＲ３ＣＯＯＲ４（
ＣＦ２）ｎＣＦＡ２（但し、Ｒ３は水素又は低級アルキ
ル基を示し、Ｒ４は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカ
ルボ低級アルコキシ基であってもよい。） で表わされるアクリル酸誘専体０．１〜２０重量％、及
び （ｂｌ一般式 ％式％ （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ−ｍ−１で
あり、Ｒ５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示す。また
、ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
ニル単量体との混合物であって、この混合物に基づいて
上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
１００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
なる水分散型高分子重合体粒子に共存結合を介して酵素
が固定化されていることを特徴とする。

本発明において用いるアクリル酸誘導体は、一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、好ましくは水素又はメチル基、Ｒ２は水素又
は低級アルキル基を示し、好ましくは水素又はメチル基
を示し、Ｒ４は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ
低級アルコキシ基であってもよい。） で表わされ、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタ
コン酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸、モノアル
キルマレイン酸、モノアルキルフマル酸、モノアルキル
イタコン酸等を好ましい例として挙げることができるが
、特に、アクリル酸、メタクリル酸及びイタコン酸の１
種又は２種以上の混合物が好ましく用いられる。

本発明において用いるアクリル酸フルオロアルキルエス
テル誘導体は、一般式 ％式％ （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基、好ましくは水
素又はメチル基を示し、Ｒ４は −（Ｃ１１２）ｌＮ−又は−（ＣＩｌ２）　、　−Ｃ１
１−（Ｃ１ｌ□）ｙ−Ｒ５ （但し、ｍはＯ〜１２の整数を示し、ｘ十ｙ＝ｍ−１で
あり、Ｒ５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦＩを示し、ｎは
０〜１２の整数を示す。）で表わされ、好ましくは、一
般式 ％式％（１） （但し、Ｒ３、Ｒ５、ｍ及びｎは前記と同じである。） で表わされ、従って、特に、本発明において好ましく用
いることができるアクリル酸フルオロアルキルエステル
誘導体の具体例としで、例えば、Ｃ１１２・Ｃ（ＣＩｌ
：１）ＣＯＯＣＨ２ＣＦ３　　　　　　　　　　（５１
Ｃ１１ｚ＝Ｃ（Ｃ１ｈ）ＣＯＯＣＩＩ□（ＣＦ、）２＋
１　　　　　　　　（６）Ｃ１（２・Ｃ（ＣＩｌ３）Ｃ
ＯＯＣＩＩ□（ＣＦ２）、１１　　　　　　　　Ｃ７）
ＣＩ＋□＝Ｃ（Ｃ１１：１）Ｃｏｏ（Ｃ１＋２）　２　
（ＣＦ２）　ｅＦ　　　　　　　　（８１等を例示する
ことができる。

本発明によれば、前記アクリル酸エステル誘導体は、乳
化共重合時の重合安定性にすくれ、また、水性媒体中で
の分散安定性にすぐれる水分散型高分子重合体粒子を得
るためのみならず、得られる重合体粒子に酵素を共有結
合にて結合し、固定化するためのカルボキシル基を付与
するために必要なｉ−ｉ体であり、本発明においては、
４ｉｔ体組成において、少なくとも０．１重量％を必要
とする。

しかし、過多に共重合単量体成分として用いるときは、
却って重合安定性と、得られる分散液の安定性を損なう
ので、２０重景％以下の範囲で用いる。特に好ましい範
囲は、０．５〜１０重量％である。

また、前記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、得られる水分散型高分子重合体粒子への酵素の固定
化時や所要の反応系において、重合体粒子が水性媒体中
で安定な分散性を保つ効果を有する。特に、重合体粒子
において、アクリル酸フルオロアルキルエステルＭＡ　
Ｒ体重計体成分は、塩や有機質物質を含む水溶液中にお
いて、例えば、正合体粒子への有害物質の吸着や被覆を
防止して、酵素活性を長期間にわたって高く保持する効
果を有するので、繰り返しての酵素反応においても高い
活性を保持させることができる。このような効果を有効
に得るためには、本発明においては、アクリル酸フルオ
ロアルキルエステル誘導体は、≠量体組成において９９
．９〜８０重量％、好ましくは９９．５〜９０重量％の
範囲で用いられる。

しかも、本発明によれば、かかる単量体成分の所定の割
合の混合物を用いることにより、特に乳化剤を用いるこ
となく、凝集物の発生なしに安定に乳化共重合させ得て
、粒径が均一であり、且つ、水性媒体中で分散状態が安
定に保持される水分散型高分子重合体粒子を得ることが
できる。

本発明においては、前記アクリル酸フルオロアルキルエ
ステル誘導体の一部を前記アクリル酸誘導体を除くラジ
カル共重合性ビニル単量体に代えることができる。

かかるラジカル共重合性ビニル単量体としては、例えば
、それ自体の単独重合体が水不溶性である疎水性単量体
を挙げることができる、具体例として、エチレン、プロ
ピレン、塩化ビニル等のα−オレフィン又はそのハロゲ
ン置換体、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン
、ビニルトルエン、クロロスチレン等のアルゲニルヘン
ゼン、ブタジェン、イソプレン等の共役ジオレフィン、
（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸メチル
、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロ
ピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸
ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル等の（メタ）ア
クリル酸エステル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等
を挙げることができる。上記したラジカル共重合性ビニ
ル単量体のうちでは、特に、メタクリル酸メチルやメタ
クリル酸イソブチル等の（メタ）アクリル酸エステルが
好ましく用いられる。このような単量体は、得られる水
分散型高分子重合体粒子の比重を調整し・又は前記した
アクリル酸エステル誘４体とアクリル酸フルオロアルキ
ルエステルａＸ　導体上の共重合反応性を調整するため
に好適に用いられる。

また、それ自体の単独重合体が水溶性又は水膨１■性で
ある親水性単量体も用いることができ、かかる単量体の
具体例として、例えば、ヒドロキシメチル（メタ）アク
リレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒ
ドロキシプロピル（メタ）アクリレート等のヒドロキシ
アルキル（メタ）アクリレート、　（′メタ）アクリル
アミド、グリシジル（メタ）アクリレート等を挙げるこ
とができる。このような親水性単量体は、特に、得られ
る重合体粒子に水酸基やエポキシ基等の官能基を有せし
めるために有効であり、上記疎水性単量体と併用するの
が好ましい。かかる官能基も、必要に応じて、水分散型
高分子重合体粒子に生理活性物質やスペーサ基を共有結
合にて結合するために用いられる。

しかし、上記したラジカル共重合性ビニル単量体は、余
りに多量に使用すると、重合安定性を撰しるのみならず
、得られる重合体粒子が水分散安定性に劣るようになる
ので、本発明においては、アクリル酸フルオロアルキル
エステル３Ｆ４　五体と上記ラジカル共重合性ビニル単
量体との混合物において、アクリル酸フルオロアルキル
エステルＢＦ　Ｆ体を少なくとも１重量％用いることが
必要である。

即ち、本発明においては、上記ラジカル共重合性ビニル
単量体は、このラジカル共重合性ビニル単量体とアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体との混合物の重量
に基づいて、９９重量％以下、好ましくは９７重量％以
下の範囲で用いられる。有効量の下限は特に制限されず
、目的に応じて適宜に選ばれるが、通常、アクリル酸フ
ルオロアルキルエステルｊＡ　’Ｉ一体とこのアクリル
酸アルキルエステル誘導体の混合物の重量に基づいて１
重量％以上である。

本発明においては、単量体成分として、内部架橋用官能
性単量体を用いることができる。この内部架橋用多官能
性車量体は、重合体に架橋構造を導入するので、存在す
る場合には好ましくない水溶性重合体の生成を抑制する
と共に、得られる重合体粒子のガラス転移温度を高める
ことができる。

更に、内部架橋剤は、水分散型高分子重合体粒子を非膨
潤化して、重合体粒子の水性媒体中での分＋ｌＪ１安定
性を高め名のに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１，３
−ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレン
グリコールジアクリレート、トリメチロールプロパント
リメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等
が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、
　Ｎ’−メチレンヒスアクリルアミド等も多官能性内部
架橋用ｊｉｉｆｉｔ体として用いることができる。

内部架橋用多官能性単量体は、必要な場合は、通常、単
量体組成において、０．１重量％以上が用いられるが、
しかし、過多に使用するときは、却って重合安定性と分
散液の安定性を損なうので好ましくなく、通常、２０重
量％以下の範囲で用いられる。好ましくは０．２〜１０
重量％の範囲である。

更に、得られる水分散型高分子重合体粒子の用途にもよ
るが、個々の単量体の具体的な種類は、得られる共重合
体のガラス転移点が０℃以上、好ましくは室温以上とな
るように選ばれる。重合体粒子のガラス転移点が０℃よ
りも低いときは、重合体粒子の相互の融着や凝集が生じ
やすく、分散液の分散安定性が低下する傾向があるから
である。

本発明においては、以上のような各単量体を水性媒体中
にて、水溶性のラジカル重合開始剤を用いて、通常の方
法にて乳化共重合させることにより、水不溶性共重合体
重合体水性分散液を得ることができるが、得られる水性
分散液中に乳化剤が遊離の状態で、或いは重合体粒子に
吸着された状態にて存在するとき、前述したように、特
に、その使用に際して種々の有害な影響が現れることが
あるので、乳化共重合に際しては乳化剤を用いないのが
好ましい。本発明による前記単量体組成によれば、乳化
剤を要せずして安定に共重合させることができると共に
、得られる重合体粒子の水分散液の分散状態が安定に保
持されるのが大きい特徴をなす。しかし、前述したよう
に、重合体粒子を緩衝液や生理食塩水に分散させた場合
にも、重合体粒子の凝集や沈降が起こらず、更には、固
定化された生理活性物質の生物学的反応が妨害されない
範囲において、乳化剤を用いることは何ら妨げられず、
また、用途によって乳化剤が有害な影響を与えないとき
は、必要に応じて、乳化剤を用いてもよい。

また、本発明による乳化共重合において、単量体成分混
合物の水性媒体中での濃度は、得られる分散液における
重合体粒子の平均粒径とも関連するが、通常、１〜４０
重量％の範囲である。

重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、これら過硫酸塩とチ
オ硫酸すｌ・リウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸水素
ナトリウム等のようなチオ硫酸塩、又は亜硫酸ナトリウ
ム、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム等のような
亜硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が好ましく用いら
れるが、これらに限定されるものではない。これら重合
開始剤の使用量は、単量体混合物に対して０．０１〜１
重量％の範囲が好適である。重合の雰囲気も、特に制限
されないが、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気
が用いられる。また、重合温度は、特に制限されないが
、通常、２０〜１００°Ｃ１好ましくは４０〜９０℃の
範囲である。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒子は、そ
の平均粒径が０．０３〜２μｍ、好ましくは０．０５〜
１．５μｍである。粒径が小さすぎると、これを組体と
する固定化酵素を水中に分散させて酵素反応を行なわせ
た後の回収が困難となり、一方、粒径が大きすぎると、
単位体積当りの粒子表面積が小さくなり、酵素の固定化
量が少なくなると共に、水中に分散させるのが困難とな
るので好ましくない。

また、重合体粒子の比重は０．９〜１．５の範囲にある
ことが好ましい。比重が０．９よりも小さいときは、酵
素反応において、重合体粒子が分散液媒体表面に浮遊し
、分散安定性に劣るようになり、また、酵素活性も低下
し、一方、１．５よりも大きいときは、重合体粒子が分
ｔｅｌ液媒体中己こ沈降、凝集し、粒子の自由度が失わ
れて、酵素活性が低下するからである。

本発明による固定化生理活性物質においては、酵素は水
分散型高分子重合体粒子に共有結合にて固定化されてい
る。特に、本発明においては、酵素が水分散型高分子重
合体粒子に共有結合にてスペーナ基を介して固定化され
ていることが好ましい。吸着法やイオン結合法によると
きは、酵素の固定化量が限られる結果、酵素活性が小さ
くなるからである。このように、重合体粒子に共有結合
によってスペーサ基が結合され、このスペーサ基に共有
結合によって酵素が固定化されることにより、固定化さ
れた酵素の重合体粒子上での自由度が高められる。

本発明において用いる酵素は特に制限されず、種々の酵
素が用いられる。具体例として、種々の酸化還元酵素、
転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガ
ーゼ等を挙げることができる。尚、本発明に用いる酵素
の代わりに、免疫活性物質のような、他の生理活性物質
を用いて生物学的反応を生じさせることもできる。

前記スペーサ基として用い得る化合物は、少なくとも二
官能性の有機化合物であり、多官能性の重合体を排除す
るものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素鎖基を
有する二官能性の有機化合物が好ましい。このようなス
ペーサ基として機能する化合物の具体例として、例えば
、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレンジアミン、
キシリレンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−ア
ミノプロピオン酸、Ｔ−アミノ酪酸、ε−アミノカプロ
ン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアルキルカルボ
ン酸、リジン、グルタミン酸、β−アラニン、アルギニ
ン、グリシルグリシルグリシン等のアミノ酸類等が好ま
しく用いられるが、これらに限定されるものではない。

このスペーサ基は、予め重合体粒子に結合させ、この後
にこのスペーサ基と酵素とを結合させてもよく、或いは
スに結合させてもよい。更に、必要に応じて、重合体粒
子及び酵素の両方に予めスペーサ基を結合させ、これら
を相互に結合させるごともできる。

官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に直接に酵素
を共有結合にて固定化し、又は重合体粒子にスペーサ基
を結合し、また、このスペーサ基に酵素を共有結合にて
固定化するための方法は、特に制限されず、従来より知
られている任意の方法によることができる。例えば、好
ましい方法の一つとして、架橋剤として水溶性カルボジ
イミドを用いる方法を挙げることができる。例えば、ジ
アミンをスペーサ基として用いる場合であれば、水溶性
カルボジイミドの存在下に、ジアミンの有するアミノ基
と水分散型高分子重合体粒子の有するカルボキシル基と
を反応させ、アミド結合を形成させることにより、スペ
ーサ基を重合体粒子に結合させ、次いで、同様に水溶性
カルボジイミドを用いてこのスペーサ基の有するアミノ
基に酵素を共有結合にて固定化することができる。

かかる方法において用いる水溶性カルボジイミドとして
は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、■−シクロへキシル−
３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−
ｐ−トルエンスルホネート等を挙げることができる。こ
のような水溶性カルボジイミドを用いて、スペーサ基を
介して、又は介さずして直接に、共有結合によって酵素
を重合体粒子に固定化するには、従来より知られている
通常の方法及び条件によることができる。例えば、スペ
ーサ基を用いる場合であれば、重合体粒子の水性分散液
にスペーサ基と共に適宜量、例えば、水性分散液の単位
容量当りに０．０１〜１０１１１ｇ／ｍｌとなるように
水溶性カルボジイミドを添加し、通常の条件、例えばｐ
Ｈを４〜９に保持して、５〜６０℃程度の温度で数分乃
至数十時間、通常、１〜５時間程度反応させればよい。

次いで、このスペーサ基を結合させた重合体粒子に同様
にして酵素を固定化すればよい。

本発明による固定化生理活性物質は水分散液として使用
に供される。固定化された酵素は、水分散液として基質
と接触され、また、その使用量は、固定化酵素の粒径や
酵素の固定化量、必要とする反応速度、基質濃度等によ
り適宜に決定される。

（発明の効果） 以上のように、本発明によれば、水不溶性担体として、
アクリル酸誘導体とアクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体とからなる共重合体を用いるので、得られる重
合体粒子がその粒径分布において狭く、均一であり、且
つ、水性媒体中で安定な分散状態を保持するので、固定
化生理活性物質の製造においては、安定に、且つ、高い
活性収率にて酵素を固定化することができ、更に、この
ようにして得られる固定化生理活性物質においては、反
応系に存在する外来の有機物質の表面への吸着や被覆に
よる表面汚染が実質的に生じないので、生理活性が長期
間にわたって高く保持される。

更に、上記水分散型高分子重合体粒子は、その製造にお
いては、乳化剤を用いずとも、乳化重合時の重合安定性
にすぐれる。

従って、本発明による固定化生理活性物質は、固定化さ
れた酵素が遊離の酵素と同様に自由に移動でき、従って
、固定化された酵素の表面への基質の拡散が殆ど問題に
ならない高活性を有するのみならず、その高活性が長期
間にわたって保持されるので、繰り返しての酵素反応に
好適に用いることができる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例により限定されるものではない。

実施例１ （ａｌ　　水分散型高分子重合体粒子の調製アクリル酸
２ｇ及び前記式（５）で表わされる２、２．２−１−リ
フルオロエチルメタクリレート４０ｇからなる単量体混
合物を蒸留水３４８ｇに加え、過硫酸アンモニウム０．
２ｇを水Ｌｏｇに溶解した重合開始剤水溶液を７０℃の
温度で窒素気流下に加え、２００ｒｐｍで攪拌しつつ８
時間重合させて、平均粒径０．２１μｍの重合体粒子の
水分散液（固形分１０．０％）を得た。次に、この重合
体粒子をアルカリ、酸及び蒸留水を用いて順次に遠心洗
浄した後、蒸留水中に固形分５重量％となるように再分
散させた。

（ｂ）　　重合体粒子へのスペーサ基の結合上で得た水
分散型高分子重合体粒子の水性分散液１００ｍ１とε−
アミノカプロン酸水溶液（０，０２Ｍ）１００ｍｌとを
混合し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液にてｐＨ７，２に
調製した。０．ＯＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ７，２）に溶
解させたＩ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）　
２０ｍｌを上記水性分ｌｉｋ液に加え、室温で３時間、
攪拌下に反応させた。−夜、冷蔵庫に放置した後、０．
０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ７，２）にて３回遠心洗浄し
て、スペーサ基の結合された重合体粒子を得、これを同
しホウ酸緩衝液に固形分５重量％になるように再分散さ
せた。

ＦＣ＋　　酵素の固定化 ウレアーゼ０．０５ｇを水１０ｍ１に溶解した酵素水溶
液を上記重合体粒子分散液１０ｍ１に加え、均一に攪拌
した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド塩酸塩水溶液（２５ｍｇ／ｍｌ）　
　５ｍｌを加え、ｐｌ＋７．２にて４℃で一夜反応させ
た。この後、遠心分離し、洗浄して、ウレアーゼが固定
化された重合体粒子を得た。ウレアーゼ固定化量は、重
合体粒子１ｇ当り３５■であった。

０．０３Ｍ尿素水溶液を基質として、この固定化酵素を
３５°Ｃにて１０分間反応させて生成したアンモニア量
を塩酸滴定して測定したところ、固定化酵素の活性収率
は５５％であった。また、この酵素反応中、重合体粒子
の相互付着や、凝集は全く認められなかった。

尚、活性収率とは、固定化された酵素量をこの固定化さ
れた酵素の活性と同じ活性を有する遊離の酵素量にて除
して求めた値である。

比較例１ 実施例１において、２．２．２−　トリフルオロエチル
メタクリレートをスチレンに代えた以外は同様にして、
平均粒子０．２２μの水分散型高分子重合体粒子の水分
散液を得た。この重合体粒子に実施例１と同様にしてス
ペーサ基を結合し、ウレアーゼを固定化した。

この固定化酵素におけるウレアーゼ固定化量は重合体粒
子１ｇ当り６４■であり、活性収率は実施例１と同し条
件下で９．５％であった。また、酵素反応中に重合体粒
子が相互に付着し、凝集していることが認められた。

比較例２ 実施例１において、２，２．２−）リフルオロエチルメ
タクリレートをメタクリル酸メチルに代えた以外は同様
にして、平均粒子０．２５μの水分散型高分子重合体粒
子の水分散液を得た。この重合体粒子に実施例１と同様
にしてスペーサ基を結合し、ウレアーゼを固定化した。

この固定化酵素におけるウレアーゼ固定化量は重合体粒
子１ｇ当り４８ｗであり、活性収率は１８％であった。

また、比較例１に比べれば僅かではあるが、酵素反応中
に重合体粒子が相互に付着し、凝集していることが認め
られた。

実施例２ 実施例１において、２，２．２−　トリフルオロエチル
メタクリレートの９０重量％をメタクリル酸メチルに代
えた以外は同様にして、平均粒子０．２２μの水分散型
高分子重合体粒子の水分散液を得た。

この重合体粒子に実施例１と同様にしてスペーサ基を結
合し、ウレアーゼを固定化した。

この固定化酵素におけるウレアーゼ固定化量は重合体粒
子１ｇ当り４２ｍｇであり、活性収率は５４％であった
。また、酵素反応中、重合体粒子の相互付着や、凝集は
全く認められなかった。

実施例３ 単量体混合物として、アクリル酸１．５ｇ、メタクリル
酸メチル１６ｇ、メタクリル酸イソブチル１６　ｇ　、
　ＩＨ，１１１，５Ｈ−オクタフルオロペンチルメタク
リレート８ｇ及びトリエチレングリコールジメタクリレ
ート０．５　ｇを用いた以外は同様にして、平均粒子０
．２６μの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を得た
。この重合体粒子に実施例１と同様にしてスペーサ基を
結合した。

実施例１のＦｅ２項におけるウレアーゼをトリプシンと
した以外は、全く同様にして上記重合体粒子にトリプシ
ンを固定化した。この固定化酵素におけるトリプンン固
定化量は重合体粒子１ｇ当り２６■であり、活性収率は
４１％であった。尚、この固定化酵素に１％カゼイン水
溶液を基質として３５°Ｃで１０分間反応させた後、５
％トリクロロ酢酸により高分子量タンパク質を沈殿させ
、次いで、遊離の非タンパク質量を２８０ｎｍの吸光度
から求め、この吸光度を１分間に１．０増加させる活性
を１単位として、固定化酵素の活性を求めた。

同様にしてａ離のトリプシンについても、その活性を求
め、前記と同様にして活性収率を求めた。

実施例４ スペーサとしてキシリレンジアミンを用いた以外は、実
施例１と同様にして、実施例１で得た水分散型高分子重
合体粒子にスペーサ基を結合させ、ホウ酸緩衝液に固形
分５重量％となるように分散させた。この分散液にグル
タルアルデヒドを０．１重量％濃度となるように加え、
４℃で３時間反応させた後、蒸留水にて遠心洗浄を３回
繰り返し、５重量％となるように再分散させた。

この分散液１０ｍ１にα−アミラーゼ溶液（５０■／ｃ
ｃ）　　２０ｍｌを加え、４℃で一夜反応させた。

この後、遠心分離による洗浄を行なって、α−アミラー
ゼが固定化された重合体粒子を得た。固定化量は重合体
粒子１ｇ当り１２０ｍｇであった。

比較のために、比較例２において得た水分散型高分子重
合体粒子に上記と同様にして、固定化蟹重合体粒子１ｇ
当り約１２７ｍｇの固定化α−アミラーゼを得た。

これらの固定化酵素について、１％デンプン水溶液を基
質として測定した活性収率は、本発明による固定化酵素
が４５％、比較例によるものは３８％であった。

次に、上記の酵素反応を行なった後の反応混合物から遠
心分離にて固定化酵素を沈殿させ、緩衝液に再分散させ
た後、上記と同様にして２回目の酵素反応を行なった。

更に、同様にして、繰り返して酵素反応を行なった。

初回の活性を基準として、その後の酵素反応における本
発明及び比較例による固定化酵素の相対活性を図面に示
す。本発明の固定化酵素によれば、繰り返しての反応に
おいても、酵素活性の低下が小さく抑えられることが明
らかである。

また、上記の酵素反応において、２回目以後の反応時に
基質水溶液中に０．５％のＢＳＡを存在させて行なった
ときの酵素反応における本発明及び比較例による固定化
酵素の相対活性を図面に示す。

本発明の固定化酵素によれば、操り返しての反応におい
ても、外来のタンパク質に基づく固定化酵素の酵素活性
の低下が小さく抑えられることが明らかである。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明及び比較例による固定化酵素を用いて、
繰り返して酵素反応を行なったときの反応回数に対する
酵素の相対活性の経時変化を示すグラフである。 特許出願人　日東電気工業株式会社 代理人　弁理士　　牧　野　逸　部 反忌ＩＢ駁（Ｃ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であつてもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
   び （ｂ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
   ニル単量体との混合物であつて、この混合物に基づいて
   上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
   １００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性・媒体中で乳化共重合させ
   てなる水分散型高分子重合体粒子に共有結合を介して酵
   素が固定化されていることを特徴とする固定化生理活性
   物質。
2. （２）水分散型高分子重合体粒子が０．０３〜２μｍの
   平均粒子径を有することを特徴とする。 特許請求の範囲第１項記載の固定化生理活性物質。