JPS63198872A - 再分散性生理活性物質固定化用担体粒子及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皇栗上旦■里立国 本発明は、再分散性生理活性物質固定化用担体粒子に関
し、詳しくは、酵素、抗体等のような生理活性物質を例
えば共有結合にて固定化するために好適に用いることが
できる再分散性生理活性物質固定化用担体粒子、及びそ
の製造方法に関する。

従米鬼茨玉 生理活性物質、例えば、酵素を水不溶性のラテックス粒
子に固定化してなる固定化酵素は、その回収が容易であ
ると共に、酵素の変性や失活が起こり難いために、近年
、工業的な酵素反応に広く用いられている。また、生理
活性物質としてレクチンをラテックス粒子に同定化した
ものは、レクチンの糖類との結合能力を利用して、＃Ｍ
類の分離や精製に用いられる。更に、生理活性物質とし
て抗原若しくはハブテン、又は抗体をラテックス粒子に
結合したものは、対応する抗体、又は抗原若しくはハプ
テンをラテックス凝集反応として検出するための免疫学
的診断試薬として広く実用化されている。

このように、生理活性物質をラテックス粒子に結合する
ための方法として、従来、代表的には、ポリスチレンラ
テックス粒子の表面に生理活性物質を物理吸着させる方
法と、カルボキシル基を有する重合体粒子の水性分散液
、即ち、カルボキシル化ラテックスを構成する粒子に生
理活性物質を共有結合にて結合させる方法とが知られて
いる。

上記物理吸着法は、操作が簡単であり、特別な試薬を必
要とせず、更に、固定化に際しても、生理活性物質の活
性の低下が殆ど生じない利点を有するところから、従来
、広く用いられている。

しかし、物理吸着法においては、生理活性物質は単にラ
テックス粒子の表面に吸着されているのみであるので、
生理活性物質がラテックス粒子から容易に解離し、例え
ば、前記した免疫学的診断試薬として用いた場合に、ラ
テックス凝集反応を阻害し、或いは自然凝集を生じたり
して、診断の精度を低下させる問題がある。また、生理
活性物質によっては、ラテックス粒子に吸着せず、或い
は吸着量が少なく、所要の活性を有するラテックス粒子
を得ることができない場合もあり、更に、ｐＨ等の環境
条件に敏感である等の問題もある。

他方、共有結合法によれば、生理活性物質はラテックス
粒子に強固に結合されているので、容易に解離すること
はないが、反面、固定化操作が煩瑣であり、且つ、高度
の技術を必要とし、更に、生理活性物質が結合されたラ
テックス粒子は、一般には、分散性がよくない。特に、
共有結合法にてカルボキシル化ラテックス粒子に生理活
性物質を結合する際に、水溶性縮合脱水剤としてのカル
ボジイミドにて活性化したラテックス粒子は、水性媒体
中での保存性に劣るために、生理活性物質の固定化操作
の都度、ラテックス粒子の活性化を行なう必要があるの
で、再現性よく生理活性物質を固定化することが困難で
ある。

カルボキシル化ラテックス粒子をＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドにて活性化する方法も知られている。この方法
による活性化ラテックス粒子は、上記カルボジイミドに
よる活性化ラテックス粒子に比べて、その水性媒体中で
の分散性は幾分は改善されているものの、長期の保存に
耐えるほどの安定性をもつには至らない。

更に、架橋試薬を用いて活性化する方法も知られている
。これは２個或いはそれ以上の官能基を有する試薬を用
いて、化学的に結合する方法であって、千畑一部編集「
固定化酵素Ｊ　　（１９７５年講談社発行）等に記載さ
れており、アミノ基を導入したラテックス粒子をグルタ
ルアルデヒドで処理することにより活性化するものであ
る。しかしながら、この方法においても、グルタルアル
デヒドが自己架橋を起こすことから、水性媒体中での分
散性は改善されない。

そこで、活性基が乾燥状態においては保存安定性が高い
ことを利用して、例えば、アガロースゲルを活性化し、
乾燥し、粒子状とした活性化担体粒子、例えば、アガロ
ースゲルの水酸基を臭化シアンにて活性化したＣＮＢｒ
−活性化セファロース４Ｂ、各種の官能基を付与した活
性化ＣＨ−セファロース４Ｂやエポキシ活性化セファロ
ース６Ｂ（いずれもファーマシア・ファイン・ケミカル
ズ社製）等が既に知られている。

しかし、これら活性化担体粒子は、４５〜２００μｍの
粒径を有し、主としてアフイニテイ・クロマトグラフィ
ー用の充填剤として用いられるものであって、元来、分
散性はもたないので、水性媒体中での分散安定性が要求
される用途には用いることができない。かかる分散安定
性が要求される用途として、例えば、前記したような免
疫学的診断試薬や、或いは担体粒子に酵素を同定化し、
水性媒体中に分散させて、基質と反応させる酵素反応等
を挙げることができる。

このような分散安定性が要求される用途には、従来、一
般に粒径０．０３〜３μｍの微細なラテックス粒子が用
いられている。しかし、これらラテックス粒子は、乾燥
すれば、相互に融着凝集するので、水性媒体中に再分散
させても、当初の微細な粒子として分散しない。

Ｕ　＜”しよ゛と　る。　占 そこで、生理活性物質を結合したラテックスに乳糖のよ
うな分散剤を加え、これを凍結乾燥して、再分散性を有
する粉末物質を得る方法が特開昭５２−１１７４２０号
公報に記載されている。また、特開昭５８−１２３４５
９号公報には、生理活性物質を固定化したラテックスを
保護剤としてのグリセリンの水溶液で処理した後に、自
然乾燥又は通気乾燥して、保存性にすぐれる乾燥粒子を
製造する方法が記載されている。

しかし、従来、生理活性物質を固定化すべき担体粒子自
体を水性媒体中で再分散性を有する乾燥担体粒子とする
方法は知られておらず、他方、乾燥担体粒子と共に分散
剤や保護剤が存在するときは、乾燥担体粒子を水性媒体
中に再分散させ、生理活性物質を固定化する際にその同
定化を妨げ、或いは固定化された生理活性物質の活性を
低下させることがあるので、分散剤や保護剤を用いる前
記方法は、再分散性を有する乾燥担体粒子を得る場合に
は適用し得ない。

本発明は、上記問題を解決するためになされたものであ
って、保存性、水性媒体中での再分散性及び生理活性物
質の固定化時の再現性にすぐれる生理活性物質固定化用
担体粒子、及びかかる担体粒子を特別な分散剤や保護剤
のような薬剤を用いることなくして製造する方法を提供
することを目的とする。

問題点を解°するための手 本発明による再分散性生理活性物質固定化用担体粒子は
、表面にカルボキシル基及びアミノ基を有し、且つ、上
記アミノ基がポリアルデヒドにて活性化されている平均
粒子径０．０３〜５μｍの水分散型高分子重合体粒子を
凍結乾燥してなることを特徴とする。

かかる担体粒子は、本発明に従って、カルボキシル基を
有する平均粒子径０．０３〜５μｍの水分散型高分子重
合体粒子にジアミンを反応させて、上記カルボキシル基
の一部をアミノ基とした後、更に、ポリアルデヒドを反
応させて、上記アミノ基を活性化することによって製造
することができる。

本発明において、生理活性物質とは、前述した酵素、補
酵素や、抗体若しくはハプテン、抗原、ホルモン等のよ
うに、生物学的又は生化学的な反応活性を有する有機物
質、通常、高分子量タンパク質を意味する。

本発明による担体粒子を製造するための水分散型高分子
重合体粒子は、好ましくは、本発明に従って、 （ａｌ一般式 ％式％ （但し、Ｒ１は水素、低級アルキル基又はカルボキシル
基を示し、ＲＺは水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ１
が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ２はカルボ低級
アルコキシ基であってもよい、）で表わされるアクリル
酸誘導体０．１〜２０重量％、及び （ｂ）一般式 ％式％ （但し、Ｒ３は水素又は低級アルキル基を示し、Ｒ４は
、 −（ＣＩ□）ｌＳ−又は−（Ｃ）１□）Ｘ−ＣＨ（ＣＨ
ｚ）　ｙ　−ＯＲ’ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
あり、Ｒ５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、Ａ
はそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ３を示し、ｎは
０−１２の整数を示す。）で表わされるアクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体と、上記アクリル酸誘導体
を除くラジカル共重合性ビニル単量体との混合物であっ
て、この混合物に基づいて上記アクリル酸フルオロアル
キルエステル誘導体が１〜１００重量％である混合物９
９，９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
、先ず、表面にカルボキシル基を有する水分散型高分子
重合体粒子を得、次いで、これにジアミンをスペーサ基
として反応させ、上記カルボキシル基の一部をスペーサ
化して、末端アミノ基とし、更に、このアミノ基にポリ
アルデヒドを結合させて、末端を遊離アルデヒド基とす
ることよって得ることができる。

上記アクリル酸誘導体としては、例えば、アクリル酸、
メタクリル酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、
フマル酸、モノアルキルマレイン酸、モノアルキルフマ
ル酸、モノアルキルイタコン酸等を好ましい例として挙
げることができるが、特に、アクリル酸、メタクリル酸
及びイタコン酸の１種又は２種以上の混合物が好ましく
用いられる。

これらアクリル酸誘導体は、乳化共重合時の重合安定性
にすぐれ、また、水性媒体中での分散安定性にすぐれる
水分散型高分子重合体粒子を得るために必要な単量体成
分であり、更に、重合体粒子にカルボキシル基を有せし
め、その一部をスペーサ化してアミノ基とするために必
要な単量体成分であって、単量体組成において、少なく
とも０゜１重量％を必要とする。しかし、過多に共重合
単量体成分として用いるときは、却って重合安定性と、
得られる重合体粒子の分散安定性を損なうので、２０重
量％以下の範囲で用いられる。特に好ましい範囲は、０
．５〜１０重量％である。

また、上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体
は、好ましくは、一般式 ％式％（１） （但し、Ｒ３、Ｒ５、ｍ及びｎは前記と同じである。）
で表わされ、従って、特に、好ましく用いることができ
るアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体の具体例
として、例えば、 Ｃ１ｌ□＝Ｃ（ＣＨａ）ＣＯＯＣＨｚＣＦ＋　　　　　
　　　　　（５）ＣＨ２１＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣＨｚ
（ＣＦｚ）Ｊ　　　　　　　　（６１Ｃ）Ｉｚ＝Ｃ（Ｃ
Ｈｚ）ＣＯＯＣＨｚ（ＣＦｚ）　ａｌｌ　　　　　　　
　（７１ＣＨｚ二〇（ＣＨ３）Ｃ００（Ｃｆｌｚ）　ｚ
（ＣＦｚ）　ａＦ　　　　　　　（８）等を例示するこ
とができる。

これらアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体単量
体成分は、本発明による再分散性生理活性物質固定化用
担体粒子において、長期間にわたる保存安定性や、これ
を水性媒体に再分散させたときにすぐれた分散安定性を
与えるために必要であるのみならず、担体粒子への生理
活性物質の固定化時に、水性媒体中において、担体粒子
に安定な分散性を保たしめる効果を有する。

このような効果を有効に得るためには、アクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体は、単量体組成において９
９．９〜８０重量％、好ましくは９９．５〜９０重量％
の範囲で用いられる。

本発明においては、上記アクリル酸フルオロアルキルエ
ステル誘導体の一部は、前記アクリル酸誘導体を除くラ
ジカル共重合性ビニル単量体に置換されてもよい。

かかるラジカル共重合性ビニル単量体としては、例えば
、それ自体の単独重合体が水不溶性である疎水性単量体
を挙げることができる、具体例として、エチレン、プロ
ピレン、塩化ビニル等のα−オレフィン又はそのハロゲ
ン置換体、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン
、ビニルトルエン、クロロスチレン等のアルケニルベン
ゼン、フ゛タジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン
、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸メチ
ル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プ
ロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル
酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル等の（メタ）
アクリル酸エステル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル
等を挙げることができる。上記したラジカル共重合性ビ
ニル単量体のうちでは、特に、メタクリル酸メチルやメ
タクリル酸イソブチル等の（メタ）アクリル酸エステル
が好ましく用いられる。このような単量体は、得られる
重合体粒子の比重を調整し、又は前記したアクリル酸誘
導体とアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体との
共重合反応性を調整するために好適に用いられる。

また、必要に応じて、それ自体の単独重合体が水溶性又
は水膨潤性である親水性単量体も用いることができる。

かかる単量体の具体例として、例えば、ヒドロキシメチ
ル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）ア
クリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート
等のヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート、（メタ
）アクリルアミド、グリシジル（メタ）アクリレート等
を挙げることができる。

しかし、上記したラジカル共重合性ビニル単量体は、余
りに多量に使用すると、重合安定性を損じるのみならず
、得られる重合体粒子が水分散安定性に劣るようになる
ので、本発明においては、アクリル酸フルオロアルキル
エステル誘導体と上記ラジカル共重合性ビニル単量体と
の混合物において、アクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体を少なくとも１重量％用いることが必要である
。

即ち、本発明においては、上記ラジカル共重合性ビニル
単量体は、このラジカル共重合性ビニル単量体とアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体との混合物の重量
に基づいて、９９重量％以下、好ましくは９７重重量以
下の範囲で用いられる。有効量の下限は特に制限されず
、目的に応じて適宜に選ばれるが、通常、アクリル酸フ
ルオロアルキルエステル誘導体とこのアクリル酸アルキ
ルエステル誘導体の混合物の重量に基づいて１重量％以
上である。

本発明によれば、かかる単量体成分の所定の割合の混合
物を用いることにより、特に乳化剤を用いることなく、
凝集物の発生なしに安定に乳化共重合させ得て、粒径が
均一であり、且つ、水性媒体中で分散状態が安定に保持
される水分散型高分子重合体粒子を得ることができる。

更に、重合体粒子の製造において、単量体成分として、
内部架橋用官能性単量体を用いることができる。この内
部架橋用多官能性単量体は、重合体に架橋構造を導入す
るので、存在する場合には好ましくない水溶性重合体の
生成を抑制すると共に、得られる重合体粒子のガラス転
移温度を高めることができる。更に、内部架橋剤は、重
合体粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中での
分散安定性を高めるのに効果がある。

かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例えば、脂
肪族多価アルコールのポリ　（メタ）アクリレートが好
ましく用いられる。具体例として、例えば、エチレング
リコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジメ
タクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレー
ト、ジプロピレングリコールジメタクリレート、１．３
−ブチレングリコールジメタクリレート、トリエチレン
グリコールジアクリレート、トリメチロールプロパント
リメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリ
レート、テトラメチロールメタンテトラアクリレート等
が好ましく用いられる。また、ジビニルベンゼンやＮ、
　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド等も多官能性内部
架橋用単量体として用いることができる。

内部架橋用多官能性単量体は、必要な場合は、通常、単
量体組成において、０．１重量％以上が用いられるが、
しかし、過多に使用するときは、却って重合安定性と得
られる重合体粒子の水性媒体中での分散安定性を損なう
ので好ましくなく、通常、２０重量％以下の範囲で用い
られる。好ましくは０．２〜１０重量％の範囲である。

また、個々の単量体の具体的な種類は、得られる共重合
体のガラス転移点が０℃以上、好ましくは室温以上とな
るように選ばれる。重合体粒子のガラス転移点が０℃よ
りも低いときは、重合体粒子の相互の融着や凝集が生じ
やすく、分散液の分散安定性が低下する傾向があるから
である。

以上のような各単量体を水性媒体中にて、水溶性のラジ
カル重合開始剤を用いて、通常の方法にて乳化共重合さ
せることにより、カルボキシル基を有する水不溶性共重
合体からなる水性分散液、即ち、カルボキシル化ラテッ
クスを得ることができるが、得られるラテックス中に乳
化剤が遊離の状態で、或いは重合体粒子に吸着された状
態にて存在するとき、前述したように、特に、その使用
に際して種々の有害な影響が現れることがあるので、乳
化共重合に際しては乳化剤を用いないのが好ましい。前
記単量体組成によれば、乳化剤を要せずして安定に共重
合させることができると共に、得られるラテックス粒子
の分散状態が安定に保持される。しかし、重合体粒子の
凝集や沈降が起こらず、更には、担体粒子に固定化され
た生理活性物質の生化学的反応が妨害されない範囲にお
いて、乳化剤を用いることは何ら妨げられず、また、乳
化剤が有害な影響を与えない場合には、必要に応じて、
乳化剤を用いてもよい。

上記のような乳化共重合において、単量体成分混合物の
水性媒体中での濃度は、得られるラテックスにおける重
合体粒子の平均粒径とも関連するが、通常、１〜４０重
量％の範囲である。

重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始剤が用い
られる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過
硫酸アンモニウム等の過硫酸塩や、これら過硫酸塩とチ
オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸水素ナ
トリウム等のようなチオ硫酸塩、又は亜硫酸ナトリウム
、亜硫酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム等のような亜
硫酸塩とのレドックス系重合開始剤が好ましく用いられ
るが、これらに限定されるものではない。これら重合開
始剤の使用量は、単量体混合物に対して０．０１〜１重
量％の範囲が好適である。重合の雰囲気も、特に制限さ
れないが、好ましくは酸素を除いた不活性ガス雰囲気が
用いられる。また、重合温度は、特に制限されないが、
通常、２０〜１００℃、好ましくは４０〜９０℃の範囲
である。

本発明による担体粒子を製造するための水分散型高分子
重合体粒子は、上述したようなカルボキシル基を有する
水分散型高分子重合体粒子をスペーサ基としてのジアミ
ンと反応させて、カルボキシル基にジアミンの一つのア
ミノ基と結合させることによって、カルボキシル基をス
ペーサ基を介して末端をアミノ基とし、次いで、このア
ミノ基にポリアルデヒドの一つのアルデヒド基を反応さ
せ、シッフ塩基を形成させて、末端アルデヒド基として
活性化する。

ここに、スペーサ基であるジアミンとしては、重合体を
排除するものではないが、特に、炭素数１〜１２の炭素
鎖基を有するジアミンが好ましく、かかるジアミンとし
ては、例えば、ヘキサメチレンジアミン、ドデカメチレ
ンジアミン、キシリレンジアミン等が好ましく用いられ
る。しかし、これらに限定されるものではない。

カルボキシル基を有する重合体粒子に上記のようなジア
ミンをスペーサ基として結合させるには、例えば、千畑
一部ばか著「実験と応用アフイニテイ・クロマトグラフ
ィーＪ　　（１９７６年講談社発行）に記載されている
ように、一般に、重合体粒子を含むラテックスに適宜量
、例えば、ラテックスの単位容量光りに０．０１〜１０
ｍｇ／ｍｌとなるように水溶性カルボジイミドを添加し
、通常の条件、例えばｐＨを４〜９に保持して、５〜６
０℃程度の温度で数分乃至数十時間、通常、１〜５時間
程度反応させればよい。水溶性カルボジイミドとしては
、通常、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロへキシ
ル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メ
ト−ｐ−）ルエンスルホネート等が用いられる。

本発明においては、前記カルボキシル基を有する水分散
型高分子重合体粒子は、当初、０．１〜６０μモル／ｄ
、好ましくは０．７〜３０μモル／Ｍの範囲にてカルボ
キシル基を有し、ジアミンとの反応後にアミノ基をカル
ボキシル基の０．１〜５０％、好ましくは１〜２０％の
範囲にて有せしめるのがよい。重合体粒子上の上記当初
のカルボキシル基量は、前述したように、乳化共重合に
おける所定の単量体組成のうち、アクリル酸誘導体の使
用量によって任意に調整することができる。

重合体粒子の存するカルボキシル基数が余りに少ないと
きは、凍結乾燥した粉末が水性媒体中での再分散性に劣
り、水性媒体中に再分散させたときに凝集を起こし、他
方、重合体粒子の有するカルボキシル基数が余りに多い
ときも、水性媒体中に再分散させたときに凝集すること
があり、或いは生理活性物質を固定化したときに、その
生化学的反応を阻害するおそれがある。また、重合体粒
子の有するアミノ基が余りに多いときは、凍結乾燥した
粉末が水性媒体中での再分散性に劣り、他方、アミノ基
数が余りに少ないときは、生理活性物質を十分な量にて
固定化することができない。

カルボキシル基とアミン基とを有する水分散型高分子重
合体粒子をポリアルデヒドにて活性化するには、即ち、
前述したように、アミノ基とシッフ塩基を形成させ、末
端を遊離アルデヒド基とするには、重合体粒子のラテッ
クスに適宜量、例えば、ラテックス（１０重量％）１ｍ
ｌ当たりに等容量のポリアルデヒドを０．００１〜２０
ｍｇ／ｍｌの範囲で加え、通常の条件下、例えば、ｐＨ
４〜９、温度５〜６０℃にて数分乃至数十時間、通常、
１〜３時間程度反応させればよい。ポリアルデヒド濃度
が小さいほど、活性化されるアミノ基の数が少なくなり
、他方、ポリアルデヒド濃度が高いほど、アミノ基が相
互に架橋されて、凍結乾燥によって得られる担体粒子の
水性媒体への再分散性が低下する。従って、本発明にお
いては、濃度０．０１〜１■／ｍｌのポリアルデヒド水
？容液を用いて、ｐＨ７〜９、温度５〜２０℃程度で反
応させることが最も有利である。

ポリアルデヒドとしては、３官能以上のアルデヒドでも
よいが、通常は、グルタルアルデヒドやテレフタルアル
デヒドのようなジアルデヒドが好ましく用いられる。

本発明において、重合体粒子は、その平均粒径が０．０
３〜５μｍ、好ましくは０．０５〜３μｍである。粒径
が小さすぎると、例えば、免疫活性物質を固定化して、
抗原抗体反応による凝集を肉眼で観察することが困難で
あり、一方、大きすぎるときは、粒子を安定な分散状態
に保つのが困難となる。また、粒径が小さすぎると、こ
れを担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素反応
を行なわせた後の回収が困難となり、一方、粒径が大き
すぎると、単位体積当りの粒子表面積が小さくなり、例
えば、酵素の固定化量が少なくなると共に、水中に分散
させるのが困難となるので好ましくない。

また、重合体粒子の比重は０．９〜１．５の範囲にある
ことが好ましい。比重が０．９よりも小さいときは、例
えば、酵素反応において、粒子が水性媒体の表層に浮遊
し、分散安定性に劣るようになり、また、酵素活性も低
下し、一方、１．５よりも大きいときは、粒子が水性媒
体中に沈降、凝集し、粒子の自由度が失われて、例えば
、酵素活性が低下するからである。

本発明において、カルボキシル基とアミノ基とを有し、
このアミノ基をポリアルデヒドにて活性化した水分散型
高分子重合体粒子を含むラテックスの凍結乾燥方法は、
特に、限定されるものではないが、通常は、ラテックス
を一７０℃がら一８０℃の温度で凍結させる。この後、
減圧下に水分を除去することによって、本発明による再
分散性にすぐれる活性化担体粒子を得ることができる。

又里鬼須王 以上のように、本発明によれば、活性化された担体粒子
を含むラテックスを凍結乾燥して、保存性、分散性、生
理活性物質の固定化における再現性にすぐれる再分散性
生理活性物質固定化用担体粒子を得ることができる。

特に、本発明によれば、粒子担体を構成するための水分
散型高分子重合体粒子として、前述した、ようなアクリ
ル酸誘導体とアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体とからなる共重合体粒子を用いるので、得られる担体
粒子は、その粒径分布において狭く、均一であり、長期
間にわたる保存安定性にすぐれ、更に、水性媒体中での
再分散性に著しくすぐれるので、再現性よく、高い活性
収率にて且つ、何ら特別な薬剤を用いることなくして、
生理活性物質を化学的に固定化することができる。

去施斑 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこ
れら実施例によって何ら制限されるものではない。

カルボキシル化ラテックス及びそのアミン化第１表に示
す組成の単量体混合物９０ｇを蒸留水３５０ｇに加え、
次いで、これに過硫酸アンモニウム０．３６　ｇを蒸留
水Ｌｏｇに溶解させた水溶液を７０℃の温度で窒素気流
下に加えた後、２５０　ｒｐｍにて攪拌しつつ、７時間
重合させて、カルボキシル化ラテックスＡ１〜Ａ４を得
た。

重合状態、重合率、得られたラテックス粒子の平均粒径
及び粒子表面のカルボキシル基量を第１表に示す。尚、
粒子表面のカルボキシル基量は、電導度滴定装置を用い
て、定量した。

次いで、このようにして得られたカルボキシル化ラテッ
クスＡＩ、Ａ２及びＡ４（固形分５重量％）のそれぞれ
に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド２００■を蒸留水１０ｍ１に溶解させた水
溶液を加え、室温にて１時間反応させた後、０．０３　
ｍｏｌ／１のｍ−キシリレンジアミン水溶液５０ｍ１を
加え、室温で更に５時間反応させた。この後、反応混合
物を遠心分離にて洗浄し、未反応のｍ−キシリレンジア
ミンを除去し、それぞれ表面にカルボキシル基とアミノ
基とを有するカルボキシル化アミン化ラテックスＢ１、
Ｂ２及びＢ４を得た。

ラテックスの分散状態、粒子表面のカルボキシル基量及
びこのカルボキシル基量に対するアミノ基量の割合を第
２表に示す。

尚、粒子表面のアミノ基量は、アミノ基の比色定量試薬
を用いて定量した。即ち、ニンヒドリン試薬にンヒドリ
ン２．Ｏｇ及びヒドリンダンチン０．３ｇを４Ｎ酢酸緩
衝液（ｐＨ５，５）　　２５ｍｌとメチルセロソルブ７
５ｍ１に溶解したもの）０．５ｍｌに標準物質並びにラ
テックス溶液０．５ｍｌを加え、８０°Ｃで１５分間加
温した後、５０％エタノール２．５ｍｌを加え、遠心分
離にて固形分を除去した後、上澄みの５７０ｎｍにおけ
る吸光度を測定し、検量線よりアミノ基量を算出した。

また、前記のようにして得られたカルボキシル化ラテッ
クスＡ１、Ａ２及びＡ４をそれぞれ用いて、ジアミンと
して、ヘキサメチレンジアミンを用いた以外は、前記と
全（同様にして、表面にカルボキシル基とアミノ基とを
有するカルボキシル化アミノ化ラテックスＢ５、Ｂ６及
びＢ７を得た。

ラテックスの分散状態、粒子表面のカルボキシル基量及
びこのカルボキシル基量に対するアミノ基量の割合を第
２表に示す。

更に、前記カルボキシル化ラテックスＡ２を用いて、カ
ルボキシル基が種々の割合にてアミン化されたカルボキ
シル化アミノ化ラテックス８８〜Ｂ１２を得た。これら
ラテックスの粒子表面のカルボキシル基量及びアミノ基
量を第３表に示す。

カルボキシル化アミン基化ラテックスの活性化次いで、
以上のようにして得られたそれぞれのカルボキシル化ア
ミノ化ラテックス（固形分５重量％）１０ｍｌにグルタ
ルアルデヒド０．０２５■をホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０
，０，０１Ｍ）　　１ｍｌに溶解させた水溶液を加え、
室温にて２時間反応させた。

この後、反応生成物を２回遠心洗浄し、同じ緩衝液に固
形分濃度２．５重量％となるように再分散させて、活性
化ラテックス０１〜Ｃ１２を得た。

次いで、これらのラテックスを一７０℃にて凍結乾燥し
て、本発明による担体粒子及び比較例としての担体粒子
を得た。

ウシ血清アルブミンの固定化による保存性の評価これら
ラテックスの凍結乾燥品と当初のままのラテックスにつ
いて、所定期間保存した後、その保存安定性を以下のよ
うにして評価した。即ち、ウシ血清アルブミン（アーマ
−社製）６０■をホウ酸緩衝液（０，０１ｍｏｌ／Ｉ、
ｐＨ８，０）　　１０ｍｌに溶解した水溶液を当初のま
まのラテックス又は凍結乾燥品に蒸留水を加えて、当初
の固形分濃度（２゜５重量％）に戻したラテックスに加
え、４℃にて一晩放置した後、遠心分離にて未反応ウシ
血清アルブミンを除去し、ラテックス粒子へのウシ血清
アルブミンの固定化量にて、それぞれの保存安定性を評
価した。但し、カルボキシル化ラテックスＡ３は、その
まま固形分濃度２．５重量％となるように希釈して、上
記と同様にして、ウシ血清アルブミンを同定化した。

結果を第４表及び第１図から第６図に示す。尚、第４表
は、活性化ラテックスの調製直後の分散状態及びウシ血
清アルブミンの固定化量と共に、これらラテックスの調
製直後にその凍結乾燥品を調製し、これを水性媒体中に
再分散させたときの分散状態及びウシ血清アルブミンの
同定化量を示し、他方、第１図から第６図は、ラテック
ス及びその凍結乾燥品について、所定期間保存後に上記
と同様にして調べた分散状態及びウシ血清アルブミンの
同定化量を示す。

これらの結果から、本発明による活性化ラテックス粒子
の凍結乾燥品は、３か月後も、これを水性媒体中に再分
散させたとき、当初とほぼ同じ固定化量を示し、保存安
定性にすぐれることが示される。

ペルオキシダーゼの固　化による保存性の評価前記ラテ
ックスＣ１の凍結乾燥品を蒸留水にて当初の固形分濃度
に戻し、これにペルオキシダーゼ（シグマ社製Ｔｙｐｅ
　ＩＶ）　６０■をホウ酸緩衝液（０，０１ｍｏｌ／１
　、　ｐＨ８，０）　　１０ｍｌに？容解させた）容液
を加え、４℃にて一晩放置した後、遠心分離にて未反応
のペルオキシダーゼを除去した。

このようにして得たラテックス粒子にはペルオキシダー
ゼ２３■が固定化されていた。このラテックスを光学顕
微鏡（２００倍）にて観察したところ、均一であって、
凝集は全く認められなかった。また、このラテックスは
、フェニレンジアミン（５ｍｍｏｌ／ｌ）と過酸化水素
（１，５ｍｍｏｌ／１）の混合水溶液にて発色し、酵素
活性が保持されていることが確認された。

ヒ目ｇ’　Ｇの固定しによる探子性の評価前記ラテック
スＣ１の凍結乾燥品に蒸留水を加えて当初の固形分濃度
とし、これに抗ヒ目ｇＧ（Ｄａｋｏ社製、６ｎｖ／ｍｌ
）　　１０ｍｌを加え、４℃で一晩放置した。遠心分離
によって未反応抗ヒトＩｇＧを除去し、洗浄した後、ホ
ウ酸緩衝液（０，０１ｍｏ１／Ｌ　ｐＨ８，０）にて固
形分１重量％になるように希釈した。このラテックスは
、光学顕微鏡（２００倍）にて観察したところ、完全に
均一であって、凝集は全く認められなかった。また、ヒ
トｒｇＧの固定化量は１６曙であった。

上記ラテックスとヒトＩｇＧ溶液（シグマ社製の凍結乾
燥品をホウ酸緩衝液（０，０１ｍｏｌ／Ｌ　ｐｌ！７゜
０）で希釈したもの）を等量混合したところ、ヒ）１ｇ
Ｇ０．０５μｇ／ｍｌまで、ラテックスの凝集が認めら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図から第６図は、本発明による担体粒子と比較例と
しての担体粒子の保存期間とウシ血清アルブミンの同定
化量との関係を示すグラフである。 特許出願人　日東電気工業株式会社 代理人　弁理士　　牧　野　逸　部　４，１＝ 第１図 ＠２図 府、鱗１４ 第３図 第４図 ４年期１４

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）表面にカルボキシル基及びアミノ基を有し、且つ
   、上記アミノ基がポリアルデヒドにて活性化されている
   平均粒子径０．０３〜５μｍの水分散型高分子重合体粒
   子を凍結乾燥してなることを特徴とする再分散性生理活
   性物質固定化用担体粒子。
2. （２）重合体粒子の有するアミノ基がカルボキシル基の
   ０．１〜５０％であることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の再分散性生理活性物質固定化用担体粒子。
3. （３）カルボキシル基を有する平均粒子径０．０３〜５
   μｍの水分散型高分子重合体粒子にジアミンを反応させ
   て、上記カルボキシル基の一部をアミノ基とした後、更
   に、ポリアルデヒドを反応させて、上記アミノ基を活性
   化することを特徴とする再分散性生理活性物質固定化用
   担体粒子の製造方法。
4. （４）水分散型高分子重合体粒子が当初０．１〜６０μ
   モル／ｍ＾２の範囲にてカルボキシル基を有し、ジアミ
   ンとの反応後に重合体粒子にカルボキシル基の０．１〜
   ５０％の範囲にてアミノ基を有せしめることを特徴とす
   る特許請求の範囲第３項記載の再分散性生理活性物質固
   定化用担体粒子の製造方法。
5. （５）カルボキシル基を有する水分散型高分子重合体粒
   子が （ａ）一般式 Ｒ＾１ＣＨ＝ＣＲ＾２ＣＯＯＨ （但し、Ｒ＾１は水素、低級アルキル基又はカルボキシ
   ル基を示し、Ｒ＾２は水素又は低級アルキル基を示し、
   Ｒ＾１が水素又は低級アルキル基のときは、Ｒ＾２はカ
   ルボ低級アルコキシ基であつてもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体０．１〜２０重量％、及
   び （ｂ）一般式 ＣＨ＿２＝ＣＲ＾３ＣＯＯＲ＾４（ＣＦ＿２）＿ｎＣＦ
   Ａ＿２（但し、Ｒ＾３は水素又は低級アルキル基を示し
   、Ｒ＾４は ▲数式、化学式、表等があります▼ （但し、ｍは０〜１２の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−１で
   あり、Ｒ＾５は水素又はアセチル基を示す。）を示し、
   Ａはそれぞれ独立に水素、フッ素又はＣＦ＿３を示し、
   ｎは０〜１２の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
   体と、上記アクリル酸誘導体を除くラジカル共重合性ビ
   ニル単量体との混合物であつて、この混合物に基づいて
   上記アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体が１〜
   １００重量％である混合物９９．９〜８０重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合させて
   なることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の再分
   散性生理活性物質固定化用担体粒子の製造方法。