JPH08133990A

JPH08133990A - 反応性マイクロスフェアー

Info

Publication number: JPH08133990A
Application number: JP6276687A
Authority: JP
Inventors: Takeshi Miyazaki; 剛宮崎; Yasuyoshi Koinuma; 康美鯉沼
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1994-11-10
Filing date: 1994-11-10
Publication date: 1996-05-28

Abstract

(57)【要約】【目的】マイクロスフェアー表面に機能性物質が共有
結合により固定されたマイクロスフェアーであって、水
中での分散安定性に優れ、しかもタンパク質などの非特
異的吸着が起こりにくい機能性物質固定化マイクロスフ
ェアーを得る。【構成】一般式（１）【化１】〔ＯＡはオキシアルキレン基、ｎは１〜１０００、
Ｒ¹、Ｒ²は水素またはメチル基〕の化合物とスチレンと
を、有機溶媒と水との混合溶媒中で重合させ、コアにポ
リスチレンが集積し、シェルにポリオキシアルキレン鎖
が集積した構造を有する反応性マイクロスフェアーを
得、次にこのマイクロスフェアー表面上のオキシカルボ
ニルイミダゾール基と機能性物質中のアミノ基とを反応
させ、機能性物質を固定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は（ポリ）オキシアルキレ
ン誘導体をマクロモノマー成分とする反応性マイクロス
フェアー、およびこのマイクロスフェアーに機能性物質
が固定化された機能性物質固定化マイクロスフェアーに
関する。さらに詳しくは、診断薬、薬物運搬体、機能性
塗料、機能性染料、機能性インクなどとして利用するこ
とができる反応性マイクロスフェアーおよび機能性物質
固定化マイクロスフェアーに関する。

【０００２】

【従来の技術】塗料または診断薬の分野においては、ポ
リスチレンからなるラテックスまたはマイクロスフェア
ーが広く用いられている。しかし、ポリスチレンのみか
らなるラテックスまたはマイクロスフェアーは、溶媒
中、特に水中での分散安定性が悪くて沈降しやすいた
め、これらを水系媒体中で単独で使用することは難し
く、界面活性剤などとの併用が必要である。また、特に
診断薬用の担体としてポリスチレンラテックスを用いる
場合、ポリスチレンラテックス中にはタンパク質と反応
する官能基が存在していないので、抗体の担持方法は吸
着平衡によるものとなり、このため吸着担持される抗体
量が制限されたり、あるいは吸着担持した抗体が脱離し
やすいという問題点がある。さらに、検体中に共存する
他のタンパク質などが非特異的に吸着し、検出感度や信
頼性を低下させるなどの問題点もある。

【０００３】このためスチレンなどと共重合させること
により、得られるポリスチレンラテックスまたはマイク
ロスフェアーに水分散安定性を付与することができるモ
ノマー、あるいは診断薬用高分子のモノマーとして使用
することにより、タンパク質などの機能性物質と容易に
共有結合する官能基を有するモノマーが要望されている
が、このような要望を十分に満足させる化合物は知られ
ていない。従って、塗料または診断薬の分野における要
望を十分に満足させるような水中での分散安定性に優れ
たマイクロスフェアーは得られていない。またマイクロ
スフェアー表面にタンパク質などの機能性物質を化学結
合により容易に固定化することができるマイクロスフェ
アーも得られていない。

【０００４】ところで特開昭５７−９２３３２号には、
片末端に重合性二重結合、他方の片末端に官能基を有す
るポリオキシアルキレン誘導体が開示され、感光性樹脂
組成物のモノマー成分として利用されている。しかし、
この化合物を、タンパク質等の機能性物質固定用の高分
子を製造するためのマクロモノマーとして利用すること
は示唆されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、水ま
たは有機媒体中での分散安定性に優れ、しかもタンパク
質などの機能性物質を容易に化学結合により安定に固定
化することが可能で、かつタンパク質などの非特異的吸
着が起こりにくい反応性マイクロスフェアーを提供する
ことである。本発明の他の目的は、上記反応性マイクロ
スフェアーにタンパク質などの機能性物質が化学結合に
より固定されたマイクロスフェアーであって、固定化さ
れた物質の脱離が起らず、しかも固定化された物質の活
性が十分に発揮される機能性物質固定化マイクロスフェ
アーを提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は次の反応性マイ
クロスフェアー、この反応性マイクロスフェアーに機能
性物質が固定化された機能性物質固定化マイクロスフェ
アーである。

【０００７】（１）一般式（１）

【化２】〔式中、ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎ
はオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１００
０の正数を表わす。オキシアルキレン基は１種のものが
付加していても、２種以上のものが付加していてもよ
い。２種以上の場合、ランダム状に付加していても、ブ
ロック状に付加していてもよい。Ｒ¹およびＲ²はそれぞ
れ独立に水素原子またはメチル基を表わす。〕で表わさ
れる（ポリ）オキシアルキレン誘導体と、疎水性のラジ
カル重合性単量体との共重合体からなることを特徴とす
る反応性マイクロスフェアー。（２）上記（１）記載の反応性マイクロスフェアーに機
能性物質が固定されたことを特徴とする機能性物質固定
化マイクロスフェアー。

【０００８】本発明において、「（ポリ）オキシアルキ
レン」はオキシアルキレンまたはポリオキシアルキレン
を意味する。一般式（１）のＯＡで表わされるオキシア
ルキレン基は、炭素数２〜４のオキシアルキレン基であ
り、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシト
リメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ
−１，２−ジメチルエチレン基、オキシテトラメチレン
基などがあげられる。これらのオキシアルキレン基は、
エチレンオキシド、プロピレンオキシド、オキセタン、
１−ブテンオキシド、２−ブテンオキシド、テトラヒド
ロフランなどのアルキレンオキシドを付加重合させた基
である。

【０００９】一般式（１）のｎは１〜１０００、好まし
くは２〜５００、さらに好ましくは５〜３００の正数で
ある。ｎが２以上の場合、オキシアルキレン基の種類は
同一のものでも、異なるものでもよい。後者の場合、ラ
ンダムに付加していても、ブロック状に付加していても
よい。親水性を付与する場合、ＯＡとしてはエチレンオ
キシドが単独で付加したものが好ましく、この場合ｎが
３以上のものが好ましい。また種類の異なるオキシアル
キレンが付加している場合、エチレンオキシドが２０モ
ル％、好ましくは５０モル％以上付加しているのが望ま
しい。（ポリ）オキシアルキレン鎖に親油性を付与する
場合はエチレンオキシド以外の付加モル数を多くする。

【００１０】オキシアルキレン基の種類の異なるものと
しては、例えばオキシエチレン基とオキシプロピレン基
とがランダムに付加したもの、ポリオキシエチレン／ポ
リオキシプロピレンのようにブロック状に付加したも
の、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン
／ポリオキシエチレンのようにブロック状に付加したも
のなどがあげられる。

【００１１】一般式（１）で表わされる（ポリ）オキシ
アルキレン誘導体は、例えば（ポリ）アルキレングリコ
ールのモノメタクリル酸エステルまたはモノアクリル酸
エステル、具体的にはα−メタクリロイル−ω−ヒドロ
キシポリ（オキシエチレン）などと、Ｎ，Ｎ′−カルボ
ニルジイミダゾールとを、無溶媒であるいはベンゼン、
トルエン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒド
ロフラン、１，４−ジオキサンなどの有機溶媒中で、−
１００〜＋１５０℃、好ましくは０〜１００℃で、１０
分間〜１００時間、好ましくは１〜４時間反応させるこ
とにより容易に製造することができる。反応終了後は、
抽出、蒸留、再結晶、再沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾
過、イオン交換樹脂処理、吸着剤処理などの方法によ
り、容易に単離・精製することができる。

【００１２】本発明の反応性マイクロスフェアーは一般
式（１）で表わされる（ポリ）オキシアルキレン誘導体
と疎水性のラジカル重合性単量体との共重合体からなる
ものであり、コアに共重合体の主鎖が集積し、シェルに
共重合体の側鎖である（ポリ）オキシアルキレン鎖が集
積した構造を有する粒子であって、（ポリ）オキシアル
キレン鎖の先端に、アミノ基、水酸基またはチオール基
などの官能基、特に第１級アミノ基に対して高い反応活
性を有するオキシカルボニルイミダゾール基またはその
置換基が存在している。反応性マイクロスフェアーの粒
径は特に限定されないが、平均粒径１〜１０００ｎｍ、
好ましくは１００〜５００ｎｍのものが望ましい。

【００１３】本発明の反応性マイクロスフェアーを模式
的に示すと次式（２）のように表すことができる。

【化３】

【００１４】本発明の反応性マイクロスフェアーに親水
性を付与する場合、一般式（１）で表される（ポリ）オ
キシアルキレン誘導体としてはＯＡがエチレンオキシド
の単独付加であるものを使用するのが好ましく、特にｎ
が３以上のものを使用するのが好ましい。オキシアルキ
レン基の種類が異なる場合、エチレンオキシドが２０モ
ル％以上、好ましくは５０モル％以上付加しているポリ
オキシアルキレン誘導体を使用するのが望ましい。この
ようなポリオキシアルキレン誘導体を用いることによ
り、前記式（２）に示したように、親水性のポリオキシ
アルキレン鎖がマイクロスフェアーの表面に集積するの
で、水分散安定性に優れたマイクロスフェアーが得られ
る。またこのような反応性マイクロスフェアーは、ポリ
オキシエチレン鎖またはオキシエチレン基の付加モル数
の多いポリオキシアルキレン鎖が両親媒性を示すので、
酢酸エチル、エタノール、メタノール、プロパノール、
ブタノールなどの有機溶媒中においても分散安定性に優
れている。反応性マイクロスフェアーに親油性を付与す
る場合、エチレンオキシド以外のアルキレンオキシドの
付加モル数が多い（ポリ）オキシアルキレン誘導体を使
用する。

【００１５】前記疎水性のラジカル重合性単量体として
は、一般式（１）で表わされる（ポリ）オキシアルキレ
ン誘導体とラジカル重合可能な疎水性の単量体が使用で
き、例えばスチレン、ｐ−クロロスチレン、ｍ−クロロ
スチレン、ｐ−ブロモスチレン、ｍ−ブロモスチレン、
ｐ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−エチル
スチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−ジビニルベンゼ
ン、ｍ−ジビニルベンゼン等のスチレン誘導体；ベンジ
ル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレー
ト、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アク
リレート等のアクリル誘導体；酢酸ビニル、安息香酸ビ
ニル等のビニルエステル誘導体などがあげられる。これ
らの中ではスチレン誘導体、特に比重が小さく生成する
反応性マイクロスフェアーの水分散液状態での安定性に
特に優れるという理由からスチレンが好ましい。

【００１６】本発明の反応性マイクロスフェアーは、一
般式（１）で表される（ポリ）オキシアルキレン誘導体
と疎水性のラジカル重合性単量体とを、水および水と混
合可能な有機溶媒の混合溶媒中でラジカル重合させるこ
とにより製造することができる。上記有機溶媒として
は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、テトラ
ヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジメチルホルムア
ミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセタミドなど
が好ましく使用できる。これらの中では、特にエタノー
ルが好ましい。有機溶媒と水との混合割合は、有機溶
媒：水の体積比で５：９５〜９９：１（５〜９９体積
％）、好ましくは５０：５０〜９５：５（５０〜９５体
積％）とするのが望ましい。反応溶媒として水単独また
は有機溶媒単独で用いても、反応性マイクロスフェアー
は形成されない。

【００１７】一般式（１）で表わされる（ポリ）オキシ
アルキレン誘導体とラジカル重合性単量体との配合割合
は、（ポリ）オキシアルキレン誘導体：単量体のモル比
で０．０１：９９．９〜５０：５０、好ましくは０．
５：９９．５〜３０：７０とするのが望ましい。上記範
囲外になると反応性マイクロスフェアーが形成されにく
くなる。混合溶媒中の総モノマー濃度は０．００１〜１
００ｍｏｌ／ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｏｌ／ｌと
するのが望ましい。この範囲外になると反応性マイクロ
スフェアーが形成されにくくなる。

【００１８】反応はラジカル重合開始剤の存在下に行う
のが好ましい。ラジカル重合開始剤としては、１０時間
半減期温度が１０〜１５０℃の過酸化物またはアゾ系化
合物が好ましい。例えば、過硫酸アンモニウム等の無機
過酸化物；過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート、ｔ
−ブチルペルオキシ（２−エチルヘキサノエート）等の
有機過酸化物；２，２′−アゾビス〔２−（５−メチル
−２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕二塩酸塩、
２，２′−アゾビス〔２−（２−イミダゾリン−２−イ
ル）プロパン〕二塩酸塩、２，２′−アゾビス〔２−
（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン〕、２，２′
−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス
（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、２，２′−アゾビ
ス（２−メチルブチロニトリル）、４，４′−アゾビス
（４−シアノ吉草酸）等のアゾ系化合物などがあげられ
る。ラジカル重合開始剤の使用割合は、総モノマーモル
数に対して０．００１〜１０ｍｏｌ％、好ましくは０．
１〜５ｍｏｌ％とするのが望ましい。

【００１９】重合反応は、脱気封管中で、または窒素、
アルゴン、二酸化炭素などの不活性ガス雰囲気下で、反
応温度０〜１５０℃、好ましくは１０〜６０℃、反応時
間３０分間〜１００時間、好ましくは１〜２４時間の条
件で行うことができる。

【００２０】また別の方法として、紫外線、電子線、γ
線などの照射による光・放射線重合法などの方法によっ
ても同様に反応性マイクロスフェアーを得ることができ
る。このようにして、重合時のモノマー濃度、溶媒組
成、モノマー組成などの諸条件を選択することにより、
平均粒径１〜１０００ｎｍ、ＣＶ値５〜３０％程度の単
分散性に優れた反応性マイクロスフェアーを得ることが
できる。得られた反応性マイクロスフェアーはそのまま
で、あるいは遠心分離、沈降分離、透析、限外濾過、ゲ
ル濾過、イオン交換樹脂処理、吸着剤処理などの方法に
より精製した後、使用することができる。

【００２１】本発明の反応性マイクロスフェアーは前記
式（２）に示されているように、コアに主鎖部分が集積
し、シェルに（ポリ）オキシアルキレン鎖が集積した構
造のものであり、水や有機溶媒中での分散安定性に優れ
ている。さらに、（ポリ）オキシアルキレン鎖の先端に
反応性に優れたオキシカルボニルイミダゾール基または
その置換基が存在し、この基が機能性物質固定用のリガ
ンドとなるため、種々の機能性物質を化学的結合により
固定化することが可能である。このため、機能性物質を
固定する基材（担体）として好適に使用することができ
る。またその他にも、コア部に染料や顔料を滲込ませて
機能性染料として使用できるほか、機能性インク、機能
性塗料などとしても使用することもできる。

【００２２】本発明の機能性物質固定化マイクロスフェ
アーは、前記反応性マイクロスフェアーに機能性物質が
化学結合（共有結合）により固定されたマイクロスフェ
アーである。固定化する機能性物質は特に限定されない
が、例えば色素、染料、放射線ラベル化合物、蛍光化合
物、化学発光化合物、電極感応性化合物等の標識物質；
光応答性化合物、ｐＨ応答性化合物、熱応答性化合物等
の外部刺激応答性化合物；酵素、抗体、抗原、その他の
タンパク質、糖、脂質、糖タンパク質、糖脂質、ホルモ
ン等の生理活性物質；医薬などがあげられる。これらの
中では、分子中にアミノ基、水酸基またはチオール基を
有するものが好ましく、特にオキシカルボニルイミダゾ
ール基またはその置換基と容易に反応する第１級アミノ
基を有するものが好ましい。

【００２３】上記抗体の具体的なものとしては、ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体、これらの一部ユニ
ットなどがあげられる。これらの抗体はヒト、ヤギ、ヒ
ツジ、ウサギ、ニワトリなど、いかなる動物種由来のも
のであっても、またいかなるハイブリドーマに由来する
ものであってもよい。また上記抗原の具体的なものとし
ては、タンパク質、オリゴ糖、高分子糖、低分子ハプテ
ン、コレステロールなどがあげられる。ただしハプテン
の場合には、固定化のために、その分子内にアミノ基、
水酸基またはチオール基のいずれかの官能基を有するこ
とが必要である。このような抗体または抗原が固定化さ
れたマイクロスフェアーは、診断薬として好適に利用さ
れる。

【００２４】機能性物質の固定化は反応性マイクロスフ
ェアーのオキシカルボニルイミダゾール基またはその置
換基と、機能性物質のアミノ基、水酸基またはチオール
基などの官能基との間で、アミド結合、エステル結合ま
たはチオールエステル結合などの共有結合を形成するこ
とにより行われる。本発明の機能性物質固定化マイクロ
スフェアーは、前記反応性マイクロスフェアーと機能性
物質とを接触させることにより容易に製造することがで
きる。接触方法としては、反応性マイクロスフェアーの
懸濁液に機能性物質を添加して攪拌する方法などが採用
できる。

【００２５】本発明の反応性マイクロスフェアーへの機
能性物質の固定化は、反応溶媒中で反応性マイクロスフ
ェアーと機能性物質とを反応させることにより行うこと
ができる。反応溶媒としては、水、生理的食塩水、また
はｐＨ＝５〜１２、好ましくは７〜１１のリン酸緩衝
液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸
緩衝液等の緩衝液；エタノール、メタノール、アセトニ
トリル、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、ジ
メチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、ジメチルス
ルホキシド等の有機溶媒；これらの有機溶媒と水、生理
的食塩水または前記緩衝液との混合溶媒などを使用する
ことができる。

【００２６】反応溶液中の反応性マイクロスフェアーの
濃度は、０．００１〜５０重量％、好ましくは０．０１
〜３０重量％、機能性物質の濃度は１ｎｍｏｌ／ｌ〜１
ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１μｍｏｌ／ｌ〜１００ｍｍｏ
ｌ／ｌとするのが望ましい。反応温度は０〜１００℃、
好ましくはアミノ基との反応の場合は２５〜６０℃、水
酸基またはチオール基との反応の場合は３０〜８０℃、
反応時間は１０分間〜２００時間、好ましくは１分間〜
４８時間とするのが望ましい。このような条件の範囲外
になるとマイクロスフェアーの安定性が悪くなる傾向に
ある。機能性物質を固定したマイクロスフェアーを診断
薬として利用する場合は、反応性マイクロスフェアーと
しては平均粒径が１００〜５００ｎｍのものを使用する
のが好ましい。

【００２７】反応性マイクロスフェアーとアミノ基を有
する機能性物質との固定化反応を模式的に示すと次式
（３）のようになる。

【化４】

【００２８】反応終了後の混合物は、遠心分離、沈降分
離、ゲルろ過、限外ろ過、透析、イオン交換樹脂処理、
吸着剤処理などの方法により精製することができる。こ
のようにして得られた機能性物質固定化マイクロスフェ
アーは、機能性物質が共有結合により固定されているの
で、機能性物質の脱離は起こらず、安定に固定化された
ものとなる。また表面に（ポリ）オキシアルキレン鎖が
集積しているのでタンパク質などの非特異的な吸着も起
こりにくく、このため機能性物質固定化マイクロスフェ
アーを診断薬として用いた場合でも、検出感度や信頼性
の高いものとなる。さらに固定化された機能性物質の活
性も十分に発揮される。本発明の機能性物質固定化マイ
クロスフェアーは、診断薬の他にも固定化酵素、薬物運
搬体などとしても利用することができる。

【００２９】

【発明の効果】本発明の反応性マイクロスフェアーは、
一般式（１）で表される（ポリ）オキシアルキレン誘導
体と疎水性のラジカル重合性単量体との共重合体から構
成されているので、水または有機溶媒中での分散安定性
に優れるとともに、機能性物質を容易に化学結合により
安定に固定化することができる。また反応性マイクロス
フェアーにはタンパク質などの非特異的吸着が起こりに
くい。

【００３０】本発明の機能性物質固定化マイクロスフェ
アーは、上記反応性マイクロスフェアーに機能性物質が
化学結合により固定されているので、機能性物質の脱離
は起こらず、しかも固定化された機能性物質の活性が十
分に発揮される。

【００３１】

【実施例】以下、実施例により、さらに詳細な説明を行
うが、本発明はこれらに限定されるものではない。合成例１ベンゼン中、α−メタクリロイル−ω−ヒドロキシポリ
オキシエチレン（ｎ≒７．６）１０．００ｇ（２３．８
ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール
３．８６ｇ（２６．２ｍｍｏｌ）を混合し、室温で２４
時間攪拌した。これを蒸留水２０ｍｌで３回洗浄し、無
水硫酸ナトリウムで乾燥した後凍結乾燥し、白色粉末状
の下式（４）のポリオキシアルキレン誘導体を得た。

【化５】

【００３２】実施例１−１溶媒となる８０％エタノール水溶液（水：エタノール＝
２：８（ｖ／ｖ））５ｍｌに、重合開始剤として２，
２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）
プロパン］２．５ｍｇ（１００μｍｏｌ；全モノマーに
対して１．５ｍｏｌ％）、合成例１で得たポリオキシア
ルキレン誘導体０．５７ｍｍｏｌ、およびスチレン２．
８８ｍｍｏｌを仕込み、脱気封管中、６０℃で４８時間
緩やかに振盪させながら重合を行った。その後、大量の
蒸留水中にて４８時間透析し、反応性マイクロスフェア
ー分散液を得た。得られた反応性マイクロスフェアーの
粒径をＣＯＵＬＴＥＲＮ４型サブミクロン粒子分析計
を用いて測定した。平均粒径およびＣＶ値を表１に示
す。

【００３３】実施例１−２〜１−５実施例１−１と同様にして、ただし表１の通りモノマー
配合を種々変えて、反応性マイクロスフェアーを得た。
なお、各実施例とも重合開始剤は全モノマーに対して
１．５ｍｏｌ％になる量で用いた。得られた反応性マイ
クロスフェアーの粒径とＣＶ値を表１に示す。

【００３４】実施例１−６実施例１−１と同様にして、ただし下式（５）のポリオ
キシアルキレン誘導体を用いて反応性マイクロスフェア
ーを得た。得られた反応性マイクロスフェアーの粒径と
ＣＶ値を表１に示す。

【化６】

【００３５】実施例１−７実施例１−１と同様にして、ただし下式（６）のポリオ
キシアルキレン誘導体を用いて反応性マイクロスフェア
ーを得た。得られた反応性マイクロスフェアーの粒径と
ＣＶ値を表１に示す。

【化７】

【００３６】

【表１】

【００３７】実施例２−１実施例１−１で得られた反応性マイクロスフェアーをリ
ン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝７．４）を用いて固形分
量２ｗｔ％に調製し、この５ｍｌに、２０ｍｇ／ｍｌの
牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す）−０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ＝９．０）３ｍｌを加え、４℃で２４
時間インキュベートした。反応終了後、遠心分離し（４
０００ｒｐｍ、１０分間）、上澄みを０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ＝７．４）で置換する操作を３回繰り返すこ
とにより精製を行い、ＢＳＡ固定化マイクロスフェアー
を得た。

【００３８】得られたＢＳＡ固定化マイクロスフェアー
のＢＳＡ固定化量を、ニンヒドリン法を用いて定量し
た。すなわち、ニンヒドリン４００ｍｇ，ヒドリンダン
チン６０ｍｇをメチルセロソルブ１５ｍｌに溶解した
後、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．５）５ｍｌを加
えることによりニンヒドリン溶液を調製した。一方、上
記により得られたＢＳＡ固定化マイクロスフェアー分散
液１ｍｌに４Ｎ塩酸を１ｍｌ加え、１００℃で２時間処
理した後、さらに４Ｎ水酸化ナトリウム溶液により中和
し、蒸留水にて正確に５ｍｌに調整した。さらに遠心分
離（４０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、上澄み３ｍｌ
を計り取り、これに上記ニンヒドリン溶液１ｍｌを加
え、１００℃で２０分間インキュベートした。水冷した
後、分光光度計にて５７０ｎｍの吸光度を測定し、あら
かじめ同様の操作で求めた検量線よりＢＳＡ固定化量を
算出した結果、２５．８μｇ／ｍｌであった。

【００３９】比較例１実施例１−１と同様にして、ただし式（４）のポリオキ
シアルキレン誘導体の代わりにα−メタクリル−ω−メ
トキシポリオキシエチレン（分子量３０００）を用い
て、マイクロスフェアー分散液を調製し、さらに実施例
２−１と同様にしてＢＳＡを接触させた。このマイクロ
スフェアーについて実施例２−１と同様にしてニンヒド
リン法を試みたが、ＢＳＡ固定化量は０μｇ／ｍｌであ
り、ＢＳＡはマイクロスフェアーに固定化されていない
ことが確認された。

【００４０】実施例２−２実施例２−１と同様にして、ただしＢＳＡの代わりに１
ｍｇ／ｍｌの西洋山葵ペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと
略す）／０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）３ｍｌを
用いて、ＨＲＰ固定化マイクロスフェアーを得た。次に
得られたＨＲＰ固定化マイクロスフェアーのＨＲＰ固定
化の確認を、ＨＲＰの酵素活性による発色法により確認
した。すなわち、得られたＨＲＰ固定化マイクロスフェ
アー分散液５００μｌに、ＨＲＰの基質である１，２−
フェニレンジアミン溶液（１０ｍｍｏｌ／ｌ）１００μ
ｌを加え、３０℃で１０分間インキュベートし、さらに
０．１Ｎ硫酸１０μｌを加えたところ、褐色の呈色が見
られ、ＨＲＰの固定化が確認された。

【００４１】比較例２実施例１−１と同様にして、ただし式（４）のポリオキ
シアルキレン誘導体の代わりにα−メタクリル−ω−メ
トキシポリオキシエチレン（分子量３０００）を用い
て、マイクロスフェアー分散液を調製し、さらに実施例
２−２と同様にしてＨＲＰを接触させた。このマイクロ
スフェアーについて実施例２−２と同様にして発色法を
試みたが、発色はみられず、ＨＲＰはマイクロスフェア
ーに固定化されていないことが確認された。

【００４２】実施例２−３実施例２−１と同様にして、ただしＢＳＡの代わりに１
０ｍｇ／ｍｌの抗ヒトヘモグロビン−ヤギＩｇＧ／０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）３ｍｌを用いて、抗体
固定化マイクロスフェアーを得た。次に得られた抗体固
定化マイクロスフェアーの抗体の固定化の確認を、抗原
抗体反応に基づく凝集反応の有無により検定した。すな
わち、得られた抗体固定化マイクロスフェアー分散液５
００μｌを、５００μｇ／ｍｌのヒトヘモグロビン−生
理的食塩水１ｍｌ中に加え、３７℃で１０分間インキュ
ベートしたところ、反応器の底に凝集物がみられ、抗体
がマイクロスフェアーに固定化されていることが確認さ
れた。

【００４３】比較例３実施例１−１と同様にして、ただし式（４）のポリオキ
シアルキレン誘導体の代わりにα−メタクリロイル−ω
−メチルポリオキシエチレン（分子量３０００）を用い
て、マイクロスフェアー分散液を調製し、さらに実施例
２−３と同様にして抗体を接触させた。このマイクロス
フェアーの凝集反応を試みたが、凝集はみられず、抗体
はマイクロスフェアーに固定化されていないことが確認
された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 9/00 Ｆ 39/385 39/44 49/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（１）【化１】〔式中、ＯＡは炭素数２〜４のオキシアルキレン基、ｎ
はオキシアルキレン基の平均付加モル数で、１〜１００
０の正数を表わす。オキシアルキレン基は１種のものが
付加していても、２種以上のものが付加していてもよ
い。２種以上の場合、ランダム状に付加していても、ブ
ロック状に付加していてもよい。Ｒ¹およびＲ²はそれぞ
れ独立に水素原子またはメチル基を表わす。〕で表わさ
れる（ポリ）オキシアルキレン誘導体と、疎水性のラジ
カル重合性単量体との共重合体からなることを特徴とす
る反応性マイクロスフェアー。
【請求項２】請求項１記載の反応性マイクロスフェア
ーに機能性物質が固定されたことを特徴とする機能性物
質固定化マイクロスフェアー。