JP4317744B2 - 高分子化合物末端への導入物結合方法 - Google Patents
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Description
本発明は、高分子化合物末端への導入物結合方法に関する。本発明によれば、例えば、機能性高分子として使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を表面にブラシ状に構築した基材に、所望の機能を有する物質を結合する際、ＰＥＧと導入物との結合効率を良くして高反応性な機能性材料を、高収率に得ることができる。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の応用分野に、抗原抗体反応によって引き起こされる凝集反応を促進する作用を利用し、測定系のシグナルを増幅させる利用法が知られている。測定したい抗原に抗血清又は抗体結合粒子を加え、更に数％のＰＥＧを加えると、タンパク質の結合水の構造破壊をもたらし、沈殿が促進するものと考えられている。
これとは異なる利用方法に、直鎖状のＰＥＧでタンパク質（例えば、酵素又は抗体など）を修飾し、熱安定性や、有機溶媒耐性を向上させる研究がなされ、種々の産業分野への応用が試みられていきた。例えば、コレステロールオキシダーゼの表面アミノ基に、末端のＯＨ基を塩化シアヌルで活性化したＰＥＧを結合することにより、トルエン中でも安定で活性を発現する修飾酵素が得られている。
これとは異なる利用方法に、直鎖状のＰＥＧでタンパク質（例えば、酵素又は抗体など）を修飾し、熱安定性や、有機溶媒耐性を向上させる研究がなされ、種々の産業分野への応用が試みられていきた。例えば、コレステロールオキシダーゼの表面アミノ基に、末端のＯＨ基を塩化シアヌルで活性化したＰＥＧを結合することにより、トルエン中でも安定で活性を発現する修飾酵素が得られている。
また、医薬品として投与された酵素又はホルモン等へ生体が拒絶反応を起こすことを抑制したり、あるいは、急速な分解による薬効の消滅が起こらないようにするためにも、ＰＥＧ修飾が有効であることが知られている。その一例としては、サイトカインの一種であるインターロイキン−２をＰＥＧ修飾し、マウスに静注すると、その生物活性の血中レベルが未修飾のインターロイキン−２と比べて非常に延長されたという報告がなされている。
また最近では、生体と接触する材料、あるいは、生体からサンプリングした血液などと接触する材料の表面加工技術として、ＰＥＧコーティングが有効であることが知られている。例えば、ＰＥＧをブラシ状に基材表面に構築することにより、タンパク質や細胞の表面への吸着が極めて抑制されるため、カテーテル、人工臓器、又は診断用機器表面へのコーティングが期待されている［例えば、大塚，長崎，及び片岡ら，Ｔｒａｎｓ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，２５（４），８９５−８９８（２０００）；Ｌｅｃｋｂａｎｄら，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．，Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．，１０（１０），１１２５−１１４７（１９９９）］。
本発明者は、以前より、官能基を有する様々なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体の合成法を開発してきた。その中で、分散剤として、反対側末端に重合性官能基を有するＰＥＧマクロモノマーと、ポリ乳酸セグメントとが導入されたブロック共重合体マクロモノマーを使用する、ビニル系モノマー（例えば、スチレン、メタクリル酸メチル、又はイソプレンなど）の分散重合により、表層にＰＥＧブラシ構造を有するナノ粒子を調製することができることを見出した。この表層ＰＥＧブラシの末端にはアルデヒド基やアミノ基のような官能基が存在するため、得られたナノ粒子は反応性を有する高機能コア−シェル型ナノ粒子となる。
得られた粒子は、表層のＰＥＧブラシ構造のため、タンパク質等の非特異吸着が抑制されると共に、ＰＥＧ末端にリガンドを導入することにより、抗原−抗体反応などのリガンド−レセプター作用などの特異的相互作用を高感度で検出する高機能粒子として期待されている。
このように、ＰＥＧと水溶液中のタンパク質との間には特殊な相互作用が働き、それを自在に用いることで、有意義な利用分野が多く存在する。
得られた粒子は、表層のＰＥＧブラシ構造のため、タンパク質等の非特異吸着が抑制されると共に、ＰＥＧ末端にリガンドを導入することにより、抗原−抗体反応などのリガンド−レセプター作用などの特異的相互作用を高感度で検出する高機能粒子として期待されている。
このように、ＰＥＧと水溶液中のタンパク質との間には特殊な相互作用が働き、それを自在に用いることで、有意義な利用分野が多く存在する。
これまで述べてきたように、ＰＥＧを表面に有する材料は、生体成分との干渉が少なく、吸着等の現象が少ないことは知られているが、ＰＥＧ表面に積極的に生理活性物質を結合させ、その生理活性物質の性能は発揮されるが、その他の非特異的反応は起こらないという利用のされ方はほとんどなされていない。そのため、抗原、抗体、酵素、ホルモン、ＤＮＡ、又は細菌等の生理活性物質を効率的にＰＥＧ表面に結合する手法は全く知られていない。本発明者は、ＰＥＧ末端のアルデヒド基にタンパク質を結合して特異性の高い機能性材料を調製する実験を行なったところ、その結合収率は非常に低く、従来の文献や特許公報に有効な方法が記されていないことから、独自に最適条件を検討する必要があると思われた。
本発明の課題は、基材表面にブラシ状に構築した水溶性高分子化合物（例えば、ポリマーブラシ）の末端に存在する反応性官能基と、前記反応性官能基と反応可能な導入物とを反応させる場合に、前記高分子化合物末端に前記導入物を高い効率で結合させることのできる方法を提供することにある。
前記課題は、本発明による、水又は水系溶媒中において、（１）一方の結合末端にて基材表面にブラシ状に結合した水溶性高分子化合物鎖のもう一方の自由末端に存在する反応性官能基と、（２）前記反応性官能基に反応可能な導入物とを、ポリエチレングリコールを共存させた状態で反応させることを特徴とする、前記水溶性高分子化合物鎖の前記自由末端への前記導入物の結合方法により解決することができる。
また、本発明は、水又は水系溶媒中において、（１）（ａ）水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなり、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全
体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子と、（２）前記反応性官能基に反応可能な導入物とを、ポリエチレングリコールを共存させた状態で反応させることを特徴とする、前記水溶性高分子化合物鎖の前記自由末端への前記導入物の結合方法に関する。
体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子と、（２）前記反応性官能基に反応可能な導入物とを、ポリエチレングリコールを共存させた状態で反応させることを特徴とする、前記水溶性高分子化合物鎖の前記自由末端への前記導入物の結合方法に関する。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明方法において、基材表面にブラシ状に構築する水溶性高分子化合物鎖は、直鎖状の高分子化合物であり、その一方の末端（結合末端）で基材表面と結合することができると共に、もう一方の末端（自由末端）に反応性官能基を有するか、あるいは、反応性官能基を導入することができ、しかも、前記基材表面にブラシ状に配置することが可能である限り、特に限定されるものではない。本明細書において、「水溶性高分子化合物鎖が基材表面にブラシ状に結合」した状態とは、直鎖状水溶性高分子化合物の各々が一方の結合末端で基材の表面と結合し、しかも、もう一方の自由末端が、少なくとも水溶性高分子化合物鎖と導入物（例えば、抗原又は抗体）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。
本発明方法において、基材表面にブラシ状に構築する水溶性高分子化合物鎖は、直鎖状の高分子化合物であり、その一方の末端（結合末端）で基材表面と結合することができると共に、もう一方の末端（自由末端）に反応性官能基を有するか、あるいは、反応性官能基を導入することができ、しかも、前記基材表面にブラシ状に配置することが可能である限り、特に限定されるものではない。本明細書において、「水溶性高分子化合物鎖が基材表面にブラシ状に結合」した状態とは、直鎖状水溶性高分子化合物の各々が一方の結合末端で基材の表面と結合し、しかも、もう一方の自由末端が、少なくとも水溶性高分子化合物鎖と導入物（例えば、抗原又は抗体）とを反応させる反応液中において、その反応液の系中に糸状又は棒状に表面から突出していることを意味する。
前記水溶性高分子化合物鎖としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、又はポリアリルアミンなどを挙げることができ、ＰＥＧ又はポリビニルアルコールが好ましい。
本発明において、基材表面にブラシ状に結合する水溶性高分子化合物鎖は、各水溶性高分子化合物鎖が前記の水溶性高分子化合物１種類のみから実質的に形成されているか、又は各水溶性高分子化合物鎖が相互に異なる前記の水溶性高分子化合物２種類以上の組み合わせから実質的に形成されていることができる。
前記水溶性高分子化合物鎖の自由末端に存在する反応性官能基は、前記水溶性高分子化合物鎖の一方の末端（結合末端）を基材表面に結合させる前からもう一方の末端（自由末端）に存在するか、あるいは、前記水溶性高分子化合物鎖の一方の末端（結合末端）を基材表面に結合させた後からもう一方の末端（自由末端）に導入するができる。これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、導入物［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、又はＤＮＡ）］と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではなく、例えば、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、アミノ基、マレイミド基、ビニルスルホン基、又はメタンスルホニル基などを挙げることができ、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基、又はマレイミド基が好ましい。
水溶性高分子化合物鎖をブラシ状に構築する前記基材としては、前記水溶性高分子化合物鎖をその表面にブラシ状に構築することができる基材である限り、特に限定されるものではないが、例えば、水不溶性担体、例えば、金属（例えば、金、銀、又はアルミなど）、シリカ、ガラス、酸化物（例えば、酸化チタンなど）、プラスチック（例えば、ラテックス粒子）、ゴム、木材、高分子ミセル、又はゲルなどを挙げることができる。また、基材の形状も特に限定されるものではなく、例えば、粒子状、板状、又はチューブ状などの形状を挙げることができる。チューブ状基材の場合には、その内壁及び／又は外壁に、水溶性高分子化合物鎖をブラシ状に構築することができる。更に、水溶性高分子化合物鎖をブラシ状に構築する基材表面の形状も特に限定されるものではなく、例えば、平面、湾曲面、又は球状面などを挙げることができる。前記基材としては、ラテックス粒子又は高分子ミセルが好ましい。
基材として用いる前記高分子ミセルとしては、例えば、公知のコア−シェル型粒子におけるコア部分を挙げることができる。前記コア−シェル型粒子は、一般に、（１）水不溶性高分子を主成分とするコア部分と、（２）反応性官能基を有する水溶性高分子を主成分とし、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなる。コア−シェル型粒子のコア部分が、本発明方法における基材に該当し、コア−シェル型粒子のシェル部分が、本発明方法における水溶性高分子化合物鎖に該当する。
基材表面に水溶性高分子化合物鎖をブラシ状に構築する方法、すなわち、高分子化合物ブラシの構築方法としては、これまで報告されている様々な公知方法が適用可能である。高分子化合物ブラシの公知の構築方法としては、例えば、マクロモノマーによる共重合、ブロックポリマーによる吸着、末端反応性オリゴマーの基材表面への固定化、イオン相互作用、あるいは、ＳＨ末端ポリマーの金属表面への結合等を挙げることができる。
例えば、基材が、コア−シェル型粒子のコア部分である場合に、基材表面に水溶性高分子化合物鎖をブラシ状に構築する方法、すなわち、コア−シェル型粒子を調製する方法としては、これまで報告されている様々な公知方法が適用可能である。前記公知方法としては、例えば、
（１）（ａ）反応性官能基を有する親水性セグメントと疎水性セグメントとを結合したブロック共重合体（親−疎水型ブロック共重合体）と、（ｂ）疎水性ポリマーとを混合して粒子を作製するエマルジョン法；
（２）反応官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、疎水性モノマーを重合させる分散重合法；又は
（３）ハイドロゲル粒子表面に水溶性高分子ブラシを導入する方法
などを挙げることができる。
（１）（ａ）反応性官能基を有する親水性セグメントと疎水性セグメントとを結合したブロック共重合体（親−疎水型ブロック共重合体）と、（ｂ）疎水性ポリマーとを混合して粒子を作製するエマルジョン法；
（２）反応官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーを分散剤として、疎水性モノマーを重合させる分散重合法；又は
（３）ハイドロゲル粒子表面に水溶性高分子ブラシを導入する方法
などを挙げることができる。
前記のエマルジョン法（１）で用いる親−疎水型ブロック共重合体の合成方法、及び前記の分散重合法（２）で用いる反応官能基を有する水溶性高分子マクロモノマーの合成方法としては、例えば、既に本発明者及びその共同研究者が開発した方法（例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報、ＷＯ９９／５７１７４号公報、又は特開平１１−３２２９１７号公報）を用いることができる。
前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の式（ＩＡ）：
［式中、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、独立して、炭素数１〜１０のアルコキシ基、アリールオキシ基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、炭素数１〜６のアルキル基で置換されていてもよい式：
−Ｏ−ＣＨ（Ｒ’）−ＣＨ−Ｏ−
（ここでＲ’は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である）
で表されるエチレンジオキシであるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、オキシ（＝Ｏ）であり、
Ｌは、式：
−ＣＨ（Ｒ３Ａ）−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ４Ａ）−
又は
−（ＣＨ２）ｒ−
で表される２価の基であり、ここで、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａは、独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、アリール基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であり、ｒは２〜５の整数であり、ｍＡは２〜１０，０００の整数であり、ｎＡは２〜１０，０００の整数であり、ｐＡは１〜５の整数であり、ｑは０又は１〜２０の整数であり、そして、ＺＡは、ｑが０であるとき、水素原子、アルカリ金属、アセチル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、２−メルカプトプロピオニル基、２−アミノプロピオニル基、アリル基、又はビニルベンジル基であり、ｑが１〜２０の整数であるとき、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキシルメルカプト基、又はアミノ基である］
で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーを挙げることができる。前記の式（ＩＡ）で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の製造方法により調製することができる。
−Ｏ−ＣＨ（Ｒ’）−ＣＨ−Ｏ−
（ここでＲ’は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基である）
で表されるエチレンジオキシであるか、あるいは、Ｒ１Ａ及びＲ２Ａは、一緒になって、オキシ（＝Ｏ）であり、
Ｌは、式：
−ＣＨ（Ｒ３Ａ）−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ４Ａ）−
又は
−（ＣＨ２）ｒ−
で表される２価の基であり、ここで、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａは、独立して、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、アリール基、又はアリール−（炭素数１〜３のアルキルオキシ）基であり、ｒは２〜５の整数であり、ｍＡは２〜１０，０００の整数であり、ｎＡは２〜１０，０００の整数であり、ｐＡは１〜５の整数であり、ｑは０又は１〜２０の整数であり、そして、ＺＡは、ｑが０であるとき、水素原子、アルカリ金属、アセチル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、シンナモイル基、ｐ−トルエンスルホニル基、２−メルカプトプロピオニル基、２−アミノプロピオニル基、アリル基、又はビニルベンジル基であり、ｑが１〜２０の整数であるとき、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、カルボキシルメルカプト基、又はアミノ基である］
で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーを挙げることができる。前記の式（ＩＡ）で表されるヘトロテレケリックブロックコポリマーは、例えば、ＷＯ９６／３３２３３号公報に記載の製造方法により調製することができる。
また、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、ＷＯ９９／５７１７４号公報に記載の式（ＩＢ）：
（式中、Ａ’及びＢ’は、相互に独立して、有機シリル型のアミノ保護基を表すか、あるいは、それらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜７員のジシラ−アザシクロヘテロ環式環を形成することのできる有機シリル型のアミノ保護基であり、
Ｙは、水素原子、アルカリ金属、又は適当な反応によりアルカリ金属に代えて導入可能な有機基であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、
ｎＢは１〜２０，０００の整数であり、そして、
ｍＢは０〜２０，０００の整数である）
で表されるポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＢ）で表されるポリオキシエチレン誘導体は、例えば、ＷＯ９９／５７１７４号公報に記載の製造方法により調製することができる。
Ｙは、水素原子、アルカリ金属、又は適当な反応によりアルカリ金属に代えて導入可能な有機基であり、
Ｒは水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、
ｎＢは１〜２０，０００の整数であり、そして、
ｍＢは０〜２０，０００の整数である）
で表されるポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＢ）で表されるポリオキシエチレン誘導体は、例えば、ＷＯ９９／５７１７４号公報に記載の製造方法により調製することができる。
更に、前記の親−疎水型ブロック共重合体又は水溶性高分子マクロモノマーとして使用することのできる化合物としては、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の式（ＩＣ）：
（式中、Ｒ１Ｃ、Ｒ２Ｃ、及びＲ３Ｃは、相互に独立して、直鎖若しくは分岐のアルキル基又はアラルキル基を表し、
ＺＣは、水素原子、アクリロイル基、メタクリロイル基、ビニルベンジル基、アリル基、パラトルエンスルホニル基、モノ−若しくはジ−低級アルキル置換アミノ基、カルボキシル基若しくはそのエステル基を有するアルキル基、アルデヒド基若しくはそのアセタール基を有するアルキル基、及びアルカリ金属からなる群より選ばれ、
ｍＣは０又は１であり、
ｎＣは０〜２０，０００の整数であり、そして、
ｐＣは正数２又は３であるが、
但し、ｍＣとｎＣは同時に０とならない）
で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＣ）で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体は、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の製造方法により調製することができる。
ＺＣは、水素原子、アクリロイル基、メタクリロイル基、ビニルベンジル基、アリル基、パラトルエンスルホニル基、モノ−若しくはジ−低級アルキル置換アミノ基、カルボキシル基若しくはそのエステル基を有するアルキル基、アルデヒド基若しくはそのアセタール基を有するアルキル基、及びアルカリ金属からなる群より選ばれ、
ｍＣは０又は１であり、
ｎＣは０〜２０，０００の整数であり、そして、
ｐＣは正数２又は３であるが、
但し、ｍＣとｎＣは同時に０とならない）
で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体を挙げることができる。前記の式（ＩＣ）で表される有機シリルスルフィド基含有化合物又はポリオキシエチレン誘導体は、例えば、特開平１１−３２２９１７号公報に記載の製造方法により調製することができる。
コア−シェル型粒子の前記エマルジョン法（１）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、又は式（ＩＣ）で表される各化合物（すなわち、親−疎水型ブロック共重合体）と、疎水性ポリマーとを混合することにより、コア−シェル型粒子を調製することができる。
また、コア−シェル型粒子の前記分散重合法（２）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、又は式（ＩＣ）で表される各化合物（すなわち、水溶性高分子マクロモノマー）を分散剤として、疎水性モノマーを重合させることにより、コア−シェル型粒子を調製することができる。
また、コア−シェル型粒子の前記分散重合法（２）によれば、前記の式（ＩＡ）、式（ＩＢ）、又は式（ＩＣ）で表される各化合物（すなわち、水溶性高分子マクロモノマー）を分散剤として、疎水性モノマーを重合させることにより、コア−シェル型粒子を調製することができる。
本発明方法において、水溶性高分子化合物鎖の末端に結合させることのできる導入物としては、水溶性高分子化合物鎖の末端に存在する反応性官能基と反応可能な導入物である限り、特に限定されるものではないが、例えば、生理活性物質、例えば、タンパク質（例えば、抗体又は酵素）、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は細胞などを挙げることができる。
本発明方法において、反応溶液中に共存させる結合促進性水溶性高分子化合物は、水に可溶な高分子であって、前記導入物と反応しない限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＰＥＧ、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸ジメチルアミノエチル、又はポリアリルアミンなどを挙げることができ、ＰＥＧ又はポリビニルアルコールが好ましい。
本発明方法において、基材表面にブラシ状に構築した水溶性高分子化合物鎖の末端に存在する反応性官能基と、導入物とを反応させる際には、反応溶液中に結合促進性水溶性高分子化合物を共存させた状態で反応させること以外は、公知の反応条件で実施することができる。
前記の公知反応条件は、用いる反応性官能基の種類と、導入物の種類とに応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、反応性官能基がカルボキシル基の場合には、生体分子のアミノ基との間を縮合剤（例えば、カルボジイミドなど）を用いて結合することができる。あるいは、予めカルボキシ基をスクシンイミド又はマレイミド等で活性化しておいて、その状態のまま、生体分子と混合することにより結合させることもできる。
前記の公知反応条件は、用いる反応性官能基の種類と、導入物の種類とに応じて、当業者であれば適宜決定することができる。例えば、反応性官能基がカルボキシル基の場合には、生体分子のアミノ基との間を縮合剤（例えば、カルボジイミドなど）を用いて結合することができる。あるいは、予めカルボキシ基をスクシンイミド又はマレイミド等で活性化しておいて、その状態のまま、生体分子と混合することにより結合させることもできる。
本発明方法において、反応溶液中の結合促進性水溶性高分子化合物の濃度は、用いる反応性官能基の種類、導入物の種類、及び／又は使用する結合促進性水溶性高分子化合物の種類に応じて、適宜決定することができ、特に限定されるものではない。例えば、反応性官能基としてアルデヒド基を使用し、導入物としてタンパク質［特には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）］を使用し、結合促進性水溶性高分子化合物としてＰＥＧ（特にはＰＥＧ６０００）を使用する場合には、ＰＥＧを０．１〜６％の濃度で用いることができる。
（作用）
本発明方法において、基材表面にブラシ状に結合している水溶性高分子化合物鎖の自由末端に導入物を高い効率で結合させることのできる理由は、現在のところ解明されていないが、その１つとしては、以下の推論が考えられる。すなわち、水溶性高分子化合物鎖（特にはＰＥＧ鎖）の自由末端の反応性官能基に導入物（特にはタンパク質）を結合する際に、その反応系に結合促進性水溶性高分子化合物が共存していないと、導入物と水溶性高分子化合物鎖とが相互に反発して結合効率が低下している。その系に、結合促進性水溶性高分子化合物（特にはＰＥＧ）を添加すると、導入物と結合促進性水溶性高分子化合物との間にも相互に反発する作用が働き、導入物が水溶性高分子化合物鎖の反応性官能基の近傍に接近する確率が向上する。また、水溶性高分子化合物鎖の末端には反応性官能基が存在するのに対し、結合促進性水溶性高分子化合物にはそのような反応性官能基が存在しないので、導入物に対する反発性は、水溶性高分子化合物鎖の方が、結合促進性水溶性高分子化合物よりも低くなる。こうして水溶性高分子化合物鎖の反応性官能基に、導入物が高い結合率で導入されるものと考えられる。なお、この推論は、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明方法において、基材表面にブラシ状に結合している水溶性高分子化合物鎖の自由末端に導入物を高い効率で結合させることのできる理由は、現在のところ解明されていないが、その１つとしては、以下の推論が考えられる。すなわち、水溶性高分子化合物鎖（特にはＰＥＧ鎖）の自由末端の反応性官能基に導入物（特にはタンパク質）を結合する際に、その反応系に結合促進性水溶性高分子化合物が共存していないと、導入物と水溶性高分子化合物鎖とが相互に反発して結合効率が低下している。その系に、結合促進性水溶性高分子化合物（特にはＰＥＧ）を添加すると、導入物と結合促進性水溶性高分子化合物との間にも相互に反発する作用が働き、導入物が水溶性高分子化合物鎖の反応性官能基の近傍に接近する確率が向上する。また、水溶性高分子化合物鎖の末端には反応性官能基が存在するのに対し、結合促進性水溶性高分子化合物にはそのような反応性官能基が存在しないので、導入物に対する反発性は、水溶性高分子化合物鎖の方が、結合促進性水溶性高分子化合物よりも低くなる。こうして水溶性高分子化合物鎖の反応性官能基に、導入物が高い結合率で導入されるものと考えられる。なお、この推論は、本発明の範囲を限定するものではない。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１》
（１）アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＡ−メタクリロイルの合成
アルゴン下、室温の反応容器に、溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４０ｍＬを装入した後、３，３’−ジエトキシ−１−プロパノール０．３２ｍＬ（２ｍｍｏｌ）を加え、更に、０．３２６３ｍｏｌ／ＬカリウムナフタレンのＴＨＦ溶液６．２ｍＬ（２ｍｍｏｌ）を加え、１５分間攪拌し、メタル化を行なった。更に、冷却したシリンジにてエチレンオキシド１２ｍＬ（２４０ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で２日間攪拌し、開環重合を行なった。次に、１ｍｏｌ／ＬのＤＬ−ラクチドＴＨＦ溶液８４ｍＬ（８４ｍｍｏＬ）を加え、室温で３時間重合した。その後、無水メタクリル酸４．５ｍＬ（２８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２日間攪拌してから、停止反応を行なった。
得られたブロックコポリマー溶液を、−１５℃に冷却した２−プロパノールに再沈殿させた後、遠心分離（６０００ｒｐｍ，４０分間，−１０℃）を行ない、溶媒を除去した。この操作を２回繰り返してブロックコポリマーの精製を行なった後、ベンゼンに溶解し、凍結乾燥を行なった。
図１に、ブロックコポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量は、ＧＰＣ測定の結果より算出した。ポリ乳酸（ＰＬＡ）の分子量は、１Ｈ−ＮＭＲの結果より、ＧＰＣ測定で得られたＰＥＧ分子量を用いて算出した。ＰＥＧの分子量は約５０００であり、ＰＬＡの分子量は約５００であった。
（１）アセタール−ＰＥＧ−ＰＬＡ−メタクリロイルの合成
アルゴン下、室温の反応容器に、溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４０ｍＬを装入した後、３，３’−ジエトキシ−１−プロパノール０．３２ｍＬ（２ｍｍｏｌ）を加え、更に、０．３２６３ｍｏｌ／ＬカリウムナフタレンのＴＨＦ溶液６．２ｍＬ（２ｍｍｏｌ）を加え、１５分間攪拌し、メタル化を行なった。更に、冷却したシリンジにてエチレンオキシド１２ｍＬ（２４０ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で２日間攪拌し、開環重合を行なった。次に、１ｍｏｌ／ＬのＤＬ−ラクチドＴＨＦ溶液８４ｍＬ（８４ｍｍｏＬ）を加え、室温で３時間重合した。その後、無水メタクリル酸４．５ｍＬ（２８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２日間攪拌してから、停止反応を行なった。
得られたブロックコポリマー溶液を、−１５℃に冷却した２−プロパノールに再沈殿させた後、遠心分離（６０００ｒｐｍ，４０分間，−１０℃）を行ない、溶媒を除去した。この操作を２回繰り返してブロックコポリマーの精製を行なった後、ベンゼンに溶解し、凍結乾燥を行なった。
図１に、ブロックコポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子量は、ＧＰＣ測定の結果より算出した。ポリ乳酸（ＰＬＡ）の分子量は、１Ｈ−ＮＭＲの結果より、ＧＰＣ測定で得られたＰＥＧ分子量を用いて算出した。ＰＥＧの分子量は約５０００であり、ＰＬＡの分子量は約５００であった。
（２）アルデヒド末端ＰＥＧを含む粒子の調製
アルゴン下、室温の反応容器に、アルゴン置換した超純水４００ｍＬを加えた後、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）３８８ｍｇ及びブロックコポリマー［実施例１（１）で調製したもの］８．６ｇのスチレン溶液２７ｍＬをアルゴン置換し、攪拌下（４００ｒｐｍ）で滴下した。
アルゴン下、室温の反応容器に、アルゴン置換した超純水４００ｍＬを加えた後、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）３８８ｍｇ及びブロックコポリマー［実施例１（１）で調製したもの］８．６ｇのスチレン溶液２７ｍＬをアルゴン置換し、攪拌下（４００ｒｐｍ）で滴下した。
室温にて３０分間攪拌した後、６０℃にて１８時間、更に８０℃にて６時間攪拌（４００ｒｐｍ）することにより、重合を行なった。重合反応終了後、濾紙［Ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ２（直径＝１８５ｍｍ）；Ａｄｖａｎｔｅｃ社］による濾過を行ない、表層部にアセタール基を有するパーティクル（ａｃｅｔａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）を得た。次に、１ｍｏｌ／Ｌ−ＨＣｌを用いてｐＨ２．０に調整した後、２時間攪拌した。その後、１ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＯＨを用いてｐＨ５．０として、保護基であるアセタール基を脱保護し、表層部にアルデヒド基を導入した。
その後、脱塩のため、このパーティクル水溶液１００ｍＬを蒸留水２Ｌに対して一日透析［分画分子量（ＭＷＣＯ）＝１２０００〜１４０００、蒸留水を４回交換］を行なった後、濾紙［Ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ２（直径＝１８５ｍｍ）；Ａｄｖａｎｔｅｃ社］による濾過を行ない、表層部にアルデヒド基を有するパーティクル（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわち、アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子（粒径＝１００ｎｍ）を得た。得られた粒子（ＰＥＧ分子量＝約５０００，ＰＬＡ分子量＝約５００）の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を、図２に示す。
その後、脱塩のため、このパーティクル水溶液１００ｍＬを蒸留水２Ｌに対して一日透析［分画分子量（ＭＷＣＯ）＝１２０００〜１４０００、蒸留水を４回交換］を行なった後、濾紙［Ｆｉｌｔｅｒ ｐａｐｅｒ ２（直径＝１８５ｍｍ）；Ａｄｖａｎｔｅｃ社］による濾過を行ない、表層部にアルデヒド基を有するパーティクル（ａｌｄｅｈｙｄｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわち、アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子（粒径＝１００ｎｍ）を得た。得られた粒子（ＰＥＧ分子量＝約５０００，ＰＬＡ分子量＝約５００）の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を、図２に示す。
また、実施例１（１）において、エチレンオキシドの開環重合を行なった後、ＤＬ−ラクチドＴＨＦ溶液を加えることなく、無水メタクリル酸を加えたこと以外は、実施例１（１）及び実施例１（２）の操作を繰り返すことにより、ＰＬＡユニットの長さを変化させた比較用粒子（ＰＥＧ分子量＝約５０００，ＰＬＡ分子量＝０）を調製した。得られた比較用粒子のＳＥＭ写真を、図３に示す。
（３）アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子へのＰＥＧ共存下でのＢＳＡの結合
実施例１（２）で調製したアルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子（粒径＝１００ｎｍ）の懸濁液（４０ｍｇ／ｍＬ、蒸留水）０．５ｍＬに、ＰＥＧ６０００（５０ｍｇ）を加え、溶解した。この混合液に、１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍＬに溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で一時間混和反応を実施した。続いて、反応液にＮａＣＮＢＨ３１２ｍｇを加え、更に室温で一夜混和反応を実施した。反応液に１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６）０．５ｍＬを加え、室温で４時間ブロックした後、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセファローズＣＬ−６Ｂカラム（２．５ｃｍ×４０ｃｍ）で２ｍＬ毎に分画し、最初に溶出された粒子のピークをプールした。
実施例１（２）で調製したアルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子（粒径＝１００ｎｍ）の懸濁液（４０ｍｇ／ｍＬ、蒸留水）０．５ｍＬに、ＰＥＧ６０００（５０ｍｇ）を加え、溶解した。この混合液に、１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍＬに溶解した牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｍｇを加え、室温で一時間混和反応を実施した。続いて、反応液にＮａＣＮＢＨ３１２ｍｇを加え、更に室温で一夜混和反応を実施した。反応液に１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６）０．５ｍＬを加え、室温で４時間ブロックした後、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセファローズＣＬ−６Ｂカラム（２．５ｃｍ×４０ｃｍ）で２ｍＬ毎に分画し、最初に溶出された粒子のピークをプールした。
《比較例１》
（１）アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子へのＰＥＧ不在下でのＢＳＡの結合
アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子の懸濁液に、ＰＥＧ６０００を加えなかったこと以外は、実施例１（３）の操作を繰り返すことにより、セファローズＣＬ−６Ｂカラムから最初に溶出された粒子のピークをプールした。
（１）アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子へのＰＥＧ不在下でのＢＳＡの結合
アルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子の懸濁液に、ＰＥＧ６０００を加えなかったこと以外は、実施例１（３）の操作を繰り返すことにより、セファローズＣＬ−６Ｂカラムから最初に溶出された粒子のピークをプールした。
《評価例１》
（１）粒子表面のＢＳＡの定量
本評価例では、本発明者が確立したタンパク質定量法、すなわち、市販のＢＣＡ蛋白分析試験試薬（ピアス社）を用い、サンプル増量法で感度を上昇させて粒子上のタンパク質を定量する方法を用いた。
具体的には、標準物質として、ＢＳＡの０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液による希釈列を０〜１００μｇ／ｍＬの間で調製し、その希釈液５０μＬにＢＣＡ蛋白分析試験試薬２００μＬを加えて密封した後、３７℃で３０分間静置反応を実施した。反応終了後、ライトパス１ｃｍで少量サンプルが測定可能なミクロセルを用い、５６２ｎｍでの吸光度を測定した。
検体として、実施例１及び比較例１でそれぞれ得られた、カラムから最初にピークが溶出されたＢＳＡ結合粒子を用い、前記と同様に、その５０μＬにＢＣＡ蛋白分析試験試薬２００μＬを加えて密封した後、３７℃で３０分間静置反応を実施し、５６２ｎｍの吸光度を測定した。なお、粒子を含む分画は白濁しており、最初から散乱による５６２ｎｍの吸光度が存在するため、実際の測定値から、ＢＣＡ試薬の代わりに蒸留水２００μＬを加えた時の吸光度を差し引いて検体の測定値とし、前記標準物質で得られた吸光度との比較からタンパク質量を算出した。
実施例１で得られたＢＳＡ結合粒子では、粒子１ｍｇ上にＢＳＡ１６．８μｇが結合しており、比較例１で得られたＢＳＡ結合粒子では、粒子１ｍｇ上にＢＳＡ３．５μｇが結合していた。反応時に５％のＰＥＧ６０００を共存させることにより、ＢＳＡ結合量が４．８倍に上昇したことが確認された。
（１）粒子表面のＢＳＡの定量
本評価例では、本発明者が確立したタンパク質定量法、すなわち、市販のＢＣＡ蛋白分析試験試薬（ピアス社）を用い、サンプル増量法で感度を上昇させて粒子上のタンパク質を定量する方法を用いた。
具体的には、標準物質として、ＢＳＡの０．３Ｍ塩化ナトリウム水溶液による希釈列を０〜１００μｇ／ｍＬの間で調製し、その希釈液５０μＬにＢＣＡ蛋白分析試験試薬２００μＬを加えて密封した後、３７℃で３０分間静置反応を実施した。反応終了後、ライトパス１ｃｍで少量サンプルが測定可能なミクロセルを用い、５６２ｎｍでの吸光度を測定した。
検体として、実施例１及び比較例１でそれぞれ得られた、カラムから最初にピークが溶出されたＢＳＡ結合粒子を用い、前記と同様に、その５０μＬにＢＣＡ蛋白分析試験試薬２００μＬを加えて密封した後、３７℃で３０分間静置反応を実施し、５６２ｎｍの吸光度を測定した。なお、粒子を含む分画は白濁しており、最初から散乱による５６２ｎｍの吸光度が存在するため、実際の測定値から、ＢＣＡ試薬の代わりに蒸留水２００μＬを加えた時の吸光度を差し引いて検体の測定値とし、前記標準物質で得られた吸光度との比較からタンパク質量を算出した。
実施例１で得られたＢＳＡ結合粒子では、粒子１ｍｇ上にＢＳＡ１６．８μｇが結合しており、比較例１で得られたＢＳＡ結合粒子では、粒子１ｍｇ上にＢＳＡ３．５μｇが結合していた。反応時に５％のＰＥＧ６０００を共存させることにより、ＢＳＡ結合量が４．８倍に上昇したことが確認された。
《実施例２》
（１）抗体Ｆ（ａｂ’）２分画結合時のＰＥＧ共存の効果
実施例１で調製したアルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子（粒径＝１００ｎｍ）の懸濁液（４０ｍｇ／ｍＬ、蒸留水）０．５ｍＬに、ＰＥＧ６０００を０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、又は６０ｍｇの量で加えたＰＥＧ共存粒子混合液を調製した。各混合液に、１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍＬに透析した抗Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２分画１ｍｇを加え、室温で一時間混和反応を実施した。なお、前記抗ＣＲＰウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２分画は、常法に従って、抗ＣＲＰウサギ抗体（Ｄａｋｏ社）から調製した。この反応液に、ＮａＣＮＢＨ３１２ｍｇを加え、更に室温で一夜混和反応を実施した。
反応液に１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６）０．５ｍＬを加えて室温で４時間ブロックした後、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセファローズＣＬ−６Ｂカラム（２．５ｃｍ×４０ｃｍ）で２ｍＬ毎に分画し、最初に溶出された粒子のピークをプールした。
プールした粒子上のタンパク質量を、評価例１に記載の方法で測定した結果を表１に示す。表１に示すように、反応時のＰＥＧ濃度が０％（すなわち、ＰＥＧ不在下）又は６％では、測定可能感度以下であり、４％のＰＥＧ６０００を共存させたときが最もタンパク質結合量が多く、抗体の場合は４％が至適と思われた。
（１）抗体Ｆ（ａｂ’）２分画結合時のＰＥＧ共存の効果
実施例１で調製したアルデヒド末端ＰＥＧ被覆粒子（粒径＝１００ｎｍ）の懸濁液（４０ｍｇ／ｍＬ、蒸留水）０．５ｍＬに、ＰＥＧ６０００を０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、又は６０ｍｇの量で加えたＰＥＧ共存粒子混合液を調製した。各混合液に、１ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）０．５ｍＬに透析した抗Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）ウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２分画１ｍｇを加え、室温で一時間混和反応を実施した。なお、前記抗ＣＲＰウサギ抗体Ｆ（ａｂ’）２分画は、常法に従って、抗ＣＲＰウサギ抗体（Ｄａｋｏ社）から調製した。この反応液に、ＮａＣＮＢＨ３１２ｍｇを加え、更に室温で一夜混和反応を実施した。
反応液に１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．６）０．５ｍＬを加えて室温で４時間ブロックした後、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液で平衡化したセファローズＣＬ−６Ｂカラム（２．５ｃｍ×４０ｃｍ）で２ｍＬ毎に分画し、最初に溶出された粒子のピークをプールした。
プールした粒子上のタンパク質量を、評価例１に記載の方法で測定した結果を表１に示す。表１に示すように、反応時のＰＥＧ濃度が０％（すなわち、ＰＥＧ不在下）又は６％では、測定可能感度以下であり、４％のＰＥＧ６０００を共存させたときが最もタンパク質結合量が多く、抗体の場合は４％が至適と思われた。
《表１》
ＰＥＧ濃度（％） 抗体結合量（μｇ／ｍｇ）
０ ０
２ ０．７８
４ １．４５
６ ０
ＰＥＧ濃度（％） 抗体結合量（μｇ／ｍｇ）
０ ０
２ ０．７８
４ １．４５
６ ０
本発明方法によれば、基材表面にブラシ状に構築した水溶性高分子化合物（特にはＰＥＧ）の末端に存在する反応性官能基と、導入物（例えば、生体分子）とを反応させる場合に、前記高分子化合物末端に前記導入物を高い効率で結合させることができる。機能性分子の一つとして注目されてきたＰＥＧ分子に自由に生体分子を結合し、その応用範囲を広げるという意味で画期的である。また、ＰＥＧブラシ粒子のＰＥＧ末端へのタンパク質の導入だけでなく、様々な医療器材の表面へのバイオ分子の導入が可能になり、高機能生体機能界面の創出が可能となる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (9)
- 水又は水系溶媒中において、（１）一方の結合末端にて基材表面にブラシ状に結合した水溶性高分子化合物鎖のもう一方の自由末端に存在する反応性官能基と、（２）前記反応性官能基に反応可能な導入物とを、ポリエチレングリコールを共存させた状態で反応させることを特徴とする、前記水溶性高分子化合物鎖の前記自由末端への前記導入物の結合方法。
- 基材表面にブラシ状に結合した水溶性高分子化合物鎖が、ポリエチレングリコールから実質的になる、請求項１に記載の方法。
- 反応性官能基と反応可能な導入物が、タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
- 反応性官能基と反応可能な導入物が、ＤＮＡである、請求項１又は２に記載の方法。
- 反応性官能基と反応可能な導入物が、細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 反応性官能基がアルデヒド基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 基材がラテックス粒子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 基材が高分子ミセルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
- 水又は水系溶媒中において、（１）（ａ）水不溶性高分子化合物から実質的になるコア部分と、（ｂ）反応性官能基を有する水溶性高分子化合物から実質的になり、前記コア部分の表面をブラシ状に覆うシェル部分とからなり、しかも、前記コア部分と前記シェル部分とが、全体として、水不溶性高分子と水溶性高分子とのブロックコポリマーからなるコア−シェル型粒子と、（２）前記反応性官能基に反応可能な導入物とを、ポリエチレングリコールを共存させた状態で反応させることを特徴とする、前記水溶性高分子化合物鎖の前記自由末端への前記導入物の結合方法。
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