JP4963789B2 - 蛍光体または造影剤を含有するラテックスポリマー粒子およびそれらの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、特に、生体成分の検出、診断の技術分野で用いることのできる無機蛍光体または無機造影剤含有ラテックスポリマー粒子およびそれらの粒子の製造方法に関する。なお、本明細書では、「ラテックスポリマー粒子」とは、水性媒体中でラテックスを形成しうるポリマー粒子を意味する。

従来の生体成分の検出、診断等に用いられてきた無機金属含有ラテックスポリマー粒子として、疎水性のビニル芳香族モノマー（また、場合によりコモノマーを含んでもよい）および磁性粒子を分散させた有機層と乳化剤を含む水性溶液との乳化重合により製造されるものが挙げられる。そして、該ラテックス粒子中へ磁性粒子を効率よく封入するのに、水不溶性の有機化合物を共存させて乳化重合を行っている（例えば、特許文献１参照。）。
また、特許文献１に記載された方法において合成される「磁性粒子は、磁性体がポリマーによりコーティングされている形状で、核となる磁性体の粒子径の違いにより、大きさの異なる磁性粒子となる。このため、磁性粒子の大きさを均一に制御する方法は難しく、磁性体の粒子径が０．１〜１．０μｍの範囲内での大きさの制御は特に困難である。また、合成操作が非常に繁雑である。」として、ポリスチレンまたはスチレン−ブタジエン共重合体であるラテックスポリマー粒子を予め有機溶媒および加熱を用いて膨潤させておき、磁性体または蛍光性物質を初めとする標識性物質を加えて混合撹拌することにより、ラテックスポリマー粒子の表層近傍に蛍光性物質等を包埋させる方法が提供されている（例えば、特許文献２）。
特許文献１に記載された乳化重合の際に、磁性体粒子をラテックスポリマー粒子中に封入する方法に随伴する短所が存在するためか、ラテックスポリマー粒子への磁性体または蛍光体の封入または包埋は、殆どが膨潤させたポリマー粒子を蛍光体等（必要により、キレート化合物とする。）の水性溶液と接触させて蛍光体等をポリマー粒子内へ混入または取り込ませる方法が採用されている（例えば、特許文献３、特許文献４参照。）。なお、特許文献３には、ラテックスポリマー粒子の水溶液中での安定性を高め、生理学的に反応性の種を共有結合または吸収によって該ポリマー粒子に固定するために、スチレン等の疎水性モノマーと、その他に、アクリルアミド等の非イオン性水溶性モノマーおよびアクリル酸等の陰イオン性モノマーを用いて得られたラテックスポリマー粒子が記載されている。また、特許文献４では、水媒体中での安定性に優れるだけでなく、タンパク質等の機能性物質を化学結合により安定に固定することが可能で、かつタンパク質等の非特異的吸着が起こりにくい反応性マイクロスフェアーを提供する目的で、片末端に重合可能なエチレン性基を有し、もう一つの片末端に活性エステル基を有するポリ（オキシアルキレン）セグメントからなるマクロマーがスチレンモノマー等のコモノマーとして用いられている。
なお、上記および下記において引用する文献は、次のとおりである。
特開昭５６−１６４５０３号公報（特に、第１頁右下欄２−１４行参照。） 特開平１０−５５９１１号公報（特に、第２頁右欄３３−４４行、第５頁左欄３４−４５行参照。） 特開昭６１−２１８９４５号公報（特に、第４頁左下欄４−１６行、第３頁右上欄２−１５行参照。） 特開平８−１３３９９０号公報（特に、第２頁左欄［請求項１］、同右欄１８−２８行参照。）

特許文献２では、上述のとおり、ラテックスポリマー粒子の表層近傍に蛍光物質等が包埋されるが、その包埋を２官能性モノマー等の重合と同時に行い、高分子材料（ラテックスポリマー粒子）の表層にオリゴマー程度の分子量の大きくない重合体を付着させている。すなわち、このことは、特許文献２に記載の包埋方法のみでは、包埋された蛍光物質等が洗浄等によりポリマー粒子から放出される可能性があることを示唆する。他方、特許文献４には、反応性マイクロスフェアーのコア部に染料や顔料を滲込ませて機能性染料等として使用できることが記載されているが、如何にして滲込ませうるのかについて具体的に記載されていないし、現に、染料等がマイクロスフェアーのコア部に滲込んだものの記載もない。また、特許文献４には、タンパク質の非特異的吸着が起こりにくくなったマイクロスフェアーが記載されているが、さらなる改善が可能であれば、そのような手段を提供することが望ましいであろう。
したがって、本発明の第一の目的は、ラテックスポリマー粒子（殊に、例えば特許文献４に記載されるような、親水性をポリマー粒子に付与するマクロマー由来の領域を粒子の表層に有するもの）に効率よく、かつ、安定に蛍光体または造影剤を含有せしめる方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、蛍光体または造影剤を安定に含有し、しかも、望ましくないタンパク質等のラテックスポリマー粒子への非特異的吸着をより一層低減できるラテックスポリマー粒子を提供することにある。
上記の課題を解決すべく研究を重ねてきたところ、特許文献１における乳化重合中に磁性粒子を共存させ、さらに水不溶性の有機化合物をも共存させるのとは対照的に、ラテックスポリマー粒子を形成する際に、ラテックス形成性モノマーおよび水溶性（または親水性）のポリマーセグメントを有するマクロマーを用いて共重合させるにもかかわらず、該重合中に無機蛍光体または無機造影剤を共存させると、これらの蛍光体または造影剤が効率よく、かつ、安定にポリマー粒子中に封入または取り込まれることを見出した。また、かようなマクロマーとして、その片末端に特定の官能基を担持するポリ（エチレングリコール）セグメントを有する少なくとも２種類のマクロマーを用いると、１種のみのマクロマーを用いるよりは、望ましくないタンパク質等の非特異的吸着を有意に低減できることを見出した。
したがって、本発明によれば、（ｉ）１種もしくは２種以上のラテックス形成性モノマー、
（ｉｉ）片末端に重合可能なエチレン性基を有し疎水性ポリマーセグメントを介するかもしくは介することなく、他の片末端側に親水性ポリマーセグメントを有するマクロマー、
（ｉｉｉ）ラジカル重合開始剤、ならびに
（ｉｖ）無機蛍光体または無機造影剤
を含んでなる水性媒体中で、該水性媒体を撹拌しながら重合反応を行うことを特徴とする蛍光体を含有するラテックスポリマー粒子の製造方法が提供される。
また、別の態様の本発明として、ａ）１種もしくは２種以上のラテックス形成性モノマー０．５〜９９．５重量％、および
ｂ）片末端に重合可能なエチレン性基を有し、疎水性ポリマーセグメントを介することなく他の片末端側に親水性ポリマーセグメントを有するマクロマー０．５〜９９．５重量％［ここで、該マクロマーは、他の片末端にヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、イミノ基メルカプト基、活性エステル型の保護されたヒドロキシル基、活性エステル型の保護されたカルボキシル基、アセタール型の保護されたアルデヒド基、有機スルホニルで保護されたヒドロキシル基、反応性の保護されたアミノ基およびＣ_１−Ｃ_４アルコキシル基からなる群より選ばれる基を担持するポリ（エチレングリコール）セグメントを有し、そのエチレングリコール繰り返し単位が、５〜１２００である少なくとも２種のマクロマーを含む。］
の水性媒体中でのラジカル重合によって形成される平均粒径０．００１μｍ〜５μｍのラテックスポリマー粒子であって、該粒子の疎水性コア領域に無機蛍光体または無機造影剤を含有する疎水性コア−親水性シェル型のラテックスポリマー粒子が提供される。

図１は、マクロマーの合成例１で得られたマクロマーの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムである。
図２は、マクロマーの合成例２で得られたマクロマーの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムである。
発明の具体的な形態の記述
本明細書では、「ラテックスポリマー粒子」とは、水性媒体中でラテックスを形成しうるポリマー粒子を意味する。ラテックスとは当業者に共通に認識されている意味内容で用いており、例えば、水を分散媒としたポリマー粒子の分散液である。水性媒体は、水と混和しうる有機溶媒、例えば、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル等、さらには緩衝剤等を含み得る水溶液を意味し、特定例では純水である。
「無機蛍光体」は、蛍光性物質もしくは蛍光物質と互換可能に用いられており、外部からの種々な刺激により、かなり高い効率でルミネセンスを発する物質を称している。造影剤は核磁気共鳴画像形成（ＭＲＩ）剤またはＸ線造影剤を意味する。限定されるものでないが、無機蛍光体または無機造影剤としては、周期表のランタノイドに属する希土類金属、例えば、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、サマリウム（Ｓｍ）およびガドリニウム（Ｇｄ）等を挙げることができ、また、ある一定の半導体、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＩｎＰ等を挙げることができる。希土類金属は、キレート化合物またはキレート錯体として本発明に従うラテックスポリマー粒子中に含有せしめることができる。蛍光体を含有するラテックス粒子とは、後述する重合可能なエチレン性基を有するラテックス形成性モノマーとマクロマーのとの共重合によってもたらされるポリマー粒子の疎水性コア領域に蛍光体の全部もしくは一部分が封入されているかまたは取り込まれ、かような粒子の通常の洗浄等では殆どもしくは全く放出されない状態にある粒子を意味する。
このような粒子を形成するのに有利に用いることのできる希土類金属のキレート剤としては、限定されるものでないが、テノイルトリフルオロアセトン、ベンゾイルアセトン、アセチルアセトン、等の１，３−ジケトン類を挙げることができる。また、特に造影剤として、例えば、Ｇｄを用いる場合には、ガドペント酸メグルミン、ガドジアミド水和物、等の一般名で最終製品として市販されているような錯体をそのまま用いてもよい。さらに、蛍光を発するために希土類金属を用いる場合には、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）、フェナントロリン（Ｐｈｅｎ）等のルイス塩基を希土類金属化合物と一緒に用いてもよい。また、希土類金属以外のバリウム、バリウム塩等も、上記造影剤に包含されるものの例示である。
本発明で用いることのできる「ラテックス形成性モノマー」は、本発明の目的に沿う限り、水性媒体中でのラジカル重合反応によりラテックスを形成できるそれ自体既知のいかなるモノマーも包含する。それ自体既知とは、例えば、上記の特許文献１、特許文献２、特許文献３等に記載されているごとき当該技術分野で公知であることを意味する。限定されるものでないが、このようなモノマーとしては、疎水性ビニルモノマー、特に、ビニル芳香族化合物、例えば、置換もしくは未置換スチレン、１−ビニルナフタリン、より具体的には、スチレン、α−メチルスチレン、エチルスチレン、ｐ−ブロモスチレン、ビニルトルエン、ｔ−ブチルスチレン等、が挙げられ、その他、（メタ）アクリル酸Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、より具体的には、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸ｎ−ブチル等が挙げられる。また、置換もしくは未置換の共役ジエン、例えばブタジエン等も含むことができる。このような疎水性モノマーは、本発明に従うラテックスポリマー粒子のポリマー総重量当たり、０．５〜９９．５重量％、好ましくは１０〜９０重量％、より好ましくは２０〜８０重量％を用いることができる。また、これらのモノマーのうち、置換もしくは未置換スチレンを用いるのが一般に好ましいが、後述するマクロマーの重合可能なエチレン性基が芳香族モノマー由来の基である場合は、（メタ）アクリル酸Ｃ_１−Ｃ_４アルキルも好ましく用いることができる。Ｃ_１−Ｃ_４アルキルは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルであることができる。さらに、これらのモノマーは、２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、（メタ）アクリル酸と称する場合、上記の（メタ）アクリル酸エステル類の例示から明らかなように、アクリル酸またはメタクリル酸のいずれか、または両方を意味する。
上記の疎水性モノマーは、本発明にいうラテックス形成性モノマーとして必須であるが、これらのモノマーには、任意成分として水溶性モノマーを含めることができる。水溶性モノマーの代表的なものとしては、（メタ）アクリル酸アミド、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシプロピル、Ｎ−ビニルピロリドン等を挙げることができ、上記の疎水性モノマー量の一部、例えば、０〜９９重量％を代替できる。さらにまた、架橋性モノマー、例えば、上記ビニル芳香族化合物のジビニル化合物または（メタ）アクリルエステルのビス化合物に相当するモノマー、具体的には、ジビニルベンゼン、ビス（メタ）アクリロイルエチル等を任意成分として、上記の疎水性モノマー量の一部、例えば、０〜９９重量％を代替できる。
本発明では、ラテックスポリマー粒子のポリマーを構成する、さらなる必須のモノマーとして少なくとも親水性ポリマーセグメントを有するマクロマーを用いる。マクロマーはマクロモノマーとも称され、通常、分子量が数千〜数万の重合可能なポリマーを意味するが、本発明に関しては、分子量数百の、所謂オリゴマーに分類されるものも包含する意味で用いている。本発明で用いるマクロマーは、必須の構成セグメントとして親水性ポリマー（オリゴマーを包含する。以下、同じ。）セグメントを有する。親水性セグメントとは、マクロマー中のセグメントとしてではなく、相当する独立したポリマーとした場合に水に可溶性となるポリマー鎖からなるセグメントを意味する。
このような親水性セグメントは、非イオン性であることが好ましく、限定されるものでないが、ポリ（エチレングリコール）［以下、ＰＥＧと略記する場合があり、なお、ポリ（オキシエチレン）もしくはポリ（エチレンオキシド）と互換可能な用語である。］、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（デキストラン）、ポリ（デキストリン）、ゼラチン、等の主鎖からなる。上記のマクロマーは、このような親水性セグメントが、片末端で適当な連結基を介して重合可能なエチレン性基に結合している。「重合可能なエチレン性基」とは、通常のラジカル重合反応条件下で反応を進行することができる機能を有する基を意味する。したがって、限定されるものでないが、重合可能なエチレン性基は上記でラテックス形成性モノマーについて例示したモノマー由来の残基中に存在しうる基であることができる。このような残基の例としては、（メタ）アクリロイル、芳香族環が置換されたもしくは未置換のビニルベンジル、ビニルフェニル、等が挙げられる。前記の親水性ポリマーセグメントは、相当するマクロマーの調製法によって左右されるが、前記残基と酸素もしくは硫黄原子、カルボニル、カルボニルオキシ、オキシカルボニル、イミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレン、Ｃ_１−Ｃ_４アルキニレンの１種または２種以上からなる連結基を介して結合されて、本発明で用いるマクロマーまたはマクロマーの部分となりうる。このようなマクロマーまたは部分は、相当する水溶性ポリマーの前記残基によるそれ自体既知の選択的末端化により形成することができる。例えば、合成ポリマーセグメントにあってはリビングポリマーの（メタ）アクリル酸もしくはその反応性エステルを用いる末端処理もしくはリビング重合開始剤としてビニルベンジルアルコール等のアルコール類を用いて、リビング重合を行うか、或いは天然水溶性ポリマーセグメントにあっては、相当するポリマーの（メタ）アクリル酸もしくはその反応性エステルを用いる片末端の選択的処理により、形成することができる。これらの処理または反応は、いずれも当業者に周知であるものが利用できる。
本発明で用いるマクロマーは、また、上記の連結基に加えて、疎水性ポリマーセグメントを介して、親水性ポリマーセグメントが結合していてもよい。疎水性ポリマーセグメントとは、上述した親水性ポリマーセグメントと対立する概念を表すものとして、本明細書では用いており、具体的には、該セグメントに相当する独立したポリマーが水に難溶性ないし不溶性であるものと、理解されている。限定されるものでないが、このような疎水性セグメントは、ポリ（ラクチド）鎖、ポリ（ε−カプロラクトン）鎖、ポリ（α−および／もしくはβ−ベンジルアスパラギン酸）鎖、ポリ（γ−ベンジルグルタミン酸）鎖であることができる。親水性セグメントとしてポリ（エチレングリコール）鎖を、そして疎水性セグメントとして前記に例示した鎖を有するポリマーまたはマクロマーの例は、例えば、米国特許第５，４４９，５１３号明細書（または特開平６−１０７５６５号公報）または米国特許第５，９２５，７２０号明細書（またはＷＯ ９６／３３２３３）を参照されたい。これらのセグメントの鎖長は、本発明の目的に沿う限り、上述のオリゴマーに相当するものからポリマーに相当するものであることができ、ＰＥＧを例にとると、エチレングリコール単位が５〜１２００の範囲内にあることが好ましい。当業者であれば、ＰＥＧ以外の親水性ポリマーセグメントの鎖長も、上記のＰＥＧを参考に決定できる。他方、疎水性ポリマーセグメントは０〜５００、該ポリマーセグメントが存在する場合は、５〜５００の範囲内にあることができる。このような疎水性ポリマーセグメントが存在する場合、該セグメントは上記の芳香族環が置換された（例えば、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、ハロゲン原子、等により）もしくは未置換のビニルベンジル、（メタ）アクリロイル等の残基に、上記の酸素もしくは硫黄原子、カルボニル、カルボニルオキシ、オキシカルボニル、イミノ、カルボニルイミノ、イミノカルボニル、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレン、Ｃ_１−Ｃ_４アルキニレンの１種または２種以上からなる連結基を介して結合することができる。また、疎水性ポリマーセグメントと親水性ポリマーセグメントとは、直接結合するか、または、前記連結基を介して結合することができる。
本発明で用いるのに特に好ましいマクロマーは、疎水性ポリマーセグメントが存在せず、ＰＥＧを親水性ポリマーセグメントとして有するものである。このような親水性ポリマーセグメントは、上述した、非特異的タンパク質等の吸着を低減するのに役立つ。また、ＰＥＧセグメントは、重合可能なエチレン性基を有する末端に対して、もう一つの末端に、ヒドロキシル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、活性エステル型の保護されたヒドロキシル基、活性エステル型の保護されたカルボキシル基、アセタール型の保護されたアルデヒド基、反応性の保護されたアミノ基（例えば、マレイミド）等の、場合により保護基の脱離後に生体分子、例えば、タンパク質、核酸、糖類、およびこれらの複合物中に存在する官能基との間で共有結合を形成しうる反応性の官能基を担持せしめたものが都合よく使用できる。また、上記ＰＥＧセグメントのもう一つの末端の基としては、生体分子等との反応性もしくは相互作用を抑制するように、Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシル基であるか、または、他の官能基へ化学的に転化できるような有機スルホニルで保護されたヒドロキシル基であることができる。限定されるものでないが、有機スルホニルとしては、トシル、メシル等が挙げられる。なお、「活性エステル型の保護された」とは、当該保護されたヒドロキシル基およびカルボキシル基が、それぞれ、上述の生体分子中のカルボキシル基およびアミノ基もしくはヒドロキシル基と容易にエステルを形成しうるように保護されていることを意味し、当業者に周知の概念で用いている。例えば、活性エステル型の保護されたヒドロキシル基を有するマクロマーの例としては、上記の特許文献４にも記載があり、また、上述のＷＯ ９６／３３２３３には、疎水性ポリマーセグメントを有するマクロマーや、多種反応性官能基を片末端に導入する方法が記載されており、これらに準じて当業者であれば、上述した、疎水性ポリマーセグメントを有していない多種多様のマクロマーを容易に製造できる。このような（疎水性ポリマーセグメントを含む場合がある）マクロマーの代表例は次の一般式（Ｉ）で表すことができるであろう。

式中、Ｒは水素原子またはＣ_１−Ｃ_４アルキル基を表し、Ｌ_１は、ラジカル重合可能なモノマーのビニル基以外の部分であり、例えば、メチレン、置換もしくは未置換のフェニレンもしくはフェニルアルキレン、オキシ、カルボニル、カルボニルオキシ、およびそれらの組み合わさった連結基を表し、Ｂは、式

を表し、
Ｌ_２は、酸素原子、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレン、カルボニル、イミノ、およびこれらの２個以上が組み合わさった連結基を表し、
Ｘは、水素原子、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレンカルボキシル、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレンカルボキシエステル（ここで、エステルは酸ハロゲン化物、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルエステル、その他の活性エステル等）、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレンアミノ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレンメルカプト、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレンアセタール（例えば、

ここでＲ^１は水素原子、もしくはＣ_１−Ｃ_４アルキルである）、Ｃ_１−Ｃ_４アルキレンオキシカルボニルイミダゾール（例えば、

ここでＲ^２は水素原子もしくはＣ_１−Ｃ_４アルキルである）を表し、ｍは０〜５００の整数であり、ｎは５〜１２００の整数である。
このようなマクロマーのうち、ｍがＯを表し（すなわち、疎水性セグメントを有していない）、そしてＸが水素原子またはＣ_１−Ｃ_４アルキル（かようなアルキルの例示は、（メタ）アクリル酸エステルについて説明したのと同じである。）を表すマクロマーの１種（以下、非反応性ＰＥＧマクロマーともいう）と、Ｘが水素原子またはＣ_１−Ｃ_４アルキル以外を表すマクロマー（以下、反応性ＰＥＧマクロマーともいう。）の少なくとも１種のマクロマーを組み合わせて用いるのが、特に好ましい。このように２種のマクロマーを組み合わせ使用して得られる蛍光体含有ラテックスポリマー粒子は、本発明者らの知る限りでは、従来文献に未載であり、新規である。そして、上記の２種のマクロマーを用いて調製したポリマー粒子は、マクロマーとして、反応性ＰＥＧマクロマーのみからなる反復単位を含む、例えば、特許文献４に記載の機能性物質固定化マイクロスフェアーに比べ、それらの表面への望ましくないタンパク質の非特異的吸着が有意に低減するとの予期せぬ効果を奏する。なお、このような新規の蛍光体または造影剤含有ラテックスポリマー粒子は、上述した本発明の方法によって都合よく製造できるが、蛍光体または造影剤をコア部に導入する方法としてはそれ自体既知の、蛍光体または造影剤不含のラテックスポリマー粒子を予め形成しておき、その後、適当な方法で蛍光体または造影剤を導入する方法によっても製造できる。
したがって、本発明では、別の態様のものとして、本発明の製造方法に限定されるものでない疎水性コア領域に蛍光体を含有する疎水性コア−親水性シェル型のラテックスポリマー粒子が提供される。ここで、非反応性ＰＥＧマクロマーと反応性ＰＥＧマクロマーにおけるＰＥＧ鎖長は同一かまたは前者の方が短くなるような組み合わせが好ましく、通常、前者のＰＥＧ鎖長は後者のＰＥＧ鎖長の２０〜１００％、好ましくは４０〜９０％であることができる。また、非反応性ＰＥＧマクロマーと反応性ＰＥＧマクロマーの使用割合は、モル比で、１：５０００〜５０００：１、好ましくは、１：３０００〜３０００：１、特に好ましくは１：１００〜１０００：１にある。このような割合で、２種のＰＥＧマクロマーに由来する反復単位を有するラテックスポリマー粒子（蛍光体を含有する場合も）は、その表面へのタンパク質等の非特異的吸着が著しく低減できるので、かかる粒子を、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでまたは生体由来の試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで取り扱う場合には、特に好ましい。また、２種のマクロマーを用いて調製したポリマー粒子は、反応性ＰＥＧマクロマー由来の官能基の生体分子への結合性も改善できる。このような１種もしくは２種以上のマクロマーは、ラテックスポリマー粒子（蛍光体を含まない）の総重量当たり、０．５〜９９．５重量％、好ましくは１０〜９０重量％、特に好ましくは２０〜８０重量％で用いられる。
本発明の方法によれば、上記のラテックス形成性モノマーと前記のマクロマーが、水性媒体中で、それ自体公知のラジカル重合に供される。そして、このラジカル重合中に蛍光体（場合によりキレート化合物として）が、上記のモノマーおよびマクロマーの総重量に対して、０．００１〜９０重量％、好ましくは０．１〜６０重量％、特に好ましくは１〜２０重量％で共存せしめられる。
ラジカル重合反応は、水性媒体中に上記のラテックス形成性モノマー、マクロマー、蛍光体およびラジカル重合開始剤を存在せしめ、必要により、加熱（約１００℃迄）して行う。この反応系は、通常、アルゴン、窒素等の不活性雰囲気下に置かれる。水性媒体中の該ラテックス形成性モノマーは０．１〜５０重量／重量％となるように選ぶのが好都合である。上記の反応系を調製する順序は、重合反応を進行することができる限り、いかなる順序であってもよく、限定されないが、好ましくは後述の実施例に従うのがよい。反応時間は、反応温度およびモノマーの種類により最適条件が変動するが、一般に２４時間行うのがよい。ラジカル重合開始剤は、慣用されている開始剤が制限なく使用できるが、代表的なものとしては、２，２’−アゾ・ビス・イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）等のアゾ系化合物、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド、ジイソプロピルペルオキシジカーボネート等の有機過酸化物を挙げることができる。このような開始剤は、総モノマー（マクロマーを含む）のモル数に対し、０．００１〜１０モル％、好ましくは１〜５モル％となるように用いることができる。
こうして製造できるラテックスポリマー粒子は、遠心分離、沈降分離、透析、限外濾過、ゲル濾過、等を単独または組み合わせて使用して精製することができる。こうして得られるラテックスポリマー粒子のうち、例えば、反応性ＰＥＧマクロマーに由来する単位を有する粒子は、必要により、保護基（例えば、アセタール）を脱離した後、それ自体既知の反応を用いて、抗体、抗原、ハプテン、レクチン、糖を共有結合を介して粒子上に固定できる。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで標的指向性標識として、または、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、特に、２種のマクロマーを用いた場合には、タンパク質等の非特異的吸着を殆どもしくは全く伴わず、したがって、バックグランド等の低いアッセイ系で使用できる。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
＜測定装置と条件等＞
（１） 分子量測定
東ソー製ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）ＨＬＣ−８０２０、検出器：Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ＲＩＤ−６Ａ、カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ（ｓｕｐｅｒ ＨＺ−２５００、ｓｕｐｅｒ ＨＺ−３０００、ｓｕｐｅｒ ＨＺ−４０００）、移動相：２％トリエチルアミン含有ＴＨＦ、流速：１ｍＬ／分間
（２） 核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ）
日本電子製 ＪＥＯＬ ＥＸ−４００（４００ＭＨｚ）、溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ＝、測定温度：２０℃
（３） 粒子径測定
大塚電子製 動的光散乱（ＤＬＳ）光度計（ＤＬＳ−７０００）光源：Ａｒレーザー
（４） 蛍光強度測定
日立製 分光蛍光光度計Ｆ−２５００、得た各粒子懸濁水溶液を超純水にて５００倍希釈し、下記測定条件にて蛍光強度を測定することにより、粒子１ｇあたりの蛍光強度を算出した。（下記の比較例１を基準とする）ホトアル電圧：７００Ｖ、励起波長：３４０ｎｍ、蛍光波長：最大強度を示す波長（６１５〜６１６．５ｎｍ）
マクロマーの合成例１：ＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の合成

アセトン−カリウムの調製法
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３５．２ｍＬ、３Ｍ水素化カリウム（ＫＨ）／ＴＨＦ溶液５ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）、アセトン０．７３５ｍＬ（１０ｍｍｏｌ）をアルゴン下、室温で反応容器に加え、１５分間攪拌して、０．２５Ｍアセトン−カリウム／ＴＨＦ溶液を調製した。
ＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の合成法
２Ｍビニルベンジルアルコール（ＶＢＡ）／ＴＨＦ溶液１ｍＬ（２ｍｍｏｌ）、０．２５Ｍアセトン−カリウムＴＨＦ溶液８ｍｌ（２ｍｍｏｌ）をアルゴン下、室温で反応容器に加え、室温で１５分間攪拌してＶＢＡのカリウムアルコキシド溶液を得た。この反応混合物から減圧乾燥でアセトンを留去した。その後、ＴＨＦ６０ｍＬを加え、さらに冷却したシリンジでエチレンオキシド１１．３ｍＬ（０．２３ｍｏｌ）を加えて室温で２日間攪拌して開環重合を行い、ＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨを合成した。
この開環重合反応物にトリエチルアミン１．３ｍＬ（９．４ｍｍｏｌ）を加え、これを溶液Ａとする。メタンスルホニルクロリド０．５ｍＬ（６．５ｍｍｏｌ）を加えたＴＨＦ１０ｍＬ溶液を溶液Ｂとする。溶液Ａを約１時間かけて溶液Ｂに滴下した。滴下後さらに２時間攪拌した後、反応混合溶液をろ過し、ろ液をエーテルに注ぎ、モノマーを沈殿させた。そのマクロマーをろ別し、減圧乾燥で溶媒を除去し、ＶＢ−ＰＥＧ−メタンスルホニル（ＶＢ−ＰＥＧ−Ｍｓ）を得た。
次いで、ＶＢ−ＰＥＧ−Ｍｓ９．０ｇ（２．３４ｍｍｏｌ）を蒸留水１１０ｍＬに溶かし、これを溶液Ｃとする。２５％アンモニア水５００ｍＬに、溶液Ｃを室温、約１時間で滴下した後、さらに室温で３日間攪拌した。この反応溶液からエバポレーターでアンモニアを留去し、さらに１００ｍＬ程度まで濃縮した。この濃縮溶液を、−１５℃に冷却したイソプロピルアルコールに注ぎ、モノマーを沈殿させ、遠心分離操作（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、４０分間、−１０℃）を行い、マクロマーを回収した。その後、ベンゼンにそのマクロマーを溶かし、凍結乾燥後にマクロマー（化合物１またはＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２ともいう）を回収した。
得た化合物が目的物であることは、上記に記載した測定条件にてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー製 ＨＬＣ−８０２０）及び核磁気共鳴測定装置（日本電子製 ＪＥＯＬ ＥＸ−４００（４００ＭＨｚ））により確認した。ＧＰＣの結果から、ＰＥＧ鎖の分子量は３５９０、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４である。
ＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムを図１に示す。ビニル基の導入率、アミノ基の導入率は^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより算出し、ほぼ定量的に導入されているのを確認した。
マクロマーの合成例２：ＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の合成その２
上記合成例１のアセトン−カリウムＴＨＦ溶液の代わりに水素化カリウム（ＫＨ）／ＴＨＦ溶液を用いてマクロマー（化合物１に相当する）を合成した。
ＫＨ／ＴＨＦ溶液の調製法
アルゴン雰囲気下の容器にＫＨ／オイルを入れ、ヘキサンでオイル分を除去した。この操作を３回行い、減圧乾燥を１晩行い、完全にヘキサンを除去した。ＴＨＦを加えて３Ｍ ＫＨ／ＴＨＦ溶液を調製した。
ＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２の合成法
ＴＨＦ５８ｍＬ、２Ｍ ＶＢＡ／ＴＨＦ溶液１ｍＬ（２ｍｍｏｌ）、３Ｍ ＫＨ／ＴＨＦ溶液０．８ｍｌ（２．４ｍｍｏｌ）をアルゴン下、室温で反応容器に加え、室温で３０分間攪拌してＶＢＡのカリウムアルコキシド溶液を得た。この溶液を２時間静置して過剰なＫＨを沈降させ、上澄み溶液をアルゴン雰囲気下の容器に入れ、冷却したシリンジでエチレンオキシド１１．３ｍＬ（０．２３ｍｏｌ）を加えて室温で２日間攪拌して開環重合を行い、ＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨを合成した。この開環重合反応物にトリエチルアミン１．３ｍＬ（９．４ｍｍｏｌ）を加え、これを溶液Ａとする。メタンスルホニルクロリド０．５ｍＬ（６．５ｍｍｏｌ）を加えたＴＨＦ１０ｍＬ溶液を溶液Ｂとする。溶液Ａを約１時間かけて溶液Ｂに滴下した。滴下後さらに２時間攪拌した後、反応混合溶液をろ過し、ろ液をエーテルに注ぎ、マクロマーを沈殿させた。そのマクロマーをろ別し、減圧乾燥で溶媒を除去しＶＢ−ＰＥＧ−Ｍｓを得た。
次いで、ＶＢ−ＰＥＧ−Ｍｓ７．７ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を蒸留水１１０ｍＬに溶かし、これを溶液Ｃとする。２５％アンモニア水５００ｍＬに、溶液Ｃを室温、約１時間で滴下した後、さらに室温で３日間攪拌した。この反応溶液からエバポレーターでアンモニアを留去し、さらに１００ｍＬ程度まで濃縮した。この濃縮溶液を、−１５℃に冷却したイソプロピルアルコールに注ぎ、マクロマーを沈殿させ、遠心分離操作（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、４０分間、−１０℃）を行い、モノマーを回収した。その後、ベンゼンにそのマクロマーを溶かし、凍結乾燥後に目的のマクロマーを回収した。
得た化合物が目的物であることは、上記に記載した測定条件にてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー製 ＨＬＣ−８０２０）及び核磁気共鳴測定装置（日本電子製 ＪＥＯＬ ＥＸ−４００（４００ＭＨｚ））により確認した。ＧＰＣの結果から、ＰＥＧ鎖の分子量は５４６０、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３である。ビニル基の導入率、アミノ基の導入率は^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより算出し、ほぼ定量的に導入されているのを確認した。
マクロマーの合成例３：ＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨの合成

２Ｍ ＶＢＡ／ＴＨＦ溶液１ｍＬ（２ｍｍｏｌ）、０．２５Ｍアセトン−カリウムＴＨＦ溶液８ｍｌ（２ｍｍｏｌ）をアルゴン下、室温で反応容器に加え、室温で１５分間攪拌してＶＢＡのカリウムアルコキシド溶液を得た。この反応混合物から減圧乾燥でアセトンを留去した。その後、ＴＨＦ６０ｍＬを加え、さらに冷却したシリンジでエチレンオキシド６．８ｍＬ（０．１４ｍｏｌ）を加えて室温で２日間攪拌して開環重合を行った。その後、メタノール３ｍＬを加えて反応を止めた。この反応混合溶液を、−１５℃に冷却したイソプロピルアルコールに注ぎ、マクロマーを沈殿させ、遠心分離操作（６０００ｒ．ｐ．ｍ．，４０分間、−１０℃）を行い、マクロマー（化合物２）を回収し、凍結乾燥して溶媒を除去した。
得た化合物が目的物（化合物２またはＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨという）であることは、上記に記載した測定条件にてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー製 ＨＬＣ−８０２０）及び核磁気共鳴測定装置（日本電子製 ＪＥＯＬ ＥＸ−４００（４００ＭＨｚ））により確認した。ＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示す。ＧＰＣの結果から、ＰＥＧ鎖の分子量は２８５０、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４である。
ビニル基の導入率は^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより算出し、ほぼ定量的に導入されているのを確認した。
マクロマーの合成例４：アセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイルの合成

カリウム−ナフタレン／ＴＨＦ溶液の調製法
ナフタレンの入ったアルゴン雰囲気下の容器にＴＨＦを加え溶解させ、氷冷しながらナフタレンに対して１．０５倍モル量の柱状カリウムを加え、１日間攪拌させた。この溶液を塩酸滴定して０．３２６３Ｍカリウム−ナフタレン／ＴＨＦ溶液を調製した。
アセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイルの合成
ＴＨＦ４０ｍＬ、３，３’−ジエトキシ−１−プロパノール０．３２ｍＬ（２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下の容器に室温で加え、０．３２６３Ｍカリウム−ナフタレン／ＴＨＦ溶液６．２ｍＬ（２ｍｍｏｌ）を加え１５分間攪拌してカリウムアルコキシド溶液を得た。この溶液に、冷却したシリンジでエチレンオキシド１１．３ｍＬ（０．２３ｍｏｌ）を加えて室温で２日間攪拌して開環重合を行い、アセタール−ＰＥＧ−ＯＨを合成した。この重合溶液に１ｍｏｌ／Ｌ ＤＬ−ラクチド／ＴＨＦ溶液８．４ｍｌ（８．４ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間攪拌し、さらに重合反応を行った。その後、無水メタクリル酸４．５ｍＬ（２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２日間攪拌して反応を止めた。このマクロマー混合溶液を−１５℃に冷却したイソプロピルアルコールに注ぎ、マクロマーを沈殿させた。遠心分離操作（６０００ｒ．ｐ．ｍ．，４０分間、−１０℃）を行い、マクロマーを回収した。さらにマクロマーをイソプロピルアルコールに注ぎ、マクロマーを沈殿させた。遠心分離操作（６０００ｒ．ｐ．ｍ．，４０分間、−１０℃）によってマクロマーを精製する操作をした後、ベンゼンにマクロマーを溶解し凍結乾燥を行ってマクロマー（化合物３またはアセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイルともいう）を回収した。
得た化合物が目的物であることは、上記に記載した測定条件にてゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（東ソー製 ＨＬＣ−８０２０）及び核磁気共鳴測定装置（日本電子製 ＪＥＯＬ ＥＸ−４００（４００ＭＨｚ））により確認した。ＧＰＣの結果から、ＰＥＧ鎖の分子量は５５３０、分子量分布Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３である。アセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイルのラクチド鎖（ＰＬＡ）の分子量はＧＰＣの結果であるＰＥＧ鎖分子量及び^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより算出し、１５０である。ビニル基の導入率は^１Ｈ−ＮＭＲスペクトラムより算出し、ほぼ定量的に導入されているのを確認した。
実施例１：蛍光物質封入アミノ末端コア−シェル型ラテックスの調製
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．４５７７ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．３９４５ｇ（１ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下の容器に入れ、さらにメタノール２０ｍＬを加え超音波照射して溶解し、さらにスチレンモノマー０．５ｍＬ（４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。これをキレートモノマー溶液とする。マクロマーの合成例１で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＝０．２５ｇ（０．０４８７ｍｍｏｌ）、アルゴン脱気した超純水２０ｍＬをアルゴン雰囲気下の容器に加え、スリーワンモーターで攪拌（５００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記キレートモノマー溶液を加えた。さらに室温で３０分間攪拌後、６０℃で２４時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁溶液を透析、遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。さらに超遠心分離（８００００ｒ．ｐ．ｍ．、２０分間、４℃）精製し、最終的に０．４５μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、表面にアミノ基が結合し、コア部に蛍光物質を封入したコアーシェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。
反応に用いた粒子重量に対しての蛍光物質添加率および相対比（下記の比較例１基準）の算出結果を表−１にまとめて示す。本実施例においては、反応に用いた総モノマー重量は、比較例における粒子重量と相対する重量として算出に用いた。
得たコア−シェル型ラテックスの平均粒子径及び粒子径分布は、上記に記載した大塚電子製 動的光散乱（ＤＬＳ）光度計（ＤＬＳ−７０００）を用いて測定した。また、日立製 分光蛍光光度計Ｆ−２５００を用いて蛍光強度を測定し、粒子１ｇ当たりの蛍光強度比（下記の比較例１基準）の各値を表−２に示す。
実施例２：
マクロマーの合成例１で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＝０．４ｇ（０．０７７９ｍｍｏｌ）、ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．４５７７ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．３９４５ｇ（１ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下の容器に入れ、メタノール２０ｍＬを加えて超音波照射して溶解し、スチレンモノマー０．５ｍＬ（４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。スリーワンモーターで攪拌（５００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、アルゴン脱気した超純水２０ｍＬを加えて、室温で３０分間攪拌後、６０℃で２４時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁溶液を透析、遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．４５μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、表面にアミノ基が結合し、コア部に蛍光物質を封入したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例３：
マクロマーの合成例１で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＝０．１２ｇ（０．０２３４ｍｍｏｌ）、マクロマーの合成例３で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨ ０．２８ｇ（０．０８９３ｍｍｏｌ）、ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．４５７７ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．３９４５ｇ（１ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下の容器に入れ、メタノール２０ｍＬを加えて超音波照射して溶解し、スチレンモノマー０．５ｍＬ（４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。スリーワンモーターで攪拌（５００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、アルゴン脱気した超純水２０ｍＬを加えて、室温で３０分間攪拌後、６０℃で２４時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁溶液を透析、遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．４５μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、表面にアミノ基が結合し、コア部に蛍光物質を封入したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例４：
マクロマーの合成例１で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＝０．０４ｇ（０．００７７９ｍｍｏｌ）、マクロマー合成例３で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨ ０．３６ｇ（０．１１５ｍｍｏｌ）、ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．４５７７ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．３９４５ｇ（１ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下の容器に入れ、メタノール２０ｍＬを加えて超音波照射して溶解し、スチレンモノマー０．５ｍＬ（４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。スリーワンモーターで攪拌（５００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、アルゴンで脱気した超純水２０ｍＬを加えて、室温で３０分間攪拌後、６０℃で２４時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁溶液を透析、遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．４５μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、表面にアミノ基が結合し、コア部に蛍光物質を封入したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例５：
マクロマーの合成例１で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＝０．０１２ｇ（０．００２３４ｍｍｏｌ）、マクロマーの合成例３で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＯＨ ０．３８８ｇ（０．１２４ｍｍｏｌ）、ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．４５７７ｇ（０．５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．３９４５ｇ（１ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下の容器に入れ、メタノール２０ｍＬを加えて超音波照射して溶解し、スチレンモノマー０．５ｍＬ（４．３５ｍｍｏｌ）を加えた。スリーワンモーターで攪拌（５００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、アルゴンで脱気した超純水２０ｍＬを加えて、室温で３０分間攪拌後、６０℃で２４時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁溶液を透析、遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．４５μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、表面にアミノ基が結合し、コア部に蛍光物質を封入したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。参考例１：コア−シェル型ラテックスの調製
アルデヒド末端コア−シェル型ラテックス
アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２９．６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにスチレン溶液２ｍＬ（１７ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレン溶液とする。超純水１６０ｍＬ、マクロマーの合成例４で得たアセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイル３．４３６ｇ（０．６２５ｍｍｏｌ）を別の容器に入れアルゴン置換し、これをモノマー溶液とする。この溶液をスリーワンモーターで撹拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間撹拌後、６０℃で１８時間攪拌し、さらに８０℃で６時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁水溶液をろ紙でろ過を行い、表面にアセタール基が結合したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。
次いで、コア−シェル型ラテックス溶液を１Ｍ塩酸でｐＨ２．０に調整した後、２時間攪拌した。その後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５．０とし、保護基のアセタール基を脱保護し、表面をアルデヒド基にしたコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。
この懸濁水溶液を透析およびろ紙でろ過をし、脱塩を行なった。
このようにして得たアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの平均粒子径及び粒子径分布は、上記に記載した大塚電子製 動的光散乱（ＤＬＳ）光度計（ＤＬＳ−７０００）を用いて測定し、粒子径は６５ｎｍ、粒子径分布は０．１５１であった。
参考例２：アルデヒド末端コア−シェル型ラテックス
アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）３８８．２ｍｇ（２．４ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにスチレン溶液２７ｍＬ（２３５ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレン溶液とする。超純水４００ｍＬ、マクロマーの合成例４で得たアセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイル８．５９ｇ（１．５６ｍｍｏｌ）を別の容器に入れアルゴン置換し、これをマクロマー溶液とする。この溶液をスリーワンモーターで攪拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間攪拌後、６０℃で１８時間攪拌し、さらに８０℃で６時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁水溶液をろ紙でろ過を行い、表面にアセタール基が結合したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。
次いで、コア−シェル型ラテックス溶液を１Ｍ塩酸でｐＨ２．０に調整した後、２時間攪拌した。その後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５．０とし、保護基のアセタール基を脱保護し、表面をアルデヒド基にしたコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。
この懸濁水溶液を透析およびろ紙でろ過をし、脱塩を行なった。
このようにして得たアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの平均粒子径及び粒子径分布は、上記に記載した大塚電子製 動的光散乱（ＤＬＳ）光度計（ＤＬＳ−７０００）を用いて測定し、粒子径は１０２．３ｎｍ、粒子径分布は０．０６６５であった。
参考例３：アミノ末端コア−シェル型ラテックス
アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにスチレン溶液０．５ｍＬ（４．３５ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレンモノマー溶液とする。マクロマーの合成例１で得たＶＢ−ＰＥＧ−ＮＨ_２＝０．２５ｇ（０．０４８７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で反応容器に加え、さらにアルゴンで脱気した超純水２０ｍＬを加えた。この溶液をスリーワンモーターで攪拌（５００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間攪拌後、６０℃で２０時間攪拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）し、さらに８０℃で４時間攪拌して重合反応を行った。この粒子懸濁水溶液をろ紙でろ過を行い、表面にアミノ基が結合したコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。
このようにして得たアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの平均粒子径及び粒子径分布は、上記に記載した大塚電子製 動的光散乱（ＤＬＳ）光度計（ＤＬＳ−７０００）を用いて測定し、粒子径は９８．２ｎｍ、粒子径分布は０．０８７であった。
比較例：有機溶媒での膨潤作用による蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスの調製
比較例１：
塩化ユーロピウム６水和物水溶液（２２ｍｇ／ｍＬ、０．０６ｍｍｏｌ）１ｍＬに、テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）のアセトン溶液（３７ｍｇ／ｍＬ、０．１７ｍｍｏｌ）１ｍＬを加え、更にトリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）のアセトン溶液（８７ｍｇ／ｍＬ、０．２３ｍｍｏｌ）２ｍＬを加えて、ユーロピウムキレート溶液を調製した。
参考例１のアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの懸濁液（１８．１３ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬにアセトン５ｍＬを加え、攪拌しながら、さらに上記のユーロピウムキレート溶液０．１２ｍＬ（ユウロピウムキレートとして０．００１８ｍｍｏｌ）を加え、遮光下室温で２５分間撹拌した。攪拌後、アセトンをエバポレーターで留去し、０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理し、過剰なユウロピウムキレートを除去して、アルデヒド末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。
反応に用いた粒子重量に対しての蛍光物質添加率および相対比（本例を基準の１とする）の算出結果を表−１にまとめて示す。本比較例においては、反応に用いた粒子重量は、実施例における反応に用いた総モノマー重量と相対する重量として算出に用いた。
得たコア−シェル型ラテックスの平均粒子径及び粒子径分布は、上記に記載した大塚電子製 動的光散乱（ＤＬＳ）光度計（ＤＬＳ−７０００）を用いて測定した。また、日立製 分光蛍光光度計Ｆ−２５００を用いて蛍光強度を測定し、粒子１ｇ当たりの蛍光強度比（本例を基準とする）の各値を表−２に示す。
比較例２：
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）５４９．２ｍｇ（０．６０ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）４７３．４ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）にアセトン４ｍＬを加えて、ユーロピウムキレート溶液を調製した。
参考例２のアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの懸濁液（１０．０ｍｇ／ｍＬ、蒸留水）１０ｍＬにアセトン１０ｍＬを加え、攪拌しながら、さらに上記のユーロピウムキレート溶液０．２４ｍＬ（ユウロピウムキレートとして０．０３６ｍｍｏｌ）を加え、遮光下室温で３０分間撹拌した。攪拌後、アセトンをエバポレーターで留去し、超純水で１０ｍＬにメスアップした。この水溶液を遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）し、０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理し、過剰なユウロピウムキレートを除去して、アルデヒド末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
比較例３：
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）３２．９６ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）２８．４ｍｇ（０．０７２ｍｍｏｌ）にアセトン１０ｍＬを加えて、ユーロピウムキレート溶液を調製した。
この溶液に、参考例２のアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの懸濁液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬを攪拌しながら加え、遮光下室温で３０分間撹拌した。攪拌後、アセトンをエバポレーターで留去し、蒸留水で１０ｍＬにメスアップした。この水溶液を遠心分離（３０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）し、０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理し、過剰なユウロピウムキレートを除去して、アルデヒド末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
比較例４：
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）３２９．５ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）２８４．１ｍｇ（０．７２ｍｍｏｌ）にアセトン１０ｍＬを加えて、ユーロピウムキレート溶液を調製した。
この溶液に、参考例２のアルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの懸濁液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）１０ｍＬを攪拌しながら加え、遮光下室温で３０分間撹拌した。攪拌後、アセトンをエバポレーターで留去し、蒸留水で１０ｍＬにメスアップした。この水溶液を遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）し、０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理し、過剰なユウロピウムキレートを除去して、アルデヒド末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
比較例５：
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）１６４．８ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）１４２．１ｍｇ（０．３６ｍｍｏｌ）にアセトン５ｍＬを加えて、ユーロピウムキレート溶液を調製した。
この溶液に、参考例３のアミノ末端コア−シェル型ラテックスの懸濁液（１０．０ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬを攪拌しながら加え、遮光下室温で３０分間撹拌した。攪拌後、アセトンをエバポレーターで留去し、蒸留水で１５ｍＬにメスアップした。この水溶液を遠心分離（６０００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）し、０．４５μｍ親水性メンブレンフィルター処理し、過剰なユウロピウムキレートを除去して、アルデヒド末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例６：蛍光物質封入アルデヒド末端コア−シェル型ラテックスの調製
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．２２８８ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．１９３３ｇ（０．４９ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）４９．３ｍｇ（０．３０ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにアセトン１０ｍＬ、スチレン溶液１ｍＬ（８．７０ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレン溶液とする。超純水８０ｍＬ、マクロマーの合成例４で得たアセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイル１．７２ｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を別の容器に入れアルゴン置換し、これをモノマー溶液とする。この溶液をスリーワンモーターで撹拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間撹拌後、６０℃で２４時間撹拌して（４００ｒ．ｐ．ｍ．）重合反応を行った。重合後、アセトンをエバポレーターで留去し、粒子懸濁溶液を遠心分離（２５００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、アセタール末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。
次いで、コア−シェル型ラテックス溶液を１Ｍ塩酸でｐＨ２．０に調整した後、２時間撹拌した。その後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ５．０とし、保護基のアセタール基を脱保護し、表面をアルデヒド基にしたコア−シェル型ラテックス懸濁水溶液を得た。この懸濁水溶液を透析およびろ紙でろ過をし、脱塩を行った。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例７：蛍光物質封入アセタール末端コア−シェル型ラテックスの調製
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．０５７２ｇ（０．０６２ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．０４８３ｇ（０．１２ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにアセトン５ｍＬ、スチレン溶液１．３ｍＬ（１１．３ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレン溶液とする。超純水２０ｍＬ、マクロマーの合成例４で得たアセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイル０．４３ｇ（０．０７８ｍｍｏｌ）を別の容器に入れアルゴン置換し、これをモノマー溶液とする。この溶液をスリーワンモーターで撹拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間撹拌後、６０℃で２４時間撹拌して（４００ｒ．ｐ．ｍ．）重合反応を行った。重合後、アセトンをエバポレーターで留去し、粒子懸濁溶液を遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、アセタール末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例８：
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）０．５７２１ｇ（０．６２ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．４８３３ｇ（１．２３ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにアセトン５ｍＬ、スチレン溶液１．３ｍＬ（１１．３ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレン溶液とする。超純水２０ｍＬ、マクロマーの合成例４で得たアセタールＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイル０．４３ｇ（０．０７８ｍｍｏｌ）を別の容器に入れアルゴン置換し、これをモノマー溶液とする。この溶液をスリーワンモーターで撹拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間撹拌後、６０℃で２４時間撹拌して（４００ｒ．ｐ．ｍ．）重合反応を行った。重合後、アセトンをエバポレーターで留去し、粒子懸濁溶液を遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、アセタール末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。
実施例９：
ユウロピウム（ＩＩＩ）テノイルトリフルオロアセトン（Ｅｕ−ＴＴＡ）１．１４４１ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）、トリオクチルフォスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）０．９６６６ｇ（２．４５ｍｍｏｌ）、アゾ−ビス−イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）２０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で反応容器に加え、さらにアセトン５ｍＬ、スチレン溶液１．３ｍＬ（１１．３ｍｍｏｌ）を加えて、これをスチレン溶液とする。超純水２０ｍＬ、マクロマーの合成例４で得たアセタール−ＰＥＧ／ＰＬＡ−メタクリロイル０．４３ｇ（０．０７８ｍｍｏｌ）を別の容器に入れアルゴン置換し、これをモノマー溶液とする。この溶液をスリーワンモーターで撹拌（４００ｒ．ｐ．ｍ．）しながら、上記のスチレンモノマー溶液を加え、室温で３０分間撹拌後、６０℃で２４時間撹拌して（４００ｒ．ｐ．ｍ．）重合反応を行った。重合後、アセトンをエバポレーターで留去し、粒子懸濁溶液を遠心分離（１００００ｒ．ｐ．ｍ．、３０分間、４℃）精製をした。最終的に０．２μｍ親水性メンブレンフィルター処理をして、アセタール末端蛍光物質封入コア−シェル型ラテックスを得た。なお、各データについては実施例１と同様に下記の表−１および表−２にまとめて示す。

以上のデータから、本発明に従うラテックスポリマー粒子の製造方法はポリマー粒子に効率よく、かつ、安定に蛍光体または造影剤を含有するラテックスポリマー粒子を提供できることがわかる。
実施例１０：
実施例１〜５および比較例１〜５の方法に従って得られた各粒子懸濁水溶液を超純水にて粒子濃度を２ｍｇ／ｍＬとした。また、得られた各粒子懸濁水溶液を測定時の蛍光強度が約１５０００になるように超純水にて調整した。粒子濃度あるいは蛍光強度が揃えられた各粒子懸濁水溶液をさらに緩衝液（０．０５ｗｔ％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む１／１５Ｍ ＰＢＳ，ｐＨ．７．４）にて５００倍希釈し、下記測定条件にて時間分解蛍光測定により蛍光強度を測定した。その後、３７℃で保存し、３日後、５日後、７日後に同様の条件で蛍光強度を測定した。緩衝液で希釈直後の蛍光強度を基準とし（１００％）、各時間にて３回の測定値の平均値を用いて経時的な蛍光強度の変化率を算出し、各粒子の蛍光安定性を比較した。
＜測定装置と条件等＞
大日本製薬製 マルチディテクションミクロプレートリーダー パワースキャンＨＴ
光源：１０Ｗキセノンフラッシュランプ、励起波長：３４０ｎｍ，蛍光波長：標準 干渉フィルター６２０／４０ｎｍ、感度：１２０、測定回数：５０回、測定位置に移動後、光源照射までの時間：５００μｓｅｃ、測定間隔時間：１０ｍｓｅｃ、遅延時間：２００μｓｅｃ、測定時間：４００μｓｅｃ
＜結果＞
粒子濃度を２ｍｇ／ｍＬとなるように調整したときの蛍光強度とその経時的な推移を表−３に示す。イニシャル時の蛍光強度に関して、実施例１〜５と比較例１〜５とを比較すると実施例の方が明らかに蛍光強度は高かった。また、蛍光強度の経時的な推移を同様に実施例と比較例とを比べると、実施例では、３７℃、７日後においてもイニシャル時の９０％以上の強度を維持したが比較例では６２〜８５％に低下した。この結果は、実施例粒子の蛍光の方が安定であることを示している。
蛍光強度を約１５０００カウントと一定にしたときの蛍光強度の推移を表−４に示す。３７℃、７日後の強度は、実施例では９５％以上を維持したが比較例では、７８〜８４％に低下した。本発明粒子の方が比較例に比べて明らかに経時的に安定であることを示した。

本発明に従うラテックスポリマー粒子の製造方法はポリマー粒子に効率よく、かつ、安定に蛍光体または造影剤を含有するラテックスポリマー粒子を提供できることがわかる。したがって、限定されるものでないが、医療分野、診断薬製造業の分野で利用できる。

Claims (2)

1. （ｉ）１種もしくは２種以上のラテックス形成性モノマー、（ii）片末端に重合可能なエチレン性基を有し、疎水性ポリマーセグメントを介するかもしくは介することなく、他の片末端側に親水性ポリマーセグメントを有するマクロマー、（iii）ラジカル重合開始剤、ならびに（iv）無機蛍光体または無機造影剤を含んでなる水性媒体中で、該水性媒体を撹拌しながら重合反応を行うことを含んでなると共に、
   ラテックス形成性モノマーが、ビニル芳香族化合物、（メタ）アクリル酸Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、及び、置換または未置換の共役ジエンからなる群より選択され、
   親水性ポリマーセグメントが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（デキストラン）、ポリ（デキストリン）、およびゼラチンからなる群より選ばれる水溶性ポリマー由来のセグメントであり、
   疎水性セグメントが、ポリ（ラクチド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（α−および／もしくはβ−ベンジルアスパラギン酸）、および（γ−ベンジルグルタミン酸）からなる群より選ばれる水難溶性ポリマー由来のセグメントである、蛍光体または造影剤を含有するラテックスポリマー粒子の製造方法。
2. ａ）１種もしくは２種以上のラテックス形成性モノマー０．５〜９９．５重量％、およびｂ）片末端に重合可能なエチレン性基を有し、疎水性ポリマーセグメントを介することなく他の片末端側に親水性ポリマーセグメントを有するマクロマー０．５〜９９．５重量％の水性媒体中でのラジカル重合によって形成される平均粒径０．００１μｍ〜５μｍのラテックスポリマー粒子であって、該粒子の疎水性コア領域に無機蛍光体または無機造影剤を含有する疎水性コア−親水性シェル型のラテックスポリマー粒子であって、
   ラテックス形成性モノマーが、ビニル芳香族化合物、（メタ）アクリル酸Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、及び、置換または未置換の共役ジエンからなる群より選択され、
   疎水性セグメントが、ポリ（ラクチド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（α−および／もしくはβ−ベンジルアスパラギン酸）、および（γ−ベンジルグルタミン酸）からなる群より選ばれる水難溶性ポリマー由来のセグメントであり、
   マクロマーが、親水性ポリマーセグメントとして、他の片末端にヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、イミノ基、メルカプト基、活性エステル型の保護されたヒドロキシル基、活性エステル型の保護されたカルボキシル基、アセタール型の保護されたアルデヒド基、有機スルホニルで保護されたヒドロキシル基およびＣ_１−Ｃ_４アルコキシル基からなる群より選ばれる基を担持するポリ（エチレングリコール）セグメントを有し、そのエチレングリコールの繰り返し単位が、５〜１２００である少なくとも２種のマクロマーを含む、疎水性コア−親水性シェル型のラテックスポリマー粒子。

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