CN111603572B - 纳米造影剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纳米造影剂，用于CT/MRI双模态成像。所述纳米造影剂由以下结构式为(I)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure DDA0002521082220000011
其中，各个P独立地为
Figure DDA0002521082220000012
或
Figure DDA0002521082220000013
各个R4独立地为‑C6H5、‑CH2C6H5、‑CH2CH2COOH、‑CH2CH2OH或‑CH2OH；各个Q独立的为‑CHCNCH3CH2CH2‑或‑CH2CH2‑；各个R1独立地为‑H、‑CH3或‑CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1‑10；m＝2‑100；n＝2‑100；q＝10‑500。本发明还提供该纳米造影剂的制备方法和应用。本发明的纳米造影剂可提高肿瘤诊断的灵敏度，以实现对早期肿瘤的精确诊断。

Description

纳米造影剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物与医学纳米材料技术领域，尤其涉及一种用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂，该纳米造影剂的制备方法，及该纳米造影剂的应用。
背景技术
癌症的死亡率居高不下，严重威胁着人民的健康与生命。若能早发现早治疗，将有望降低癌症的致死率。然而，早期肿瘤通常较微小，尺寸通常在1cm以下，导致传统的医学成像技术，如计算机断层扫描(CT)、核磁共振成像(MRI)、X-射线、及超声(US)等，难以对该微小肿瘤进行精确的诊断。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种纳米造影剂，旨在提高肿瘤诊断的灵敏度，以实现对早期肿瘤的精确诊断。
为解决上述技术问题，本发明提供的纳米造影剂，用于CT/MRI双模态成像，所述纳米造影剂由以下结构式为(I)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000011
其中，P独立地为
Figure GDA0003500051970000012
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述纳米造影剂由以下结构式为(II)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000021
其中，R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述纳米造影剂由以下结构式为(III)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000022
其中，R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述纳米造影剂由以下结构式为(IV)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000031
其中，m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述能络合Bi3+的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、或谷氨酸(Glu)；和/或
所述Fe3O4的直径的范围为2nm～10nm；和/或
所述纳米造影剂中，Bi3+占纳米造影剂的质量百分比范围为1％～10％，Fe3O4占纳米造影剂的质量百分比范围为5％～20％；和/或
所述纳米造影剂的粒径的范围为80nm～300nm。
本发明还提供一种纳米造影剂的制备方法，其包括以下步骤：
提供以下结构式为(I)的化合物：
Figure GDA0003500051970000032
其中，P独立地为
Figure GDA0003500051970000033
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500；
将结构式为(I)的化合物和铋盐溶于第一有机溶剂中，以使Bi3+与结构式为(I)的化合物络合，获得第一混合物；
将所述第一混合物加入到分散于第二有机溶剂中的Fe3O4中，获得第二混合物；及
将所述第二混合物加入到水中，搅拌，去除第一有机溶剂和第二有机溶剂后，获得所述纳米造影剂。
在一些实施例中，所述第一有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其混合物；和/或
所述能络合Bi3+的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、或谷氨酸(Glu)；和/或
所述第二有机溶剂为氯仿、或二氯甲烷；和/或
所述Fe3O4的直径的范围为2nm～10nm；和/或
所述纳米造影剂中，Bi3+占纳米造影剂的质量百分比范围为1％～10％，Fe3O4占纳米造影剂的质量百分比范围为5％～20％；和/或
所述纳米造影剂的粒径的范围为80nm～300nm；和/或
所述铋盐为Bi2(SO4)3、Bi2(NO3)3、或BiCl3。
在一些实施例中，所述制备方法还包括制备大分子链转移剂的步骤，所述制备所述大分子链转移剂的步骤包括：
将小分子链转移剂和聚乙二醇(PEG)溶解在第三有机溶剂中；
向第三有机溶剂中加入二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)，于常温下搅拌24h～72h；
过滤，沉降后，制备所述大分子链转移剂，
其中，所述小分子链转移剂的结构式(V)为：
Figure GDA0003500051970000051
所述聚乙二醇的结构式(VI)为：
Figure GDA0003500051970000052
在一些实施例中，所述制备方法还包括制备亲水性聚合物的步骤，所述制备亲水性聚合物的步骤包括：
将所述大分子链转移剂(PEG-CPAD)和甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸加入至含有引发剂的第三有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h；
用冷正己烷或冷乙醚沉降三次后，制得所述亲水性聚合物(PtBu-Asp-b-PEG)，
其中，所述大分子链转移剂的结构式(IX)为：
Figure GDA0003500051970000053
所述甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸的结构式(X)为：
Figure GDA0003500051970000054
所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、及偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)中的至少一种。
在一些实施例中，所述制备方法还包括制备嵌段聚合物的步骤，所述制备嵌段聚合物的步骤包括：
将甲基丙烯酸丁酯单体与所述亲水性聚合物加入至含有引发剂的第四有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h；及
用冷正己烷或冷乙醚沉淀后，制得所述嵌段聚合物，
其中，所述甲基丙烯酸丁酯单体的结构式(VII)为：
Figure GDA0003500051970000061
所述亲水性聚合物的结构式(VIII)为：
Figure GDA0003500051970000062
所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、及偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)中的至少一种。
在一些实施例中，所述制备方法还包括制备所述结构式为(I)的化合物的步骤，所述制备结构式为(I)的化合物的步骤包括：
将所述嵌段聚合物溶于第五有机溶剂中；
向第五有机溶剂中加入质量分数为25％～40％的盐酸，于70℃～100℃的温度下反应12h～24h，以去除叔丁基；及
用冷正己烷或冷乙醚沉淀去除叔丁基后的嵌段聚合物，进行离心，以制得结构式为(I)的化合物，其中，第五有机溶剂与盐酸的体积比为：8～10：1。
本发明还提供上述纳米造影剂在CT/MRI双模态成像中的应用。
本发明技术方案的用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂由结构式为(I)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000071
其中，P独立地为
Figure GDA0003500051970000072
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
Bi具有原子序数高、X射线衰减系数高、生物相容性好的特点。通过氨基酸以共价连接的方式将Bi3+与结构式为(I)的化合物络合，以增加Bi3+的局部浓度，从而增强CT造影信号。再通过自组装的方式来装载Fe3O4，形成纳米团簇，从而增加Fe3O4的局部浓度，从而增强MRI造影效果。本发明的纳米造影剂可同时利用Bi3+提高CT影像信号，Fe3O4纳米粒子降低MRI信号从而大幅提高软组织尤其是肿瘤部位的影像明暗对比度。因此，该纳米造影剂不仅比传统的CT和MRI造影剂具备更长效的血液循环时间，更可同时通过CT和MRI的互补影像，提高肿瘤(尤其是早期的微小肿瘤)的影像诊断准确性和灵敏度。另外，由于本发明的纳米造影剂可同时用于CT成像和MRI成像，可减少检查过程中多次用药造成的毒副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明一实施例的两亲性嵌段聚合物(PEG-b-PAsp-b-PBMA)在氘代氯仿(CDCl3)中的核磁共振氢谱；
图2为本发明一实施例的用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂的TEM表征图谱；
图3为本发明一实施例的用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂的XRD衍射图谱；
图4为本发明一实施例的用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂在溶液中CT造影性能的验证结果图；
图5为本发明一实施例的具有CT/MRI双模态成像的纳米造影剂在溶液中MR造影性能的验证结果图；
图6为本发明一实施例的具有CT/MRI双模态成像的纳米造影剂的细胞活性和聚合物浓度的关系图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
在至少一实施例中，本发明提供一种用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂。
所述纳米造影剂由以下结构式为(I)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000091
其中，P独立地为
Figure GDA0003500051970000092
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述能络合Bi3+的氨基酸AA为苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、或谷氨酸(Glu)。
在一些实施例中，所述纳米造影剂中，Bi3+占纳米造影剂的质量百分比范围为1％～10％，Fe3O4占纳米造影剂的质量百分比范围为5％～20％.；
在一些实施例中，所述Fe3O4的直径的范围为2nm～10nm。
在一些实施例中，所述纳米造影剂的粒径的范围为80nm～300nm。
Bi具有原子序数高、X射线衰减系数高、生物相容性好的特点。本发明技术方案通过氨基酸以共价连接的方式将Bi3+与结构式为(I)的化合物络合，以增加Bi3+的局部浓度，从而增强CT造影信号。再通过自组装的方式来装载Fe3O4，形成纳米团簇，从而增加Fe3O4的局部浓度，从而增强MRI造影效果。本发明的纳米造影剂可同时利用Bi3+提高CT影像信号，Fe3O4纳米粒子降低MRI信号从而大幅提高软组织尤其是肿瘤部位的影像明暗对比度。因此，该纳米造影剂不仅比传统的CT和MRI造影剂具备更长效的血液循环时间，更可同时通过CT和MRI的互补影像，提高肿瘤(尤其是早期的微小肿瘤)的影像诊断准确性和灵敏度。另外，由于本发明的纳米造影剂可同时用于CT成像和MRI成像，可减少检查过程中多次用药造成的毒副作用。
在一些实施例中，所述纳米造影剂由以下结构式为(II)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000101
其中，P为C6H5SS-，h＝2，Q为-CCNCH3CH2CH2-，R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述纳米造影剂由以下结构式为(III)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000102
其中，P为C6H5SS-，Q为-CCNCH3CH2CH2-，AA为天冬氨酸，R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
在一些实施例中，所述纳米造影剂由以下结构式为(IV)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure GDA0003500051970000111
其中，P为C6H5SS-，h＝2，Q为-CCNCH3CH2CH2-，AA为天冬氨酸，m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
可以理解的，结构式为(IV)中聚(叔丁基天冬氨酸)-嵌段-聚乙二醇分子量为1236～61800。
在至少一实施例中，本发明还提供一种纳米造影剂的制备方法，其包括以下步骤：
提供以下结构式为(I)的化合物：
Figure GDA0003500051970000112
其中，P独立地为
Figure GDA0003500051970000113
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500；
将结构式为(I)的化合物和铋盐溶于第一有机溶剂中，以使Bi3+与结构式为(I)的化合物络合，获得第一混合物；
将所述第一混合物加入到分散于第二有机溶剂中的Fe3O4中，获得第二混合物；
将所述第二混合物加入到水中，搅拌，去除有机溶剂后，获得所述纳米造影剂。
可以理解的，可将所述第二混合物加入到处于搅拌状态的水中，搅拌速度可为2000r/min～4000r/min，搅拌时间为1h～2h。
在一些实施例中，可通过透析或者超滤法去除有机溶剂。
在一些实施例中，所述第一有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其混合物。
在一些实施例中，所述能络合Bi3+的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、或谷氨酸(Glu)。
在一些实施例中，所述第二有机溶剂为氯仿或二氯甲烷。
在一些实施例中，所述纳米造影剂中，Bi3+占纳米造影剂的质量百分比范围为1％-10％，Fe3O4占纳米造影剂的质量百分比范围为5％-10％。
在一些实施例中，所述纳米造影剂的粒径的范围为80nm～300nm。
在一些实施例中，所述铋盐为Bi2(SO4)3、Bi2(NO3)3、或BiCl3。
Bi具有原子序数高、X射线衰减系数高、生物相容性好的特点。本发明技术方案通过氨基酸以共价连接的方式将Bi3+与结构式为(I)的化合物络合，以增加Bi3+的局部浓度，从而增强CT造影信号。再通过自组装的方式来装载Fe3O4，形成纳米团簇，从而增加Fe3O4的局部浓度，从而增强MRI造影效果。本发明的纳米造影剂可同时利用Bi3+提高CT影像信号，Fe3O4纳米粒子降低MRI信号从而大幅提高软组织尤其是肿瘤部位的影像明暗对比度。因此，该纳米造影剂不仅比传统的CT和MRI造影剂具备更长效的血液循环时间，更可同时通过CT和MRI的互补影像，提高肿瘤(尤其是早期的微小肿瘤)的影像诊断准确性和灵敏度。另外，由于本发明的纳米造影剂可同时用于CT成像和MRI成像，可减少检查过程中多次用药造成的毒副作用。
在一些实施例中，制备所述大分子链转移剂的步骤包括：
将小分子链转移剂和聚乙二醇(PEG)溶解在第三有机溶剂中；
向第三有机溶剂中加入二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)，于常温下搅拌24h～72h；
过滤，用冷正己烷或冷乙醚沉降后，制备所述大分子链转移剂，
其中，所述小分子链转移剂的结构式(V)为：
Figure GDA0003500051970000131
所述聚乙二醇的结构式(VI)为：
Figure GDA0003500051970000132
在一些实施例中，所述第三有机溶剂为二氯甲烷、1,4-四氧六环、二甲基亚砜、或N,N-二甲基甲酰胺。
在一些实施例中，可采用滤纸进行过滤。
在一些实施例中，所述制备方法还包括制备亲水性聚合物的步骤，所述制备亲水性聚合物的步骤包括：
将所述大分子链转移剂和甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸加入至含有引发剂的第三有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h；
用冷正己烷或冷乙醚沉降三次后，制得所述亲水性聚合物，
其中，所述大分子链转移剂的结构式(IX)为：
Figure GDA0003500051970000141
所述甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸的结构式(X)为：
Figure GDA0003500051970000142
在一些实施例中，所述第三有机溶剂为二氯甲烷、1,4-四氧六环、二甲基亚砜、或N,N-二甲基甲酰胺。
在一些实施例中，所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、及偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)中的至少一种；
在一些实施例中，制备所述嵌段聚合物的步骤包括：
将甲基丙烯酸丁酯单体与亲水性聚合物加入至含有引发剂的第四有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h；及
用冷正己烷或冷乙醚沉淀后，制得所述亲水性嵌段聚合物，
其中，所述甲基丙烯酸丁酯单体的结构式(VII)为：
Figure GDA0003500051970000143
所述亲水性聚合物的结构式(VIII)为：
Figure GDA0003500051970000144
所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)、偶氮二异庚腈(ABVN)、及偶氮二异丁酸二甲酯(AIBME)中的至少一种；
所述第四有机溶剂为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、及N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
在一些实施例中，制备所述结构式(VIII)的亲水性聚合物的步骤包括：
提供甲基丙酸苷修饰的L-天冬氨酸二叔丁基酯盐酸盐，其结构式为：
Figure GDA0003500051970000151
提供大分子链转移剂，其结构式为
Figure GDA0003500051970000152
将结构式为(VIII-1)的甲基丙酸苷修饰的L-天冬氨酸二叔丁基酯盐酸盐和结构式为(IX)的大分子链转移剂加入到含有引发剂的第四有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h，通过冷乙醇或冷乙醚沉淀后，得到结构式(VIII)的亲水性聚合物。
所述第四有机溶剂为1,4-二氧六环、二甲基亚砜、及N,N-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
在制备大分子链转移剂的制备过程中，如使用的氨基酸不具备能够进行可逆加成-断裂链转移聚合(Reversible Addition-Fragmentation Chain TransferPolymerization，RAFT)反应的官能团(如双键，三键等)，需预先使用一些小分子化合物(例如天冬氨酸需要预先使用甲基丙烯酸酐修饰)对氨基酸进行修饰。另外，若氨基酸不溶于有机溶剂，需对氨基酸进行修饰(如天冬氨酸用叔丁基进行修饰)，然后再将修饰后的氨基酸与大分子链转移剂聚合。如使用的氨基酸本身具有能够进行聚合反应的官能团，则不需要对其进行预先修饰。氨基酸的修饰方法为本领域的常规的技术，在此不赘述。
在一些实施例中，制备所述结构式为(I)的化合物的步骤包括：
将所述嵌段聚合物溶于第五有机溶剂中；
向第五有机溶剂中加入质量分数为25％～40％的盐酸，于70℃～100℃的温度下反应12h～24h，以去除叔丁基；及
用冷正己烷或冷乙醚沉淀去除叔丁基后的嵌段聚合物，进行离心，以制得结构式为(I)的化合物，其中，第五有机溶剂与盐酸的体积比为：8～10：1。
在一些实施例中，所述第五有机溶剂可为甲醇等。
在一具体的实施例中，所述纳米造影剂的制备方法包括：
a.采用叔丁基修饰天冬氨酸，得到L-天冬氨酸二叔丁基酯盐酸盐；
b.采用甲基丙烯酸苷对L-天冬氨酸二叔丁基酯盐酸盐进行进一步的修饰，以得到甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸；
c.将聚乙二醇和小分子链转移剂进行酰胺化反应，以合成大分子链转移剂(PEG-CPAD)；
d.将甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸与大分子链转移剂(PEG-CPAD)进行聚合，以得到亲水性聚合物(PtBu-Asp-b-PEG)；
e.将该亲水性聚合物(PtBu-Asp-b-PEG)和甲基丙烯酸丁酯(BMA)反应，以得到两亲性嵌段聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)；
f.向两亲性嵌段聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)中加入盐酸，以除去用于修饰的天冬氨酸的叔丁基，得到除去叔丁基的两亲性嵌段聚合物；
g.将去除去叔丁基的两亲性嵌段聚合物络合Bi3+；
h.将络合有Bi3+的两亲性嵌段聚合物进行自组装，来装载Fe3O4，得到所述用于CT/MRI双模态成像的纳米造影剂。
在该两亲性嵌段聚合物(PEG-b-PAsp-b-PBMA)中，聚(天冬氨酸)(Asp)的聚合度m、聚(甲基丙烯酸丁酯)(PBMA)的聚合度n、及聚乙二醇(PEG)的聚合度q可依据实验设定的聚合度和转化率而定。通常，m＝2-100、n＝2-100、q＝10-500。
可以理解的，所述步骤a+b与步骤c的排序不分先后。
可以理解的，通过可逆加成断裂链转移聚合方法(RAFT)和酰胺化反应，来制备出两亲性聚合物。两亲性聚合物中的聚氨基酸可络合Bi3+，然后通过自组装的方法来包裹Fe3O4纳米粒子，使得本发明的纳米造影剂具有CT/MRI双模态成像特性。
在本实施例中，使用聚乙二醇(PEG)和小分子链转移剂(CPAD)进行酰胺化反应得到大分子链转移剂(PEG-CPAD)的步骤中，所述大分子链转移剂(PEG-CPAD)的制备方法如反应式(a)所示：
Figure GDA0003500051970000171
具体步骤为：将小分子链转移剂(CPAD)和聚乙二醇(PEG)溶于溶剂(如，二氯甲烷)中，向第三有机溶剂中加入二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)，在常温下搅拌24h～72h，滤纸过滤后，用冷乙醚进行沉降，制得大分子链转移剂(PEG-CPAD)。
在本实施例中，通过RAFT聚合来制备亲水性嵌段聚合物(聚乙二醇-嵌段-聚叔丁基天冬氨(PEG-PtBu-Asp))，所述制备方法如反应式(b)所示：
Figure GDA0003500051970000181
具体步骤为：将大分子链转移剂(PEG-CPAD)和甲基丙烯酸苷修饰的叔丁基天冬氨酸(tBu-Asp-MA)加入到有机溶剂(如，1,4-二氧六环为有机溶剂)中，在引发剂(如，偶氮二异丁腈(AIBN))的作用下，于50℃～120℃的温度反应1h～100h，再通过乙醚沉淀，获得亲水性嵌段聚合物。
在本实施例中，所述两亲性聚合物(聚乙二醇-嵌段-聚叔丁基天冬氨酸-嵌段-聚甲基丙烯酸丁酯(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA))的制备方法如反应式(c)所示：
Figure GDA0003500051970000182
具体步骤为：将亲水性嵌段聚合物(聚乙二醇-嵌段-聚天冬氨酸(PEG-b-PtBu-Asp))和甲基丙烯酸丁酯(BMA)溶于有机溶剂(如，1,4-二氧六环)中，在引发剂(如，偶氮二异丁腈(AIBN))的作用下，于50℃～120℃的温度下反应1h～100h，然后通过正己烷沉淀，获得两亲性聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)。
在本实施例中，所述能络合Bi3+和承载Fe3O4的两亲性聚合物的制备方法如反应式(d)所示:
Figure GDA0003500051970000191
具体步骤为：先将两亲性聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)溶于有机溶剂(如，甲醇)中，加入质量分数为32％的盐酸(其中，甲醇和盐酸的体积比为9：1)，于70℃～100℃的温度下反应12h～24h，以去除叔丁基，用冷乙醚沉淀后进行离心处理，以获得结构式为(I)的化合物。
在上述具体的技术方案中，所述纳米造影剂采用“自下而上”的自组装方法制备得到：将去除叔丁基后的两亲性聚合物(PEG-b-PAsp-b-PBMA)溶于有机溶剂(如，二甲基亚砜(DMSO))中，加入溶有Fe3O4和一定浓度的Bi3+的有机溶剂(如，氯仿)中后，快速注入到去离子水中，搅拌一段时间后，通过透析或者超滤法除去有机溶剂，得到所述纳米造影剂。
本发明还提供一种上述纳米造影剂在CT/MRI双模态成像中的应用。
本发明的纳米造影剂可同时利用Bi3+提高CT影像信号，Fe3O4纳米粒子降低MRI信号从而大幅提高软组织尤其是肿瘤部位的影像明暗对比度。因此，该纳米造影剂可应用于CT/MRI双模态成像中后，不仅比传统的CT和MRI造影剂具备更长效的血液循环时间，更可同时通过CT和MRI的互补影像，提高肿瘤(尤其是早期的微小肿瘤)的影像诊断准确性和灵敏度。另外，由于本发明的纳米造影剂可同时用于CT成像和MRI成像，可减少检查过程中多次用药造成的毒副作用。
实施例一：
1、制备亲水性嵌段聚合物(PEG-b-PtBu-Asp)
参照上述反应式(a)，将聚乙二醇(PEG)(5g,1mmol)、小分子链转移剂(CPAD)(0.558g,2mmol)、二环己基碳二亚胺(DCC)(0.824g，4mmol)、和二甲氨基吡啶(DMAP)(0.048g，0.4mmol)加入到100mL圆底烧瓶中，用50mL二氯甲烷溶解，于常温下搅拌24h～72h，用滤纸过滤后，然后用冷乙醚进行沉降，制备得到大分子链转移剂(PEG-CPAD)。
参照上述反应式(b)，将大分子链转移剂(PEG-CPAD)(636mg，0.12mmol)、甲基丙烯酸苷修饰的叔丁基天冬氨酸(tBu-Asp-MA)(477.6mg，1.2mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(3.9mg，0.024mmol)溶于装在安瓿瓶中的1,4-二氧六环(2mL)中。将安瓿瓶置于液氮中冷冻后用油泵抽气，然后密闭安瓿瓶，恢复到室温使反应混合物融化；再冷冻抽气，如此冻融循环反复操作三次。然后在真空下密封，于70℃下搅拌反应23h后，用液氮中止聚合反应，打开安瓿瓶，将反应后的混合物在冷乙醚中沉淀，离心，再溶解在二氯甲烷中，并用大量冷乙醚沉淀，反复三次，将最终产物在真空干燥箱中，于室温下过夜干燥，得到粉红色粉末，即亲水性聚合物(PEG-b-PtBu-Asp)，产率为32.6％，核磁表征结果显示PEG聚合度为13，PtBu-Asp聚合度为6。即，亲水性聚合物为PEG13-b-PtBu-Asp6。
2、制备两亲性嵌段聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)
参照上述反应式(c)，将制得的亲水性聚合物(PEG-b-PtBu-Asp)(384mg，0.05mmol)、甲基丙烯酸丁酯(BMA)(213mg，0.6mmol)、偶氮二异丁腈(AIBN)(3.9mg，0.024mmol)溶于装在安瓿瓶中的1,4-二氧六环(2mL)。与合成PEG-b-PtBu-Asp的方式一致，进行进行三冻三融，于70℃下搅拌反应16h后，用液氮终止聚合反应，然后用正己烷对反应物进行沉淀，离心，再溶解在二氯甲烷中，并用大量冷正己烷沉淀，反复三次，将最终产物在真空干燥箱中于室温下过夜干燥，得到淡黄色粘稠物，即两亲性性聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)，产率为50.1％。
将上述两亲性聚合物(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA)置于25mL的圆底烧瓶中，用9mL超干的甲醇溶解，加入1mL浓度为36％的盐酸，在通入氮气条件下，于100℃下反应12h，然后用冷乙醚沉降三次，并在真空干燥箱中烘干，得到白色粉末。
图1显示了本实施例制备的两亲性嵌段聚合物(PEG-b-PAsp-b-PBMA)的核磁共振氢谱。经过计算得到，BMA的聚合度为24，因此，该两亲性聚合物表示为PEG13-b-PAsp6-b-PBMA24。
3、构建具有CT/MRI双模态成像的纳米造影剂
将22mg两亲性嵌段聚合物(PEG13-b-PAsp6-b-PBMA24)充分溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，并将10μL，2M的Bi(NO3)3加入到上述聚合物溶液中，还可加入乙二胺四乙酸(EDTA)(5μL，0.5M)，以使天冬氨酸可稳定地络合Bi3+；
将5mg Fe3O4分散到100μL氯仿中后加入到上述溶液中，再快速加入到9mL快速搅拌的水相中后，继续搅拌1.5h，然后通过分子量为8KDa的透析膜去除有机溶剂；每2h换一次水，透析12h，从而通过自组装得到具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子，即，具有CT/MRI双模态成像的纳米造影剂。
可以理解的，通过自组装形成的具有CT/MRI双模态成的纳米造影剂，可通过改变聚合物的用量，Bi3+的浓度，Fe3O4的浓度来调整组装成的纳米粒子的大小。
如图2所示，使用TEM对具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子进行了表征。结果显示，具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子(PEG-b-PAsp-b-PBMA@Bi@Fe3O4)的粒径的范围为80nm～135nm。
如图3所示，使用XRD物相分析技术对具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子中的各组分的存在形态进行分析。结果显示，所述纳米粒子中含有Bi、Fe、O、Cu、C元素。
如图4所示，使用CT成像仪对具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子的CT成像性能进行了验证。具体的验证步骤包括：将Bi(NO3)3和碘海醇在96孔板中进行梯度稀释，浓度依次为100mM,50mM,25mM,12.5mM,6.25mM，3.13mM然后使用CT成像仪。结果显示，当Bi/I的浓度为0.1M时，I的CT值为398.6Hu，Bi的CT值为594.1Hu，这表明与临床所用的碘海醇相比Bi具有更明显的CT信号，这主要是因为Bi的原子序数比I的高，具有更强的X射线衰减系数。
如图5所示，使用MRI成像仪对具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子的MRI成像特性进行了验证。具体的验证步骤包括：将制得的具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子(Fe3O4纳米团簇)在96孔板中进行梯度稀释，浓度依次为2mM,1mM,0.5mM,0.25mM,0.125mM，制备相同的游离的Fe3O4为对照组，然后用MRI成像仪(型号为：以色列Aspect M3TM)进行MRI成像信号检测。结果显示，与游离的Fe3O4相比，Fe3O4纳米团簇(PEG-b-PtBu-Asp-b-PBMA@Bi@Fe3O4)具有更强的MRI T2造影效果。这主要是因为组装成纳米胶束后，Fe3O4的局部浓度增加，从而增强了MRI T2的造影效果。
如图6所示，使用细胞活性实验对具有CT/MRI双模态成像的纳米粒子的生物安全性进行了验证。具体的验证步骤包括：
选用人肝癌细胞株7721在96孔细胞培养板(每孔1×104细胞)中培养24小时，然后分别用不同浓度(0.3mg/mL、0.6mg/mL、1.2mg/mL、2.4mg/mL、4.8mg/mL、9.6mg/mL)的纳米造影剂(PEG-b-PAsp-b-PBMA@Bi@Fe3O4)处理24小时和48小时。将纳米造影剂移除后，加入100μL无血清和双抗培养基，再加入10μL CCK-8试剂，孵育2h后，将培养液移到新的96孔板，用酶标仪(Multiskan GO,Thermo-Scientific)测量450nm处的吸收值；
图6所示的细胞活性表明：具有CT/MRI双模态成像的纳米造影剂在聚合物浓度为9.6mg/mL时，24h后细胞活性达到90％以上，在48h后细胞活性在80％以上。这说明了本发明的纳米造影剂无细胞毒性，生物安全性好。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (11)

1.一种纳米造影剂，其特征在于，所述纳米造影剂由以下结构式为(I)的化合物络合Bi3 +，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure FDA0003500051960000011
其中，P独立地为
Figure FDA0003500051960000012
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
2.如权利要求1所述的纳米造影剂，其特征在于，所述纳米造影剂由以下结构式为(II)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure FDA0003500051960000013
其中，R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
3.如权利要求1所述的纳米造影剂，其特征在于，所述纳米造影剂由以下结构式为(III)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure FDA0003500051960000021
其中，R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
4.如权利要求1所述的纳米造影剂，其特征在于，所述纳米造影剂由以下结构式为(IV)的化合物络合Bi3+，并通过分子自组装来装载Fe3O4得到：
Figure FDA0003500051960000022
其中，m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500。
5.如权利要求1至4任一项所述的纳米造影剂，其特征在于，所述能络合Bi3+的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、或谷氨酸(Glu)；和/或
所述Fe3O4的直径的范围为2nm～10nm；和/或
所述纳米造影剂中，Bi3+占纳米造影剂的质量百分比范围为1％～10％，Fe3O4占纳米造影剂的质量百分比范围为5％～20％；和/或
所述纳米造影剂的粒径的范围为80nm～300nm。
6.一种纳米造影剂的制备方法，其包括以下步骤：
提供以下结构式为(I)的化合物：
Figure FDA0003500051960000031
其中，P独立地为
Figure FDA0003500051960000032
R4独立地为-C6H5、-CH2C6H5、-CH2CH2COOH、-CH2CH2OH或-CH2OH；Q独立的为-CCNCH3CH2CH2-或-CH2CH2-；R1独立地为-H、-CH3或-CH2CH3；AA为能络合Bi3+的氨基酸；h＝1-10；m＝2-100；n＝2-100；q＝10-500；
将结构式为(I)的化合物和铋盐溶于第一有机溶剂中，以使Bi3+与结构式为(I)的化合物络合，获得第一混合物；
将所述第一混合物加入到分散于第二有机溶剂中的Fe3O4中，获得第二混合物；及
将所述第二混合物加入到水中，搅拌，去除第一有机溶剂和第二有机溶剂后，获得所述纳米造影剂。
7.如权利要求6所述的纳米造影剂的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其混合物；和/或
所述能络合Bi3+的氨基酸为苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、蛋氨酸(Met)、半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、或谷氨酸(Glu)；和/或
所述第二有机溶剂为氯仿、或二氯甲烷；和/或
所述Fe3O4的直径的范围为2nm～10nm；和/或
所述纳米造影剂中，Bi3+占纳米造影剂的质量百分比范围为1％～10％，Fe3O4占纳米造影剂的质量百分比范围为5％～20％；和/或
所述纳米造影剂的粒径的范围为80nm～300nm；和/或
所述铋盐为Bi2(SO4)3、Bi2(NO3)3、或BiCl3。
8.如权利要求6所述的纳米造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备大分子链转移剂的步骤，所述制备所述大分子链转移剂的步骤包括：
将小分子链转移剂和聚乙二醇(PEG)溶解在第三有机溶剂中；
向第三有机溶剂中加入二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)，于常温下搅拌24h～72h；
过滤，沉降后，制备所述大分子链转移剂，
其中，所述小分子链转移剂的结构式(V)为：
Figure FDA0003500051960000041
所述聚乙二醇的结构式(VI)为：
Figure FDA0003500051960000042
9.如权利要求8所述的纳米造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备亲水性聚合物的步骤，所述制备亲水性聚合物的步骤包括：
将所述大分子链转移剂和甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸加入至含有引发剂的第三有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h；
用冷正己烷或冷乙醚沉降后，制得所述亲水性聚合物，
其中，所述大分子链转移剂的结构式(IX)为：
Figure FDA0003500051960000051
所述甲基丙烯酸苷修饰过的天冬氨酸的结构式(X)为：
Figure FDA0003500051960000052
10.如权利要求9所述的纳米造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备嵌段聚合物的步骤，所述制备嵌段聚合物的步骤包括：
将甲基丙烯酸丁酯单体与所述亲水性聚合物加入至含有引发剂的第四有机溶剂中，在50℃～120℃的温度下反应1h～100h；及
用正己烷或乙醚沉淀后，制得所述嵌段聚合物，
其中，所述甲基丙烯酸丁酯单体的结构式(VII)为：
Figure FDA0003500051960000053
所述亲水性聚合物的结构式(VIII)为：
Figure FDA0003500051960000054
11.如权利要求10所述的纳米造影剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备所述结构式为(I)的化合物的步骤，所述制备结构式为(I)的化合物的步骤包括：
将所述嵌段聚合物溶于第五有机溶剂中；
向第五有机溶剂中加入质量分数为25％～40％的盐酸，于70℃～100℃的温度下反应12h～24h，以去除叔丁基；及
用正己烷或冷乙醚沉淀去除叔丁基后的嵌段聚合物，进行离心，以制得结构式为(I)的化合物，其中，第五有机溶剂与盐酸的体积比为：8～10：1。
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