JPS5911602B2 - 診断用微粒子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規親水性不溶性微粒子に関する。

近年医学診断の目的をもつて合成高分子化合物ラテック
スがしばしば利用されている。最もよく用いられている
のはポリスチレンラテックスである。例えばポリスチレ
ン微粒子を白血球に貧食させて白血球の貧食能を測定す
ることが行なわれる。 またポリスチレン微粒子表面に
免疫活性物質を吸着させておき、その凝集反応や細胞へ
の付着反応により、免疫学的検査を行なうことが多い。

しかしながらポリスチレン微粒子を利用する場合の問題
点は、ポリスチレンが疎水性であるため細胞に１０非選
択的に付着して生理反応を惹起することである。またポ
リスチレン表面に固定すべき抗体などの免疫活性蛋白質
の吸着が強くないために、凝集反応でも限られた場合に
しか満足な結果を得ることができない。またアガロース
、架橋デキストランおよびポリアクリルアミドなどの親
水性ゲルも蛋白質に対する非特異的吸着が少ないために
免疫吸着クロマトグラフの担体としてしばしば利用され
ている。この場合抗原又は抗体などの免疫活性物質の担
体への固定は共有結合によつて行なわれ２０る。しかし
従来知られたこれらクロマトグラフ用ピースの直径は１
０μ以上であつて貧食能測定用、細胞付着用マーカーな
いし凝集反、応用としては適当とはいえない。貧食能測
定のためには平均直径が０．１ないし５μの範囲で、細
胞への非特異的付２５着がない微粒子がのぞましい。さ
らに染色、螢光または放射能で標識できれば好都合であ
る。細胞付着用ないし凝集反応用マイクロピースの担体
として望ましいのは直径が０．１ないし１０μの範囲で
、細胞への付着や血清蛋白の非特異的吸着がな３０く、
しかも蛋白質や螢光物質を化学的に結合させるのに必要
な官能基を有することである。Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕ
ｌｅ、９、３２８（１９７６）には、２−ヒドロキシエ
チルメタクリレート（以下ＨＥＭＡと略記）を放射線を
用いて水中で重合す３５ることにより粒径０．３ないし
３μの範囲のＰＨＥＭＡ微粒子を得、それを細胞付着用
マーカーとして応用することが提案されている。

このＰＨＥＭＡ微粒子は粒度分布も比較的狭く細胞標識
以外の免疫試験にも利用可能と思われるが、放射線重合
によらなければ製造できないことが大きな制約である。

一方、特公昭５３−１６０３７号公報にはＨＥＭＡおよ
び交さ結合剤を芳香族炭化水素のような不活性希釈剤中
で重合することにより直径１０μ以下のＰＨＥＭＡ微粒
子を得られることが提案されている。

しかしこれらＰＨＥＭＡ微粒子の問題点は生理食塩水、
尿または血清中で自発凝集を起こしやすいことである。

本発明の主要な目．的の一つは、表面に免疫活性物質（
例えば抗原）を固定化した微粒子がその固定化した免疫
活性物質と特異的に反応する別の免疫活性物質（例えば
抗体）と接触することにより凝集する現象を利用して免
疫学的検査を行なうために好適に利用される担体微粒子
を提供することにある。かかる用途への利用に際し、免
疫学的反応と無関係に自発凝集が起こつては目的とする
検査が行なえないことは明らかであろう。本発明者らは
凝集反応細胞標識および貧食能測定等の免疫学的ないし
細胞学的検査に有用な微粒子を開発すべく鋭意研究の結
果本発明に到達した。すなわち本発明の診断用微粒子は
、式なる繰返し単位が全繰返し単位の少なくとも５０モ
ル％を占める架橋重合体で、２５℃における平衡含水率
が１０ないし９０％の範囲にあり、含水状態における平
均直径が０．１〜１０μの範囲にあることを特徴とする
ものである。

本発明による微粒子はヒトおよび動物の細胞に非特異的
に付着することがなく、また血清から蛋白質を非特異的
に吸着することも、実質上ないといてつよい。

また生理食塩水や尿により凝集することがなく、血清に
おいても４倍以上に希釈すれば実質上凝集することはな
い。またヒドロキシル４基やエステル結合を含んでいる
ためその反応性を利用して抗原・抗体をはじめとして生
理活性物質や免疫活性物質を共有結合によつて固定化す
ることができる。また螢光標識や染色も容易である。本
発明の微粒子を構成する重合体は、２，３−ジヒドロキ
シプロピルメタクリレートが繰り返し単位の少なくとも
５０モル％を占める架橋重合体であり、この場合、５０
モル％未満の範囲で許容される共重合成分としては炭素
炭素二重結合を有する付加重合性化合物からなる非架橋
性共重合成分と架橋性共重合成分が包含されるが、非架
橋性共重合成分としては、例えばメタクリル酸メチル、
メタクリルアミド、アクリルアミド、２−オキシエチル
メタクリレート、メタクリル酸、ジメチルアミノエチル
メタクリレート、ジエチルアミノエチルメタクリレート
およびスチレンなどの炭素炭素二重結合を有する付加重
合性化合物がある。これら非架橋性共重合成分の添加は
必ずしも必要ではないが、非架橋性共重合成分の導入に
よつて粒子の親水性、含水率および分散安定性などを調
節することができる。粒子の含水率は架橋５度によつて
もまた調節することができる。重合体の架橋は必要不町
欠の条件である。何９故なら主成分である２，３−ジヒ
ドロキシプロピルメタクリレートの重合体は非架橋の状
態では水に溶解してしまい粒子の形態を保ち得ないから
である。なお非架橋性共重合成分の割合が５０モル％を
越えると、微粒子が本発明の目的とする性能、すなわち
血清や尿と混合しても凝集せずに安定に分散状態を保つ
こと、細胞に非特異的に付着しないこと、血清蛋白を非
特異的に吸着しないことなどの特長を持ち得ない。本発
明の微粒子は、その表現から自明のとおり固体状態を維
持するに十分な分子量を有しており、微粒子という表現
がその分子量の下限を表わしているといえるが、架橋構
造を有するため、通常の手段でその具体的値を測定する
ことは不可能である。

本発明の微粒子は剖水率が１０ないし９０％であること
が必要である。

含水率は次式によつて定義され、２５℃で測定する。含
水率が１０％未満では板子が細胞に非特異的に付着しや
すいこと、自発的に凝集しやすいことなどの問題があり
本発明の目的に適しない。

また含水率が９０％以上になると含水ゲル粒子と水性媒
体との間の屈折率の差が非常に小さくなり、凝集・細胞
付着・貧食等の現象を肉眼的にも顕微鏡的にも観察し難
くなる。粒子を観察しやすくするために染色することは
しばしば利用される技法であるが、９０％以上の高含水
率では濃色に着色することは困難である。本発明の微粒
子の平均直径は０．１ないし１０μの範囲内にあること
が必要である。

粒径が０．１μ以下では凝集を肉限により観察すること
も、細胞への付着を光学顕微鏡により観察することも困
難となる。粒径１０μ以上では粒子の分散安定性が悪く
なり、また細，抱に対しても相対的に大きくなるので細
５抱付着の観察にも適しない。なお上記の説明から理解
できるように粒径の分布はできるだけ狭いことがのぞま
しい。具体的には例えば粒径の標準偏差値を平均直径（
数平均）で除した値が０．２以下であれば本発明の目的
に適しているということができる。上記の特徴を有する
本発明の重合体微粒子を製造するのに適した方法を次に
説明する。

その製造方法はグリシジルメタクリレートを単独、若し
くは他のエチレン性不飽和単量体と共に架橋剤の共存下
に適当な希釈剤中で重合することによりグリシジルメタ
クリレートの単独重合体又は共重合体の微粒子を析出せ
しめ、その微粒子を酸性またはアルカリ性の水溶液で処
理することにより、グリシジルメタクリレート単位中の
エポキシ環を加水分解することよりなる。ここで適当な
希釈剤とはグルシジルメタクリレート単量体が容易に溶
解するが重合により生成するポリグリシジルメタクリレ
ートが溶解せずに沈殿析出するような媒体のことであり
、例えば酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソプロ
ピル、酢酸ブチル各異性体およびプロピオン酸の上記相
当エステルなどのエステル類、メチルｎ−プロピルケト
ン、メチルイソプロピルケトンおよびメチルイソブチル
ケトンなどのケトン類などである。上記重合媒体は混合
使用してもよい。

また四塩化炭素、タロロホルム、ブロモホルムなどのハ
ロゲン１ヒ炭化水素と混合して使用することもしばしば
好ましい結果をもたらす。また架橋剤即ち炭素炭素二重
結合を２個以上有する付加重合性化合物としては、例え
ばエチレングリコールジメタクリレート、ジエチレング
リコールジメタクリレート、およびＨそ０ＣＨ２−ＣＨ
２）。−０Ｈ（ｎは３以上の整数）で表わされるポリエ
チレングリコールのジメタクリレート、ジビニルベンゼ
ン、またはメチレンビスアクリルアミドなどが好ましく
用いられる。架橋性単量体の添加量は通常全単量体中の
０．１〜３０モル％である。０．１モル％以下では、後
で重合体中のエポキシ基を加水分解した時に重合体が水
に溶解してしまうのを抑えることができない。

また３０モル％以上にすると重合中の粒子の分散状態が
悪くなり凝集傾向が顕著となる。架橋剤を式（ここでＲ
１及びＲ３はＨ又はメチル基を示し、Ｒ２は２価の有機
基を示す）で表わした場合、本発明の架橋重合体はその
構造中に、式なる架橋結合を少なくとも１個有するもの
と表現することができる。

勿論３官能以上の架橋剤を用いた場合はそれに対応する
構造となる。非架橋性共重合成分を添加する意義および
適当な非架橋性共重合成分の種類についてはすでに述べ
たが、非架橋性共重合成分を使用することによるもう１
つの大きな効果は重合体微粒子の粒度の調節である。共
重合成分の種類によつて重合体微粒子の平均直径は大き
く変り得る。平均粒径に影響するもう一つの大きな因子
は重合媒体の種類である。すなわち生成する重合粒子の
直径は主として重合媒体および共重合成分の種類とその
添加量によつて調節する。ただし共重合成分は架橋性お
よび非加橋性を合わせて全単量体の５０モル％を越える
ことはできない。共重合成分が５０モル％以上の範囲で
はすでに述べたように生成する粒子の生理食塩水、尿お
よび血清などに対する分散安定性や蛋白質の非吸着性な
どが失われ本発明の目的にそぐわなくなる。重合開始剤
としては通常のラジカル重合開始剤、例えば、２，２′
−アゾビスイソブチロニトリル、２，２′−アゾビス（
２，４−ジメチルバレロニトリノ（ハ）、２，２′−ア
ゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリ
ル）、２，２′−アゾビス（４−メトキシ−４，２−ジ
メチルバレロニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベン
ゾイル、ジラウロイルパーオキサイド、ジ一Ｔｅｒｔブ
チルパーオキサイドなどの過酸化物を用いることができ
る。

重合温度も通常のラジカル重合の温度範囲でよく２０℃
ないし８０℃がとくに好ましい。重合開始剤の重合混合
液中の濃度は通常０．００１ないし０．０３モル／ｌ程
度である。単量体の重合混合液中の濃度は通常５ないし
５０重量％の範囲が好ましい。単量体濃度が５０重量％
を超えると生成する重合体粒子が凝集する傾向がある。
また単量体濃度が５重量％未満でも本発明は実施可能で
あるが、得られる重合体微粒子が少くなるので生産性が
低くなる。なお重合は窒素またはアルゴンなどの不活性
ガスで置換して行なうのがのぞましい。本発明の重合体
微粒子を製造するのに適した別の方法は乳化重合として
よく知られた重合方法である。乳化重合法について詳し
く説明する必要はないが、乳化剤としてはアニオン系、
カチオン系およびノニオン系のいずれも使用可能である
。重合開始剤としては過硫酸のカリウム、ナトリウムま
たはアンモニウム塩、２，２′−アゾビス（２−アミジ
ノプロパン）塩酸塩、または４，４″−アゾビス−４−
シアンペンタン岐などの水溶性遊離基発生剤が適当であ
る。重合体微粒子の平均直径を調節するのに最も有効な
手段は重合系における単量体濃度および乳化剤濃度の調
節である。次に上記のようにして製造したグリシジルメ
タクリレートを主成分とする重合体微粒子を加水分解処
理する。

この加水分解は通常酸性又はアルカリ性水溶液で重合体
微粒子を処理することにより実施され、重合体中のエポ
キシ基を加水分解してジオールに変換するものである。
その際反応条件が過酷であるとエステル結合まで加水分
解されるのでそれを避けるためにできるだけ緩和な条件
を選ぶことが望ましい。アルカリはエステルを切断する
傾向が強いので、一般的に言えば酸性の条件を使用する
のが好ましい。酸としては例えば硫酸、塩酸、硝酸、リ
ン酸などの無機酸又はベンゼンスルホン酸、トルエンス
ルホン酸などの有機酸の希薄水溶液が好ましい。酸濃度
としては０．０１ないし１規定の範囲が好ましい。加水
分解温度は０℃ないし５０℃の範囲が好ましい。それよ
り高温では副反応が無視できなくなる。上記のように反
応条件が緩和であるため反応速度が小さく、十分な攪拌
を行なつても通常反応完結には相当の時間を要する。そ
こで反応系にアセトン、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ンなど水に可溶で該重合体を膨潤させる能力のある有機
溶媒を添加すると反応を促進することができる。

これらの溶媒によつて重合体が膨潤し酸が重合体粒子内
部に拡散するのを助けられるものと解釈されるが、その
結果加水分解の反応時間を短縮することができる。加水
分解終了後、粒子は通常十分量の水で洗浄される。さら
に炭酸水素ナトリウム水溶液等で洗浄してもよい。この
ようにしてほとんど副反応を起こすことなくエポキシ基
を１，２−ジオールに変換し、２，３−ジオキシプロピ
ルメタクリレートを主成分とする重合体粒子を製造する
ことができる。目的とする重合体が生成していることは
例えば実施例１で詳しく述べるように赤外線吸収スペク
トルにより確認することができる。このようにして製造
した２，３−ジオキシプロピルメタクリレートを主成分
とする重合体微粒子は含水状態における平均直径が０．
１ないし１０μの範囲にあり、粒度分布も比較的狭い。

また２５℃における平衡含水率は１０〜９０％の範囲に
あり通常水に分散した状態で保存されるが、乾燥して保
存してもよい。乾燥微粒子は使用時に水を加えて振り混
ぜれば容易に再分散することができる。実施例 １ グリシジルメタクリレートとトリエチレングリコールジ
メタクリレートとを９５：５のモル比で混合し、この単
量体混合物２３部（重Ｉ基準、以下同じ）を７７部のプ
ロピオン酸エチルに溶解し、２，２′−アゾビス（２，
４−ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）０．１部
を添加して重合させた。

重合開始剤の初濃度は３．６ｍｍ０１，／ｌである。重
合はアルゴン雰囲気下４０℃で１．５時間静置状態で行
なつた。所定時間経過後白濁した重合混合物をアセトン
に注ぎ、１５００ｘ９、１０分間で遠心分離し、沈降し
た粒子をエタノールで再分散して洗浄、次いで再び遠心
分離した。減圧下に乾燥し２０部の微粒子状重合体を得
た。この微粒子状重合体１部をＮ／２０硫酸１００に懸
濁させ３０℃で１４日間攪拌し加水分解を行なつた。時
間が経過するにつれて懸濁液は不透明度が減少し、また
微粒子の分散状態が安定化して攪拌を止めても沈降しに
くくなつていることが観察された。加水分解終了後微粒
子は遠沈・分散を繰り返す事により水で洗浄した。分散
液の一部を乾燥し、赤外線吸収スペクトルを測定した。
別に２，３−ジオキシプロピルメタクリレート単量体と
トリエチレングリコールジメタクリレートとを９５：５
のモル比で混合し、水中で過硫酸アンモニウムを重合開
始剤として常法により重合することによつて調製した標
品重合体の赤外線吸収スペクトルが上記微粒子状重合体
の赤外吸収スペクトルと一致した。したがつてここで得
られた微粒子状重合体は、トリエチレングリコールジメ
タクリレートによつて橋かけされたポリ（２，３−ジオ
キシプロピルメタクリレート）である。この重合体微粒
子を光学顕微鏡により１０００倍の倍率で観察すると、
粒子の直径は１．６μから３．２μの範囲にあり、平均
２．７μであつた。次に乾燥粒子０，５９をブルーデキ
ストラン５即／ｍｌ溶液２ｍ１に加えて分散し、２５℃
で１夜放置した後ブルーデキストラン濃度を再び測定し
、乾燥粒子を加えたことによるブルーデキストランの濃
度変化から、粒子の含水率を計算した結果、含水率は４
８％であつた。

ブルーデキストランとしてはＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎ
ｅＣｈｅｍｉｃａＩｓ社製ＢｌｕｅＤｅｘｔｒａｎ２Ｏ
ＯＯ（平均分子量２，０００，０００）を使用し、その
后液中の濃度は６２０ｍμの吸収により測定した。実施
例 ２ グリシジルメタクリレート、２−オキシエチルメ．タク
リレートおよびエチレングリコールジメタクリレートの
３者を８５．７：９．５：４．８のモル比で混合し、そ
の単量体混合物２４部、プロピオン酸エチル７６部およ
び２・，２７−アゾビス（２，４−ジメチル−４−メト
キシバレロニトリル）０．１３部（４．７ｍ１ｎ０Ｉ／
ｌ）の混合物を実施例１と同様にして重合させた。

ただし重合時間のみ３時間に変更した。同様にアセトン
およびエタノールで洗浄して乾燥させた。微粒子状重合
体の収量は４７部であつた。この重合体微粒子１部は水
５０部、アセトン５０部および濃硫酸０．２部の混合液
に分散し、３０℃で７日間撹拌して加水分解を行なつた
。この重合体粒子を光学顕微鏡により１０００倍の倍率
で観察すると粒子の直径の分布は表１の通りである。直
径の平均は３．５２μ、標準偏差は０．４４７μ、した
がつて標準偏差／平均＝０．１２６である。

実施例１と同様にしてブルーデキストラン法により含水
率を測定すると、２５℃における含水率は４６％であつ
た。また別法として水で膨潤した粒子と乾燥脱水した粒
子の直径の比から含水率を求めた。すなわちハイドロゲ
ルの容積についてその構成成分であるポリマと水との加
成性が成り立つと仮定すれば下式（１）が導かれる。た
だし、Ｓ★一膨潤粒子直径Ｓｄ＝乾燥粒子直径Ｄ，＝ポ
リマの比重＝１．１５本実施例の場合乾燥粒子の直径が
平均２．８９μであつたので含水率は４５％となり、ブ
ルーデキストラン法とよく一致した。

実施例 ３ グリシジルメタクリレート９．４７部、２−オキシエチ
ルメタクリレート０．９６部およびトリエチレングリコ
ールジメタクリレート０．０６部の混合物（モル比は８
９．９：９．９：０．２７）の混合物を３０部のプロピ
オン酸エチルに溶解し、２，２′−アゾビス（２，４−
ジメチル−４−メトキシバレロニトリル）０．０３部を
添加して窒素雰囲気下４０℃で３時間重合させた。

２，２′−アゾビス（２，４−ジメチル−４−メトキシ
バレロニトリル）の重合液中の濃度は２．２ｍ！ＮＯＩ
／ｉである。

白濁した重合混合液はアセトンに注ぎ、遠沈し、アセト
ンで１回、メタノールで１回さらに石油エーテルで２回
洗浄した後沢過乾燥した。乾燥重合体微粒子の収量は２
．９１部であつた。それをさらに実施例２と同様にして
希硫酸で加水分解した。加水分解後の微粒子は顕微鏡で
観察した結果、粒子のの直径は平均３．０μ、標準偏差
は０．４３μであつた。この微粒子の含水率はブルーデ
キストラン法によれば６１％、式（１）によれば５９％
であつた。実施例 ４〜１８ 実施例２に順じた操作により、非架橋性共重合成分、架
橋性共重合成分、重合媒体、重合開始剤、重合温度およ
び重合時間などの条件を変更してハイドロゲル微粒子を
調製した。

重合条件と収率、加水分解後のハイドロゲル微粒子の平
均直径と含水率をまとめて表２に示した。ＨＥＭＡ：２
−ヒドロキシエチルメタクリレート、ＭＭＡ：メチルメ
タクリレート、ＴＥＧＤＭ：トリエチレングリコールジ
メタクリレート、ＥＧＤＭ：エチレングリコールジメタ
クリレート、−７０：２，２′−アゾビス（４−メトキ
シ−４，２一ジメチルバレロニトリル）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ なる繰返し単位５０モル％以上と炭素炭素二重結合を有
   する付加重合性化合物からなる共重合成分単位５０モル
   ％未満からなり、該付加重合性化合物のうち炭素炭素二
   重結合を２個以上有するものが０．１〜３０モル％（モ
   ル％はすべて全単量体成分基準である）がある架橋重合
   体からなり、２５℃における平衡含水率が１０〜９０％
   で、含水状態における平均直径が０．１〜１０μの範囲
   内にある親水性で水不溶性の診断用微粒子。