JPS5829135B2 - 蛋白質に吸着された有機化合物の分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、有機化合物を吸着している蛋白質水溶液から
被吸着有機化合物を分離する方法に関する。

一般に発酵工業における培養物の単離精製、動物血液等
の精製等においては、有機化合物の吸着された蛋白質の
水溶液が、精製の対象となることが多い。

これらの吸着状態には、疎水結合、イオン結合、水素結
合、ファンデルワールス力による結合及びこれらの異な
った結合形式のかさなりによって強い吸着が生じている
すべての結合状態が含まれる。

ここで疎水結合とは、水溶液中で水分子との間に結合を
作りにくい分子もしくは分子中の原子団同志が親和性を
もって集まる現象を指す。

蛋白質に有機化合物が強く吸着されている水溶液から、
蛋白質の変性を惹起せずに被吸着有機化合物を分離する
ことは、被吸着有機化合物自体が目的生成物である場合
、蛋白質自体が目的生成物である場合のいずれにも極め
て重要な単位操作であり、この効率よい分離方法の確立
が強く要望されている。

本発明者等は、このような有機化合物を吸着した蛋白質
水溶液から被吸着有機化合物を分離する方法について鋭
意研究をかさねできたが、本発明者等がさきに見出し特
願昭５１−１２８８６８号及び特願昭５２−５２５８５
号明細書等に開示した含シアノ多孔性共重合体が、上記
用途の吸着剤として殊の他優れたものであることを見出
し、本発明をなすに至った。

即ち、本発明は、有機化合物を吸着している蛋白質の水
溶液を２重量％〜９９重量％の架橋重合性単量体と１重
量％〜９８重量％のアクリロニトリル、メタクロルトリ
ル、α−クロルアクリロニトリル、シンナムニトリルの
うちからえらばれた含シアノ単量体を含む単量体混合物
を共重合して得られる平均孔径ｄが６０λ〜９０００人
であり、かつ孔径が０．５ｄ以上２ｄ未満である孔の体
積が全気孔量の２０〜６０％である多孔性共重合体に接
触せしめた後、水洗により蛋白質を除去し、有機化合物
を水よりも極性の低い溶媒により溶出せしめることを特
徴とする蛋白質に吸着された有機化合物を分離する方法
に関するものである。

以下本発明について具体的に説明する。

本発明方法の対象となる有機化合物が吸着された蛋白質
水溶液は、前記の如きその吸着結合形式の如何を問わず
、又蛋白質の種類及び被吸着有機化合物の種類の如何を
問わず、あらゆる有機化合物吸着蛋白質水溶液をすべて
包含する。

例えば、非抱含ビリルビン、バゾフラビン、アスコルビ
ン酸、アセチルコリン、アデノシン、遊離脂肪酸、胆汁
酸、トリヨードサイロニン、サイロキシン、チロキシン
、コーチゾール、ヒスタミン等の代謝物質、クロロマイ
セチン、バルビッール酸、ジギトニン、ネオサルパル酸
オーレオマイシン、ペニシリン、サリチル酸等の生理活
性物質、インドシアニングリーン、プロムスルフオフタ
レン、フロムクレゾールグリーン、フェノールレッド、
コンゴーレッド等の色素類などを吸着した血清アルブミ
ン分画水溶液、ビタミンＡ、に、Ｄ、Ｅ等を吸着した血
清グロブリン分画水溶液、非反応型の拮抗及び非拮抗阻
害剤を吸着した酵素水溶液、各種の免疫原性物質及びハ
プテン等を吸着した抗体蛋白質、蛋白質の可溶化剤であ
るアルキルベンゼンスルホン酸、ラウリル硫酸ナトリウ
ム等のアニオン性界面活性剤、セチルピリジニウムクロ
ライド等のカチオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノオレエート、バライソオクチルポリオキ
シエチレンフェノールポリマー等の非イオン性界面活性
剤などを含む各種蛋白質水溶液、その他、アミノ酸発酵
、核酸発酵、有機酸発酵、抗生物質の発酵生産、生理活
性物質の発酵生産、酵素の発酵生産、菌体タンパクの発
酵生産等の発酵工業において得られる培養液のすべては
本発明の対象物である。

本発明で用いる含シアノ多孔性共重合体の構成単位とな
る含シアノ単量体としては、アクリロニトリル、メタク
ロルニトリル、α−クロルアクリロニトリル、シンナム
ニトリルがある。

これらの含シアノ単量体の重量分率は１％〜９８％であ
り、好ましくは５％〜８５％である。

含シアノ単量体の含量が多すぎると必然的に架橋重合性
単量体の含量が減少して強度の低下を招く、又含シアノ
単量体の含量が極端に低いと二ｌ−ＩＪル基の特性が十
分発揮されない。

この共重合体は、含シアノ単量体と共重合可能の他の単
量体を含むことができる。

それらの単量体としては、スチレン、メチルスチレン、
エチルスチレン、ビニルナフタレン、ブクジエン、イソ
プレン、ピペリレン等の炭化水素化合物：クロルスチレ
ン、ブロムスチレン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノスチレン
、ニトロスチレン、クロルメチルアミノスチレン等のス
チレン誘導体：メチルビニルスルフィド、フェニルビニ
ルスルフィド等のビニルスルフィド誘導体ニアクリル酸
：メタクリル酸ニアクリル酸メチル、アクリル酸クロル
メチル等のアクリル酸エステル：メタクリル酸シクロヘ
キシル、メタクリル酸ジメチルアミノエチル、メタクリ
ル酸グリシジル、メタクリル酸テトラヒドロフルフリル
、メタクリル酸ヒドロキシエチル等のメタクリル酸エス
テル：メチルビニルケトン、エチルイソプロペニルケト
ン等のビニルケトン：塩化ビニリデン、臭化ビニリデン
等のビニリデン化合物ニアクリルアミド、Ｎ−ブトキシ
メチルアクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミンエチル
アクリルアミド等アクリルアミド誘導体：酢酸ビニル、
カプリン酸ビニル等の脂肪酸ビニル誘導体：チオアクリ
ル酸メチル、チオ酢酸ビニル等のチオ脂肪酸誘導体：さ
らに、Ｎ−ビニルスクシンイミド、Ｎ−ビニルピロリド
ン、Ｎ−ビニルフタルイミド、Ｎ−ビニルカルバゾール
、ビニルフラン、ビニルイミダゾール、メチルビニルイ
ミダゾール、ビニルピラゾール、ビニルオキサゾリドン
、ビニルチアゾール、ビニルピリジン、メチルビニルピ
リジン、２，４−ジメチル−６−ビニルトリアジン等の
異部環状ビニル化合物がある。

この共重合体の構成単位となる架橋重合性単量体として
は、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキ
シレン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、
トリビニルベンゼン、ジビニルジフェニル、ジビニルジ
ベンジル、ジビニルフェニルエーテル、ジビニルジフェ
ニルアミン、ジビニルスルホン、ジビニルケトン、ジビ
ニルピリジン、ジビニルキノリン、フマル酸ジアリル、
マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、炭酸ジアリル
、シュウ酸ジアリル、アジピン酸ジアリル、酒石酸ジア
リル、ジアリルアミン、トリアリルアミン、リン酸トリ
アリル、トリカルバリル酸トリアリル、Ｎ、Ｎ′−エチ
レンジアクリルアミド、Ｎ。

Ｎ′−メチレンジメタクリルアミド、エチレングリコー
ルジメタクリレート、ポリエチレングリコールジメタク
リレート、トリメチロールプロパントリメタクリレ−ト
、ペンタエリスリトールテトラメタクリレート、１，３
−ブチレングリコールジアクリレート、トリメチルプロ
パントリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラア
クリレート、トリアリルイソシアヌレート、１，３．５
−１−リアクリロイルへキサヒドロ−１，３，５−トリ
アジン、ジアリールメラミン等が含まれる。

架橋重合性単量体の含量は、２重量％〜９９重量饅であ
り、好ましくは５重量％〜７０重量優、さらに好ましく
は８重量％〜６０重量優である。

架橋重合性単量体の含量が低すぎると膨潤収縮度が大き
くなり機械的強度が低下する。

又架橋度が増加しすぎると蛋白質に吸着した有機化合物
吸着の場を与える微少孔が形成されにくくなったり、共
重合体内への液の拡散速度の低下がみられる。

本発明に用いる共重合体は、平均孔径が６０Ａ〜９００
０人の範囲内にある多数の孔を有する構造体であるが、
その平均孔径は、６０Ａ〜４０００人の範囲にあるもの
がより好ましく、６０人〜２５００Ａの範囲にあればさ
らに好ましい。

平均孔径が小さすぎると孔内に有機化合物を吸着した蛋
白質が浸入出来なくなったり、拡散速度の著しい低下を
みたりするために不都合であり、孔径が大きすぎると吸
着に寄与する表面積が小さくなることや機械的強度が低
下する等の欠点が生じてくる。

その孔径分布も該有機化合物の吸着能に関して重要な因
子であり、平均孔径をｄとする時、孔径が０．５ｄ以上
２ｄ未満である孔の体積が全気孔量の６０％以下、好ま
しくは５０％以下であるのが望ましい。

この値の下限には特に制限はないが、平均孔径附近の孔
が最も多い故必然的に２０％以上となるが、一般的には
３０％である。

さらに、気孔量も該有機化合物の吸着能に重要な関係が
ある。

即ち、全単量体に対する架橋重合性単量体の重量分率を
Ｘ％とする時、乾燥重合体１ｇ当りの全気孔量力ｏ、
０５ Ｊｘｍｉ以上１．５ｆｉｍｌ以下であることが好
ましく、ざらにｏ１ｓ４−以上１．３ Ｊ５＜ｍｌ以下
であることが望ましい。

気孔量が少なすぎると十分な吸着表面を提供することが
出来ず、又過大な気孔量は、共重合体の機械的強度を低
下させるのみならず、単位体積の共重合体当りの吸着量
を却って低下させる。

次に、本発明で採用した多孔特性の測定法について述べ
る。

平均孔径、孔径分布、気孔量、比表面積の測定法は、水
銀圧入式ポロシメーターによった。

この方法は多孔性物質に水銀を圧入していき、浸入した
水銀量から気孔量を求めるとともに、細孔の直径とその
孔に水銀を圧入するに要する圧力は反比例するという原
理に基づいて孔径を測定するものである。

この方法の詳細は、成書ファインパーティクルメジャー
メント（Ｆｉｎｅ ＰａｒｔｉｃｌｅＭｅａｓｕｒｅｍ
ｅｎｔ ）クライト・オア・ジュニア及びジエ・エム・
ダアラアバアル（Ｃ１ｙｄｅ−Ｏｒｒ Ｊ ｒ ａｎｄ
Ｊ 、Ｍ、Ｄａｌ １ａｖａｌ ｌｅ）共著、ザ・マク
ラミン・カンパニイ、ニュー・ヨーク（Ｔｈｅ Ｍａｅ
ｍｉ ｌｌａｎＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ ｙｏｒｋ ）
１９５９に記載されている。

この方法では、３５〜４０人までの孔を測定することが
可能である。

本発明において、孔とはその孔径が４０Å以上の表面か
らの連通孔と定義し、気孔量、表面積もその孔に由来す
る値である。

又、平均孔径はｄｖ／ｄｌＱｇｒの値が最大値となるｒ
の値と定義する。

ここでｒは孔径、■はポロシメーターで測定した累積の
気孔量である。

もうひとつの多孔性の指標となる値はカサ比重である。

発明者等は、次の方法でカサ比重を測定した。

即ち、まずガラスフィルター付カラムに樹脂を充填して
水を十分流し、その時の樹脂が充填されている部分のカ
ラムの体積を求める。

その後試料を十分乾燥して重量を測定し、両者の値から
カサ比重を計算した。

次に、本発明吸着剤共重合体の製造法について述べる。

本発明者の一部は、既に高度に多孔性の架橋重合体の製
造方法を見出しているが、本発明の多孔性共重合体の製
造にもこの技術を用いることが出来る。

その一つの方法は、共重合性単量体の混合物であって、
その内の２重量％以上が架橋重合性単量体である混合物
を、該混合物中の少なくとも一種の単量体の単独重合体
には親和性であり、且つ少なくとも一種の他の単量体の
単独重合体には非親和性であり、しかも単量体混合物を
溶解し且つ各単量体とは反応しない単一液体の存在下で
共重合させて共重合体を得、次いで該共重合体の内部よ
り前記液体及び未反応単量体を除去することを特徴とし
ており、もうひとつは、共重合性単量体の混合物であっ
て、その内の２重量％以上が架橋重合性単量体である混
合物を、該混合物中の少なくとも一種の単量体の単独重
合体に親和性で、しかも単量体混合物を溶解し且つ各単
量体とは反応しない液体と、該混合物中の少なくとも一
種の単量体の単独重合体に非親和性で、しかも各単量体
を溶解し且つ各単量体とは反応しない液体とからなる混
合液体の存在下で共重合させて共重合体を形成させ、そ
の後該共重合体の内部より前記の混合液体及び未反応単
量体を除去することを特徴とする方法である。

この方法をさらに今Ａ、Ｂ二種のモノマーの共重合によ
り共重合物を合成する場合について具体的に述べるなら
ば、有機液体を以下の様に分類する時、次の（１）から
（４）の組み合わせの液体を、単量体混合物と混合し、
共重合反応を行うことにより、多孔性構造を得ることが
出来る。

即ち、（１）少なくとも１種の液体Ｘ （２）少なくとも１種の液体Ｘと、少なくとも１種の液
体Ｙの混合物 （３）少なくとも１種の液体Ｘと、少なくとも１種の液
体Ｚの混合物 （４）少なくとも１種の液体Ｙと、少なくとも１種の液
体Ｚの混合物 ここで、液体Ｘ、Ｙ、Ｚとはそれぞれ次の性質を有する
ものである。

液体Ｘ：ポリマーＡ（モノマーＡの単独重合体）とポリ
マーＢのいずれか一方に親和性があり、他には親和性の
ない液体 液体Ｙ：ポリマーＡ１ポリマーＢに対し共に親和性を示
す液体 液体Ｚ：ポリマーＡ、ポリマーＢいずれに対しても親和
性を示さない液体 なおここでは、ある単量体の線状重合体で平均分子量が
１００００以上のものがある液体に１％以上溶解する場
合、該液体は該重合体に対して親和性があると定義する
。

架橋重合性単量体の場合には、単量体５部、アゾビスイ
ソブチロニＩ−ＩＪル０．１部、液体１００部からなる
混合物をガラス管に封入し、行おうとする重合反応と同
じ温度、時間スケジュールで加熱する。

生成物が透明である場合、該単量体の重合体は該液体に
親和性があると定義する。

以上の様に、（１）ない［４）の方法で多孔性架橋共重
合体を容易に合成することが可能であるが、本発明で開
示されている共重合体を得るには、特に（２）ないしく
４）の方法が適している。

即ちこれらの方法では共重合体に対し親和的である液体
と非親和的である液体の混合物の存在下、共重合反応を
行うこととなる。

その結果巾広い孔径分布の共重合体が得られるからであ
る。

又この様に溶解性の異なる二種の液体を用いる場合には
、その混合比を変えることにより、生成する共重合体の
孔径を連続的に変化させることが可能となる。

効果的な多孔性構造の設計のためには架橋性単量体の全
単量体に対する割合が増加するにつれ加える有機液体の
量を増加させることが必要である。

即ち、全単量体に対する全液体の重量％をＤ１全単量体
に対する架橋重合性単量体の重量％をＸとする時、式
１０１・２．／’５；’＜Ｄ＜ １０２・２７又￥満足
することが好ましく 式 １０ｆ −５ｖ／Ｙ＜Ｄ＜ １０２−ＩＶ／Ｙを満
足することが更に好ましい。

多孔性共重合体の気孔量は基本的には、加える液体の相
対量によって決められる。

次に、さらに具体的な場合について求められる液体名を
列挙する。

アクリロニトリル−ジビニルベンゼン−エチルスチレン
の共重合においては、液体Ｙとしてジメチルホルムアミ
ド、Ｎ−メチルアセトアミド、ニトロメタン、ジメチル
スルホキシド、ベンゾニトリル、γ−ブチロラクトン、
Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、アセトフェノン等、液
体Ｘとしては、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、
テトラリン等芳香族炭化水素、シクロヘキサノン、アニ
ソール、クロルベンゼン、ジクロルベンゼン、安息香酸
メチル、安息香酸エチル、ベンジルアルコール、二塩化
メチレン、クロロホルム、ジオキサン等が、液体Ｚとし
ては、ヘプタン、デカリン等の脂肪族炭化水素、ｎ−ブ
タノール、シクロヘキサノール、イソオクチルアルコー
ル等脂肪族アルコール、酢酸アミル、フタル酸ジブチル
、フタル酸ジオクチル等が挙げられる。

アクリロニトリル−エチレングリコールジメタクリレー
トの共重合に於いては、液体Ｙとしジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、γブチロラクトン、Ｎ、Ｎ
−ジメチルアセトアミド等が、液体Ｘとしては、トルエ
ン、メチルエチルケトン、ジオキサン、シクロヘキサノ
ン、塩化メチレン、クロルベンゼン等が、液体Ｚとして
は、ヘプタン、オクタン、ｎ−ブタノール、イソプロパ
ツール等から選ぶことが出来る。

メタシクロニトリルージビニルベンゼンーエチルビニル
ベンゼンから共重合体を合成するに際して用いるべき液
体の例は、液体Ｙとして、ピリジン、ニトロメタン、ベ
ンゾニトリル、シクロヘキサノン、メチルエチルケトン
、γ−ブチロラクトン等が、液体Ｘとしては、トルエン
、エチルベンゼン、テトラリン、酢酸ブチル、プロピオ
ン酸エチル等が、液体Ｚとしては、ヘプタン、ブタノー
ル、イソオクタツール、シクロヘキサノール、フタル酸
ジオクチル等がある。

以上は一例にすぎず、溶解性を調べる事により巾広く種
々の液体を用いることが可能である。

、本発明における共重合体を得るための重合方法は、ラ
ジカル重合、イオン重合を問わないが、般にはラジカル
開始剤を単量体液体混合物に溶解して加熱することによ
り重合を行うことが推奨される。

適当なラジカル開始剤としては、液体と単量体の混合物
に溶解し、反応温度で分解が起こるラジカル開始剤から
選ばれ、その例としては過酸化ベンゾイル、過酸化ラウ
ロイル等の過酸化アシル類、アゾビスイソブチロニトリ
ル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）等のアゾニトリル類、過酸化ジクーシャリーブチル
、過酸化ジクミル、メチルエチルケトンパーオキシド等
の過酸化物、クメンヒドロペルオキシド、ターシャリ−
ヒドロペルオキシド等のヒドロペルオキシド類がある。

反応温度は１０℃ないし２００℃、好ましくは、２０℃
ないし１５０℃、さらに好ましくは、３０℃ないし１０
０℃であるが、アクリロニトリルを含むモノマーを開放
系で重合する場合にはアクリロニトリルの沸点が低いた
め重合温度を低くする必要がある。

そのため、重合開始剤の一部又は全部に低温分解型の開
始剤を用いることが望ましい。

例えば、２．２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロ
ニトリル）、２．２’−アゾビス（４−メトキシ−２，
４−ジメチルバレロニトリル）、過吉草酸ターシャリー
ブチル、ペルオキソ炭酸ジイソブチル等が適当である。

本発明の共重合体を合成する場合の好ましい重合法の一
つは、水中での懸濁重合であり、この場合は、粒状樹脂
を容易に得ることが出来る。

アクリロニｔ−ＩＪルは水に若干の溶解性を示すが、水
に不溶性の液体や単量体を加えると水への溶解度は著し
く減少する。

しかし、水溶性の有機液体を添加して重合を行う場合に
は、懸濁重合法は採用出来ず、溶液重合により塊状物を
得て、それを適当な粒度に粉砕して用いる方法をとるべ
きである。

本発明で用いられる懸濁剤としては、澱粉、トラカント
ゴム、ゼラチン等の天然高分子物質：ヒドロキシエチル
セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセル
ロース等の加工天然高分子物質：ポリアクリル酸：ポリ
ビニルピロリドン、ホリビニルアルコール、一部分ケン
化されたポリ酢酸ビニル等の水溶性合成高分子物質：硫
酸バリウム、タルク、ヒドロキシアパタイト、ベントナ
イト、無水ケイ酸、炭酸カルシウム等の無機物が用いら
れる。

又、アクリロニトリルを用いる場合はその若干の水溶性
を抑制する意味から、塩化ナトリウム、塩化カルシウム
等の無機塩を懸濁液に添加することは広く推奨される。

以上が代表的な製造法である。

このような製造法により、任意の大きさの平均孔径及び
孔径分布をもつ含シアノ共重合体がほぼ自由に製造出来
る結果、平均孔径６０〜９０００人の大孔径通路に多数
の小孔径分岐路を有すると考えられる孔径分布の広い多
孔性重合体が得られる。

この多孔性共重合体は、含有シアノ基による親水性及び
その多孔構造によって本発明の吸着剤としてのすぐれた
効果を奏するものと考えられるが、この他に、広いｐＨ
領域にわたって安定であり、水、溶媒等に不活性であり
、機械的強度が犬で、従って寿命が長く、又乾燥後も吸
着能の変化がなく、又球状に製造でき、製造工程も簡単
である等の吸着剤として一般的に備えるべき性質も良く
具備している。

この様な含シアノ多孔性共重合体は、蛋白質水溶液から
、該蛋白質に吸着した有機化合物を吸着分離する。

吸着機構の詳細は解明されていないが、まず、有機化合
物を吸着した蛋白質が多孔性共重合体の中に拡散してゆ
き、内部孔の表面に吸着する。

この状態で吸着される場合もあれば、共重合体との相互
作用の方が蛋白質との相互作用より大きく、有機化合物
のみが吸着される場合もあるであろう。

牛血清アルブミン水溶液中に色素インドシアニングリー
ンを溶解し、色素をアルブミンに吸着状態とし、本発明
に示される多孔性共重合体によるアルブミン及び、色素
の吸着特性を観察したところでは色素の顕著な吸着分離
現象が認められ、後者の吸着形式が優位であると考えら
れた。

本発明の方法を実施するに当っては、通常の吸着分離法
のいずれも用いることができる。

即ち、有機化合物蛋白質水溶液に含シアン多孔性共重合
体を加えるバッチ法、球状台シアノ多孔性共重合体を充
填したカラムを用いるカラムクロマトグラフィーによる
方法のいずれも用いることができる。

分離取得の目的物が被吸着有機化合物である場合、蛋白
質水溶液を該共重合体で処理して有機化合物を吸着せし
めた後、水洗により夾雑蛋白質を除去し、メタノール、
エタノール、アセトニトリル等の水と相溶性を有するが
、水よりも極性の低い溶媒により溶出し、目的とする有
機化合物を分離取得する事が可能である。

この際カラムクロマトグラフィ法を採用した場合、濃度
勾配酸溶出法を併用することにより目的物の有機化合物
の純度を一層向上させることが可能である。

本発明の方法の適用例を２．３挙げる。

酵素精製過程の最終段に本発明の多孔性共重合体を充填
したカラムクロマトグラフィーもしくはバッチ法による
処理を組み込むことにより、酵素精製に際して夾雑する
拮抗阻害剤、非拮抗阻害剤を除去し、比活性を向上させ
ることができる。

アルブミン、β−リポプロティン等の水溶性蛋白質を精
製するに際して精製過程に本発明の多孔性共重合体を充
填したカラムクロマトグラフィーもしくはバッチ法によ
る処理を組み込むことにより、該蛋白質に吸着した夾雑
有機化合物を除去し純度を向上せしめることができる。

またいずれの蛋白質の場合でも、当該蛋白質に吸着した
界面活性剤の除去に本発明による多孔性共重合体は有用
である。

又目的物が被吸着有機化合物である一例として培養済液
からのペニシリンＧの分離を行う場合の使用方法を示す
。

一般に抗生物質は、弱酸性のイオン抑制状態で有機溶媒
抽出が可能な場合が多いが、弱酸性では半減期が短かく
なるというジレンマがある。

そこで、中性域で活性炭もしくは、ポリスチレン系陰イ
オン交換樹脂を用いる方法が考案された。

しかしいずれの方法も、夾雑蛋白質の存在する培養母液
中では、ペニシリンＧが夾雑蛋白質に吸着する為、著し
く吸着容量が低下するが、本発明に開示された方法を用
いることにより、容易に目的が達成される。

本発明の方法は勿論以上述べた数例に適用されるのみで
なく、既述のとおり、発酵工業の全領域にわたる培養液
、その他動物取液の精製等において対象となる蛋白質水
溶液の蛋白質と被吸着有機化合物の分離精製に適用され
る。

その際、蛋白質の変性を起さず、被吸着有機化合物を蛋
白質水溶液から迅速に効率よく吸着分離することができ
、これまで困難とされてきた各種の生化学的分離プロセ
スを簡略化する上で大いに貢献するものである。

以下に実施例を示す。

実施例 １ 多孔性共重合体の製造 還流冷却器、ステンレススチール製二枚羽根攪拌器、温
度計を備えた３１の三ロフラスコに蒸留したばかりのア
クリロニトリル５５ｇ、ジビニルベンゼン（純度５６％
、不純物として４４饅のビニルエチルベンゼンを含む、
以下５６％シヒニルベンゼント記す）４５ｇ、アセトフ
ェノン１３０ｇ１デカリン１２０ｇ、アゾビスイソブチ
ロニトリル１ｇ、２，２′−アゾビス−（２，４−ジメ
チルバレロニトリル）１ｇを加え、均一溶液にする。

さらに部分ケン化ポリビニルアルコール（粘度２３ｃｐ
ｓケン化度８８％）６．２５Ｌ塩化ナトリウム１２．５
を溶解した蒸溜水１２７０ｇを加え、２００ｒｐｍの回
転数で攪拌を行いながら、４５℃で１時間、５０℃で２
時間、６０℃で２時間、さらに７０℃で４時間加熱した
。

反応中一定時間毎に反応混合物をサンプリングしてその
ベンゼン抽出物をガスクロマトグラフにより分析して、
残存単量体を定量し重合率を測定したところ、上記の条
件で９８％以上の重合率であることが確認された。

なお、アクリロニトリルは沸点が低いため還流冷却器は
内部に冷水を流通させる等して効率を高める必要がある
。

生成した共重合体は良好な球状をしており直径６０〜５
００μの範囲にあった。

ふるいを用いて湿式分級を行った後、メタノールで未反
応単量体、液体等を除去した。

その一部をとり減圧下６０°Ｃで１８時間乾燥しポロシ
メーター用の試料とした。

残りの共重合体は十分水洗を繰りかえした。

このもののカサ比重は０．２１、平均孔径１２００人、
気孔量２．２８ｍ１／ｇ、表面積２２０ｍ”／、？と測
定された。

又、孔径が６００λ〜２４００人の間の乳量は０．８７
ｍ１．７ｇであった。

以下これをＲ１と称する。

ペニシリンＧの単離 ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ
Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ）を乳糖３φコ一ンステープ
リカー６％炭酸カルシウム１％を含む培地１１に加え、
５日間のフラスコ振盪培養を行う。

培養終了後、濾紙により菌体を分離し、培養済液のｐＨ
を５．０とし多孔性共重合体Ｒ１の３６〜７０メツシユ
分画２０ｇを充填したカラムに１０ｍ１／ｍｉｎの速度
で通液する。

通液後蒸溜水１． ＯＯＣＣで洗浄後、含水８５％アセ
トン１１により溶離した。

溶離後をフラッシュエバポレーク−でアセトンを溜出し
、残溜した水溶液中のペニシリンＧの取得率を測定した
ところ、培養液は３５００ Ｕ／ｍｌであり、その総活
性の９５％を取得した。

培養に際し菌体が産生ずる蛋白質は一般にペニシリンＧ
を吸着した形で培養液中に挾雑蛋白質として存在するが
、上記取得したペニシリンＧ中の蛋白質の存在は実質的
に認められなかった。

実施例 ２ 多孔性共重合体の製造 実施例１で用いたフラスコにヒドロキシアパタイト１０
ｇ、ヒドロキシメチルセルロース１ｏ９゜塩化カルシウ
ム２０ｇ、蒸溜水２０００ＴＬｌを加え、７０℃で攪拌
し溶液を均一にした後、液温を３０℃に下げる。

この水溶液を２００丁…で攪拌しつつ、その中にアクリ
ロニトリル５０．ｐ、エチレングリコールジメタクリレ
ート１０ｇ、スチレン４０ｇ、クロロベンゼン３００ｇ
、過吉草酸ターシャリーブチル０．２５ ｇ、過酸化ベ
ンゾイル０．７５ｇの均一溶液を一気に加えた。

３０’Ｃで３０分、４０’Ｃで１時間、５０℃で２時間
、６０℃で２時間、７０℃で２時間、更に８０’Ｃで２
時間反応を行った。

十分な抽出及び水洗を行った後得られた樹脂の性能は次
のとおりであった。

粒径９０〜５００μ、平均孔径５００人、気孔量２．０
２ｍ１／ｇ、２５０人〜１０００人の径の孔に基づく気
孔量は１．０３ＴＬｌ／ｇ、表面積２６０ ｙｒｉ：７
ｇ。

以下この樹脂をＲ２と呼ぶ。

ペニシリンＧの単離 実施例１と同様の操作を多孔性共重合体Ｒ２の３６〜７
０メツシユ分画を用いて行った。

用いた培養液は実施例１と同一であり、ペニシリンＧの
総活性の９２％を取得した。

取得したペニシリンＧ中には実施例１と同様挾雑蛋白質
は実質的に認められなかった。

実施例 ３ ５ｇのアルブミンに吸着されている２■のブロムクレゾ
ールグリーンを含むリン酸緩衝化生理食塩水１０ＱｍＡ
を、実施例１で用いたと同じ多孔性共重合体Ｒ１の３６
〜７０メツシユ分画５ｇを充填したカラムに１ｍｌ／ｍ
ｉｎの速度で通液した。

通液後、蒸留水１００ｒｆｔｌで洗浄後、含水８５優ア
セトン３００ＴＩＬｌにてブロムクレゾールグリーンを
溶離した。

得られた液中のブロムクレゾールグリーンを定量したと
ころ１．４１ｒｌＬ？相当であり、７０φのフロムクレ
ゾールグリーンを蛋白含有液中から回収することができ
た。

比較例 １ 吸着剤としてヤシガラ活性炭３６〜７０メツシユ２０ｇ
を用いて実施例１と同様の操作を行った。

用いた培養液は実施例１と同一であり、ペニシリンＧの
活性取得率は７０％であった。

比較例 ２ 実施例１で用いたフラスコにヒドロキシアパタイト１０
ｇ、ヒドロキシメチルセルロース１（Ｂｉ’。

塩化カルシウム２０ｇ、蒸溜水２０００ＴＬｌを加え、
７０℃で攪拌し溶液を均一にした後液温を３０℃に下げ
る。

この水溶液を２０Ｏｒｐｍで攪拌しつつ、その中にアク
リロニトリル６４，９，５６％ジビニルベンゼン３６ｇ
１メチルイソブチルケトン５０ｇ ｓ ２．２’−ア
ゾビスイソブチロニトリル１ｇの均一溶液を一気に加え
、３０℃で３０分、４０°Ｃで１時間、５０℃で２時間
、６０℃で２時間、７０’Ｃで２時間、更に８０℃で２
時間反応を行った。

十分な抽出及び水洗を行った後得られた樹脂の性能は次
の通りであった。

粒径９０〜５００μ、平均孔径５２５Ａ、気孔量０．７
５ｍ１ｌ、Ｑｌ、 ２６０〜１０５０Ａの径の孔に基づ
く気孔量は０．５２７７１１／ｇ（７０％）であった。

このものを篩にて２１０〜４２０μの粒径のものを分け
とり、実施例１と同一操作を行った。

用いた培養液は実施例１と同一であり、ペニシリンＧの
活性取得率は７６％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １２重量％〜９９重量饅の架橋重合性単量体と１重量％
   〜９８重量饅のアクリロニトリル、メタシクロニトリル
   、α−クロルアクリロニトリル、シンナムニトリルのう
   ちからえらばれた含シアン単量体を含む単量体混合物を
   共重合して得られる、平均孔径ｄが６０人〜９０００Ａ
   であり、かつ孔径が０．５ｄ以上２ｄ未満である孔の体
   積が全気孔量の２０〜６０％である多孔性共重合体に、
   有機化合物を吸着した蛋白質を含む水溶液を接触せしめ
   た後、水洗により蛋白質を除去し、該有機化合物を水よ
   りも極性の低い溶媒により溶出せしめることを特徴とす
   る蛋白質に吸着された有機化合物の分離方法。 ２ 含シアノ単量体がアクリロニトリルである特許請求
   の範囲第１項記載の蛋白質に吸着された有機化合物の分
   離方法。 ３ 含シアノ単量体の重量分率が５％〜８５％である特
   許請求の範囲第１項記載の蛋白質に吸着された有機化合
   物の分離方法。 ４ 架橋重合性単量体がジビニルベンゼンである特許請
   求の範囲第１項記載の蛋白質に吸着された有機化合物の
   分離方法。 ５ 架橋重合性単量体が、エチレングリコールジメタク
   リレートもしくは、ポリエチレングリコールジメタクリ
   レートである特許請求の範囲第１項記載の蛋白質に吸着
   された有機化合物の分離方法。 ６ 全単量体に対する架橋重合性単量体の重量分率をＸ
   ％とする時、乾燥重合体１ｇあたりの全気孔量力０．０
   ５７Ｋｍ１以上１．５ ｆｉｍｌ！以下である特許請求
   の範囲第１項記載の蛋白質に吸着された有機化合物の分
   離方法。