KR101013679B1 - 분자 식별 재료와 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형태의 제어가 가능하고 또한 주형 분자의 선택성 및 포착 효율이 우수한 신규의 분자 식별 재료, 및 그 간편한 제조 방법을 제공하는 것으로, 즉 본 발명에 관한 분자 식별 재료는 코어 입자 표면에 쉘층을 구비한 코어-쉘 입자이고 상기 쉘층에 주형 분자가 임프린트되어 있는 것을 특징으로 하며, 또한, 본 발명에 관한 분자 식별 재료의 제조 방법은 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 것으로 (a) 코어 입자 표면에 이니퍼터기를 도입하는 공정, (b) (a) 공정 후 주형 분자를 상기 코어 입자 표면에 흡착시키는 공정, (c) (b) 공정 후 상기 코어 입자 표면에 쉘층을 형성하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

분자 식별 재료와 그 제조 방법{MOLECULE RECOGNIZING MATERIAL AND PROCESS FOR PRODUCING THE MOLECULE RECOGNIZING MATERIAL}
본 발명은 분자 식별 재료와 그 제조 방법에 관해, 특히 그 식별성 및 포착성의 개선에 관한 것이다.
생체에는 예를 들어 폐의 막이 흡입된 공기로부터 산소만을 골라내는, 소위 분자 식별능이 있다. 이와 같이 분자를 특이적으로 식별하는 능력을 인공적으로 부여한 재료를 만들어 내는 시도는 종래 활발하게 이루어져 왔다. 분자 식별 재료는 그 특정 분자만을 탐지, 선별, 흡착 내지 방출시키는 등의 여러 가지 기능의 이용에서 의료, 미용, 식품 등을 비롯한 많은 분야에 응용이 예상되고, 그 완성이 강하게 요망되고 있다.
특히 최근, 분자 식별 능력을 갖는 기능성 고분자 재료의 창제(創製)를 향한 연구가 활발하게 이루어지고 있고, 그 개발 수법 중 하나로서 「분자 임프린트법」에 대한 주목이 높아지고 있다.
분자 임프린트법이라는 것은 분자 식별의 타겟 분자[주형(鑄型) 분자]와 모노머와의 혼재하에서 가교 고분자를 제작한 후에 주형 분자를 제거함으로써, 그 형상이나 성질이라는 정보를 고분자의 그물코에 기억시키는 매우 간편한 수법이고, 이에 의해 수득된 주형 분자를 선택적으로 흡착(포착)하는 것이 가능한 인텔리젠트겔은 고선택적·고감도의 분리나 센서, 촉매 등으로의 응용이 기대되고 있다.
예를 들어, Derek 등은 타겟 분자로서 Bovine hemoglobin(BHb)을 사용하여, 아크릴아미드(AAm)와의 혼재하에서 폴리아크릴아미드 하이드로겔을 제작하고 있다[Derek et al., Anal. Chim. Acta, 542, 61-65(2005)]. 여기에서, 아크릴레이트계의 질소 함유 폴리머인 PAAm은 수용성이고 저렴한 가격, 그리고 용이하게 생성할 수 있고 또한 매력적인 구조 파라미터를 갖도록 설계되어 있으므로, 생체 분자를 임프린트하는 기판으로서 적당하다는 것이 보고되어 있다. 다음에 상기 폴리아크릴아미드 하이드로겔에서 BHb를 제거함으로써 겔내에 BHb의 임프린트 공극을 갖는 하이드로겔계 분자 임프린트 폴리머(Hydrogel-based molecularly imprinted polymers)[하이드로(hydro MIPs)]를 제작하고, 이것이 다른 구조 유사체에 비해 BHb에 대해서 높은 선택성을 갖는 것을 나타내고 있다.
그러나, 종래의 분자 임프린트법에 의해 수득되는 벌크 겔에서는 그 임프린트 공극이 형성되는 자리를 제어하는 것이 곤란했다. 3차원 그물코 구조의 겔 내부에 형성된 임프린트 공극에서 주형 분자의 포착을 실시하는 데에는, 주형 분자가 겔에 근접할 뿐만 아니라 그 내부에 침입하는 것이 필수 사항이 된다. 단백질 등 어느 정도 분자량이 큰 고분자를 주형 분자로 사용한 경우, 단백질을 겔 내부로 침입시키는 것은 용이하지는 않다. 즉, 보다 효율적인 주형 분자의 포착을 실현하는 데에는 임프린트 공극이 재료의 최표면(最表面) 또는 그 근방에 제어된 형태로 존재하고 있는 것이 바람직하다.
그래서, Wang 등은 나노 다공성 알루미나 구멍벽(내벽)에 BHb를 고정화하고, 이어서 AAm과, N,N’-메틸렌-비스-(아크릴아미드)(MBAAm)의 혼합물로 구멍내를 채워 중합을 실시했다. 그 후, 알루미나막을 제거함으로써 최표면 근방에만 임프린트 공극을 갖는 가는 튜브 형상의 폴리머를 작성하고, 높은 선택성으로 효율 좋게 주형 분자를 포착하는 것을 실현하고 있다[Wang et al., Anal. Chem, 78, 317-320(2006)].
그러나, 상기 기술은 임프린트 공극의 위치를 제어하는 것을 가능하게 했지만 폴리머 입자의 형태나 크기는 알루미나 구멍에 의해 불균일해지지 않을 수 없었다.
이와 같이, 분자 인식 재료의 제작에 대해서는 종래 활발하게 연구가 계속되고 있지만 입자 형태의 제어와, 상기 입자 표면으로의 임프린트 공극 형성을 양립시키는 문제점이 해결되지 않았으므로, 아직 산업 이용에 이르지 못했다.
본 발명은 이와 같은 배경에서 이루어진 것으로 형태의 제어가 가능하고 또한 주형 분자의 선택성 및 포착 효율이 뛰어난 신규의 분자 식별 재료, 및 그 간편한 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들이 예의 검토를 거듭한 결과, 기재(基材)가 되는 입자 표면을 폴리머로 이루어진 쉘층으로 피복하고, 상기 쉘층에 주형 분자와 상보적인 임프린트를 실시함으로써, 입자 표면 근방에 분자 식별성이 높은 임프린트 부위를 구비한 분자 식별 재료가 수득되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명에 관한 분자 식별 재료는 코어 입자 표면에 쉘층을 구비한 코어-쉘 입자이고, 상기 쉘층에 주형 분자가 임프린트되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서는 상기 코어 입자가 단분산 폴리머 미립자인 것이 바람직하다.
또한, 상기 주형 분자가 단백질인 것이 바람직하다.
또한, 상기 분자 식별 재료의 제조 방법은 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 코어 입자 표면에 이니퍼터기를 도입하는 공정;
(b) (a) 공정 후 주형 분자를 상기 코어 입자 표면에 흡착시키는 공정; 및
(c) (b) 공정 후 상기 코어 입자 표면에 쉘층을 형성하는 공정.
상기 제조 방법은 또한
(d) (c) 공정 후 상기 입자로부터 주형 분자를 용출시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 다양한 주형 분자에 대한 선택성 및 포착 효율이 우수한 분자 식별 재료를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, 본 발명에 관한 분자 식별 재료는 그 분자 흡착·방출 기능을 이용하여, 예를 들어 특정 물질의 정제, 불필요한 물질의 선택적인 제거, 유용한 물질을 유지·방출하는 담체로서의 사용 등, 여러 분야에서 응용할 수 있다. 또한, 종래 분자 식별 재료로 기대받아 온 드러그 딜리버리 등에도 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 관한 분자 식별 재료의 구조를 모식적으로 도시한 도면;
도 2는 N,N-디에틸디티오카르바민산 나트륨 삼수화물(NaDC) 용액의 검량선을 도시한 그래프;
도 3은 투과형 전자 현미경(TEM)에 의한 St-VBC-AAm 공중합 단분산 미립자(SVA 입자) 및 N,N-디에틸디티오카르바메이트기를 도입한 SVA 입자(SVA-DC 입자)의 사진;
도 4는 SVA-DC 입자의 단백질 흡착량을 경시적으로 도시한 그래프;
도 5는 SVA-DC 입자의 단백질 흡착량을 단백질 농도마다 도시한 그래프;
도 6은 TEM에 의한 쉘층 형성후의 SVA-DC 입자의 사진;
도 7은 분자 식별 입자의 전기 영동 이동도(EPM) 및 수중 입자경을 도시한 그래프;
도 8은 TEM에 의한 SVA-DC 입자 및 SVA-DC 입자를 코어 입자로서 표면에 아크릴아미드(AAm)를 20분 중합시킨 코어-쉘 입자(SVA-A 입자)의 사진;
도 9는 SVA-A 한 입자 당의 소의 헤모글로빈(BHb)의 흡착량 및 용출량을 도시한 그래프;
도 10은 분자 식별 입자의 단백질 포착능을 도시한 그래프;
도 11은 SVA-DC 입자로의 BHb 흡착량을 도시한 그래프;
도 12는 SVA-DC 입자, SVA-A 입자, 대조군 입자에 대해서 DSL에 의한 수중 입자경 측정, 전기 영동 이동도 측정의 결과를 도시한 그래프;
도 13은 코어 입자로의 BHb 흡착량에 대한 SVA-A 입자로부터의 BHb 용출량을 도시한 그래프;
도 14는 분자 식별 입자(MIP) 및 대조군 입자로의 BHb 흡착 등온선을 도시한 그래프;
도 15는 BHb를 임프린트한 MIP의 각종 단백질의 흡착 거동을 도시한 그래프;
도 16은 흡착계 용매에 의한 MIP의 단백질 흡착량의 변화를 도시한 그래프;
도 17은 BHb를 임프린트한 MIP의 단백질 2 성분계에서의 각종 단백질의 흡착 거동을 도시한 그래프; 및
도 18은 BHb를 임프린트한 MIP의 단백질 2 성분계에서의 각종 단백질의 흡착 거동을 시간 변화로 도시한 그래프이다.
이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.
본 발명에 관한 분자 식별 재료는 기재가 되는 입자에 하기 처리를 실시함으로써 제조할 수 있다. 도 1은 각 단계의 입자의 구조를 모식적으로 도시한 것이다.
(1) 입자 표면으로의 이니퍼터기의 도입[도 1의 (A)]
(2) 입자 표면으로의 주형 분자(타겟 분자)의 흡착[도 1의 (B)]
(3) 입자 표면에서의 리빙 라디컬 중합에 의한 쉘층의 형성[도 1의 (C)]
(4) 주형 분자의 용출에 의한 임프린트 공극의 형성[도 1의 (D)]
각 단계에서는 후술하지만 본 발명의 제조 방법을 도 1을 따라서 간략하게 설명하면 기재 입자에 도입한 이니퍼터기를 개시종(開始種)으로 하는 리빙 라디컬 중합을 실시하고, 상기 입자 표면에 폴리머를 그래프트화한다. 즉, 본 발명에 관한 분자 식별 재료는 기재 입자(코어 입자)의 외층에 폴리머(쉘층)를 그래프트한 코어-쉘형 입자를 기본 구조로 하고 있다.
여기에서, 본 발명에서는 상기 쉘층의 그래프트에 앞서 코어 입자에 식별의 대상이 되는 주형 분자를 흡착시켜 둠으로써, 주형 분자가 쉘층에 임프린트된 입자를 수득할 수 있다. 또한, 필요에 따라서 상기 쉘층으로부터 주형 분자를 용출시키면, 주형 분자에 상보적인 임프린트 공극을 구비한 분자 식별 재료를 수득하는 것도 가능해진다.
이하, 본 발명의 분자 식별 재료의 구조를 상기 처리 단계를 따라 설명한다:
(1) 입자 표면으로의 이니퍼터기의 도입
우선, 기재가 되는 입자에 대해서 설명한다.
본 발명에 관한 분자 식별 재료의 기재로서는 후술하는 이니퍼터기의 도입이 가능한 것이면 제한은 없지만, 특히 입자 크기 및 형상이 거의 균일한 단분산 폴리머 미립자를 사용하는 것이 바람직하다. 단분산 폴리머 미립자는 공지의 합성 방법, 예를 들어 소프프리 유화 중합법, 현탁 중합법, 시드 유화 중합법이라는 라디컬 중합에 의한 합성 방법에 준하여, 모노머로 이루어진 혼합물을 개시제의 존재하에서 중합시킴으로써 수득할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 입자경이 제어된 고순도의 입자가 수득되는 점에서, 소프프리 유화 중합에 의한 단분산 폴리머 미립자를 사용하는 것이 바람직하다.
소프프리 유화 중합법은 이온성 잔기를 갖는 개시제를 사용하고, 이것이 입자 표면에 전하를 부여함으로써 유화제를 대신하여 입자를 안정화시킨다. 또한, 유화 중합으로 입자경 분포를 좁힐 수 있다는 이점도 있다. 본 발명과 같이 입자 표면에 관능기를 도입하여 입자 표면을 기능화하거나, 표면을 반응장으로서 사용하는 경우에는 특히 청정한 표면을 갖는 입자를 제작하는 것이 중요해진다.
소프프리 유화 중합에서는 용매를 물로 하고, 물에 용해되지 않는 모노머와, 수용성의 개시제를 사용한다. 그 입자 발생의 메커니즘은 우선 수용성의 개시제가 물에 약간 용해되어 있는 모노머와 반응하여 수상으로 활성 올리고머를 생성한다. 상기 올리고머는 어느 임계의 사슬 길이에서 물에 불용이 되어 석출되고, 입자의 핵이 되는 올리고머 미셀을 형성한다. 석출 후에도 올리고머는 성장을 계속하지만, 서로 합일·응집하여 중합체 입자로서의 특성을 만족하게 된다. 기름 방울로서 존재하고 있던 미반응 모노머는 올리고머 미셀에 분배되고, 중합의 장은 수상으로부터 입자핵으로 이동하여 반응이 진행된다. 반응의 장이 석출 입자로 이동한 단계에서는 용해 모노머와 개시 라디컬의 개시 반응은 중요하지는 않게 되고, 설령 일어났다고 해도 빠르게 기존의 입자핵에 흡수되어 입자수는 일정해진다.
미립자의 표면 구조는 주로 중합 개시제와 코모노머에 의해 제어되고, 개시제 잔기가 입자 표면에 국재(局在)할 확률은 미립자의 크기나 고분자의 분자량, 개시제 잔기의 극성에 의존한다. 친수성 모노머와 소수성 모노머의 소프프리 유화 공중합에서는 중합중에 친수성 모노머 유닛이 표면에 모이고, 미립자는 표면에 형성되는 수화(水和) 구조에 의해 안정성을 수득한다.
단분산 폴리머 미립자를 형성하는 모노머에 제한은 없지만, 미립자 표면에 이니퍼터기를 도입하는 것을 고려하여, 측쇄 및/또는 말단에 치환기를 갖는 것을 1 종 이상 선택해 두는 것이 바람직하다.
단분산 폴리머 미립자를 구성하는 모노머로서는 스티렌, α-메틸스티렌, 디메틸스티렌, 모노클로로스티렌, 디클로로스티렌, 4-비닐벤질클로라이드, 에틸렌, 1-펜텐, 3-메틸-1-부텐, 4-메틸-1-펜텐, 1-헥센, 비닐시클로헥산, 시클로부텐, 시클로펜텐, 시클로헥센, 아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N,N-디메틸아미노프로필아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, N-이소부톡시메틸아크릴아미드, N-tert-부틸아크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, N-이소부톡시메틸아크릴아미드, 2-아크릴아미드-2-메틸프로판설폰산, 메타크릴아미드, 아크로일모르폴린, 아크릴로니트릴, 아세트산 비닐, 비닐피롤리돈, N-비닐카르바졸, 비닐피리딘; 아크릴산, 아크릴산 메틸, 아크릴산 에틸, 아크릴산 n-프로필, 아크릴산 이소프로필, 아크릴산 n-부틸, 아크릴산 t-부틸, 아크릴산 n-헥실, 아크릴산 시클로펜틸, 아크릴산 시클로헥실, 아크릴산 페닐, 아크릴산 2-피리딜, 아크릴산 2-에틸헥실, 아크릴산 2-히드록시프로필, 아크릴산 2-메톡시에틸, 아크릴산 2-에톡시에틸, 아크릴산 n-라우릴, 아크릴산 n-도데실, 아크릴산 n-스테아릴, 아크릴산 벤질, 아크릴산 테트라히드로푸르푸릴, 아크릴산 글리시딜, 아크릴산 알릴, 아크릴산 에틸카르비놀, 디메틸아미노아크릴레이트, 트리메티롤프로판트리아크릴레이트, 1,4-부탄디올디아크릴레이트, 1,6-헥산디올디아크릴레이트, 네오펜틸글리콜디아크릴레이트, 펜타에리스리톨트리아크릴레이트, 아크릴산 소다 등의 아크릴산 및 아크릴산 에스테르 화합물; 메타크릴산, 메타크릴산 메틸, 메타크릴산 에틸, 메타크릴산 n-프로필, 메타크릴산 이소프로필, 메타크릴산 n-부틸, 메타크릴산 t-부틸, 메타크릴산 n-헥실, 메타크릴산 시클로펜틸, 메타크릴산 시클로헥실, 메타크릴산 페닐, 메타크릴산 2-피리딜, 메타크릴산 2-에틸헥실, 메타크릴산 2-히드록시프로필, 메타크릴산 2-메톡시에틸, 메타크릴산 2-에톡시에틸, 메타크릴산 n-라우릴, 메타크릴산 n-도데실, 메타크릴산 n-스테아릴, 메타크릴산 벤질, 메타크릴산 테트라히드로푸르푸릴, 메타크릴산 글리시딜, 메타크릴산 알릴, 메타크릴산 에틸카르비놀, 디메틸아미노메타크릴레이트, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트, 1,4-부탄디올디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올디메타크릴레이트, 네오펜틸글리콜디메타크릴레이트, 펜타에리스리톨트리메타크릴레이트, 글리세롤메타크릴레이트, 메타크릴산 소다 등의 메타크릴산 및 메타크릴산 에스테르 화합물 등의 라디컬 중합성 모노머를 들 수 있다.
특히 바람직한 모노머로서 스티렌, 4-비닐벤질클로라이드(VBC), 아크릴아미드, 아크릴산, 글리세롤메타크릴레이트를 들 수 있다. 또한, 측쇄 및/또는 말단에 치환기를 갖고 미립자 표면에 이니퍼터기를 도입시키기 위한 모노머로서는 4-비닐벤질클로라이드(VBC), 글리세롤메타크릴레이트 등이 바람직하다.
중합 개시제로서는 상기 입자 합성 방법에서 라디컬 중합을 개시할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없고 예를 들어 과산화 벤조일 등의 과산화물, 아조비스이소부티로니트릴(AIBN), 2,2′-아조비스(이소낙산)디메틸 등의 아조계 화합물 이외에, 과황산 칼륨, 과황산 암모늄 등의 과황산계 중합 개시제를 들 수 있다. 또한, 이들 중합 개시제에 의하지 않아도 광화학 반응이나 방사선 조사 등에 의해서도 중합을 실시할 수 있다.
중합 온도는 사용하는 개시제의 중합 개시 온도에 의해 설정할 수 있다. 예를 들어, 과산화물계 중합 개시제에서는 통상 70 ℃ 정도로 하면 좋다.
중합 시간은 특별히 제한되지 않고 생성되는 입자의 크기에 맞추어 통상 2~24 시간 정도의 사이에서 적절하게 조정할 수 있다.
본 발명에서는 특히 모노머로서 스티렌(St), 4-비닐벤질클로라이드(VBC), 아크릴아미드(AAm)를 적용한 단분산 폴리머 미립자가 바람직하게 사용될 수 있다. 상기 입자의 제조예를 이하에 나타내지만 본 발명은 이에 제한되지 않는다.
(제조예) St-VBC-AAm 공중합 단분산 미립자(SVA 입자)
교반봉, 아린식 냉각관, 세럼 러버, 교반 시일을 부착한 300 ㎖ 4구 둥근 바닥 플라스크에 모노머로서 스티렌(St) 2.85 g, 4-비닐벤질클로라이드(VBC) 0.10 g, 아크릴아미드(AAm) 0.05g, 용매로서 물 75 g을 넣고 70 ℃에서 300 rpm으로 교반했다. 소정 온도의 항온조 중에서 30 분간 질소 치환을 실시한 후, 개시제로서 과황산 칼륨(KPS) 0.1 g을 물 10 g에 용해시킨 것을 주사기로 계내에 첨가했다. 그 후 추가로 30 분간 질소 치환을 실시하고 중합 반응을 24 시간 실시했다. 중합 종료 후의 라텍스 분산액은 13500 rpm, 12 분간, 15 ℃의 조건에서 원심 분리를 실시하고, 상등액만을 데칸테이션에 의해 제거한 후, 하층의 입자를 물로 재분산시키는 조작을 4회 반복하여 정제하고 입자 분산액을 수득했다.
상기 제조예는 개시제를 과황산 칼륨으로 하고 70 ℃의 조건에서 소프프리 유화 중합을 실시하는 것이다. 아크릴아미드의 모노머 유닛 및 전하가 있는 개시제 말단은 친수성이므로 성장 과정에서 입자 내부에 침입하지 않고, 입자의 표면에 머무르고 있다. 이 때문에, 수득되는 미립자(SVA 입자)는 표면에 개시제 유래의 음전하를 갖고, 정전 반발력에 의해 분산 안정성을 수득하고 있다. 또한, 친수성인 아크릴아미드의 모노머 유닛이 입자 표면에 존재함으로써, 스티렌 유래의 소수적인 장(場)의 입자 표면으로의 노출을 적게 하는, 쉘층 도입시의 반응의 토대가 되는, 등의 역할을 기대할 수 있다.
또한, 상기 제조예를 포함하여 본 발명에 사용하는 기재 입자의 형태 및 크기는 분자 식별 재료의 사용 목적이나 식별하는 분자의 성질 등에 의해, 입자의 제조에서 적절히 조정하여 사용할 수 있다. 본 발명의 기재 입자로서 바람직하게는 입자경이 0.05~2 ㎛, 더욱 바람직하게는 0.1~0.5 ㎛의 거의 균일한 구형상 입자이다.
계속해서, 이와 같이 수득된 입자의 표면에 이니퍼터기(iniferter기)를 도입한다. 이니퍼터라는 것은 1982년에 Otsu 등에 의해 제안된, 개시제로의 연쇄 이동(CT) 및/또는 1차 라디컬 정지(PRT) 능을 갖는 라디컬 개시제이다. 이니퍼터는 이와 같은 리빙 라디컬 중합 개시제로서 뿐만 아니라 억제제, 중합 정지제, 연쇄 이동제로서도 기능하고, 이를 이용함으로써 후술하는 쉘층 형성에 관한 그래프트 중합을 제어하는 것이 가능해진다.
즉, 이니퍼터기의 도입은 상기 이니퍼터 기능을 갖는 관능기의 도입, 더 나아가서는 쉘층 형성의 개시종을 도입하는 것을 의미한다.
리빙 라디컬 중합의 개시종이 되는 이니퍼터기로서는 광, 열, 또는 금속 착체의 첨가에 의해 라디컬을 발생시키는 관능기가 있다.
자외선에 의해 라디컬이 되는 관능기(광 이니퍼터)의 예로서 N,N-디메틸디티오카르바메이트기, N,N-디히드록시에틸디티오카르바메이트기, N,N-디메틸페닐디티오카르바메이트기, N-메틸-N-에틸디티오카르바메이트기, N-메틸-N-히드록시에틸디티오카르바메이트기, N-메틸-N-메틸페닐디티오카르바메이트기, N-에틸-N-히드록시에틸디티오카르바메이트기, N-에틸-메틸페닐디티오카르바메이트기, N-히드록시에틸-N-메틸페닐디티오카르바메이트기 등을 들 수 있다.
열에 의해 라디컬이 되는 관능기(열 이니퍼터)의 예로서 1,1,2,2-테트라페닐에탄 유도체가 있고, 예를 들어 1-메틸-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-에틸-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-히드록시-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-메톡시-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-에톡시-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-벤질옥시-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-시아노-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-카르복시에틸-1,1,2,2-테트라페닐에틸기, 1-트리메틸실릴옥시-1,1,2,2-테트라페닐에틸기 등을 들 수 있다.
또한, 금속 착체의 첨가에 의해 라디컬을 생성하는, 원자 이동 라디컬 중합(ATRP)에 의한 개시종의 관능기로서는 할로겐화 알킬 유도체가 있고, 할로알칸류, 할로케톤류, 할로니트릴류, 할로에스테르류, 할로알킬벤젠류 등이 있다.
본 발명에서는 어떤 종류의 이니퍼터기를 도입하는 것도 가능하지만, 저온하에서 중합 반응을 진행시킬 수 있는 점에서, 특히 광 이니퍼터기의 적용이 바람직하다. 열 이니퍼터기의 경우 가열에 의해 중합이 개시되는 점에서, 단백질을 주형 분자로 했을 때에 열 변성을 일으키는 일이 있다.
입자 표면으로의 상기 이니퍼터기의 도입은 입자가 갖는 치환기와 이니퍼터기를 갖는 이니퍼터화 시약을 수계 용매 중에서 교반하에서 반응시킴으로써 실시된다. 반응 후, 용매를 제거하면 표면에 이니퍼터기를 구비한 입자를 수득할 수 있다.
이니퍼터화 시약으로서는 예를 들어 카르바메이트계 화합물, 아미녹실 화합물, 세렌 화합물, 디세레니드 화합물 및 디페닐에탄 유도체를 들 수 있다.
카르바메이트계 화합물로서는 예를 들어 N,N-디에틸디티오카르바메이트, n-부틸-N,N-디메틸디티오카르바메이트, 벤질디티오카르바메이트, 벤질-N,N-디메틸디티오카르바메이트, 벤질-N,N-디에틸디티오카르바메이트, 티우람모노설피드, N,N’-디메틸티우람모노설피드, N,N,N’,N’-테트라메틸티우람모노설피드, N,N’-디에틸티우람모노설피드, N,N,N’,N’-테트라에틸티우람모노설피드, 티우람디설피드, N,N-디메틸티우람디설피드, N,N,N’,N’-테트라메틸티우람디설피드, N,N’-디에틸티우람디설피드, N,N’-디메틸티우람테트라설피드, N,N,N’,N’-테트라에틸티우람디설피드, p-크실렌비스(디티오카르바메이트), p-크실렌비스(N,N-디메틸디티오카르바메이트), p-크실렌비스(N,N-디에틸디티오카르바메이트), 1,2-비스(N,N-디에틸디티오카르바밀)에탄, 1,2-비스(N,N-디메틸디티오카르바밀)에탄, 1,2,3-트리스(N,N-디메틸디티오카르바밀)프로판, 1,2,4,5-테트라키스(N,N-디에틸디티오카르바밀메틸)벤젠, 1-(N,N-디에틸디티오카르바밀)에틸아세테이트, 또는 그들의 염, 내지는 그 수화물 등을 들 수 있다.
또한, 상기 화합물로서 하기 구조식으로 표시되는 디메틸디티오카르바메이트기를 갖는 폴리에틸렌옥시드 유도체(PEO2K)를 사용할 수 있다.
Figure 112010013633472-pct00001
아미녹실 화합물로서는 예를 들어 ((2’,2’, 6, 6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)메틸)벤젠, 1-페닐-1-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)에탄, 1-(4’-브로모페닐)-1-(2”,2”,6”,6”-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)에탄, 1-나프틸-1-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1”-피페리디닐옥시)에탄, 1-페닐-1-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)프로판, 1-(벤질옥시)-2-페닐-2-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)에탄, 1-히드록시-2-페닐-2-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)에탄, 페닐-4-시아노-4-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)펜타노에이트, 펜타플루오로페닐-4-시아노-4-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)펜타노에이트, 3-페닐-1-(2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)프로판, 1-((2’,2’,6’,6’-테트라메틸-1’-피페리디닐옥시)메틸)-4-(트리플루오로메틸)벤젠, 또는 그들의 염 내지 그 수화물 등을 들 수 있다.
세렌 화합물로서는 예를 들어, 벤질페닐세레니드, p-메틸벤질페닐세레니드, p-에틸벤질페닐세레니드, 벤질톨릴세레니드, 크실레닐디페닐디세레니드, 크시레닐디톨릴디세레니드 등을 들 수 있다.
디세레니드 화합물로서는 예를 들어 디페닐디세레니드, 디톨릴디세레니드, 디-(p-쿠메닐)디세레니드, 디-(1-나프틸)디세레니드, 디-(2-나프틸)디세레니드, 디-(p-t-부틸페닐)디세레니드, 또는 그들의 염 내지 그 수화물 등을 들 수 있다.
디페닐에탄 유도체로서는 예를 들어 1,2-디시아노-1,2-디페닐숙신산 디에틸, 3,4-디메틸-3,4-디페닐헥산, 3,4-디에틸-3,4-디페닐헥산, 4,5-디메틸-4,5-디페닐옥탄, 2,3-디메틸-2,3-디페닐부탄, 2,2,3,3-테트라페닐부탄, 1,2-디시아노-1,1,2,2-테트라페닐에탄, 3,3,4,4-테트라페닐헥산, 또는 그들의 염 내지 그 수화물 등을 들 수 있다.
본 발명에서는 특히 N,N-디에틸디티오카르바메이트 또는 PEO2K를 사용하여 입자상에 N,N-디에틸디티오카르바메이트기를 도입하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 상기 제조예에 의한 SVA 입자에 광 이니퍼터기 N,N-디에틸디티오카르바메이트기를 도입하는 경우, SVA 입자의 표면에 존재하는 VBC 잔기의 클로로메틸기에 이니퍼터화 시약을 반응시키면 입자 표면에 광 이니퍼터기가 도입된다.
구체적으로는 SVA 입자에 이니퍼터화 시약으로서 N,N-디에틸디티오카르바민산 나트륨 삼수화물(NaDC)를 작용하게 하고, 하기의 치환 반응을 거쳐 입자 표면에 N,N-디에틸디티오카르바메이트기를 도입할 수 있다.
Figure 112010013633472-pct00002
(2) 입자 표면으로의 주형 분자의 흡착
다음에 이니퍼터기를 도입한 상기 입자로 식별의 타겟이 되는 분자, 즉 주형 분자를 흡착시킨다.
주형 분자가 되는 분자는 단백질이 바람직하지만 그 밖의 천연 또는 합성화합물, 또는 바이러스 등이어도 좋다.
주형 분자가 되는 분자의 크기는 흡착시키는 기재 입자의 크기나 형상에도 따르지만, 단체에서 1~20 ㎚ 정도가 바람직하다. 또한, 특히 분자량 500~100만의 단백질이 바람직하게 사용될 수 있다.
주형 분자가 너무 커지면 기재 입자로의 주형 분자의 흡착이나 그 후의 쉘층의 형성이 불충분한 경우가 있고, 또는 주형 분자가 너무 작아지면 쉘층에 충분한 두께를 갖게 할 수 없고, 형성한 임프린트 간극이 무너지는 경우가 있다.
이니퍼터기를 도입한 입자로의 주형 분자의 흡착은 기재 입자나 사용하는 주형 분자의 특성에 따라서 공지의 방법에 의해 실시할 수 있다. 일반적으로는 입자와 주형 분자를 적당한 용매 중에서 혼합하고, 그 분자간 힘이나 정전 상호 작용을 이용하여 주형 분자를 입자 표면으로 흡착시킴으로써 주형 흡착 입자를 수득할 수 있다.
예를 들어, 단분산 폴리머 미립자에 단백질을 흡착시킬 때 중합 개시제의 영향으로부터 폴리머 미립자의 표면 전위가 음이 되어 있다고 하면 단백질 분자의 등전점(等電点)을 기준으로 하여 상기 분자가 양으로 대전하는 pH에 용매를 조정함으로써 정전 상호 작용에 의해 단백질을 입자에 흡착시킬 수 있다.
또한, 특히 단백질의 주형 분자를 적용하는 경우 단백질이 용매로 완전하게 용해되지 않고, 용해되지 않은 분자가 침강을 일으키는 경우가 있다. 그와 같은 경우, 원심 분리 등에 의해 침강부를 제외한 상등액을 미리 취해 두고, 상기 상등액을 입자와의 혼합에 사용하는 것이 바람직하다.
입자에 흡착시키는 주형 분자의 농도나 처리 시간은 입자 및 주형 분자의 종류, 크기, 또는 처리량에 의해 적절하게 설정할 수 있다. 또한, 본 공정에서의 주형 분자의 흡착량은 분자 식별에 기능하는 임프린트부의 수를 결정하는 조건 중 하나인 점에서 흡착량의 조정에 의해 분자 식별 재료의 기능성 제어가 가능하다고 생각된다.
한편, 주형 분자의 입자로의 흡착량은 어느 정도에서 포화에 도달하고, 과잉으로 고농도의 주형 분자를 작용시켜도 흡착량은 일정 이상이 되지 않는 것으로 생각된다. 동일하게 흡착 처리 시간을 과잉으로 길게 해도 포화량 이상의 흡착은 수득되지 않는 것을 고려할 필요가 있다.
통상, 주형 분자 농도는 입자 1 개 당의 표면을 10~50 % 덮을 수 있는 정도이면 충분히 기능성이 높은 분자 식별 재료를 제조할 수 있고 흡착 처리는 실온하에서 15 분~24 시간 정도로 도달할 수 있다.
(3) 입자 표면으로의 쉘층의 피복
주형 분자를 흡착시킨 입자는 이를 코어 입자로 하고, 먼저 도입한 이니퍼터기를 개시종으로 하여 리빙 라디컬 중합을 일으켜 입자 표면에 쉘층을 구성하는 중합성 모노머를 그래프트해 간다.
코어 입자 표면에서의 쉘층의 형성은 공지의 이니퍼터법에 준하여 실시할 수 있다. 구체적으로는 코어 입자, 중합성 모노머 및 가교제를 용매 중에서 혼합하고, 개시종에 따라서 리빙 라디컬 중합을 개시하게 한다. 즉, 코어 입자로 광이니퍼터기를 도입한 것이면 자외선(UV)의 조사, 열 이니퍼터기이면 가열, 또는 금속 착체의 첨가에 의해 라디컬을 생성하는 이니퍼터기이면 금속 착체의 첨가에 의해 중합을 개시한다.
입자 표면에서의 그래프트 중합에 적용할 수 있는 중합성 모노머는 라디컬 중합에 의해 폴리머를 형성할 수 있는 것이면 문제없이 사용할 수 있다.
이와 같은 모노머로서는 예를 들어 스티렌, α-메틸스티렌, 디메틸스티렌, 모노클로로스티렌, 디클로로스티렌, 에틸렌, 프로필렌, 클로로에틸렌, 1,1-디클로로에틸렌, 1-부텐, 이소부텐, 1-펜텐, 3-메틸-1-부텐, 4-메틸-1-펜텐, 1-헥센, 비닐시클로헥산, 시클로부텐, 시클로펜텐, 시클로헥센, 아크릴아미드, N,N-디메틸아크릴아미드, N,N-디에틸아크릴아미드, N,N-디메틸아미노프로필아크릴아미드, N-이소프로필아크릴아미드, N-부톡시아크릴아미드, N-tert-부틸아크릴아미드, N-히드록시메틸아크릴아미드, N-이소부톡시메틸아크릴아미드, 2-아크릴아미드-2-메틸프로판설폰산, 메타크릴아미드, 아크로일모르포린, 아크릴로니트릴, 아세트산 비닐, 비닐피롤리돈, N-비닐카르바졸, 비닐피리딘; 아크릴산, 아크릴산 메틸, 아크릴산 에틸, 아크릴산 n-프로필, 아크릴산 이소프로필, 아크릴산 n-부틸, 아크릴산 t-부틸, 아크릴산 n-헥실, 아크릴산 시클로펜틸, 아크릴산 시클로헥실, 아크릴산 페닐, 아크릴산 2-피리딜, 아크릴산 2-에틸헥실, 아크릴산 2-히드록시프로필, 아크릴산 2-메톡시에틸, 아크릴산 2-에톡시에틸, 아크릴산 n-라우릴, 아크릴산 n-도데실, 아크릴산 n-스테아릴, 아크릴산 벤질, 아크릴산 테트라히드로푸르푸릴, 아크릴산 글리시딜, 아크릴산 알릴, 아크릴산 에틸카르비놀, 디메틸아미노아크릴레이트, 트리메틸올프로판트리아크릴레이트, 1,4-부탄디올디아크릴레이트, 1,6-헥산디올디아크릴레이트, 네오펜틸글리콜디아크릴레이트, 펜타에리스리톨트리아크릴레이트, 아크릴산 소다 등의 아크릴산 및 아크릴산 에스테르 화합물; 메타크릴산, 메타크릴산 메틸, 메타크릴산 에틸, 메타크릴산 n-프로필, 메타크릴산 이소프로필, 메타크릴산 n-부틸, 메타크릴산 t-부틸, 메타크릴산 n-헥실, 메타크릴산 시클로펜틸, 메타크릴산 시클로헥실, 메타크릴산 페닐, 메타크릴산 2-피리딜, 메타크릴산 2-에틸헥실, 메타크릴산 2-히드록시프로필, 메타크릴산 2-메톡시에틸, 메타크릴산 2-에톡시에틸, 메타크릴산 n-라우릴, 메타크릴산 n-도데실, 메타크릴산 n-스테아릴, 메타크릴산 벤질, 메타크릴산 테트라히드로푸르푸릴, 메타크릴산 글리시딜, 메타크릴산 알릴, 메타크릴산 에틸카르비놀, 디메틸아미노메타크릴레이트, 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트, 1,4-부탄디올디메타크릴레이트, 1,6-헥산디올디메타크릴레이트, 네오펜틸글리콜디메타크릴레이트, 펜타에리스리톨트리메타크릴레이트, 메타크릴산 소다 등의 메타크릴산 및 메타크릴산 에스테르 화합물 등의 라디컬 중합성 모노머를 들 수 있다. 상기 모노머는 단독 또는 2 종 이상을 조합하여 사용하는 것이 가능하다. 본 발명에서는 특히 아크릴산, 아크릴아미드를 바람직하게 사용할 수 있다.
가교제로서는 모노머의 반응성 관능기와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있는 관능기를 2 이상 갖는 다관능성 화합물을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, N,N’-메틸렌비스아크릴아미드, N,N’-메틸렌비스메타크릴아미드 등의 비스아크릴아미드류, 에틸렌글리콜디(메타)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜디(메타)아크릴레이트 등의 긴 사슬 디아크릴레이트류, 디비닐벤젠 등을 들 수 있고, 특히 N, N’-메틸렌비스아크릴아미드가 바람직하다.
중합 용매는 그래프트 중합에 의한 쉘층의 형성을 저해하는 것이 아니면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, n-헥산, n-헵탄 등의 지방족 탄화수소류, 시클로헥산, 시클로펜탄 등의 지환족 탄화수소류, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소류, 테트라히드로푸란 등의 에테르계 화합물류를 사용한다.
또한, 중합 온도는 라디컬 중합의 개시제에 의해 적절하게 결정된다. 리빙 라디컬 중합의 개시종이 광 이니퍼터기이면 자외선 조사에 의해 라디컬을 발생시키므로 특별히 제한되지 않는다. 또한, 금속 착체의 첨가에 의해 라디컬이 생성되는 이니퍼터기를 개시종으로 한 경우도 중합 온도는 특별히 제한되지 않는다. 개시종이 열 이니퍼터기인 경우에는 열로 라디컬이 발생하므로 50~150 ℃에서 중합을 실시한다.
중합의 정지는 자외선 조사에 의해 라디컬 생성을 일으키고 있는 것이면 자외선 조사의 정지에 따른다. 가열에 의해 라디컬이 생성되어 있는 것이면 가열의 정지에 따른다. 또한, 금속 착체의 첨가에 의해 라디컬을 생성하고 있는 것이면 금속 착체의 제거, 또는 산소의 봉입 등에 의한 불활성화에 의해 빠르게 중합은 정지된다. 또한, 모노머를 모두 중합에 의해 소비한 경우에도 중합은 정지된다.
생성된 코어-쉘 입자의 정제는 일반적인 폴리머의 정제 방법에 따라 빈용매(貧溶媒)에 의한 침전, 투석, 중합 용매의 유거 등에 의해 실시할 수 있다.
리빙 라디컬 중합에 의한 폴리머 생성은 라디컬 중합과 달리, 재결합이나 불균화(不均化)에 의해 정지되지 않고, 상기의 정지 처리를 실시할 때까지 균일하게 진행되므로 각 개시종의 중합량은 거의 동일해진다. 따라서, 본 발명에 의하면 쉘층을 입자 표면에 거의 균일한 두께로 형성할 수 있다.
또한, 본 발명에서는 이와 같은 리빙 라디컬 중합의 성질을 이용하여 중합 처리 시간, 또는 모노머 내지 가교제 농도를 적절하게 조정함으로써, 중합량 즉 쉘층의 두께를 제어하는 것이 가능하다. 또한, 입자로의 이니퍼터기의 도입량에 따라 리빙 그래프트 중합의 개시종의 수를 조정하는 것으로도 중합량의 제어가 가능하다.
본 발명에서는 주형의 임프린트부가 입자 표면 근방이 되도록 하기 위해 코어 입자에 흡착시킨 주형 분자의 두께에 따라서 쉘층의 두께를 제어하는 것이 바람직하다.
(4) 주형 분자의 용출에 의한 임프린트 공극의 형성
상기한 코어-쉘 입자에는 입자 표면의 쉘층에 주형 분자가 메워진 상태에서 분산되고 있다. 본 발명에서는 이들 주형 분자를 쉘층으로부터 용출시킴으로써 주형 분자의 구조가 나타나는 임프린트 공극을 표면에 구비한 입자를 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 분자 식별 재료는 임프린트부에 주형 분자를 유지한 입자, 및 주형 분자를 제외한 임프린트 공극을 구비한 입자의 양쪽을 포함하는 것을 의도하는 것이다. 따라서, 쉘층으로부터의 주형 분자의 용출은 필요에 따라서 실시할 수 있고 또한 한번 주형 분자를 용출시킨 후에 입자에 세정 등을 실시하여 다시 임프린트 공극으로 적합 분자를 유지시켜 사용해도 좋다.
쉘층 중의 주형 분자의 용출은 형성된 코어-쉘 입자를 적당한 용매에 용출시킴으로써 제거할 수 있다. 용출에 사용하는 용매는 입자를 손상시키는 것이 아니면, 용출하는 주형 분자의 종류에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어 단백질을 주형 분자로 한 경우, 도데실 황산 나트륨(SDS)을 포함하는 아세트산 용액이 용매로서 적합하게 사용될 수 있다.
이상의 공정에 의해 수득되는 본 발명에 관한 분자 식별 재료는 화장품, 의약품 및 식품 등, 분자 식별 재료의 이용이 생각되는 모든 분야에서 적용할 수 있다.
또한, 본 발명에 관한 분자 식별 재료의 입자 형태는 그 효과가 손상되지 않는 한 임의이고, 사용 목적에 따른 형태 및 입자경으로 할 수 있다 .
상기 분자 식별 재료의 사용 용도로서는 예를 들어, HPLC 컬럼 단체로서 특정 분자의 고정밀한 분리에 이용할 수 있다. 또한, 임프린트 공극 등에 효소 등의 특정 분자를 유지시킨 미립자를 화장품 등에 배합하고, 케미컬 필링제로서 이용하는 것도 가능하다. 또한, 피부상의 불필요한 물질을 선택적으로 흡수하는 분체로서 화장료에 배합하는 등, 본 발명의 분자 식별 재료를 성분으로 하여 각종 제품에 적용하는 이외에, 고가의 의약품 원료를 분리 정제하는 등 원료 생산의 단계에서의 이용도 기대할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1
우선 하기 방법에 의해 St-VBC-AAm 공중합 단분산 미립자(SVA 입자)를 수득했다.
SVA 입자의 제조 방법
교반봉, 아린식 냉각관, 세럼 러버, 교반 시일을 부착한 300 ㎖ 4구 둥근 바닥 플라스크에 모노머로서 스티렌(St) 2.85 g, 4-비닐벤질클로라이드(VBC) 0.10 g, 아크릴아미드(AAm) 0.05 g, 용매로서 물 75 g을 넣고, 70 ℃에서 300 rpm으로 교반했다. 소정 온도의 항온조 중에서 30 분간 질소 치환을 실시한 후, 개시제로서 과황산 칼륨(KPS) 0.1 g을 물 10 g에 용해시킨 것을 주사기로 계내에 첨가했다. 그 후 또한 30 분간 질소 치환을 실시하고 중합 반응을 24 시간 실시했다. 중합 종료 후의 라텍스 분산액은 13500 rpm, 12 분간, 15 ℃의 조건에서 원심 분리를 실시하고, 상등액을 데칸테이션에 의해 제거한 후 하층의 입자를 물로 재분산시키는 조작을 4 회 반복하여 정제하여 입자 분산액을 수득했다.
상기 소프프리 유화 공중합에서의 전화율(轉化率)을 중량법에 의해 구한 바 83.5 %였다.
계속해서 상기에서 수득한 SVA 입자 표면에 하기 방법에 의해 이니퍼터기를 도입했다.
이니퍼터기 도입 방법
300 ㎖ 3구 둥근 바닥 플라스크에 SVA 입자를 고형분으로 2.0 g 넣고 전량이 70 g이 되도록 증류수를 가했다. 상기 반응 용기에 교반봉, 교반 시일을 부착하고 빙냉하 200 rpm에서 교반했다. N,N-디에틸디티오카르바민산 나트륨 삼수화물(NaDC) 0.74 g을 30 g의 물에 용해시키고 계내에 조금씩 가했다. 그 후, 실온에서 하룻밤 반응시킨 후 13500 rpm, 12 분, 15 ℃의 조건에서 원심 정제를 4 회 실시하고, 이니퍼터기로서 N,N-디에틸디티오카르바메이트기를 갖는 SVA-DC 입자를 수득했다.
상기에서 수득한 이니퍼터기 도입 SVA 입자에 관해 그 형태를 이하의 방법으로 확인했다.
<이니퍼터기의 정량>
NaDC는 C=S 결합(n→π*)에 기인하는 자외 영역에서의 흡수가 352(㎚) 부근에 있고 희박한 용액에서는 Lambert-Beer의 법칙에 따라 농도에 비례하여 흡광도가 상승했다. 그래서, SVA 입자와 NaDC의 개질 반응 후, 원심 정제시에 수득되는 상등액(FT, W1~3)의 352(㎚)에서의 흡광도로부터 입자로 도입된 이니퍼터량을 측정했다.
흡광도의 측정은 초순수를 사용하여 베이스 라인을 긋고 샘플을 분광 광도계(BioSpec-1600 Series, 시마즈 세이사쿠쇼 제조)에 넣고 20 ℃에서 실시했다. 하나의 샘플로부터 수득된 상등액의 흡광도의 합(FT+W1+W2+W3)을 구하고 모액(母液)으로부터 수득한 검량선(도 2)으로부터 상등액 중에 잔존하는 NaDC량을 구했다. 또한, 포함된 이니퍼터량으로부터 잔존량을 뺌으로써 입자로의 고정화량을 산출했다.
이상의 상등 정량으로부터 구한 입자 표면의 이니퍼터량은 2.6 units/㎚2였다. 따라서, 상기 이니퍼터기 도입 처리에 의해 SVA 입자에 충분한 양의 관능기를 도입할 수 있었던 것으로 나타났다.
<입자의 형태>
투과형 전자 현미경(TEM)에서 요철이 있는 시료에 전자선을 조사하면 시료의 두께에 의해 흡수가 일어나고 농담이 있는 상이 수득된다. 또한, 대물 조리개를 초면(焦面)의 위치에 삽입하여 관찰하면 시료에 의해 산란된 전자 중, 어느 각도 이상의 각도에서 산란된 것은 차폐된다. 이와 같이 하여 생성되는 콘트라스트는 시료의 두께에 따라 다르다.
시료는 Cu의 TEM용 그리드에 콜로디온막을 접착하고 지지막상에 얹었다. 콜로디온이라는 것은 질소화도가 낮은(11~12 %)=니트로셀룰로스의 아세트산 아밀 용액이다. 콜로디온 용액은 1.5~2 % 아세트산아밀 용액이다. 콜로디온 용액을 수면상에 한방울 떨어뜨리면 물의 표면 장력에 의해 액체 방울은 수면상으로 퍼진다. 그리고, 용매가 증발하면 수면상에 100 Å 정도의 박막이 생긴다. 콜로디온막의 두께는 수온으로 컨트롤할 수 있으므로, 40 ℃ 정도의 수면을 이용하여 막을 제작했다. 이를 동 메쉬 상에 접착하여 건조시켜 지지막으로 했다.
제작한 각 라텍스 입자를 적당한 농도로 희석하고 금속 메쉬 상에 지지된 콜로디온막에 침착(沈着) 고정시켰다. 이를 TEM(JSM-5200, 닛폰 덴시 제조)에서 적당한 개율로 촬영하여 입자 형태를 관찰했다. TEM에 의해 촬영한 SVA[도 3(A)] 및 SVA-DC[도 3(B)]의 사진을 도 3에 도시한다.
또한, 상기 사진의 입자경을 노기스를 사용하여 측정하고 다음 식에 따라서 건조 상태에서의 입자의 수 평균 입자경(Dn), 및 중량 평균 입자경(Dw)을 산출했다. 또한, Dw/Dn의 값으로부터 입자경의 단분산성을 평가했다.
Figure 112010043838067-pct00026
Figure 112010043838067-pct00027
* Ni: 직경 Di인 입자수
전자선이 물질에 충돌하면 산란을 받는다. 상기 산란 전자는 대물 렌즈의 조리개에 의해 절단된 상면(像面)에 도착하지 않으므로 어두운 콘트라스트를 형성한다. 상기 산란의 정도는 중량 두께에 비례한다. 비정질 시료가 콜로디온 지지막 위에 분산되어 있는 경우의 콘트라스트는 상기 산란 콘트라스트가 지배적이 된다. 따라서, 도 3에서 검게 찍혀 있는 그림자가 스티렌을 주성분으로 하는 코어 부분이다.
도 3에서 SVA 입자의 건조 입자경은 수 평균입자경(Dn)이 334.2(㎚), 중량 평균 입자경(DW)이 334.6(㎚), 단분산성(Dw/Dn)은 1.001이 되고 단분산 코어 입자가 제작할 수 있었던 것이 확인되었다.
또한, 일반적으로 입자 현탁액을 평활한 기판상에서 건조시키면, 매체의 흐름에 의해 입자가 이동하고 증발 속도가 큰 부분에서 입자는 기판에 집적된다. 또한, 입자와 기판의 상호 작용이 약한 경우에는 매체의 표면 장력에 의해 입자간에 인력이 작용하고 입자는 국소적으로 집적된다. 그 때문에, 도 3의 각 샘플은 입자가 밀집된 상태가 된 것으로 생각된다.
도 3 및 측정값으로부터 밝혀진 바와 같이, SVA 입자는 형태 및 크기가 균일한 단분산 입자였다. 또한, 입자 표면으로 이니퍼터기를 도입한 후에도 동일하게 균일 입자를 유지하고 있는 것이 확인되었다.
<수중 입자경의 측정>
동적 광 산란법이라는 것은 미립자 분산액의 산란광의 흔들림을 측정함으로써 입자경을 구하는 방법이다. 현탁 용액이나 용액 중에 분산된 미립자는 항상 미크로 브라운 운동을 하고 있는 상태에 있고, 그 움직임은 큰 입자일수록 느리고, 작은 입자일수록 빠르다. 입자간 상호 작용이 무시할 수 있을 정도의 충분히 희박한 라텍스 중에 레이저광(He-Ne 레이저: 632.8 ㎚)을 입사하면 입자에 의해 광은 산란되지만, 산란되는 광의 파장은 입자 자체의 미크로 브라운 운동에 의해 시간과 시간의 경과에 따라 흔들린다. 상기 광의 파장의 흔들림은 각각의 입자의 입자경에 대응하고 있다. 핀홀계의 광자(光子) 검출 장치에 의해 상기 흔들림을 관찰하고, 광자 상관법을 사용하여 그 자기상관함수 등을 해석함으로써 입자경이나 그 분포에 대한 정보를 수득할 수 있다. 상기 방법에 의해 구해진 입자경은 유체 역학적 반경(d)이고, Stokes-Einstein의 식에 의해 산출된다.
Figure 112010043838067-pct00028
D: 확산 계수, k: 볼츠만 정수, T: 절대온도
실제의 측정에서는 생성된 각 입자를 소량 취하고, 증류수로 적당한 농도로 희석하여 전(全) 투명셀에 넣고 PCS(Photon Correlation Spectroscopy: PAR Ⅲ, 오즈카 덴시 제조)를 사용하여 라텍스 입자의 수중 입자경을 적당한 온도에서 측정했다. 또한, 단분산성의 지표가 되는 분산도 Dw/Dn를 산출했다.
상기 동적 광산란법에 의해 측정한 SVA 입자의 유체역학적 반경은 370(㎚)이고 분산도는 1.014였다.
이상의 측정 결과로부터 본 발명에 관한 분자 식별 재료에서 소프프리 유화 중합에 의한 단분산 입자가 형태적으로도 이니퍼터기의 도입에 대해서도 기재가 되는 입자로서 바람직하다고 생각된다.
계속해서, 상기 제조 방법에 의한 SVA-DC 입자에 주형 분자(단백질)을 흡착시키고 그 흡착 상태를 분석했다. 우선, 단백질의 흡착 방법을 설명한다.
단백질의 흡착 방법
상기 방법에서 제작한 SVA-DC 입자 2.5 ㎎(고형분)을 2 ㎖ 마이크로 튜브에 취하고, 10 mM 인산 나트륨 완충액(SPB)(pH 7.0)으로 3 회 버퍼 치환을 하여 완전하게 상등액을 제거했다. 그 후, 500 ppm의 소의 헤모글로빈(BHb) 용액을 200 μL 가하고, 서모믹서에서 혼합하면서 37 ℃에서 1 시간, 입자와 단백질을 작용시켰다.
입자와 단백질을 작용시킨 후 원심 분리에서 상등액 180 μL를 제거하여(비결합 분획 FT), 또한 동 버퍼 180 μL를 가하여 원심 분리를 실시하고 3 회 세정했다(세정 분획 W1~W3).
<단백질 흡착량의 정량>
하기 2 개의 정량법에 의해 단백질 흡착량을 정량했다.
하나는 비신코닌산(BCA)법에 의한 단백질 흡착량이다.
96구멍 마이크로 플레이트(IWAKI 제조)에 200 μL의 BCA 용액(Reagent A: Reagent B=50:1로 혼합)과 FT, W1~W3의 샘플 용액 5 μL를 넣고, 37 ℃에서 2 시간 배양했다. 측정은 마이크로 플레이트 리코더(MPR A4i, 도소 제조)에서 실시하고, 파장 570 ㎚에서의 흡광도를 측정했다. 또한, 이 때 농도를 이미 알고 있는 단백질 용액을 조제하고 검량선을 작성했다.
입자로의 단백질의 흡착량은 첨가된 단백질량으로부터 상등액(FT, W1~W3) 중의 미흡착 단백질량을 뺌으로써 구했다.
다른 쪽은 Soret 흡수대 스펙트럼 측정에 의한 정량이다.
BHb의 구성 성분인 헴은 철-포르피린 착체의 구조를 갖는다. 포르피린 고리의 흡수 스펙트럼을 측정하면 400 ㎚ 부근에 Soret 흡수대 스펙트럼이 관찰된다. 이 성질을 이용하여 원심 분리에 의해 수득한 상등액(FT, W1~W3)의 파장 405.5에서의 흡광도를 측정했다. 또한, 이 때 농도를 이미 알고 있는 단백질 용액을 조제하고 검량선을 작성했다.
입자로의 단백질의 흡착량은 BCA법과 동일하게 첨가된 단백질량으로부터 상등액(FT, W1~W3) 중의 미흡착 단백질량을 뺌으로써 구했다.
상기 두 측정으로부터 구한 단백질 흡착량을 경시적으로 나타낸 그래프를 도 4에 도시한다.
또한, BHb 용액을 500 ppm으로 한 샘플과, 1000 ppm으로 한 샘플에 대해서, SVA-DC 입자로의 BHb 흡착량의 비교를 실시했다. 한 입자당 단백질 흡착량[도 5(A)], 첨가된 단백질을 100으로 했을 때의 흡착된 전체 단백질의 비율[도 5(B)]을 도 5에 도시한다.
도 4에서 단백질은 반응 개시후 바로 입자 상에 흡착되어 있는 것이 분명하다. 흡착은 반응 시간 15 분에 평형에 도달하고 그 후 흡착량은 거의 일정했다.
따라서, 이니퍼터기를 도입한 단분산 미립자를 단백질 용액 중에 작용시킴으로써 용이하게 흡착이 가능한 것을 알 수 있었다.
또한, 도 5(A)에서 주형 분자 단백질 용액을 500 ppm으로 했을 때도 1000 ppm으로 했을 때도 흡착량은 거의 동일했지만, 단백질 농도가 500 ppm 또는 1000 ppm인 경우, 각각의 BHb 전량에 대한 흡착율은 약 50 %와 25 %였다[도 5(B)]. 코어 입자 1 개당의 표면 중 BHb에 의해 피복되어 있는 비율(표면 피복률)은 어느 농도에서도 3 할 정도였다.
이 결과로부터 단백질의 입자로의 흡착량에는 상한이 있고 본 시험예에서 SVA-DC 입자에 BHb를 흡착시킨 경우에는 표면 피복률 3 할이 상한이라고 생각된다. 또한, 단백질 농도 500 ppm과 1000 ppm에서 입자에 흡착한 단백질량이 동일했던 점에서 보다 저농도에서 상한까지의 흡착이 가능한 것이 시사되었다.
계속해서, 상기 방법에 의해 주형 분자(단백질)을 흡착시킨 SVA-DC 입자로 하기 방법으로 쉘층을 도입하고 그 입자의 상태를 분석했다.
쉘층의 도입
표면에 광 이니퍼터기를 갖는 SVA-DC 입자를 코어 입자로 하고 UV 조사에 의한 리빙 라디컬 중합에 의해 표면에 AAm 쉘층을 갖는 코어-쉘 입자의 제작을 실시했다.
상기 방법에 의해 제작한 SVA-DC(수중 입자경 360 ㎚), 모노머로서 아크릴아미드(AAm)을 2.0 g, 아크릴산(AAc) 0.04 g, 가교제로서 N,N’-메틸렌-비스-(아크릴아미드)(MBAAm) 0.36 g에 용매를 전량이 200 g이 되도록 가하고 반응 용기에 넣었다. 상기 반응 용기에 리비히 냉각관을 부착하고, 스터러 팁으로 교반하고 질소 분위기하에서 실온에서 1 시간, 400 W의 고압 UV 램프에서 UV 조사를 실시했다. UV 조사후의 반응액은 13500 rpm으로 35 분, 15 ℃의 조건에서 상등액이 투명해질 때까지 원심 분리, 데칸테이션, 재분산을 3 회 반복하여 정제를 실시했다. 이에 의해, 표면에 AAm 쉘층을 갖는 SVA-A 입자를 수득했다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같은 SVA-DC의 첨가량(x), 용매의 종류, SVA-DC 입자상으로의 단백질(BHb) 흡착의 유무의 조건으로 한 시험예 1~3에 대해서 쉘층 도입후의 동적 광산란 및 TEM에 의한 입자경, 도입 전후에서의 입자경의 증대를 각각 평가했다. 결과를 하기 표 1에 나타낸다. 또한, 하기 시험예 2의 쉘층 형성후의 TEM 화상을 도 6에 도시한다.
Figure 112010013633472-pct00006
도 6의 화상으로부터 코어-쉘형 입자가 형성되어 있는 것이 분명하다. 중앙의 검은 그림자가 코어 부분이고, 그 주위의 회색의 그림자가 쉘 부분이다. 폴리아크릴아미드(PAAm) 쉘층의 두께는 150 ㎚ 정도이고, 이니퍼터법에 의한 UV 그래프트 중합이 충분히 진행되었다고 할 수 있다.
표 1에 나타낸 바와 같이 어떤 시험예에서도 입자경의 증대가 인정되고, PAAm 쉘층의 도입이 달성된 것이 시사되었다. 또한, 입자 첨가량이 감소됨에 따라 수득되는 SVA-A 입자의 입자경이 증대되는 경향이 있었다. 이는 입자 첨가량의 차이는 즉 반응계내의 중합 개시점 농도의 차이인 점에서, 중합 개시점 농도가 낮을수록 하나의 개시점에 들어가는 모노머량이 증가되므로, 그 결과 입자경이 증대된 것으로 생각된다.
또한, 용매를 물로 해도 인산 버퍼(SPB)로 해도 중합의 진행은 충분히 인정되고 단백질을 흡착시킨 SVA-DC 입자에서도 현저한 입자경의 증가, 즉 PAAm에 의한 쉘층의 형성이 인정되었다.
이상의 점에서 주형 분자를 흡착시킨 코어 입자 표면에서 이니퍼터법에 의한 UV 그래프트 중합을 실시함으로써, 쉘층의 도입이 가능한 것이 확인되었다.
또한, 코어 입자의 첨가량의 조정에 의해 상기 쉘층의 층두께의 제어가 가능한 것이 시사되었다.
계속해서 쉘층을 도입한 SVA-A 입자로부터 주형 분자(단백질)을 용출하고 수득된 분자 식별 재료를 평가했다.
단백질의 용출
상기한 쉘층의 도입예에서 SVA-DC 0.5 g, AAm 0.5 g, MBAAm 0.09 g, AAc 0.01 g으로 하고 용매로서 SPB를 전량이 200 g이 되도록 가하여 제작한 샘플을 사용하여 쉘층으로부터의 단백질의 용출을 실시했다.
여기에서 사용한 SVC-DC 입자는 단백질(BHb) 흡착 반응을 실시한 후의 것이다. 또한, 고압 UV램프의 조사에 의한 그래프트 중합의 개시로부터 10 분, 20 분에 정량 송액 펌프를 사용하여 샘플링을 실시하고 30 분으로 중합 반응을 종료했다. 이에 의해, 소정의 중합 시간에 따른 코어-쉘(SVA-A) 입자를 수득했다. 각각의 샘플에 대해서 상기의 방법으로 원심 정제를 실시하고 하기 기능연구(characterization)을 실시했다.
상기 각 코어-쉘 입자 샘플 2.5 ㎎(고형분)은 2 mL 마이크로 튜브에 넣고 코어 입자 표면에 흡착시킨 BHb의 용출을 실시했다. 즉, 상기 마이크로 튜브에 단백질 용출액으로서 10 중량% SDS를 포함하는 10 % AcOH 용액(SDS: AcOHaq)를 180 μL 가하여 재분산시킨 후에 13500 rpm, 10 분, 5 ℃의 조건에서 원심 분리를 실시하고 상등액 180 μL를 제거하는 조작을 3 회 반복했다(용출 분획 R1~R3). 단백질 용출후의 샘플은 10 mM SPB(pH 7.0)로 충분히 세정하고, 임프린트 공극을 갖는 입자(분자 식별 입자)를 수득했다.
<코어-쉘 입자의 기능연구>
상기에서 수득한 코어-쉘 입자는 PCS(동적 광산란법에 의한 수중 입자경), TEM 및 전기 영동 이동도의 측정에 의해 실시했다. PCS 및 TEM에 의한 측정은 상술한 방법과 동일하게 했다. 이하, 전기 영동 이동도의 측정 방법을 설명한다.
콤팩트제이터 전위 측정 장치(ZEECOM, 마이크로텍크·니치온샤 제조, 셀 두께 0.76 ㎚, 정지층 0.15 ㎚, 전극간 거리 9 ㎝)를 사용하여 각 입자의 전기 영동 이동도를 측정했다. 1 mM의 KCl 수용액에 분산시킨 각 입자(SVA-DC 입자 및 중합 시간을 10 분, 20 분, 30 분으로 한 각 SVA-A 입자)를 셀내에 채우고 순환수를 사용하여 셀 내를 소정의 온도로 유지했다. 여기에서 전압을 걸어 정지면에 부유하고 있는 입자의 이동도를 측정하고, 다음 식을 사용하여 전기 영동 이동도를 산출했다. 측정은 각각 20 개의 입자에 대해서 실시하고 그 평균값을 사용했다.
Figure 112010043838067-pct00029
v: 이동 속도, d: 전극간 거리, V: 전압
전기 영동 이동도(EPM) 및 PCS의 측정 결과를 도 7에 도시한다. 또한, SVA-DC입자 및 중합 시간 20 분으로 한 SVA-A 입자의 TEM 화상을 도 8에 도시한다.
도 7에서 중합 전후의 각 샘플의 수중 입자경에 큰 변화는 보이지 않았다. 동적 광산란법에 의한 측정값은 ±25 ㎚ 정도의 표준 편차를 포함하고 있고, 상기 범위 내에서의 입자경 변화를 정확하게 측정하는 것은 곤란하다고 생각된다. 한편, 전기 영동 이동도에서는 중합의 진행에 따라서 이동도가 음으로 증대되는 경향이 인정되었다.
코어 입자는 음이온성 개시제인 KPS를 사용하여 제작하고 있으므로 그 표면은 KPS 유래의 음전하를 띠고 있다. 중합에 따라 음 방향으로 이동도가 증대되는 이유로서는 PAAm 쉘층 도입시, 모노머로서 미량의 AAc를 사용하고 있는 것에 기인하는 것으로 생각된다. AAc는 구조 중에 비닐기와 카르복실기를 갖고 있고, 상기 카르복실기가 pH 의존적으로 해리하여 음전하를 갖는다. 즉, 본 측정은 1 mM의 KCl 중에서 실시하지 않았으므로 AAc를 갖는 쉘층이 도입될수록 코어-쉘형 입자 표면의 전하는 코어 입자와 비교하여 음 방향으로 강해졌다고 생각된다.
이상에서 전기 영동 이동도에 의해 주형 분자를 흡착한 코어 입자상에 쉘층이 형성된 것이 정성적으로 확인되었다. 또한, 중합 반응 시간에 비례하여 중합 정도에 변화가 보인 점에서 반응 시간에 의한 쉘층의 층두께 제어의 가능성이 시사되었다.
또한, 도 8에서 중합 전후에서 입자의 모습이 분명히 변화되어 있는 것이 관찰되었다. SVA-DC 입자에서는 하나하나의 입자의 표면이 분명한 것에 비해 그래프트 중합을 20 분 실시한 SVA-A 입자에서는 각 입자의 윤곽이 불명료하고 표면에 어렴풋이 얇은 스킨층이 존재하는 모습은 알아볼 수 있다. 이점에서도 코어 입자의 표면으로 얇은 PAAm 쉘층이 도입되어 있는 것이 시사되었다.
<단백질 용출량의 정량>
정량은 상술한 Soret 흡수대 스펙트럼 측정과 동일하게 실시했다. 단, 원심 분리에 의해 수득한 상등액(R1~R3)의 파장 395.0 ㎚에서의 흡광도를 측정했다. 또한, 용출액에 소정의 단백질(BHb)을 용해시킨 농도를 이미 알고 있는 BHb-SDS: AcOHaq를 조제하여 검량선을 작성했다.
상기 방법에 의해 상등액(R1~R3) 중의 단백질량으로서 산출되는 값으로서, 입자로부터 용출된 단백질량을 수득했다. SVA-A 한 입자당의 BHb 흡착량 및 용출량을 도 9에 도시한다. 또한, 각 샘플에서의 흡착량은 코어(SVA-DC) 입자 표면에 원래 흡착되어 있던 BHb량을 나타내고, 용출량은 PAAm 쉘층의 그래프트 중합 반응후에 수득된 코어-쉘(SVA-A) 입자로부터 용출된 BHb량을 나타낸다.
도 9에 의하면 중합 시간 10 분의 샘플에서는 거의 완전하게 BHb가 용출되었다. 한편, 중합 시간 20 분 및 30 분의 샘플에서는 흡착량의 7 할 정도의 BHb가 용출되었다. 이점에서, 중합 시간이 길어질수록 도입되는 PAAm 쉘층의 두께는 증대되고, 코어 입자 표면에 존재하는 BHb의 용출량은 감소되는 것으로 추찰되었다.
이상에서 표면에 주형 분자를 흡착하고, 쉘층을 도입한 코어-쉘 입자로부터 충분량의 주형 분자의 용출이 가능한 것이 명백해짐과 동시에, 상기 입자 표면에서 주형 분자 용출량에 상당하는 정도의 임프린트 공극이 형성된 것이 시사되었다.
<타겟 분자의 포착>
상기한 단백질의 용출 공정에서 수득된 중합 시간이 다른 각 분자 식별 입자(MIP)에 대해서 타겟 단백질의 포착능을 검토했다.
즉, 각 입자 2.5 ㎎에 200 μL의 BHb 용액(500 ppm)을 가하고 37 ℃에서 1 시간 배양을 실시하고 입자로의 BHb의 포착을 시도했다. 입자에 포착된 단백질의 정량은 상기한 단백질 용출량의 정량과 동일한 방법에 의한다.
또한, 대조군으로서 단백질 미용출의 각 코어-쉘(SVA-A) 입자에 대해서도 중합 시간이 다른 샘플마다 동일한 시험을 실시했다. 결과를 도 10에 나타낸다.
여기에서, 도 10에서 각 MIP는 도 9의 각 샘플에 상당하고, SVA-A 입자로부터의 BHb 용출량에 상당하는 정도의 임프린트 공극을 갖는 것으로 생각된다. 한편, 대조군의 입자에서는 코어 입자 표면에 흡착시킨 BHb는 그대로 쉘층내에 존재하고 있고 임프린트 공극은 존재하지 않는다. 즉, 대조군에서의 BHb 흡착량은 쉘층 표면에 불가역적으로 흡착된 BHb량을 나타낸다. MIP의 쉘층 표면에도 이와 동일한 정도의 BHb의 흡착이 일어나 있는 것으로 생각된다. 이점에서 MIP의 재포착량은 각 중합시간에서의 MIP로의 BHb의 전체 흡착량으로부터 대조군으로의 BHb의 흡착량을 뺀 값으로 했다. 재포착량으로서 유의한 값이 얻어지는 것은 즉 MIP 표면에 임프린트 공극이 존재하고, 그 공극에 대해서 위치 선택적인 BHb의 흡착이 일어나고 있는 것을 정성적으로 뒷받침하는 것이다.
도 10에 의하면 어느 중합 시간의 MIP에서도 재포착이 인정되고 쉘층 표면에 BHb의 임프린트 공극을 갖는 미립자가 수득된 것이 시사되었다.
실시예 2
하기 MIP 제조예에서의 제조 과정, 및 제조된 분자 식별 입자(MIP)에 대해서 이하 기재하는 각 시험을 실시했다.
MIP 제조예
(1) St-VBC-AAm 공중합 단분산 미립자(SVA 입자)에 이니퍼터기로서 N,N-디에틸디티오카르바메이트기를 도입하고, SVA-DC 입자(코어 입자)를 수득했다.
(2) 500 ppm BHb 용액 40 mL에 상기 SVA-DC 0.5 g을 첨가하여 pH 7.0 및 37 ℃의 조건하에서 1 시간 배양했다. 그 후, 원심 분리에 의해 입자를 분리하고 이를 세정하여 BHb를 표면에 흡착시킨 SVA-DC 입자를 수득했다.
(3) 계속해서, 상기 SVA-DC 입자 0.5 g, 아크릴아미드(AAm) 0.25 g, N,N’-메틸렌-비스-(아크릴아미드)(MBAAm) 0.045 g, 아크릴산(AAc) 0.005 g에 10 mM SPB(인산 버퍼, pH 7.0)을 가하고 합계 200 g의 혼합액으로 했다. 이 혼합액에 UV를 조사하여 실온에서 1 시간 중합 반응시켰다. 반응 후, 원심 분리 및 세정을 반복하여 표면에 AAm의 쉘층을 갖는 SVA-A 입자(코어-쉘 입자)를 수득했다.
(4) 10 중량% SDS: 10 % AcOH 용액(pH 2.8)에 상기 SVA-A 입자를 가하고 실온하에서 원심 분리를 3 회 반복하여 입자에 흡착된 BHb를 용출시키고 고형분으로서 BHb를 임프린트한 MIP를 수득했다.
<코어 입자 표면으로의 타겟 분자의 흡착>
상기 MIP 제조예의 (2) 공정에서 SVA-DC 입자에 흡착된 BHb량을 정량했다. 500 ppm BHb 용액중의 BHb량(투입량)에 대한 실제의 BHb 흡착량(흡착량)을 도 11에 도시한다.
도 11에 도시한 바와 같이 BHb 투입량의 43 %가 SVA-DC 입자로의 흡착에 소비되고, 이들은 SVA-DC 입자 표면의 약 30 %를 피복하고 있었다.
<쉘층의 형성>
상기 MIP 제조예에서 (2) 공정에서 수득된 SVA-DC 입자, (3) 공정에서 수득된 SVA-A 입자, (2) 공정을 거치지 않고 (3) 공정을 실시한 대조군 입자(BHb 미흡착)의 각각에 대해서 DLS에 의한 수중 입자경 측정 및 전기 영동 이동도 측정을 실시했다. 결과를 도 12에 도시한다.
도 12에 도시한 바와 같이 각 샘플의 수중 입자경은 SVA-DC 입자에서 342 ㎚, SVA-A 입자에서 350 ㎚, 대조군 입자에서 352 ㎚가 되고, (3) 공정에 의해 쉘층이 형성되고 입자경이 증대되어 있는 것이 명백하다. 또한, 전기 영동 이동도 측정의 결과로부터 SVA-DC 입자 표면에 아크릴산을 포함하는 쉘층이 생긴 것을 알 수 있다.
<BHb의 제거>
상기 MIP 제조예에서 (2) 공정에서 SVA-DC 입자에 흡착된 BHb량(흡착량)과, (4) 공정에서 SVA-A 입자로부터 용출된 BHb량(용출량)을 각각 정량했다. SVA-DC 입자의 BHb량에 대해서는 (4) 공정과 동일하게 10 중량% SDS: 10 % AcOH 용액(pH 2.8)에 용출시킨 것을 정량했다. 결과를 도 13에 나타낸다.
도 13에 도시한 결과로부터 코어 입자에 흡착시킨 BHb 입자의 약 60 %가 (4) 공정에서 제거되고 임프린트 공극이 형성되어 있는 것을 알 수 있다.
<타겟 분자의 흡착>
상기 MIP 제조예에 의해 수득한 MIP와, (2) 공정을 거치지 않고 (3) 공정을 실시한 대조군 입자(임프린트 공극 미형성)에 대해서, 각 입자 2.5 ㎎을 다른 농도(0~500 ppm)의 BHb 용액[10 mM SPB(pH 7.0)] 200μL에 첨가하고, 37 ℃의 조건하에서 1 시간 반응시켰다. 이들의 결과로부터 수득된 BHb의 흡착 등온선을 도 14에 도시한다.
도 14에 도시한 바와 같이, BHb의 임프린트 공극을 갖는 MIP는 공극을 갖지 않는 대조군 입자에 비해, 동일한 농도하에서 거의 배의 BHb 흡착량을 나타냈다. 또한, 두 입자 모두 BHb 용액의 농도에 따라서 BHb 흡착량은 상승하지만, 흡착량이 포화에 도달하면 거의 일정해졌다. 즉, MIP를 사용함으로써 보다 많은 타겟 분자를 포착할 수 있다.
<타겟 분자의 식별>
상기 제조예에 의해 수득한 MIP의 각종 단백질에 대한 흡착량을 검토했다.
시험 방법
소의 헤모글로빈(BHb), 미오글로빈(Mb), 소의 혈청 알부민(BSA), α-락토알부민(α-LA), 면역 글로불린G(IgG), 라이소자임(LZM))의 각각에 대해서 상기 단백질을 500 ppm의 농도로 포함하는 10 mM SPB(pH 7.0)을 조제하고 흡착계 용매로 했다. MIP 2.5 ㎎을 상기 흡착계 용매 200 μL로 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후, 각 샘플의 MIP에 흡착된 단백질량을 정량했다. 결과를 도 15에 도시한다. 또한, 도 15 중의 임프린트 공극의 양은 상기 MIP 조제예에서 코어-쉘 입자로부터 용출된 단백질의 양을 나타내고, MIP의 임프린트 공극으로의 타겟 단백질의 흡착 허용량을 나타낸다.
도 15에 도시한 바와 같이 BHb를 임프린트한 MIP는 거의 임프린트 공극의 흡착 허용량에 이르기까지 상기 공극에 BHb를 포착했다. 그러나, IgG 및 LZM에도 MIP에 흡착이 인정되었다. 이는 MIP의 표면 전하가 음이고, IgG 및 LZM은 pH 7.0에서 양으로 하전되어 있으므로, 정전 인력에 의해 상기 단백질이 MIP 표면에 흡착된 것으로 생각되었다. 또한, IgG 및 LZM의 흡착에는 그 특성으로부터 소수성 상호 작용도 관계하고 있는 것으로 생각된다.
한편, pH 7.0에서 중성을 나타내는 Mb, 음으로 하전되는 BSA 및 α-LA와 같은 단백질에 대해서는 모두 음으로 하전되는 MIP에 거의 흡착되지 않았다. 또한, BHb도 또한 pH7.0에서 중성을 나타내는 단백질인 것을 고려하면, 임프린트부가 특정 단백질에 대해서, 매우 높은 포착력을 갖고 있는 것이 시사된다.
따라서, 본 발명에 관한 분자 식별 재료인 MIP를 갖고 임프린트된 분자를 식별하여 포착시키는 것이 가능하다.
또한, 하기의 흡착계 용매(PBS)를 사용하여 BHb 및 IgG에 대해서 상기와 동일한 방법으로 시험을 실시했다. 결과를 도 16에 도시한다.
또한, 도 16에서 임프린트 공극의 양은 상기 MIP 조제예에서 코어-쉘 입자로부터 용출된 단백질의 양을 나타내고, MIP의 임프린트 공극으로의 타겟 단백질의 흡착 허용량을 나타낸다. 또한, 「SPB」는 상기 시험에서의 결과를 나타내고 「PBS」는 하기 흡착계 용매를 사용한 본 시험의 결과를 나타낸다.
흡착계 용매의 조제
10 mM SPB로 150 mM NaCl을 가하여 pH7.0으로 조정하고, 흡착계 용매(PBS)를 수득했다.
도 16에 도시한 바와 같이, 염을 첨가한 흡착계 용매(PBS)를 사용한 샘플에서는 SPB를 흡착계 용매로 한 것에 비해, MIP로의 IgG 흡착량이 대폭 감소되어 있었다. 한편, 임프린트 분자인 BHb의 포착량은 흡착계 용매에서의 염의 유무에 관계없이 양호했다.
IgG 흡착량의 감소는 흡착계 용매로 첨가한 염의 작용에 의해, MIP와 IgG 사이의 정전 인력이 차폐된 것에 의한 것으로 생각된다.
따라서, 본 발명에 관한 분자 식별 재료의 적용에서 흡착계 용매에 염을 첨가함으로써 식별성의 정밀도를 향상시키는 것이 가능하다.
다음에, 임프린트 분자를 포함하는 단백질 2 성분계에서 MIP로의 흡착 거동을 이하의 시험 방법에 의해 검토했다.
시험 방법
소의 헤모글로빈(BHb) 및 경합시키는 단백질(경합 단백질, competitor)의 1:1(w/w) 혼합물을 500 ppm 농도로 포함하는 10 mM SPB(pH7.0)를 조제하여 흡착계 용매로 했다. MIP 2.5 ㎎을 상기 흡착계 용매 200 μL로 첨가하고 37 ℃에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후, 각 샘플의 MIP에 흡착시킨 단백질을 정량했다. 단백질의 정량은 상기한 단백질 용출량의 정량과 동일한 방법에 따른다.
소의 혈청 알부민(BSA), 미오글로빈(Mb), α-락토알부민(α-LA), 피브리노겐(FBG), 면역 글로불린G(IgG), 라이소자임(LZM)을 각각 경합 단백질(competitor)로서 사용한 결과를 도 17에 도시한다.
도 17에 도시한 바와 같이 경합하는 단백질의 종류에 관계없이 MIP는 임프린트 분자에 대해서 우수한 포착성을 나타냈다.
또한, BSA, FBG, IgG를 경합 단백질(competitor)로 하는 상기 2 성분계 흡착 시험예에서 반응 시간에 따른 단백질 흡착량의 변화를 조사했다.
BHb 및 경합 단백질(competitor)의 MIP 흡착 시험은 상기 방법에 따라 반응 시간만을 0.5, 1, 4, 6, 24 시간으로 바꾸어 각각 실시했다. 결과를 도 18에 도시한다.
도 18에 도시한 바와 같이 임프린트 분자(BHb)의 흡착은 1~4 시간의 반응으로 포화에 이르고, 반응 시간이 4 시간을 초과하면 흡착량은 거의 일정해졌다. 상기 흡착량 변화는 어떤 경합 단백질(competitor)를 사용한 샘플에서도 동일한 점에서, MIP의 임프린트 분자에 대한 반응은 경합 단백질(competitor)의 흡착 거동에 거의 영향을 받고 있지 않은 것으로 추찰되었다.

Claims (5)

  1. 표면적의 10~50 %가 주형 분자로 덮인 코어 입자 표면에 쉘층을 형성한 코어-쉘 입자로부터 상기 주형 분자 만을 용출하여 수득하고, 상기 쉘층에 상기 주형 분자에 의한 임프린트 공극을 갖는 것을 특징으로 하는 분자 식별 재료.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 코어 입자가 단분산 폴리머 미립자인 것을 특징으로 하는 분자 식별 재료.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 주형 분자가 단백질인 것을 특징으로 하는 분자 식별 재료.
  4. 하기 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 분자 식별 재료의 제조 방법:
    (a) 코어 입자 표면에 이니퍼터기를 도입하는 공정;
    (b) (a) 공정 후 주형 분자를 상기 코어 입자 표면에 흡착시키는 공정; 및
    (c) (b) 공정 후 상기 코어 입자 표면에 쉘층을 형성하는 공정.
  5. 제 4 항에 있어서,
    추가로 하기 공정 (d)를 포함하는 것을 특징으로 하는 분자 식별 재료의 제조 방법:
    (d) (c) 공정 후 상기 입자로부터 주형 분자 만을 용출시키는 공정.
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