CN101808726A - 分子识别材料和其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可控制形态、且模板分子的选择性和捕捉效率优异的新型分子识别材料、和其简便的制造方法。即，本发明的分子识别材料是在核粒子表面具有壳层的核-壳粒子，其特征在于，在上述壳层印迹了模板分子。另外，本发明的分子识别材料的制造方法的特征在于，含有下述步骤：(a)在核粒子表面导入引发-转移-终止剂基团的步骤、(b)(a)步骤后，使模板分子吸附在上述核粒子表面的步骤、(c)(b)步骤后，在上述核粒子表面形成壳层的步骤。

Description

分子识别材料和其制造方法
相关申请
本申请主张2007年8月30日申请的日本国专利申请2007-224772号的优先权，这里导入其内容。
技术领域
本发明涉及分子识别材料和其制造方法，特别地，涉及其识别性和捕捉性的改善。
背景技术
在生物体中，例如肺膜具有从吸入的空气中仅选出氧这种所谓的分子识别能力。目前，人们正积极地尝试研发人工赋予这种特异性地识别分子的能力的材料。分子识别材料具有仅对特定分子进行探知、筛选、吸附乃至释放等的各种功能，利用这些功能，可以预想将其用于以医疗、美容、食品等为首的众多领域，从而人们强烈的期盼其的完成。
特别是近年来，研制具有分子识别能力的功能性高分子材料的研究日益盛行，作为其开发方法的一种，“分子印迹法”受到人们的高度关注。
分子印迹法是通过在分子识别的靶标分子(模板分子)与单体混合存在的情况下制作交联高分子，然后去除模板分子，从而使其形状或性质这样的信息记忆在高分子的网眼中的非常简便的方法，人们期待着将由此得到的可选择性吸附(捕捉)模板分子的智能凝胶应用于高选择性-高灵敏度的分离或传感器、催化剂等中。
例如，Derek等使用牛血红蛋白(BHb)作为靶标分子，在与丙烯酰胺(AAm)混合存在的状态下制作聚丙烯酰胺水凝胶(非专利文献1)。其中报告了作为丙烯酸类的含氮聚合物的PAAm由于是水溶性的，且价格便宜、易于生成，进而设计成具有好的结构参数，因而适于用作印迹生物体分子的基板。其次，通过从上述聚丙烯酰胺水凝胶中除去BHb，制作在凝胶内具有BHb的印迹空隙的水凝胶类分子印迹聚合物(hydroMIPs)，其与其它的结构类似物相比，对于BHb具有高的选择性。
但是，对于由现有的分子印迹法得到的疏松凝胶(バルクゲル)，难以控制印迹空隙形成的位置。为了在3维网眼结构的凝胶内部形成的印迹空隙处进行模板分子的捕捉，模板分子不仅要接近于凝胶，还必须侵入其内部。当将蛋白质等的一定程度分子量大的高分子用于模板分子时，蛋白质侵入凝胶内部是不容易的。即，为了实现更有效的模板分子的捕捉，优选印迹空隙以被控制在材料的最表面或其附近的形式存在。
因此，Wang等将BHb固定在纳米多孔性氧化铝的孔壁(内壁)，接着用AAm与N，N′-亚甲基-双丙烯酰胺(MBAAm)的混合物填满孔内，进行聚合。然后，通过除去氧化铝膜，制成仅在最表面附近具有印迹空隙的细的管状的聚合物，实现了可高选择性且高效地捕捉模板分子(非专利文献2)。
但是，上述技术虽然可控制印迹空隙的位置，但聚合物粒子的形状或尺寸因氧化铝孔而变得不均一，这是不可避免的。
这样，对于分子认识材料的制作，其研究虽然目前仍在持续火热地进行，但由于如何兼顾粒子形态的控制、和该粒子表面上的印迹空隙形成这样的问题未能解决，因此至今仍未实现产业利用。
非专利文献1    Derek et al.，Anal.Chim.Acta，542，61-65(2005)
非专利文献2    Wang et al.，Anal.Chem，78，317-320(2006)
发明内容
本发明是鉴于这种背景而进行的发明，其目的在于提供可控制形态、且模板分子的选择性和捕捉效率优异的新型的分子识别材料、和其简便的制造方法。
为了实现上述目的，本发明人进行了努力研究，结果发现通过将作为基材的粒子表面用包含聚合物的壳层被覆，对该壳层实施与模板分子互补的印迹，可以得到在粒子表面附近具有分子识别性高的印迹部位的分子识别材料，从而完成了本发明。
即，本发明涉及的分子识别材料是在核粒子表面具有壳层的核-壳粒子，其特征在于，在上述壳层印迹了模板分子。
另外，在本发明中，上述核粒子优选为单分散聚合物微粒。
进而，上述模板分子优选是蛋白质。
另外，上述分子识别材料的制造方法的特征在于含有下述步骤：
(a)在核粒子表面导入引发-转移-终止剂基团的步骤、
(b)(a)步骤后，使模板分子吸附在上述核粒子表面的步骤、
(c)(b)步骤后，在上述核粒子表面形成壳层的步骤。
上述制造方法优选还含有：
(d)(c)步骤后，使模板分子从上述粒子中溶出的步骤。
根据本发明，可以容易地得到对于多种模板分子的选择性和捕捉效率优异的分子识别材料。另外，本发明的分子识别材料利用其分子吸附-释放功能，例如可以应用于特定物质的精制、选择性除去不需要的物质、作为保持-释放有用物质的载体等各种领域。另外，还可以用于现有分子识别材料所期待的药物传输(drug delivery)等中。
附图说明
[图1]是示意地表示本发明的分子识别材料的结构的图。
[图2]是N，N-二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(NaDC)溶液的标准曲线图。
[图3]是利用透射型电子显微镜(TEM)得到的St-VBC-AAm共聚单分散微粒(SVA粒子)和导入了N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯基的SVA粒子(SVA-DC粒子)的照片。
[图4]是表示SVA-DC粒子的蛋白质吸附量随时间的变化的图。
[图5]是表示各蛋白质浓度下的SVA-DC粒子的蛋白质吸附量的图。
[图6]是利用TEM得到的壳层形成后的SVA-DC粒子的照片。
[图7]是表示分子识别粒子的电泳迁移率(EPM)和水中粒径的图。
[图8]是利用TEM得到的SVA-DC粒子、和以SVA-DC粒子作为核粒子并使丙烯酰胺(AAm)在表面聚合20分钟而成的核-壳粒子(SVA-A粒子)的照片。
[图9]是表示每个SVA-A粒子的牛血红蛋白(BHb)吸附量和溶出量的图。
[图10]是表示分子识别粒子的蛋白质捕捉能力的图。
[图11]是表示SVA-DC粒子上的BHb吸附量的图。
[图12]是对于SVA-DC粒子、SVA-A粒子、对照粒子，利用DSL的水中粒径测定、电泳迁移率测定的结果的图。
[图13]是表示SVA-A粒子中的BHb溶出量相对于核粒子上的BHb吸附量的图。
[图14]是分子识别粒子(MIP)和对照粒子的BHb吸附等温线的图。
[图15]是表示印迹了BHb的MIP的各种蛋白质吸附行为的图。
[图16]是表示由吸附体系溶剂导致的MIP的蛋白质吸附量变化的图。
[图17]是表示印迹了BHb的MIP的、蛋白质2成分体系中各种蛋白质的吸附行为的图。
[图18]是印迹了BHb的MIP的、蛋白质2成分体系中各种蛋白质的吸附行为随时间的变化图。
具体实施方式
以下，对于本发明进行详细地说明。
本发明的分子识别材料可以通过对于作为基材的粒子实施下述处理来进行制造。图1是示意地表示各阶段粒子的结构的附图。
(1)引发-转移-终止剂基团向粒子表面的导入(图1(A))
(2)模板分子(靶标分子)向粒子表面的吸附(图1(B))
(3)在粒子表面通过活性自由基聚合形成壳层(图1(C))。
(4)通过模板分子的溶出形成印迹空隙(图1(D))
对于各阶段在下面进行详述，但根据图1对本发明的制造方法进行简单地介绍，即，进行以导入基材粒子的引发-转移-终止剂基团为引发种子(開始種)的活性自由基聚合，将聚合物接枝在该粒子表面。即，本发明的分子识别材料以核-壳型粒子为基本结构，所述核-壳型粒子是在基材粒子(核粒子)的外层接枝聚合物(壳层)而成。
这里，在本发明中，通过在上述壳层的接枝之前，在核粒子上吸附作为识别对象的模板分子，可以得到在壳层印迹了模板分子的粒子。另外，如果根据需要使模板分子从上述壳层中溶出，则还可以得到具有与模板分子互补的印迹空隙的分子识别材料。
以下，按上述处理阶段说明本发明的分子识别材料的结构。
(1)引发-转移-终止剂基团向粒子表面的导入
首先，对于作为基材的粒子进行说明。
作为本发明的分子识别材料的基材，只要可导入下述的引发-转移-终止剂基团即可，没有特别地限定，特别地，优选使用粒子尺寸和形状大致均一的单分散聚合物微粒。单分散聚合物微粒可以按照公知的合成方法、例如无乳化剂乳液聚合法、悬浮聚合法、种子乳液聚合法这种利用了自由基聚合的合成方法，在引发剂的存在下使含有单体的混合物聚合来获得。特别地，在本发明中，从可获得粒径得到控制的高纯度粒子的角度考虑，优选使用通过无乳化剂乳液聚合得到的单分散聚合物微粒。
对于无乳化剂乳液聚合法，其使用具有离子性残基的引发剂，该引发剂使粒子表面具有电荷，由此代替乳化剂而使粒子稳定。另外，利用乳液聚合还有可使粒径分布变窄的优点。当如本发明这样在粒子表面导入官能团，将粒子表面功能化或使用表面作为反应场所时，制作具有特别清洁的表面的粒子是重要的。
在无乳化剂乳液聚合中，以水为溶剂，并使用不溶于水的单体和水溶性的引发剂。作为该粒子发生的机制，首先是水溶性的引发剂与在水中稍有溶解的单体反应而在水相中生成活性低聚物。该低聚物为一定临界的链长时变得不溶于水而析出，形成作为粒子的核的低聚物微团(micelle)。即使析出后低聚物也持续生长，但相互合一、凝聚，满足作为聚合体粒子的特性。作为油滴存在的未反应单体分配到低聚物微团中，聚合的场所从水相向粒子核转移而进行反应。在反应的场所转移至析出粒子的阶段，溶解单体与引发自由基的引发反应变得不重要，即使发生反应，也迅速被已存在的粒子核吸收，粒子数是一定的。
微粒的表面结构主要通过聚合引发剂和共聚单体来控制，引发剂残基在粒子表面局部存在的概率依赖于微粒的尺寸或高分子的分子量、引发剂残基的极性。对于亲水性单体和疏水性单体的无乳化剂乳化聚合，聚合中亲水性单体单元在表面聚集，微粒通过形成于表面的水合结构而得到稳定性。
对形成单分散聚合物微粒的单体没有限制，但考虑到向微粒表面导入引发-转移-终止剂基团，而优选选择1种以上在侧链和/或末端具有取代基的单体。
构成单分散聚合物微粒的单体可以列举苯乙烯、α-甲基苯乙烯、二甲基苯乙烯、单氯苯乙烯、二氯苯乙烯、4-乙烯基苄基氯、乙烯、1-戊烯、3-甲基-1-丁烯、4-甲基-1-戊烯、1-己烯、乙烯基环己烷、环丁烯、环戊烯、环己烯、丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-异丁氧基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-异丁氧基甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰基吗啉、丙烯腈、乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基咔唑、乙烯基吡啶；丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸环戊酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苯酯、丙烯酸-2-吡啶酯(ァクリル酸2-ピリジル)、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸-2-羟基丙酯、丙烯酸-2-甲氧基乙酯、丙烯酸-2-乙氧基乙酯、丙烯酸正月桂酯、丙烯酸正十二烷基酯、丙烯酸正硬脂酯、丙烯酸苄酯、丙烯酸四氢糠酯、丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸烯丙酯、丙烯酸乙基甲醇酯、二甲基氨基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、1，4-丁二醇二丙烯酸酯、1，6-己二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、丙烯酸钠等的丙烯酸和丙烯酸酯化合物；甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸环戊酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸-2-吡啶酯(メタクリル酸2-ピリジル)、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-羟基丙酯、甲基丙烯酸-2-甲氧基乙酯、甲基丙烯酸-2-乙氧基乙酯、甲基丙烯酸正月桂酯、甲基丙烯酸正十二烷基酯、甲基丙烯酸正硬脂酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸乙基甲醇酯、二甲基氨基甲基丙烯酸酯、、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、1，4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1，6-己二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、丙三醇甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸钠等甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯化合物等的自由基聚合性单体。
特别优选的单体可以列举苯乙烯、4-乙烯基苄基氯(VBC)、丙烯酰胺、丙烯酸、丙三醇甲基丙烯酸酯。另外，作为在侧链和/或末端具有取代基、且用于在微粒表面导入引发-转移-终止剂基团的单体，优选4-乙烯基苄基氯(VBC)、丙三醇甲基丙烯酸酯等。
聚合引发剂只要是在上述粒子合成方法中可引发自由基聚合的物质即可，没有特别地限定，例如除了过氧化苯甲酰等的过氧化物、偶氮二异丁腈(AIBN)、2，2’-偶氮二异丁酸二甲酯等的偶氮系化合物以外，还可以列举过硫酸钾、过硫酸铵等的过硫酸系聚合引发剂。另外，除了这些聚合引发剂，利用光化学反应、或放射线照射等也可以进行聚合。
聚合温度可以根据使用的引发剂的聚合引发温度来设定。例如对于过氧化物系聚合引发剂，通常为70℃左右即可。
聚合时间没有特别地限定，结合生成的粒子的大小，通常可以适当调节在2～24小时左右。
在本发明中，特别地，可以优选使用用苯乙烯(St)、4-乙烯基苄基氯(VBC)、丙烯酰胺(AAm)作为单体的单分散聚合物微粒。上述粒子的制造例如下所示，但本发明不限定于这些例子。
(制造例)St-VBC-AAm共聚单分散微粒(SVA粒子)
在安装了搅拌棒、阿林式冷凝管、陶瓷橡胶(セラムラバ一)、搅拌塞的300ml四颈圆底烧瓶中，加入作为单体的苯乙烯(St)2.85g、4-乙烯基苄基氯(VBC)0.10g、丙烯酰胺(AAm)0.05g、和作为溶剂的水75g，在70℃以300rpm的转速搅拌。在规定温度的恒温槽中进行30分钟的氮置换后，用注射器向体系内添加将过硫酸钾(KPS)0.1g溶解于10g水中而成的溶液来作为引发剂。之后进一步进行30分钟的氮置换，进行24小时的聚合反应。聚合结束后的胶乳分散液以13500rpm、12分钟、15℃的条件进行离心分离，利用倾析法除去上清液后，反复进行4次使下层粒子在水中再分散的操作，进行精制，得到粒子分散液。
上述制造例是以过硫酸钾为引发剂、在70℃的条件下进行无乳化剂乳液聚合的例子。丙烯酰胺的单体单元和具有电荷的引发剂末端由于是亲水性的，因而在生长过程中不侵入粒子内部，而留在粒子的表面。因此，所得微粒(SVA粒子)在表面具有来源于引发剂的负电荷，通过静电排斥力而得到分散稳定性。另外，亲水性的丙烯酰胺的单体单元存在于粒子表面，由此减少了源于苯乙烯的疏水处在粒子表面上的暴露，可以期待其成为壳层导入时发生反应的场所(足場)等的功能。
另外，包括上述制造例，在本发明中使用的基材粒子的形态和尺寸可以根据分子识别材料的使用目的或识别的分子性质等，在粒子的制造中进行适当调节来使用。作为本发明的基材粒子，优选是粒径为0.05～2μm，进而优选0.1～0.5μm的大致均匀的球状粒子。
接着，在这样得到的粒子的表面导入引发-转移-终止剂基团(iniferter基)。引发-转移-终止剂是在1982年由Otsu等提出的、具有向引发剂的链转移(CT)和/或初级自由基终止(PRT)能力的自由基引发剂。引发-转移-终止剂不仅作为这种活性自由基聚合引发剂发挥作用，还可以作为抑制剂、聚合终止剂、链转移剂发挥功能，通过利用其，可以控制下述壳层形成中的接枝聚合。
即，引发-转移-终止剂基团的导入是指具有上述引发-转移-终止剂功能的官能团的导入、进而是指导入了壳层形成的引发种子。
作为形成活性自由基聚合的引发种子的引发-转移-终止剂基团，有通过光、热或金属配位化合物的添加而生成自由基的官能团。
作为利用紫外线形成自由基的官能团(光引发-转移-终止剂)的例子，可以列举例如N，N-二甲基二硫代氨基甲酸酯基、N，N-二羟乙基二硫代氨基甲酸酯基、N，N-二甲基苯基二硫代氨基甲酸酯基、N-甲基-N-乙基二硫代氨基甲酸酯基、N-甲基-N-羟基乙基二硫代氨基甲酸酯基、N-甲基-N-甲基苯基二硫代氨基甲酸酯基、N-乙基-N-羟基乙基二硫代氨基甲酸酯基、N-乙基-甲基苯基二硫代氨基甲酸酯基、N-羟基乙基-N-甲基苯基二硫代氨基甲酸酯基等。
作为利用热形成自由基的官能团(热引发-转移-终止剂)的例子，有1，1，2，2-四苯基乙烷衍生物，可以列举例如1-甲基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-乙基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-羟基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-甲氧基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-乙氧基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-苄氧基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-氰基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-羧基乙基-1，1，2，2-四苯基乙基、1-三甲基甲硅烷氧基-1，1，2，2-四苯基乙基等。
另外，作为通过添加金属配位化合物而生成自由基的、利用了原子转移自由基聚合(ATRP)的引发种子的官能团，有卤代烷基衍生物，有卤代烷烃类、卤代酮类、卤代腈类、卤代酯类、卤代烷基苯类等。
在本发明中，可以导入任一种引发-转移-终止剂基团，但从可在低温下进行聚合反应的角度考虑，特别优选使用光引发-转移-终止剂基团。对于热引发-转移-终止剂基团的情况，通过加热引发聚合，因此在以蛋白质为模板分子时，有诱发热变性的问题。
上述引发-转移-终止剂基团向粒子表面的导入可以通过使粒子具有的取代基、与具有引发-转移-终止剂基团的引发-转移-终止剂化试剂(ィニファ一タ化試薬)在水系溶剂中、在搅拌下反应来进行。反应后，将溶剂除去，则可以得到在表面具有引发-转移-终止剂基团的粒子。
引发-转移-终止剂化试剂可以列举例如氨基甲酸酯系化合物、氮氧(aminoxyl)化合物、硒化合物、联硒化合物和二苯基乙烷衍生物。
氨基甲酸酯系化合物可以列举例如N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯、N，N-二甲基二硫代氨基甲酸正丁酯、二硫代氨基甲酸苄基酯、N，N-二甲基二硫代氨基甲酸苄基酯、N，N-二乙基二硫代氨基甲酸苄基酯、一硫化秋兰姆、一硫化N，N’-二甲基秋兰姆、一硫化N，N，N’，N’-四甲基秋兰姆、一硫化N，N’-二乙基秋兰姆、一硫化N，N，N’，N’-四乙基秋兰姆、二硫化秋兰姆、二硫化N，N-二甲基秋兰姆、二硫化N，N，N’，N’-四甲基秋兰姆、二硫化N，N’-二乙基秋兰姆、四硫化N，N’-二甲基秋兰姆、二硫化N，N，N’，N’-四乙基秋兰姆、对二甲苯双(二硫代氨基甲酸酯)、对二甲苯双(N，N-二甲基二硫代氨基甲酸酯)、对二甲苯双(N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯)、1，2-双(N，N-二乙基二硫代氨基甲酰基)乙烷、1，2-双(N，N-二甲基二硫代氨基甲酰基)乙烷、1，2，3-三(N，N-二甲基二硫代氨基甲酰基)丙烷、1，2，4，5-四(N，N-二乙基二硫代氨基甲酰基甲基)苯、1-(N，N-二乙基二硫代氨基甲酰基)乙基乙酸酯、或者它们的盐、或其水合物等。
另外，作为上述化合物，可以使用以下述结构式表示的、具有二甲基二硫代氨基甲酸酯基的聚环氧乙烷衍生物(POE2K)。
[化1]
Figure GPA00001038443500091
氮氧化合物可以列举例如((2’，2’，6，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)甲基)苯、1-苯基-1-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)乙烷、1-(4’-溴代苯基)-1-(2”，2”，6”，6”-四甲基-1’-哌啶氧基)乙烷、1-萘基-1-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1”-ピペニルジニルォキシ)乙烷、1-苯基-1-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)丙烷、1-(苄氧基)-2-苯基-2-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)乙烷、1-羟基-2-苯基-2-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)乙烷、苯基-4-氰基-4-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)戊酸酯、五氟苯基-4-氰基-4-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)戊酸酯、3-苯基-1-(2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)丙烷、1-((2’，2’，6’，6’-四甲基-1’-哌啶氧基)甲基)-4-(三氟甲基)苯或者它们的盐、或其水合物等。
硒化合物可以列举例如苄基苯基硒、对甲基苄基苯基硒、对乙基苄基苯基硒、苄基甲苯基硒、(二甲基苯基)二苯基二硒(xylenyldiphenyldiselenide)、二甲基苯基(二甲苯基)二硒(xylenylditolyldiselenide)等。
联硒化合物可以列举例如二苯基二硒、二(甲苯基)二硒、二(对异丙苯基)二硒、二(1-萘基)二硒、二(2-萘基)二硒、二(对叔丁基苯基)二硒、或者它们的盐、或其水合物等。
二苯基乙烷衍生物可以列举例如1，2-二氰基-1，2-二苯基琥珀酸二乙酯、3，4-二甲基-3，4-二苯基己烷、3，4-二乙基-3，4-二苯基己烷、4，5-二甲基-4，5-二苯基辛烷、2，3-二甲基-2，3-二苯基丁烷、2，2，3，3-四苯基丁烷、1，2-二氰基-1，1，2，2-四苯基乙烷、3，3，4，4-四苯基己烷、或者它们的盐、或其水合物等。
在本发明中，特别优选使用N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯或PEO2K，在粒子上导入N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯基。
例如，当在上述制造例的SVA粒子中导入光引发-转移-终止剂基团N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯基时，使引发-转移-终止剂化试剂与存在于SVA粒子表面的VBC残基的氯甲基反应，从而可在粒子表面导入光引发-转移-终止剂基团。
具体来说，使作为引发-转移-终止剂化试剂的N，N-二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(NaDC)与SVA粒子作用，经过下述取代反应，可在粒子表面导入N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯基。
Figure GPA00001038443500111
(2)模板分子向粒子表面的吸附
接着，使成为识别靶标的分子、即模板分子吸附于导入了引发-转移-终止剂基团的上述粒子。
作为模板分子的分子优选是蛋白质，但也可以是其它的天然或合成化合物，进而还可以是病毒等。
作为模板分子的分子的尺寸依赖于吸附的基材粒子的大小或形状，但对于单体，优选为1～20nm左右。另外，特别优选使用分子量为500～100万的蛋白质。
当模板分子过于大时，模板分子向基材粒子的吸附、或之后的壳层的形成不充分，另外，当模板分子过于小时，不能在壳层上形成充分的厚度，形成的印迹间隙遭到破坏。
模板分子向导入了引发-转移-终止剂基团的粒子的吸附可以根据基材粒子或使用的模板分子的特性，利用公知的方法来进行。一般来说，可以通过将粒子和模板分子在适当的溶剂中混合，利用其分子间力或静电相互作用使模板分子吸附于粒子表面上，从而得到模板吸附粒子。
例如，在单分散聚合物微粒上吸附蛋白质时，如果由于聚合引发剂的影响而使聚合物微粒的表面电位为负，则以蛋白质分子的等电点为基准，将溶剂调节为使该分子带正电的pH，由此可通过静电相互作用而使蛋白质吸附在粒子上。
并且，特别是使用蛋白质的模板分子时，蛋白质不完全溶于溶剂，未溶解的分子沉淀。该情况下，优选预先通过离心分离而除去沉淀部分，取得上清，并将该上清用于与粒子的混合。
吸附在粒子上的模板分子的浓度或处理时间可以根据粒子和模板分子的种类、尺寸、或者处理量而适当设定。另外，本步骤中的模板分子的吸附量是决定发挥分子识别功能的印迹部分的数目的条件之一，因此认为可以通过调节吸附量而控制分子识别材料的功能性。
另一方面，模板分子向粒子的吸附量可以一定程度地达到饱和，即使使过量的高浓度的模板分子作用，吸附量也不能变为一定以上。同样，需要考虑即使过度地延长吸附处理时间，也不能得到饱和量以上的吸附。
通常，模板分子浓度如果是可将每1个粒子的表面覆盖10～50％左右的浓度，则可充分地制造功能性高的分子识别材料，吸附处理可在室温下用15分钟～24小时左右来完成。
(3)在粒子表面被覆壳层
对于吸附了模板分子的粒子，以其为核粒子，将先前导入的引发-转移-终止剂基团作为引发种子，诱发活性自由基聚合，在粒子表面接枝构成壳层的聚合性单体。
核粒子表面上壳层的形成可以按照公知的引发-转移-终止剂法进行。具体来说，将核粒子、聚合性单体和交联剂在溶剂中混合，根据引发种子而引发活性自由基聚合。即，如果向核粒子导入光引发-转移-终止剂基团，则通过紫外线(UV)的照射引发聚合，如果导入热引发-转移-终止剂基团，则通过加热引发聚合，或者如果导入通过添加金属配位化合物而生成自由基的引发-转移-终止剂基团，则通过添加金属配位化合物引发聚合。
可适用于粒子表面的接枝聚合的聚合性单体只要是能够通过自由基聚合来形成聚合物，就可以没有问题地使用。
这种单体可以列举例如苯乙烯、α-甲基苯乙烯、二甲基苯乙烯、单氯苯乙烯、二氯苯乙烯、乙烯、丙烯、氯乙烯、1，1-二氯乙烯、1-丁烯、异丁烯、1-戊烯、3-甲基-1-丁烯、4-甲基-1-戊烯、1-己烯、乙烯基环己烷、环丁烯、环戊烯、环己烯、丙烯酰胺、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、N，N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-丁氧基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-羟甲基丙烯酰胺、N-异丁氧基甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、甲基丙烯酰胺、丙烯酰基吗啉、丙烯腈、乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基咔唑、乙烯基吡啶；丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸环戊酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苯酯、丙烯酸-2-吡啶酯、丙烯酸-2-乙基己酯、丙烯酸-2-羟基丙酯、丙烯酸-2-甲氧基乙酯、丙烯酸-2-乙氧基乙酯、丙烯酸正月桂酯、丙烯酸正十二烷基酯、丙烯酸正硬脂酯、丙烯酸苄酯、丙烯酸四氢糠酯、丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸烯丙酯、丙烯酸乙基甲醇酯、二甲基氨基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、1，4-丁二醇二丙烯酸酯、1，6-己二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、丙烯酸钠等丙烯酸和丙烯酸酯化合物；甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸环戊酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸苯酯、甲基丙烯酸-2-吡啶酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-羟基丙酯、甲基丙烯酸-2-甲氧基乙酯、甲基丙烯酸-2-乙氧基乙酯、甲基丙烯酸正月桂酯、甲基丙烯酸正十二烷基酯、甲基丙烯酸正硬脂酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸烯丙酯、甲基丙烯酸乙基甲醇酯、二甲基氨基甲基丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、1，4-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1，6-己二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸钠等的甲基丙烯酸和甲基丙烯酸酯化合物等的自由基聚合性单体。上述单体可以单独使用，或者将2种以上组合使用。在本发明中，特别优选使用丙烯酸、丙烯酰胺。
交联剂可以使用具有2个以上官能团的多官能性化合物，所述官能团可与单体的反应性官能团反应而形成共价键。具体来说，可以列举例如N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双甲基丙烯酰胺等的双丙烯酰胺类、乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇二(甲基)丙烯酸酯等的长链二丙烯酸酯类、二乙烯基苯等，特别优选N，N’-亚甲基双丙烯酰胺。
聚合溶剂只要不阻碍利用接枝聚合进行的壳层的形成即可，没有特别地限定。例如，可以使用正己烷、正庚烷等的脂肪族烃类、环己烷、环戊烷等的脂环族烃类、苯、甲苯等的芳香族烃类、四氢呋喃等的醚系化合物类。
另外，聚合温度可以根据自由基聚合的引发剂而适当决定。活性自由基聚合的引发种子如果是光引发-转移-终止剂基团，则可通过紫外线照射而产生自由基，因而聚合温度没有特别地限定。另外，当以通过添加金属配位化合物而生成自由基的引发-转移-终止剂基团为引发种子时，聚合温度没有特别地限定。当引发种子为热引发-转移-终止剂基团时，由于热而产生自由基，从而在50～150℃进行聚合。
对于聚合的终止，如果是利用紫外线照射来产生自由基，则通过紫外线照射的终止而终止聚合。如果是利用加热来生成自由基，则通过加热的终止而终止聚合。另外，如果利用金属配位化合物的添加而生成自由基，则通过除去金属配位化合物、或氧的封入等导致的不活性化而迅速终止聚合。另外，当通过聚合将单体全部消耗时，也可以使聚合终止。
生成的核-壳粒子的精制可以按照一般聚合物的精制方法，通过由不良溶剂导致的沉淀、透析、聚合溶剂的蒸馏除去等来进行。
利用了活性自由基聚合的聚合物生成与自由基聚合不同，其不会由于再结合或不均化而终止，可以均匀地进行，直至进行上述终止处理，因此各引发种子的聚合量大致相同。因此，根据本发明，可以在粒子表面以大致均一的厚度形成壳层。
另外，在本发明中，通过利用这种活性自由基聚合的性质来适当调节聚合处理时间、或单体或交联剂浓度，可以控制聚合量，即壳层的厚度。另外，利用导入粒子的引发-转移-终止剂基团的量来调节活性接枝聚合的引发种子的数目，也可以进行聚合量的控制。
在本发明中，模板的印迹部分形成于粒子表面附近，因此优选根据吸附在核粒子上的模板分子的厚度来控制壳层的厚度。
(4)通过模板分子的溶出形成印迹空隙
对于上述核-壳粒子，模板分子以埋入粒子表面的壳层的状态分散。在本发明中，通过使这些模板分子从壳层中溶出，可以得到在表面具有模拟模板分子结构的印迹空隙的粒子。
并且，本发明的分子识别材料是包含在印迹部保持模板分子的粒子、和具有除去模板分子得到的印迹空隙的粒子这两者的材料。因此，模板分子从壳层中的溶出可以根据需要进行，另外，也可以在将模板分子溶出后，对粒子实施洗涤等，再次使合适分子保持在印迹空隙中来使用。
壳层中模板分子的溶出可以通过在适当的溶剂中使形成的核-壳粒子进行溶出而除去。溶出所使用的溶剂只要不损害粒子即可，可以根据溶出的模板分子的种类而适当选择。例如，当以蛋白质为模板分子时，优选使用含有十二烷基硫酸钠(SDS)的乙酸溶液作为溶剂。
由以上步骤得到的本发明的分子识别材料可以适用于能够适用于化妆品、医药品和食品等设想利用分子识别材料的所有领域。
另外，本发明的分子识别材料的粒子形态只要不损害其效果就可以是任意的，可以制成与使用目的相适应的形状和粒径。
作为上述分子识别材料的使用用途，例如可以是作为HPLC柱子的载体，用于特定分子的高精度的分离。另外，将在印迹空隙等中保持了酶等特定分子的微粒配合在化妆品等中，还可以作为化学剥离剂来利用。进而，可以期待作为选择性吸收肌肤上无用物质的粉体而配合在化妆料中等的、以本发明的分子识别材料为成分而适用于各种制品的用途，除此以外，还可以期待分离精制高价医药品原料等的在原料生产阶段的利用。
以下，通过实施例来说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
实施例
实施例1
首先，根据下述方法得到St-VBC-AAm共聚单分散微粒(SVA粒子)。
SVA粒子的制造方法
在安装了搅拌棒、阿林式冷凝管、陶瓷橡胶、搅拌塞的300ml四颈圆底烧瓶中，加入作为单体的苯乙烯(St)2.85g、4-乙烯基苄基氯(VBC)0.10g、丙烯酰胺(AAm)0.05g，作为溶剂的水75g，在70℃以300rpm的转速搅拌。在规定温度的恒温槽中进行30分钟的氮置换后，用注射器向体系内添加将过硫酸钾(KPS)0.1g溶解于10g水中而成的溶液来作为引发剂。之后进一步进行30分钟的氮置换，并进行24小时的聚合反应。将聚合结束后的胶乳分散液在13500rpm、12分钟、15℃的条件进行离心分离，利用倾析法除去上清后，反复进行4次使下层粒子在水中再分散的操作，进行精制，得到粒子分散液。
利用重量法求得上述无乳化剂乳化聚合中的转化率，结果为83.5％。
接着，在上述得到的SVA粒子表面上用下述方法导入引发-转移-终止剂基团。
引发-转移-终止剂基团导入方法
在300ml三颈圆底烧瓶中加入以固形成分计为2.0g的SVA粒子，添加蒸馏水，以使总量为70g。在该反应容器上安装搅拌棒、搅拌塞，在冰冷却下以200rpm的转速搅拌。使N，N-二乙基二硫代氨基甲酸钠三水合物(NaDC)0.74g溶解在30g的水中，一点一点地添加到体系内。然后，室温下使其反应一晚后，以13500rpm、12分钟、15℃的条件进行4次离心精制，得到具有N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯基作为引发-转移-终止剂基团的SVA-DC粒子。
对于上述得到的导入了引发-转移-终止剂基团的SVA粒子，其形态用以下的方法确认。
<引发-转移-终止剂基团的定量>
NaDC源于C＝S键(n→π*)的紫外区域的吸收在352(nm)附近，在稀溶液中根据Lambert-Beer法则，吸光度与浓度成比例地上升。因此由下述吸光度可测定向粒子导入的引发-转移-终止剂量，所述吸光度是在SVA粒子与NaDC的改性反应后，离心精制时得到的上清液(FT、W1～3)在352(nm)处的吸光度。
吸光度的测定是使用超纯水作为基线，将样品加入到分光光度计(BioSpec-1600Series、岛津制作所制)中，在20℃进行的。求得由1个样品得到的上清的吸光度的和(FT+W1+W2+W3)，根据由母液得到的标准曲线(图2)来求出上清液中残存的NaDC量。进而，通过从引发-转移-终止剂加入量中减去残存量，算出固定于粒子的量。
由以上的上清定量求得的粒子表面的引发-转移-终止剂量为2.6units/nm2。因此，通过上述引发-转移-终止剂基团导入处理，可以在SVA粒子上导入足够量的官能团。
<粒子的形态>
当在透射型电子显微镜(TEM)中对于具有凹凸的样品照射电子束时，由于样品的厚度而产生吸收，得到具有浓淡的图像。另外，当将物镜光圈插入在焦面的位置来观察时，在由于样品而发生散射的电子中，以一定角度以上的角度散射的电子被遮蔽。这样产生的对比度根据样品的厚度而有所不同。
对于样品，在Cu的TEM用栅格上贴附火棉胶膜，将其放置在支持膜上。火棉胶是指硝化度低的(11～12％)＝硝酸纤维素的乙酸戊酯溶液。火棉胶溶液是1.5～2％的乙酸戊酯溶液。当将火棉胶溶液在水面上滴加一滴时，由于水的表面张力，液滴在水面上扩散。当溶剂蒸发时，可在水面上形成左右的薄膜。火棉胶膜的厚度可以用水温控制，因此利用40℃左右的水面来制作膜。将其贴附在铜网上并干燥，形成支持膜。
将制作的各胶乳粒子稀释至适当的浓度，并沉积固定在支持于金属网上的火棉胶膜上。利用TEM(JSM-5200、日本电子制)以适当的倍数对其进行拍照，观察粒径体。由TEM拍摄的SVA(图3(A)和SVA-DC(图3(B))的照片示于图3。
另外，使用游标卡尺测定该照片的粒径，根据下式算出干燥状态的粒子的数均粒径(Dn)、和重均粒径(Dw)。另外，由Dw/Dn的值可以对粒径的单分散性进行评价。
Dn＝∑NiDi/Ni
Dw＝∑NiDi 4/NiDi 3
*Ni：直径为Di的粒子数
电子束在与物质冲撞时产生散射。该散射电子被物镜的光圈拦截，不能到达图像上，因此产生暗的对比。该散射的程度与重量厚度成比例。对于非晶质样品以火棉胶支持膜状分散时的对比度，该散射对比度是支配性的。因此，在图3中，拍摄的黑的影子是以苯乙烯为主成分的核部分。
由图3可以确认，对于SVA粒子的干燥粒径，数均粒径(Dn)为334.2(nm)，重均粒径(Dw)为334.6(nm)，单分散性(Dw/Dn)为1.001，可以制成单分散核粒子。
并且，当一般在平滑的基板上使粒子悬浮液干燥时，由于介质的流动而使粒子移动，在蒸发速度大的地方，粒子聚集在基板上。另外，当粒子与基板的相互作用弱时，由于介质的表面张力而导致在粒子间引力发生作用，粒子在局部聚集。因此，对于图3的各样品，粒子形成密集的状态。
由图3和测定值可知，SVA粒子是形态和尺寸均匀的单分散粒子。另外，可以确认即使在将引发-转移-终止剂基团导入粒子表面后，也可以同样维持均匀粒子。
<水中粒径的测定>
动态光散射法是指通过测定微粒分散液的散射光的波动而求得粒径的方法。分散在悬浮溶液或溶液中的微粒通常处于微观布朗运动的状态，粒子越大，该动作越慢，粒子越小，动作越快。当向可忽视粒子间相互作用的十分稀的胶乳中照射激光(He-Ne激光：632.8nm)时，光由于粒子而发生散射，但散射的光的波长由于粒子自身的微观布朗运动而随时间一起波动。该光的波长的波动与各自粒子的粒径相对应。通过小孔系的光子检测装置来观察该波动，使用光子相关法来解析其自身相关函数等，可以得到粒径或其分布的信息。由该方法求得的粒径是流体力学半径(d)，可通过Stokes-Einstein的式子算出。
d＝kT/(6πηD)
D：扩散系数，k：波尔兹曼常数，T：绝对温度
在实际的测定中，取少量生成的各粒子，用蒸馏水稀释至适当的浓度并放入全透明小池中，使用PCS(Photon Correlation Spectroscopy：PAR III、大电子制)，在适当的温度下测定胶乳粒子的水中粒径。另外，计算作为单分散性指标的分散度Dw/Dn。
利用上述动态光散射法测定的SVA粒子的流体力学半径为370(nm)，分散度为1.014。
根据以上的测定结果，在本发明的分子识别材料中，由无乳化剂乳液聚合形成的单分散粒子，在形态上对于引发-转移-终止剂基团的导入，是优选的作为基材的粒子。
接着，在由上述制造方法得到的SVA-DC粒子上吸附模板分子(蛋白质)，并分析其吸附状态。首先，对蛋白质的吸附方法进行说明。
蛋白质的吸附方法
将用上述方法制作的SVA-DC粒子2.5mg(固形成分)取入到2mL微管中，用10mM磷酸钠缓冲液(SPB)(pH7.0)进行3次缓冲液置换，完全去除上清。然后，添加200μL 500ppm的牛血红蛋白(BHb)溶液，一边用恒温混匀器(thermomixer)振荡混合，一边在37℃使粒子和蛋白质作用1小时。
在使粒子和蛋白质作用后，利用离心分离除去上清180μL(非结合组分FT)，进而加入相同的缓冲液180μL并进行离心分离，洗涤3次(洗涤组分W1～W3)。
<蛋白质吸附量的定量>
根据下述2种定量法对蛋白质吸附量进行定量。
一种是利用二喹林甲酸(BCA)法来测定蛋白质吸附量。
在96孔微板(IWAKI制)中打入200μL的BCA溶液(以ReagentA∶ReagentB＝50∶1的比例混合)、和FT、W1～W3的样品溶液5μL，在37℃进行2小时的孵育。测定用酶标仪(MPR A4i、东ソ一制)进行，测定波长570nm下的吸光度。另外，此时调制浓度已知的蛋白质溶液，制成标准曲线。
蛋白质向粒子的吸附量通过从加入的蛋白质量中减去上清(FT、W1～W3)中的未吸附蛋白质量而求得。
另一种是利用Soret吸收带光谱测定进行定量。
作为BHb的构成成分的血红素具有铁-卟啉配位化合物的结构。当测定卟啉环的吸收光谱时，在400nm附近观察到Soret吸收带光谱。利用该性质，测定由离心分离得到的上清(FT、W1～W3)在波长为405.5时的吸光度。另外，此时调制浓度已知的蛋白质溶液，制成标准曲线。
蛋白质对于粒子的吸附量与BCA法同样，可以通过从加入的蛋白质量中减去上清(FT、W1～W3)中的未吸附蛋白质量而求得。
表示由上述两种测定方法求得的蛋白质吸附量随时间变化的图示于图4。
另外，对于将BHb溶液制成500ppm的样品和制成1000ppm的样品，进行SVA-DC粒子上的BHb吸附量的比较。每一粒子的蛋白质吸附量(图5(A))、以加入蛋白质为100时的吸附的全部蛋白质的比例(图5(B))示于图5。
由图4可知，蛋白质在反应开始后立即吸附在粒子上。吸附在反应时间为15分钟时达到平衡，之后吸附量大致一定。
因此，可知通过使导入了引发-转移-终止剂基团的单分散微粒在蛋白质溶液中进行作用，可以容易地吸附。
另外，根据图5(A)，在模板分子蛋白质溶液为500ppm或1000ppm时，吸附量大致相同，但当蛋白质浓度为500ppm或1000ppm时，相对于BHb总量的吸附率分别约为50％和25％(图5(B))。每1个核粒子的表面上被BHb被覆的比例(表面被覆率)在任一浓度下都为3成左右。
由该结果可知，蛋白质吸附于粒子的量具有上限，对于在本试验例中使BHb吸附在SVA-DC粒子上的情况，表面被覆率为3成时，达到上限。另外，对于500ppm和1000ppm的蛋白质浓度，吸附在粒子上的蛋白质量相同，因此暗示了能够以更低的浓度进行达到上限的吸附。
接着，用下述方法将壳层导入利用上述方法吸附了模板分子(蛋白质)的SVA-DC粒子，并分析该粒子的状态。
壳层的导入
以在表面具有光引发-转移-终止剂基团的SVA-DC粒子为核粒子，通过利用UV照射的活性自由基聚合来进行在表面具有AAm壳层的核壳粒子的制作。
在由上述方法制作的SVA-DC(水中粒径为360nm)、作为单体的丙烯酰胺(AAm)2.0g、丙烯酸(AAc)0.04g、作为交联剂的N，N’-亚甲基-双丙烯酰胺(MBAAm)0.36g中添加溶剂，使总量为200g，并放入反应容器中。在上述反应容器上安装李比希冷凝管，利用搅拌片进行搅拌，在氮氛围下于室温利用400W的高压UV灯进行1小时的UV照射。UV照射后的反应液用13500rpm的转速、以35分钟、15℃的条件进行离心分离，直至上清透明，反复进行3次倾析、再分散，进行精制。由此，得到在表面具有AAm壳层的SVA-A粒子。
对于以下表1所示的SVA-DC添加量(x)、溶剂种类、有无蛋白质(BHb)在SVA-DC粒子上的吸附为条件的试验例1～3，分别对壳层导入后的利用动态光散射和TEM得到的粒径、导入前后的粒径的增大进行评价。结果示于下表1。另外，下述试验例2的壳层形成后的TEM图像示于图6。
[表1]
*SPB：10mM SPB(pH 7.0)
由图6的图像可知形成了核壳型粒子。中央的黑影为核部分，其周围灰色的影子为壳部分。聚丙烯酰胺(PAAm)壳层的厚度为150nm左右，可以说利用了引发-转移-终止剂法的UV接枝聚合得到充分地进行。
如表1所示，对于任一试验例，粒径都增大，暗示实现了PAAm壳层的导入。另外，随着粒子添加量减少，所得SVA-A粒子的粒径有增大的倾向。这是因为，粒子添加量的不同即是反应体系内的聚合引发点浓度的不同，聚合引发点浓度越低，一个引发点所摄取的单体量越增加，因而结果是粒径增大。
另外，不论溶剂为水或磷酸缓冲液(SPB)，都能够充分地进行聚合，即使对于吸附了蛋白质的SVA-DC粒子，也有显著的粒径增加、即利用了PAAm形成壳层。
由以上可以确认，在吸附了模板分子的核粒子表面，通过进行利用了引发-转移-终止剂法的UV接枝聚合，可以导入壳层。
另外，暗示了通过调节核粒子的添加量，可以控制上述壳层的层厚。
接着，从导入了壳层的SVA-A粒子中，将模板分子(蛋白质)溶出，对所得分子识别材料进行评价。
蛋白质的溶出
在上述壳层的导入例中，使SVA-DC为0.5g、AAm为0.5g、MBAAm为0.09g、AAc为0.01g，并添加SPB作为溶剂，使总量为200g，使用这样制作的样品，进行蛋白质从壳层中的溶出。
这里使用的SVC-DC粒子是进行了蛋白质(BHb)吸附反应后的粒子。另外，在从开始利用高压UV灯的照射进行接枝聚合起10分钟、20分钟时，使用定量输液泵进行采样，在30分钟时终止聚合反应。由此，得到与规定的聚合时间相应的核壳(SVA-A)粒子。对于各个样品用上述方法进行离心精制，进行下述的表征鉴定。
将上述各核壳粒子样品2.5mg(固形成分)放入2mL微管中，进行吸附在核粒子表面上的BHb的溶出。即，在上述微管中加入含有10wt％SDS的10％AcOH溶液(SDS：AcOHaq)180μL作为蛋白质溶出液并使其再分散后，在13500rpm、10分钟、5℃的条件下进行离心分离，除去上清180μL，将该操作反复进行3次(溶出组分R1～R3)。蛋白质溶出后的样品用10mM  SPB(pH7.0)充分洗涤，得到具有印迹空隙的粒子(分子识别粒子)。
<核壳粒子的表征鉴定>
对于上述得到的核壳粒子，通过PCS(利用动态光散射法测定的水中粒径)、TEM、和电泳迁移率的测定来进行。利用PCS和TEM进行的测定与上述方法同样。以下，对于电泳迁移率的测定方法进行说明。
使用小型ζ-电位测定装置(ZEECOM、マィクロテック·ニチォン社制：池子厚度为0.76nm，静止层为0.15nm，电极间距离为9cm)测定各粒子的电泳迁移率。将分散于1mM的KCl水溶液中的各粒子(SVA-DC粒子和聚合时间为10分钟、20分钟、30分钟的各SVA-A粒子)在池内装满，使用循环水使池内保持在规定的温度。向其施加电压，测定浮游在静止面上的粒子的迁移率，使用下式算出电泳迁移率。测定分别对于20个粒子进行，使用其平均值。
μ＝v×d/V
v：迁移速度、d：电极间距离、V：电压
电泳迁移率(EPM)和PCS的测定结果示于图7。另外，SVA-DC粒子和聚合时间为20分钟的SVA-A粒子的TEM图像示于图8。
在图7中，聚合前后的各样品的水中粒径没有出现大的变化。利用动态光散射法的测定值含有±25nm左右的标准偏差，难以正确地测定该范围内的粒径变化。另一方面，对于电泳迁移率，认为伴随着聚合的进行，迁移率有向负的方向增大的倾向。
核粒子由于使用作为阴离子性引发剂的KPS来制作，因此其表面带有来源于KPS的负电荷。作为伴随着聚合，迁移率向负方向增大的原因，认为是由于在导入PAAm壳层时，使用了微量的AAc作为单体的缘故。AAc在结构中具有乙烯基和羧基，该羧基依赖于pH发生解离而带有负电荷。即，本测定在1mM的KCl中进行，因此随着导入具有AAc的壳层，核壳型粒子表面的电荷与核粒子相比向负方向增强。
由以上可知，利用电泳迁移率可以定性地确认，在吸附了模板分子的核粒子上形成壳层。另外，可以观察到聚合程度与聚合反应时间成比例地变化，因此暗示了利用反应时间控制壳层的层厚的可能性。
进而，由图8可以观察到，在聚合前后粒子的样子明显发生变化。对于SVA-DC粒子，一个个粒子的表面很清晰，相对于此，对于进行了20分钟接枝聚合的SVA-A粒子，各粒子的轮廓不明了，在表面存在混沌或薄的皮层。由此，暗示了在核粒子的表面导入了薄的PAAm壳层。
<蛋白质溶出量的定量>
定量与上述Soret吸收带光谱的测定同样进行。其中，测定由离心分离得到的上清(R1～R3)在395.0nm波长处的吸光度。另外，调制在溶出液中溶解了规定的蛋白质(BHb)的已知浓度的BHb-SDS∶AcOHaq，制成标准曲线。
根据上述方法，由作为上清(R1～R3)中的蛋白质量算出的值，可以得到从粒子中溶出的蛋白质量。每个SVA-A粒子的BHb吸附量和溶出量示于图9。并且，各样品的吸附量表示原本吸附在核(SVA-DC)粒子表面的BHb量，溶出量表示从在PAAm壳层的接枝聚合反应后所得的核壳(SVA-A)粒子中溶出的BHb量。
根据图9，对于聚合时间为10分钟的样品，BHb几乎完全溶出。另一方面，对于聚合时间为20分钟和30分钟的样品，吸附量7成左右的BHb溶出。由此可以推断，聚合时间越长，则导入的PAAm壳层的厚度越大，存在于核粒子表面的BHb的溶出量减少。
由以上可以明确，可以从表面吸附了模板分子、且导入了壳层的核壳粒子中溶出充分量的模板分子，同时暗示了在该粒子表面，形成了相当于模板分子溶出量的程度的印迹空隙。
<靶标分子的捕捉>
对于由上述蛋白质的溶出步骤得到的、聚合时间不同的各分子识别粒子(MIP)，研究靶标蛋白质的捕捉能力。
即，向各粒子2.5mg加入200μL的BHb溶液(500ppm)，在37℃孵育1小时，尝试进行粒子上的BHb的捕捉。粒子捕捉的蛋白质的定量利用与上述蛋白质溶出量的定量为同样的方法进行。
另外，作为对照，对于蛋白质未溶出的各核壳(SVA-A)粒子，对聚合时间不同的每种样品进行同样的试验。结果示于图10。
这里，在图10中，各MIP相当于图9的各样品，并具有与SVA-A粒子中的BHb溶出量相当程度的印迹空隙。另一方面，对于对照的粒子，吸附在核粒子表面的BHb仍然存在于壳层内，不存在印迹空隙。即，对照中的BHb吸附量表示不可逆地吸附在壳层表面的BHb量。认为在MIP的壳层表面也产生了与其相同程度的BHb吸附。因此，MIP的再捕捉量是从各聚合时间的MIP上BHb的总吸附量中减去对照上BHb的吸附量而得到的数值。再捕捉量可以得到有意义的值，即，这定性地证实了在MIP表面存在印迹空隙，对于该空隙，产生了位置选择性的BHb的吸附。
根据图10，任何聚合时间的MIP都有再捕捉，暗示得到了在壳层表面具有BHb的印迹空隙的微粒。
实施例2
对于下述MIP制造例中的制造过程、和制造的分子识别粒子(MIP)，进行以下所述的各试验。
MIP制造例
(1)在St-VBC-AAm共聚单分散微粒(SVA粒子)上导入作为引发-转移-终止剂基团的N，N-二乙基二硫代氨基甲酸酯基，得到SVA-DC粒子(核粒子)。
(2)在500ppm BHb溶液40mL中添加上述SVA-DC 0.5g，在pH7.0和37℃的条件下进行1小时的孵育。然后，利用离心分离将粒子分离，对其进行洗涤，得到在表面吸附了BHb的SVA-DC粒子。
(3)接着，在上述SVA-DC粒子0.5g、丙烯酰胺(AAm)0.25g、N，N’-亚甲基-双丙烯酰胺(MBAAm)0.045g、丙烯酸(AAc)0.005g中加入10mM SPB(磷酸缓冲液，pH7.0)，形成合计200g的混合液。向该混合液照射UV，在室温使其进行1小时的聚合反应。反应后，反复进行离心分离和洗涤，得到在表面具有AAm的壳层的SVA-A粒子(核-壳粒子)。
(3)在10wt％SDS∶10％AcOH溶液(pH2.8)中添加上述SVA-A粒子，在室温下重复3次离心分离，使吸附在粒子上的BHb溶出，作为固形成分得到印迹了BHb的MIP。
<靶标分子向核粒子表面的吸附>
对在上述MIP制造例的(2)步骤中吸附于SVA-DC粒子的BHb量进行定量。相对于500ppm BHb溶液中的BHb量(加入量)的实际BHb吸附量(吸附量)示于图11。
如图11所示的那样，BHb加入量的43％消耗在对于SVA-DC粒子的吸附上，它们被覆了SVA-DC粒子表面的约30％。
<壳层的形成>
分别对于在上述MIP制造例中，由(2)步骤得到的SVA-DC粒子、由(3)步骤得到的SVA-A粒子、不经过(2)步骤而进行了(3)步骤的对照粒子(未吸附BHb)，进行利用了DLS的水中粒径测定和电泳迁移率测定。结果示于图12。
如图12所示的那样，对于各样品的水中粒径，SVA-DC粒子为342nm，SVA-A粒子为350nm，对照粒子为352nm，可知利用(3)步骤形成了壳层，粒径得到增大。另外，由电泳迁移率测定的结果可知，在SVA-DC粒子表面形成含有丙烯酸的壳层。
<BHb的除去>
分别对于在上述MIP制造例中，(2)步骤中吸附在SVA-DC粒子上的BHb量(吸附量)和(3)步骤中由SVA-A粒子溶出的BHb量(溶出量)进行定量。对于SVA-DC粒子的BHb量，与(3)步骤同样对在10wt％SDS∶10％AcOH溶液(pH2.8)中溶出的BHb进行定量。结果示于图13。
由图13所示的结果可知，吸附在核粒子上的BHb粒子的约60％在(3)步骤中被除去，可以形成印迹空隙。
<靶标分子的吸附>
对于由上述MIP制造例得到的MIP、和不经过(2)步骤而进行了(3)步骤的对照粒子(未形成印迹空隙)，将各粒子2.5mg添加到不同浓度(0～500ppm)的BHb溶液(10mM  SPB(pH7.0))200μL中，在37℃的条件下使其反应1小时。由这些结果得到的BHb的吸附等温线示于图14。
如图14所示，具有BHb的印迹空隙的MIP与没有空隙的对照粒子相比，在相同浓度下表现出大致一倍的BHb吸附量。另外，两粒子的BHb吸附量都是随着BHb溶液浓度的增加而升高，但当吸附量达到饱和时，便形成大致一定的值。即，通过使用MIP，可以捕捉更多的靶标分子。
<靶标分子的识别>
对由上述制造例得到的MIP对于各种蛋白质的吸附量进行研究。
试验方法
分别对于牛血红蛋白(BHb)、肌红蛋白(Mb)、牛血清白蛋白(BSA)、α-乳白蛋白(α-LA)、免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶(LZM))，调制以500ppm的浓度含有上述蛋白质的10mM  SPB(pH7.0)，制成吸附体系溶剂。向上述吸附体系溶剂200μL中添加MIP2.5mg，在37℃反应1小时。反应后，对各样品的吸附在MIP上的蛋白质量进行定量。结果示于图15。并且，图14中的印迹空隙的量表示在上述MIP调制例中由核壳粒子溶出的蛋白质的量，表现为靶标蛋白质对于MIP的印迹空隙的吸附容许量。
如图15所示的那样，印迹了BHb的MIP以几乎达到印迹空隙的吸附容许量的程度在该空隙中捕捉BHb。但是，对于IgG和LZM，在MIP上也有吸附。认为这是因为MIP的表面电荷为负，IgG和LZM在pH7.0时带正电荷，因而由于静电引力而使该蛋白质吸附在MIP表面的缘故。另外，对于IgG和LZM的吸附，与由其特性产生的疏水性相互作用也有关系。
另一方面，对于在pH7.0时显示中性的Mb、带负电荷的BSA和α-LA这样的蛋白质，都几乎不吸附在带负电荷的MIP上。并且，如果考虑到BHb在pH为7.0时也是显示为中性的蛋白质，则暗示了印迹部分对于特定蛋白质具有极高的捕捉力。
因此，用本发明的作为分子识别材料的MIP，可以识别并捕获印迹的分子。
进而，使用下述的吸附体系溶剂(PBS)，对于BHb和IgG，用与上述同样的方法进行试验。结果示于图16。
并且，在图16中，印迹空隙的量表示在上述MIP调制例中由核壳粒子溶出的蛋白质的量，表现为靶标蛋白质对于MIP的印迹空隙的吸附容许量。另外，“SPB”表示上述试验的结果，“PBS”表示使用了下述吸附体系溶剂的本试验的结果。
吸附体系溶剂的调制
向10mM SPB中添加150mM NaCl，将pH调节为7.0，得到吸附体系溶剂(PBS)。
如图16所示，对于使用添加了盐的吸附体系溶剂(PBS)的样品，与以SPB作为吸附体系溶剂的情况相比，MIP上的IgG吸附量大幅减少。另一方面，作为印迹分子的BHb的捕捉量不论吸附体系溶剂中有无盐，均是良好的。
认为IgG吸附量的减少是因为由添加到吸附体系溶剂中的盐的作用而导致MIP与IgG之间的静电引力被遮蔽的缘故。
因此，对于本发明的分子识别材料的应用，通过在吸附体系溶剂中添加盐，可以提高识别性的精度。
其次，在含有印迹分子的蛋白质2成分体系中，通过以下的试验方法研究对于MIP的吸附行为。
试验方法
调制以500ppm的浓度含有牛血红蛋白(BHb)与竞争蛋白质(competitor)1∶1(w/w)混合物的10mM SPB(pH7.0)，形成吸附体系溶剂。向上述吸附体系溶剂200μL中添加MIP2.5mg，在37℃反应1小时。反应后，对各样品的吸附在MIP上的蛋白质进行定量。蛋白质的定量利用与上述蛋白质溶出量的定量同样的方法进行。
分别使用牛血清白蛋白(BSA)、肌红蛋白(Mb)、α-乳白蛋白(α-LA)、纤维蛋白原(FBG)、免疫球蛋白G(IgG)、溶菌酶(LZM)作为竞争蛋白质的结果示于图17。
如图17所示，不论竞争的蛋白质的种类如何，MIP对于印迹分子都表现优异的捕捉性。
进而，在以BSA、FBG、IgG为竞争蛋白质的上述2成分体系吸附试验中，研究的蛋白质吸附量随反应时间的变化。
BHb和竞争蛋白质的MIP吸附试验根据上述方法，仅将反应时间分别改变为0.5、1、4、6、24小时这样来进行。结果示于图18。
如图18所示，印迹分子(BHb)的吸附用1～4小时的反应而达到饱和，如果反应时间超过4小时，则吸附量大致一定。该吸附量变化对于使用任一种竞争蛋白质的样品都相同，由此推断MIP对于印迹分子的反应几乎不受竞争蛋白质的吸附行为的影响。

Claims (5)

1.分子识别材料，其是在核粒子表面具有壳层的核-壳粒子，其特征在于，上述壳层上印迹了模板分子。
2.根据权利要求1所述的分子识别材料，其特征在于，上述核粒子是单分散聚合物微粒。
3.根据权利要求1或2所述的分子识别材料，其特征在于，上述模板分子是蛋白质。
4.权利要求1～3所述的分子识别材料的制造方法，其特征在于，含有下述步骤：
(a)在核粒子表面导入引发-转移-终止剂基团的步骤、
(b)(a)步骤后，使模板分子吸附在上述核粒子表面的步骤、
(c)(b)步骤后，在上述核粒子表面形成壳层的步骤。
5.根据权利要求5所述的分子识别材料的制造方法，其特征在于，进而含有：
(d)(c)步骤后，使模板分子从上述粒子溶出的步骤。
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