JPH0528105B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は固定化生理活性物質に関する。 （従来の技術） 固定化生理活性物質は、その生物学的反応を利
用して種々利用されている。その代表例として、
酵素を水不溶性の担体に固定化させてなる固定化
酵素や、免疫活性物質を固定化させてにる免疫学
的診断試薬が知られており、前者は近年、工業的
な酵素反応に実用され、また後者は従来より種々
の診断に広く実用されている。 酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれ
ば、反応条件を一定に維持しつく、新鮮な酵素を
補給したり、また、反応後に酵素を失活させるこ
となく、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。前記
した固定化酵素はかかる問題を解決するために実
用化されたものであり、この固定化酵素に基質を
反応させることによつて、酵素反応が行なわれ
る。 このような固定化酵素の製造方法として、代表
的には、水不溶性の担体に酵素を共有結合、イオ
ン結合又は物理吸着によつて結合させる担体結合
法が知られている。しかし、従来、用いられてい
る担体は、通常、セルロース、デキストラン、ア
ガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルアミ
ド、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒子であ
り、このような粒子に酵素が固定化された固定化
酵素は、通常、カラムに充填され、固定されて、
基質溶液と接触されるので、基質が高分子量の場
合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に長時間
を要すると共に、反応収率が低いという問題があ
る。 そこで、担体として水分散型高分子重合体粒子
を用いることも提案されている。例えば、従来の
代表的な水分散型高分子重合体粒子は、乳化剤及
び水溶性ラジカル重合開始剤の存在下に、例えば
スチレンのような水難溶性ラジカル重合性単量体
を乳化重合させて製造されている。ここに、上記
乳化剤は、一般に、乳化重合時における重合安定
性を確保すると共に、粒径が小さく、分散安定性
のよい重合体粒子を得るのに効果がある。乳化剤
がこのようにして得られた重合体粒子の分散安定
性を高める作用については、必ずしも明らかでは
ないが、一般には、乳化剤の一部が重合体粒子に
吸着されており、残余は媒体中に遊離の状態で存
在し、このような水分散型高分子重合体粒子の水
分散液中において、これら重合体粒子に吸着され
た乳化剤と遊離の乳化剤との間に吸着脱着平衡が
存在し、かかる平衡の結果として、重合体粒子の
分散安定化が達成されるとされている。従つて、
このように乳化剤を含む水分散型高分子重合体粒
子の水分散液は、この重合体粒子に酵素等の生理
活性物質を固定化するために、これを緩衝液や生
理食塩水中に分散させたとき、乳化剤の前記した
ような吸着脱着平衡がくずれる結果、重合体粒子
の分散安定性が損なわれて、重合体粒子が凝集、
沈降し、粒子の自由度が奪われ、生物学的反応性
が低下する。また、遊離の乳化剤は、酵素反応等
の生物学的反応の妨害物質となることが多い。更
に、前記したような水難溶性単量体であるスチレ
ンの乳化共重合によるポリスチレン重合体粒子
は、重合体粒子が疎水性であるために、これを有
機質の溶質を含有する緩衝液や生理食塩水に分散
させた場合に、容易に凝集を生じる。 また、水溶性ラジカル重合開始剤を用いてメタ
クリル酸エステルを親水性のメタクリル酸、２−
ヒドロキシエチルメタクリレート及び内部架橋用
多官能性単量体と共に、乳化剤の存在下に乳化共
重合させて、重合体水性分散液を得る方法も既に
知られているが（Polymer、Vol.19、August、
867−871（1978））、この方法により得られる分散
液も乳化剤を含有するために、上記と同様の問題
を有する。更に、粒子が含水性又は膨潤性である
ので、分散液の緩衝剤濃度によつては、粒子が凝
集したり、或いは固定化された生理活性物質の生
物学的活性が不安定である等の問題も生じる。 他方、前記した免疫学的診断試薬は、血液、尿
その他の体液中の生理活性物質が有する免疫活性
を利用する免疫学的診断のために用いられる試薬
であつて、かかる免疫学的診断方法には、例え
ば、免疫学的な反応を起こす抗原又は抗体のいず
れか一方、又は両者を組合せて体液等の被検液と
反応させ、抗原又は抗体と、これらに対応する抗
体又は抗原との間の特異的な反応、即ち、抗原抗
体反応に基づく凝集反応又は凝集阻止反応によつ
て、上記のような免疫活性成分の存在を測定する
方法等がある。この場合、肉眼や光学的方法によ
る測定を容易にするために、一般に、抗原又は抗
体は水不溶性の微粒子状の担体、例えば、ラテツ
クス、赤血球等に担持されて診断試薬とされ、こ
のような粒子の凝集反応を利用して、血清等の体
液中の被検成分が測定される。 このような免疫学的診断試薬は、免疫活性物質
が微量にでも被検液中に存在すれば、これを検出
し得る高い感度と、目的とする免疫活性物質との
み反応する高い特異性を有することが要求され
る。更に、長期間の保存によつても、高い検出感
度及び特異性を保持することが要求される。 このような免疫学的診断試薬としては、従来、
ポリスチレンラテツクス粒子表面に生理活性物質
を物理吸着により固定化してなる診断試薬や、カ
ルボキシル化ラテツクス粒子にカルボジイミド、
ジアルデヒド等を用いて共有結合により固定化し
てなる診断試薬等が提案されている。しかし、従
来のかかる診断試薬は、いずれも、体液と反応さ
せたとき、対応する陽性物質のみならず、陰性物
質に対しても凝集反応を起こすことがある。この
ような凝集反応は非特異的凝集反応と呼ばれてお
り、しばしば診断を誤まらせることがある。 以上のように、酵素や免疫活性物質等の生理活
性物質を水不溶性の担体に固定化してなる固定化
生理活性物質については、従来より種々の問題が
指摘されており、また、一層改善された特性が要
求されている。 そこで、本発明者らは、かかる問題を解決し、
また、要望に応えるべく、水不溶性担体に関して
鋭意研究し、例えば、固定化酵素については、既
に、特開昭59−45883号公報や特開昭59−45886号
公報等に記載されているように、所定の単量体混
合物を水性媒体中で乳化共重合させて得られる水
分散型高分子重合体粒子を担体として用いること
を提案している。 本発明者らは、かかる水分散型高分子重合体粒
子を担体とする固定化酵素について、更に研究を
重ねた結果、水分散型高分子重合体粒子を形成す
るための単量体成分として、アクリル酸誘導体と
アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体とを
用いることによつて、先ず、水分散型高分子重合
体粒子の製造においては、乳化剤を用いずとも、
乳化重合時の重合安定性にすぐれ、また、得られ
る重合体粒子がその粒径分布において狭く、均一
であり、且つ、水性媒体中で安定な分散状態を保
持する水分散型高分子重合体粒子を得ることがで
き、従つて、固定化生理活性物質の製造において
は、安定に、且つ、高い活性収率にて酵素を固定
化することができ、更に、このようにして得られ
る固定化生理活性物質においては、その酵素活性
が一層長期間にわたつて高く保持されることを見
出して、本発明に至つたものである。 （発明の目的） 従つて、本発明は、固定化生理活性物質のため
の水不溶性担体として水分散型高分子重合体粒子
を用いるために、一般に、反応系において遊離の
酵素と同様に自由に移動でき、従つて、固定化酵
素表面への基質の拡散が殆ど問題にならない高活
性及び高感度を有するのみならず、その製造に際
しては、高い活性収率にて安定に酵素を固定化す
ることができ、且つ、このようにして得られる固
定化生理活性物質は、その酵素活性が長期間にわ
たつて高く保持される固定化生理活性物質を提供
することを目的とする。 特に、本発明は、有機物質や無機塩を含む反応
系中においても、その表面が反応系中の有害物質
によつて汚染されず、又は被覆されないために、
酵素活性が低下せず、また、反応系において重合
体粒子相互の凝集が起こらないために、見掛けの
活性も低下しない固定化生理活性物質を提供する
ことを目的とする。 従つて、本発明は、粒子が有害物質によつて吸
着されず、又は吸着されることが少ないので、固
定化された酵素が構造変性を生じず、このように
して高活性を保持すると共に、保存安定性にもす
ぐれる固定化生理活性物質を提供することを目的
とする。 （発明の構成） 本発明による固定化生理活性物質は、 (a) 一般式 R¹CH＝CR²COOH （但し、R¹は水素、低級アルキル基又はカル
ボキシル基を示し、R²は水素又は低級アルキ
ル基を示し、R¹が水素又は低級アルキル基の
ときは、R²はカルボ低級アルコキシ基であつ
てもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体0.1〜20重量％、
及び (b) 一般式 CH₂＝CR³COOR⁴（CF₂）_oCFA₂ （但し、R³は水素又は低級アルキル基を示し、
R⁴は −（CH₂）_n−又は

【式】 （但し、ｍは０〜12の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ
−１であり、R⁵は水素又はアセチル基を示
す。）を示し、Ａはそれぞれ独立に水素、フツ
素又はCF₃を示し、ｎは０〜12の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエス
テル誘導体と、上記アクリル酸誘導体を除くラ
ジカル共重合性ビニル単量体との混合物であつ
て、この混合物に基づいて上記アクリル酸フル
オロアルキルエステル誘導体が１〜100重量％
である混合物99.9〜80重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合
させてなる水分散型高分子重合体粒子に共有結合
を介して酵素が固定化されていることを特徴とす
る。 本発明において用いるアクリル酸誘導体は、一
般式 R¹CH＝CR²COOH （但し、R¹は水素、低級アルキル基又はカルボ
キシル基を示し、好ましくは水素又はメチル基、
R²は水素又は低級アルキル基を示し、好ましく
は水素又はメチル基を示し、R¹は水素又は低級
アルキル基のときは、R²はカルボ低級アルコキ
シ基であつてもよい。） で表わされ、例えば、アクリル酸、メタクリル
酸、イタコン酸、クロトン酸、マレイン酸、フマ
ル酸、モノアルキルマレイン酸、モノアルキルフ
マル酸、モノアルキルイタコン酸等を好ましい例
として挙げることができるが、特に、アクリル
酸、メタクリル酸及びイタコン酸の１種又は２種
以上の混合物が好ましく用いられる。 本発明において用いられるアクリル酸フルオロ
アルキルエステル誘導体は、一般式 CH₂＝CR³COOR⁴（CF₂）_oCFA₂ （但し、R³は水素又は低級アルキル基、好まし
くは水素又はメチル基を示し、R⁴は −（CH₂）_n−又は

【式】 （但し、ｍは０〜12の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ−
１であり、R⁵は水素又はアセチル基を示す。）を
示し、Ａはそれぞれ独立に水素、フツ素又はCF₃
を示し、ｎは０〜12の整数を示す。） で表わされ、好ましくは、一般式 CH₂＝CR³COO（CH₂）_n（CF₂）_oCF₃ (1) CH₂＝CR³COO（CH₂）_n（CF₂）_oCF₂H (2) CH₂＝CR³COO（CH₂）_n（CF₂）_oCF（CF₃）₂ (3) 又は （但し、R³、R⁵、ｍ及びｎは前記と同じであ
る。） で表わされ、従つて、特に、本発明において好ま
しく用いることができるアクリル酸フルオロアル
キルエステル誘導体の具体例として、例えば、 CH₂＝Ｃ（CH₃）COOCH₂CF₃ (5) CH₂＝Ｃ（CH₃）COOCH₂（CF₂）₂H (6) CH₂＝Ｃ（CH₃）COOCH₂（CF₂）₄H (7) CH₂＝Ｃ（CH₃）COO（CH₂）₂（CF₂）₈F (8) 等を例示することができる。 本発明によれば、前記アクリル酸エステル誘導
体は、乳化共重合時の重合安定性にすぐれ、ま
た、水性媒体中での分散安定性にすぐれる水分散
型高分子重合体粒子を得るためのみならず、得ら
れる重合体粒子に酵素を共有結合にて結合し、固
定化するためのカルボキシル基を付与するために
必要な単量体であり、本発明においては、単量体
組成において、少なくとも0.1重量％を必要とす
る。しかし、過多に共重合単量体成分として用い
るときは、却つて重合安定性と、得られる分散液
の安定性を損なうので、20重量％以下の範囲で用
いる。特に好ましい範囲は、0.5〜10重量％であ
る。 また、前記アクリル酸フルオロアルキルエステ
ル誘導体は、得られる水分散型高分子重合体粒子
への酵素の固定化時や所要の反応系において、重
合体粒子が水性媒体中で安定な分散性を保つ効果
を有する。特に、重合体粒子において、アクリル
酸フルオロアルキルエステル誘導体単量体成分
は、塩や有機質物質を含む水溶液中において、例
えば、重合体粒子への有害物質の吸着や被覆を防
止して、酵素活性を長期間にわたつて高く保持す
る効果を有するので、繰り返しての酵素反応にお
いても高い活性を保持させることができる。この
ような効果を有効に得るためには、本発明におい
ては、アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体は、単量体組成において99.9〜80重量％、好ま
しくは99.5〜90重量％の範囲で用いられる。 しかも、本発明によれば、かかる単量体成分の
所定の割合の混合物を用いることにより、特に乳
化剤を用いることなく、凝集物の発生なしに安定
に乳化共重合させ得て、粒径が均一であり、且
つ、水性媒体中で分散状態が安定に保持される水
分散型高分子重合体粒子を得ることができる。 本発明においては、前記アクリル酸フルオロア
ルキルエステル誘導体の一部を前記アクリル酸誘
導体を除くラジカル共重合性ビニル単量体に代え
ることができる。 かかるラジカル共重合性ビニル単量体として
は、例えば、それ自体の単独重合体が水不溶性で
ある疎水性単量体を挙げることができる、具体例
として、エチレン、プロピレン、塩化ビニル等の
α−オレフイン又はそのハロゲン置換体、スチレ
ン、メチルスチレン、エチルスチレン、ビニルト
ルエン、クロロスチレン等のアルケニルベンゼ
ン、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフイ
ン、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル
酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）ア
クリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、
（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸
オクチル等の（メタ）アクリル酸エステル、酢酸
ビニル、プロピオン酸ビニル等を挙げることがで
きる。上記したラジカル共重合性ビニル単量体の
うちでは、特に、メタクリ酸メチルやメタクリル
酸イソブチル等の（メタ）アクリル酸エステルが
好ましく用いられる。このような単量体は、得ら
れる水分散型高分子重合体粒子の比重を調整し、
又は前記したアクリル酸エステル誘導体とアクリ
ル酸フルオロアルキルエステル誘導体との共重合
反応性を調整するために好適に用いられる。 また、それ自体の単独重合体が水溶性又は水膨
潤性である親水性単量体も用いることができ、か
かる単量体の具体例として、例えば、ヒドロキシ
メチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル
（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メ
タ）アクリレート等のヒドロキシアルキル（メ
タ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、グ
リシジル（メタ）アクリレート等を挙げることが
できる。このような親水性単量体は、特に、得ら
れる重合体粒子に水酸基やエポキシ基等の官能基
を有せしめるために有効であり、上記疎水性単量
体と併用するのが好ましい。かかる官能基も、必
要に応じて、水分散型高分子重合体粒子に生理活
性物質やスペーサ基を共有結合にて結合するため
に用いられる。 しかし、上記したラジカル共重合性ビニル単量
体は、余りに多量に使用すると、重合安定性を損
じるのみならず、得られる重合体粒子が水分散安
定性に劣るようになるので、本発明においては、
アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導体と上
記ラジカル共重合性ビニル単量体との混合物にお
いて、アクリル酸フルオロアルキルエステル誘導
体を少なくとも１重量％用いることが必要であ
る。 即ち、本発明においては、上記ラジカル共重合
性ビニル単量体は、このラジカル共重合性ビニル
単量体とアクリル酸フルオロアルキルエステル誘
導体との混合物の重量に基づいて、99重量％以
下、好ましくは97重量％以下の範囲で用いられ
る。有効量の下限は特に制限されず、目的に応じ
て適宜に選ばれるが、通常、アクリル酸フルオロ
アルキルエステル誘導体とこのアクリル酸アルキ
ルエステル誘導体の混合物の重量に基づいて１重
量％以上である。 本発明においては、単量体成分として、内部架
橋用官能性単量体を用いることができる。この内
部架橋用多官能性単量体は、重合体に架橋構造を
導入するので、存在する場合には好ましくない水
溶性重合体の生成を抑制すると共に、得られる重
合体粒子のガラス転移温度を高めることができ
る。更に、内部架橋剤は、水分散型高分子重合体
粒子を非膨潤化して、重合体粒子の水性媒体中で
の分散安定性を高めるのに効果がある。 かかる多官能性内部架橋用単量体としては、例
えば、脂肪族多価アルコールのポリ（メタ）アク
リレートが好ましく用いられる。具体例として、
例えば、エチレングリコールジメタクリレート、
ジエチレングリコールジメタクリレート、トリエ
チレングリコールジメタクリレート、ジプロピレ
ングリコールジメタクリレート、１，３−ブチレ
ングリコールジメタクリレート、トリエチレング
リコールジアクリレート、トリメチロールプロパ
ントリメタクリレート、トリメチロールプロパン
トリアクリレート、テトラメチロールメタンテト
ラアクリレート等が好ましく用いられる。また、
ジビニルベンゼンやＮ，N′−メチレンビスアク
リルアミド等も多官能性内部架橋用単量体として
用いることができる。 内部架橋用多官能性単量体は、必要な場合は、
通常、単量体組成において、0.1重量％以上が用
いられるが、しかし、過多に使用するときは、却
つて重合安定性と分散液の安定性を損なうので好
ましくなく、通常、20重量％以下の範囲で用いら
れる。好ましくは0.2〜10重量％の範囲である。 更に、得られる水分散型高分子重合体粒子の用
途にもよるが、個々の単量体の具体的な種類は、
得られる共重合体のガラス転移点が０℃以上、好
ましくは室温以上となるように選ばれる。重合体
粒子のガラス転移点が０℃よりも低いときは、重
合体粒子の相互の融着や凝集が生じやすく、分散
液の分散安定性が低下する傾向があるからであ
る。 本発明においては、以上のような各単量体を水
性媒体中にて、水溶性のラジカル重合開始剤を用
いて、通常の方法にて乳化共重合させることによ
り、水不溶性共重合体重合体水性分散液を得るこ
とができるが、得られる水性分散液中に乳化剤が
遊離の状態で、或いは重合体粒子に吸着された状
態にて存在するとき、前述したように、特に、そ
の使用に際して種々の有害な影響が現れることが
あるので、乳化共重合に際しては乳化剤を用いな
いのが好ましい。本発明による前記単量体組成に
よれば、乳化剤を要せずして安定に共重合させる
ことができると共に、得られる重合体粒子の水分
散液の分散状態が安定に保持されるのが大きい特
徴をなす。しかし、前述したように、重合体粒子
を緩衝液や生理食塩水に分散させた場合にも、重
合体粒子の凝集や沈降が起こらず、更には、固定
化された生理活性物質の生理学的反応が妨害され
ない範囲において、乳化剤を用いることは何ら妨
げられず、また、用途によつて乳化剤が有害な影
響を与えないときは、必要に応じて、乳化剤を用
いてもよい。 また、本発明による乳化共重合において、単量
体成分混合物の水性媒体中での濃度は、得られる
分散液における重合体粒子の平均粒径とも関連す
るが、通常、１〜40重量％の範囲である。 重合開始剤としては、水溶性ラジカル重合開始
剤が用いられる。通常、過硫酸カリウム、過硫酸
ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩
や、これら過硫酸塩とチオ硫酸ナトリウム、チオ
硫酸カリウム、チオ硫酸水素ナトリウム等のよう
なチオ硫酸塩、又は亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カ
リウム、亜硫酸水素ナトリウム等のような亜硫酸
塩とのレドツクス系重合開始剤が好ましく用いら
れるが、これらに限定されるものではない。これ
ら重合開始剤の使用量は、単量体混合物に対して
0.01〜１重量％の範囲が好適である。重合の雰囲
気も、特に制限されないが、好ましくは酸素を除
いた不活性ガス雰囲気が用いられる。また、重合
温度は、特に制限されないが、通常、20〜100℃、
好ましくは40〜90℃の範囲である。 本発明において用いられる水分散型高分子重合
体粒子は、その平均粒径が0.03〜2μｍ、好ましく
は0.05〜1.5μｍである。粒径が小さすぎると、こ
れを担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵
素反応を行なわせた後の回収が困難となり、一
方、粒径が大きすぎると、単位体積当りの粒子表
面積が小さくなり、酵素の固定化量が少なくなる
と共に、水中に分散させるのが困難となるので好
ましくない。 また、重合体粒子の比重は0.9〜1.5の範囲にあ
ることが好ましい。比重が0.9よりも小さいとき
は、酵素反応において、重合体粒子が分散液媒体
表面に浮遊し、分散安定性に劣るようになり、ま
た、酵素活性も低下し、一方、1.5よりも大きい
ときは、重合体粒子が分散液媒体中に沈降、凝集
し、粒子の自由度が失われて、酵素活性が低下す
るからである。 本発明による固定化生理活性物質においては、
酵素は水分散型高分子重合体粒子に共有結合にて
固定化されている。特に、本発明においては、酵
素が水分散型高分子重合体粒子に共有結合にてス
ペーサ基を介して固定化されていることが好まし
い。吸着法やイオン結合法によるときは、酵素の
固定化量が限られる結果、酵素活性が小さくなる
からである。このように、重合体粒子に共有結合
によつてスペーサ基が結合され、このスペーサ基
に共有結合によつて酵素が固定化されることによ
り、固定化された酵素の重合体粒子上での自由度
が高められる。 本発明において用いる酵素は特に制限されず、
種々の酵素が用いられる。具体例として、種々の
酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアー
ゼ、異性化酵素、リガーゼ等を挙げることができ
る。尚、本発明に用いる酵素の代わりに、免疫活
性物質のような、他の生理活性物質を用いて生物
学的反応を生じさせることもできる。 前記スペーサ基として用い得る化合物は、少な
くとも二官能性の有機化合物であり、多官能性の
重合体を排除するものではないが、特に、炭素数
１〜12の炭素鎖基を有する二官能性の有機化合物
が好ましい。このようなスペーサ基として機能す
る化合物の具体例として、例えば、ヘキサメチレ
ンジアミン、ドデカメチレンジアミン、キシリレ
ンジアミン等のジアミン類、グリシン、β−アミ
ノプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、ε−アミノカ
プロン酸、ε−アミノカプリル酸等のアミノアル
キルカルボン酸、リジン、グルタミン酸、β−ア
ラニン、アルギニン、グリシルグリシルグリシン
等のアミノ酸類等が好ましく用いられるが、これ
らに限定されるものではない。このスペーサ基
は、予め重合体粒子に結合させ、この後にこのス
ペーサ基と酵素とを結合させてもよく、或いはス
に結合させてもよい。更に、必要に応じて、重合
体粒子及び酵素の両方に予めスペーサ基を結合さ
せ、これらを相互に結合させることもできる。 官能基を有する水分散型高分子重合体粒子に直
接に酵素を共有結合にて固定化し、又は重合体粒
子にスペーサ基を結合し、また、このスペーサ基
に酵素を共有結合にて固定化するための方法は、
特に制限されず、従来より知られている任意の方
法によることができる。例えば、好ましい方法の
一つとして、架橋剤として水溶性カルボジイミド
を用いる方法を挙げることができる。例えば、ジ
アミンをスペーサ基として用いる場合であれば、
水溶性カルボジイミドの存在下に、ジアミンの有
するアミノ基と水分散型高分子重合体粒子の有す
るカルボキシル基とを反応させ、アミド結合を形
成させることにより、スペーサ基を重合体粒子に
結合させ、次いで、同様に水溶性カルボジイミド
を用いてこのスペーサ基の有するアミノ基に酵素
を共有結合にて固定化することができる。 かかる方法において用いる水溶性カルボジイミ
ドとしては、例えば、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホ
ネート等を挙げることができる。このような水溶
性カルボジイミドを用いて、スペーサ基を介し
て、又は介さずして直接に、共有結合によつて酵
素を重合体粒子に固定化するには、従来より知ら
れている通常の方法及び条件によることができ
る。例えば、スペーサ基を用いる場合であれば、
重合体粒子の水性分散液にスペーサ基と共に適宜
量、例えば、水性分散液の単位容量当りに0.01〜
10mg／mlとなるように水溶性カルボジイミドを添
加し、通常の条件、例えばPHを４〜９を保持し
て、５〜60℃程度の温度で数分乃至数十時間、通
常、１〜５時間程度反応させればよい。次いで、
このスペーサ基を結合させた重合体粒子に同様に
して酵素を固定化すればよい。 本発明による固定化生理活性物質は水分散液と
して使用に供される。固定化された酵素は、水分
散液として基質と接触され、また、その使用量
は、固定化酵素の粒径や固定化量、必要とする反
応速度、基質濃度等により適宜に決定される。 （発明の効果） 以上のように、本発明によれば、水不溶性担体
として、アクリル酸誘導体とアクリル酸フルオロ
アルキスエステル誘導体とからなる共重合体を用
いるので、得られる重合体粒子がその粒径分布に
おいて狭く、均一であり、且つ、水性媒体中で安
定な分散状態を保持するので、固定化生理活性物
質の製造においては、安定に、且つ、高い活性収
率にて酵素を固定化することができ、更に、この
ようにして得られる固定化生理活性物質において
は、反応系に存在する外来の有機物質の表面への
吸着や被覆による表面汚染が実質的に生じないの
で、生理活性が長期間にわたつて高く保持され
る。 更に、上記水分散型高分子重合体粒子は、その
製造においては、乳化剤を用いずとも、乳化重合
時の重合安定性にすぐれる。 従つて、本発明による固定化生理活性物質は、
固定化された酵素が遊離の酵素と同様に自由に移
動でき、従つて、固定化された酵素の表面への基
質の拡散が殆ど問題にならない高活性を有するの
みならず、その高活性が長期間にわたつて保持さ
れるので、繰り返しての酵素反応に好適に用いる
ことができる。 （実施例） 以下に実施例を挙げて本発明を説明すが、本発
明はこれら実施例により限定されるものではな
い。 実施例 １ (a) 水分散型高高分子重合体粒子の調製 アクリル酸２ｇ及び前記式(5)で表わされる
２，２，２−トリフルオロエチルメタクリレー
ト40ｇからなる単量体混合物を蒸留水348ｇに
加え、過硫酸アンモニウム0.2ｇを水10ｇに溶
解した重合開始剤水溶液を70℃の温度で窒素気
流下に加え、200rpmで撹拌しつつ８時間重合
させて、平均粒径0.21μｍの重合体粒子の水分
散液（固形分10.0％）を得た。次に、この重合
体粒子をアルカリ、酸及び蒸留水を用いて順次
に遠心洗浄した後、蒸留水中に固形分５重量％
となるように再分散させた。 (b) 重合体粒子へのスペース基の結合 上で得た水分散型高分子重合体粒子の水性分
散液100mlとε−アミノカプロン酸水溶液
（0.02M）100mlとを混合し、1N水酸化ナトリ
ウム水溶液にてPH7.2に調製した。0.01Mホウ
酸緩衝液（PH7.2）に溶解させた１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジ
イミド塩酸塩水溶液（25mg／ml）20mlに上記水
性分散液に加え、室温で３時間、撹拌下に反応
させた。一夜、冷蔵庫に放置した後、0.01Mホ
ウ酸緩衝液（PH7.2）にて３回遠心洗浄して、
スペーサ基の結合された重合体粒子を得、これ
を同じホウ酸緩衝液に固形分５重量％になるよ
うに再分散させた。 (c) 酵素の固定化 ウレアーゼ0.05ｇを水10mlに溶解した酵素水
溶液を上記重合体粒子分散液10mlに加え、均一
に撹拌した後、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩水溶
液（25mg／ml）５mlを加え、PH7.2にて４℃で
一夜反応させた。この後、遠心分離し、洗浄し
て、ウレアーゼが固定化された重合体粒子を得
た。ウレアーゼ固定化量は、重合体粒子１ｇ当
り35mgであつた。 0.03M尿素水溶液を基質として、この固定化
酵素を35℃にて10分間反応させて生成したアン
モニア量を塩酸滴定して測定したところ、固定
化酵素の活性収率は55％であつた。また、この
酵素反応中、重合体粒子の相互付着や、凝集は
全く認められなかつた。 尚、活性収率とは、固定化された酵素量をこの
固定化された酵素の活性と同じ活性を有する遊離
の酵素量にて除して求めた値である。 比較例 １ 実施例１において、２，２，２−トリフルオロ
エチルメタクリレートをスチレンに代えた以外は
同様にして、平均粒子0.22μの水分散型高分子重
合体粒子の水分散液を得た。この重合体粒子に実
施例１と同様にしてスペーサ基を結合し、ウレア
ーゼを固定化した。 この固定化酵素におけるウレアーゼ固定化量は
重合体粒子１ｇ当り64mgであり、活性収率は実施
例１と同じ条件下で9.5％であつた。また、酵素
反応中に重合体粒子が相互に付着し、凝集してい
ることが認められた。 比較例 ２ 実施例１において、２，２，２−トリフルオロ
エチルメタクリレートをメタクリル酸メチルに代
えた以外は同様にして、平均粒子0.25μの水分散
型高分子重合体粒子の水分散液を得た。この重合
体粒子に実施例１と同様にしてスペーサ基を結合
し、ウレアーゼを固定化した。 この固定化酵素におけるウレアーゼ固定化量は
重合体粒子１ｇ当り48mgであり、活性収率は18％
であつた。また、比較例１に比べれば僅かではあ
るが、酵素反応中に重合体粒子が相互に付着し、
凝集していることが認められた。 実施例 ２ 実施例１において、２，２，２−トリフルオロ
エチルメタクリレートの90重量％をメタクリル酸
メチルに代えた以外は同様にして、平均粒子
0.22μの水分散型高分子重合体粒子の水分散液を
得た。この重合体粒子に実施例１と同様にしてス
ペーサ基を結合し、ウレアーゼを固定化した。 この固定化酵素におけるウレアーゼ固定化量は
重合体粒子１ｇ当り42mgであり、活性収率は54％
であつた。また、酵素反応中、重合体粒子の相互
付着や、凝集は全く認められなかつた。 実施例 ３ 単量体混合物として、アクリル酸1.5ｇ、メタ
クリル酸メチル16ｇ、メタクリル酸イソブチル16
ｇ、1H，1H，5H−オクタフルオロペンチルメ
タクリレート８ｇ及びトリエチレングリコールジ
メタクリレート0.5ｇを用いた以外は同様にして、
平均粒子0.26μの水分散型高分子重合体粒子の水
分散液を得た。この重合体粒子に実施例１と同様
にしてスペーサ基を結合した。 実施例１の(c)項におけるウレアーゼをトリプシ
ンとした以外は、全く同様にして上記重合体粒子
にトリプシンを固定化した。この固定化酵素にお
けるトルプシン固定化量は重合体粒子１ｇ当り26
mgであり、活性収率は41％であつた。尚、この固
定化酵素に１％カゼイン水溶液を基質として35℃
で10分間反応させた後、５％トリクロロ酢酸によ
り高分子量タンパク質を沈殿させ、次いで、遊離
の非タンパク質量を280nｍの吸光度から求め、
この吸光度を１分間に1.0増加させる活性を１単
位として、固定化酵素の活性を求めた。同様にし
て遊離のトリプシンについても、その活性を求
め、前記と同様にして活性収率を求めた。 実施例 ４ スペーサとしてキシリレンジアミンを用いた以
外は、実施例１と同様にして、実施例１で得た水
分散型高分子重合体粒子にスペーサ基を結合さ
せ、ホウ酸緩衝液に固形分５重量％となるように
分散させた。この分散液にグルタルアルデヒドを
0.1重量％濃度となるように加え、４℃で３時間
反応させた後、蒸留水にて遠心洗浄を３回繰り返
し、５重量％となるように再分散させた。 この分散液10mlにα−アミラーゼ溶液（50mg／
c.c.）20mlを加え、４℃で一夜反応させた。この
後、遠心分離による洗浄を行なつて、α−アミラ
ーゼが固定化された重合体粒子を得た。固定化量
は重合体粒子１ｇ当り120mgであつた。 比較のために、比較例２において得た水分散型
高分子重合体粒子に上記と同様にして、固定化量
重合体粒子１ｇ当り約127mgの固定化α−アミラ
ーゼを得た。 これらの固定化酵素について、１％デンプン水
溶液を基質として測定した活性収率は、本発明に
よる固定化酵素が45％、比較例によるものは38％
であつた。 次に、上記の酵素反応を行なつた後の反応混合
物から遠心分離にて固定化酵素を沈殿させ、緩衝
液に再分散させた後、上記と同様にして２回目の
酵素反応を行なつた。更に、同様にして、繰り返
して酵素反応を行なつた。 初回の活性を基準として、その後の酵素反応に
おける本発明及び比較例による固定化酵素の相対
活性を図面に示す。本発明の固定化酵素によれ
ば、繰り返しての反応においても、酵素活性の低
下が小さく抑えられることが明らかである。 また、上記の酵素反応において、２回目以後の
反応時に基質水溶液中に0.5％のBSAを存在させ
て行なつたときの酵素反応における本発明及び比
較例による固定化酵素の相対活性を図面に示す。
本発明の固定化酵素によれば、繰り返しての反応
においても、外来のタンパク質に基づく固定化酵
素の酵素活性の低下が小さく抑えられることが明
らかである。

【図面の簡単な説明】

図面は、本発明及び比較例による固定化酵素を
用いて、繰り返して酵素反応を行なつたときの反
応回数に対する酵素の相対活性の経時変化を示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 一般式 R¹CH＝CR²COOH （但し、R¹は水素、低級アルキル基又はカル
   ボキシル基を示し、R²は水素又は低級アルキ
   ル基を示し、R¹が水素又は低級アルキル基の
   ときは、R²はカルボ低級アルコキシ基であつ
   てもよい。） で表わされるアクリル酸誘導体0.1〜20重量％、
   及び (b) 一般式 CH₂＝CR³COOR⁴（CF₂）_oCFA₂ （但し、R³は水素又は低級アルキル基を示し、
   R⁴は −（CH₂）_n−又は 【式】 （但し、ｍは０〜12の整数を示し、ｘ＋ｙ＝ｍ
   −１であり、R⁵は水素又はアセチル基を示
   す。）を示し、Ａはそれぞれ独立に水素、フツ
   素又はCF₃を示し、ｎは０〜12の整数を示す。） で表わされるアクリル酸フルオロアルキルエス
   テル誘導体と、上記アクリル酸誘導体を除くラ
   ジカル共重合性ビニル単量体との混合物であつ
   て、この混合物に基づいて上記アクリル酸フル
   オロアルキルエステル誘導体が１〜100重量％
   である混合物99.9〜80重量％ からなる単量体混合物を水性媒体中で乳化共重合
   させてなる水分散型高分子重合体粒子に共有結合
   を介して酵素が固定化されていることを特徴とす
   る固定化生理活性物質。 ２ 水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μｍの平
   均粒子を有することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の固定化生理活性物質。